7 kwietnia 2023
Obecny protokół opisuje zintegrowaną strategię badania kluczowych celów i mechanizmów Fructus Phyllanthi przeciwko hiperlipidemii w oparciu o przewidywania farmakologiczne sieci i weryfikację metabolomiczną.
Nasze badania obejmują technikę seryjnych eksperymentów, a protokół zawiera te szczegóły, które są niezbędne, aby czytelnicy mogli zrozumieć nasze metody. Nasza zintegrowana metoda kompensuje wady farmakologii sieciowej i metabolomiki i może być stosowana do metaanalizy terapeutycznej medycyny naturalnej. Metoda ta służy do odsiewania związku aktywnego od składnika firmy i kombinezonu dla biegaczy o masywnym składzie chemicznym, takich jak tradycyjna medycyna chińska.
Aby rozpocząć, wybierz składniki aktywne i kluczowe cele, wyszukując słowo kluczowe phyllanthi fructus w bazie danych farmakologii tradycyjnej medycyny chińskiej. Aby uzyskać listę potencjalnych składników aktywnych i celów fructus phyllanthi lub FP, przeszukaj słowo kluczowe hiperlipidemia w bazie danych kart genowych, internetowej bazie danych dziedziczenia mendlowskiego u ludzi oraz bazie danych celów terapeutycznych, aby uzyskać odpowiednie potencjalne cele hiperlipidemii. Pobierz arkusze kalkulacyjne z celami choroby i zapisz je w folderze i usuń powtarzające się cele, aby uzyskać listę celów hiperlipidemii.
Następnie skopiuj listy składników aktywnych FP, celów FP i celów hiperlipidemii do nowego arkusza kalkulacyjnego. Użyj funkcji identyfikacji duplikatów danych na pasku narzędzi, aby uzyskać cele skrzyżowania. Zaimportuj listę celów przecięć do bazy wiedzy UniProt w celu standaryzacji nazw genów i białek.
Aby skonstruować sieć interakcji białek białkowych, wklej listę celów przecięcia FP przeciwko hiperlipidemii w oknie dialogowym listy nazw bazy danych ciągów 11.5. Wybierz homo sapiens w organizmach. Kliknij przycisk Wyszukaj, a następnie kontynuuj.
Gdy wyniki będą dostępne, włącz wysokie rozłączone węzły w sieci w ustawieniach zaawansowanych. Ustaw najwyższy poziom ufności na 0,900 w minimalnym wymaganym wyniku interakcji. Następnie kliknij przycisk aktualizacji.
Kliknij eksporty w pasku tytułu i pobierz krótki tekst tabelaryczny sieci interakcji białek w formacie PNG i TSV. Aby skonstruować sieć docelową choroby składnika leku, otwórz Cytoscape 3.9.1 i zaimportuj plik w formacie TSV. Zoptymalizuj kolor, czcionkę i bok węzłów sieci za pomocą paska stylów w panelu sterowania.
Korzystając z funkcji analizy sieci do analizy topologii sieci, uzyskaj geny piasty w CytoHubba w Cytoscape i ustal sieć chorób docelowych składników leków. Aby przeprowadzić analizę wzbogacania GO i KEGG, otwórz zasoby bioinformatyczne Davida. Kliknij rozpocznij analizę i wklej listę celów w lewym oknie dialogowym.
Wybierz oficjalny symbol genu w wybranym identyfikatorze i homo sapiens w wybranym gatunku. Następnie włącz listę genów w typie listy i kliknij prześlij listę. Następnie kliknij grupowanie adnotacji funkcjonalnych w obszarze analizuj powyższą listę genów za pomocą jednego z narzędzi Davida.
Włącz GO term BP direct, GO term CC direct, GO term MF direct i ontologię genów do analizy wzbogacania funkcji GO. Włącz ścieżkę KEGG w ścieżkach do analizy wzbogacania ścieżki KEGG. Kliknij wykres adnotacji funkcjonalnej, aby wyświetlić wyniki.
Oprogramowanie SIMCA P służy do wielowymiarowej analizy statystycznej wartości całkowych uzyskanych z wyników LCMS. Użyj ortogonalnej częściowej analizy dyskryminacyjnej metodą najmniejszych kwadratów (OPLSDA) dla danych uśrednionego środka i modelowania klas próby. Po przeprowadzeniu testu OPLSDA należy rozważyć metabolity o znaczeniu zmiennym całkowym w projekcji lub wartości VIP większe niż jeden i wartość P mniejszą niż 0,05 z testu T studenta jako potencjalne metabolity różnicowe.
Zidentyfikuj zaburzone metabolity i szlaki metaboliczne za pomocą otwartych źródeł danych, w tym ludzkiego metabolomu, encyklopedii genów i genomów z Kioto oraz MetaboAnalyst 5.0. Wizualizacja widoków wyników przez MetaboAnalyst 5.0 i platformę Wukong. Pobierz wybraną strukturę 3D składników FP z bazy danych farmakologicznych systemów tradycyjnej medycyny chińskiej.
Wyszukaj nazwy składników w polu wyszukiwania nazw chemicznych i pobierz odpowiednie pliki struktury 3D w dwóch formatach MOL. Następnie pobierz struktury krystaliczne kluczowych celów z bazy danych struktury białek fałdowych alfa. Wyszukaj nazwy docelowe w polu wyszukiwania i pobierz odpowiednie pliki struktury krystalicznej w formacie PDB.
Następnie zaimportuj składniki i pliki struktury docelowej do oprogramowania narzędzi AutoDock. Kliknij edytuj i usuń wodę, aby usunąć cząsteczki wody. Następnie kliknij edytuj wodór i dodaj, aby dodać wodór.
Ustaw składniki jako ligand i wykonaj dokowanie na ślepo, wybierając całe cele jako receptor. Wprowadź wartość w polu za środkiem i rozmiarem, aby dostosować nowo powstałą przestrzeń, umożliwiając pełne objęcie liganda i receptora. Zapisz pliki liganda i receptora w formacie PDBQT.
Użyj AutoDock Vina, aby wykonać dokowanie molekularne. Ustaw pasek receptora na nazwę kropki receptora PDBQT, a pasek liganda na nazwę kropki liganda PDBQT. Uzyskaj optymalne miejsce do wiązania liganda z receptorem i zapisz wartość energii wiązania w optymalnej pozycji.
Zaimportuj pliki dokowania do profilera interakcji ligandów białkowych, aby uzyskać wizualny model systemu. Pobierz pliki modelu w formacie PSC i zaimportuj je do oprogramowania PyMOL w celu skonstruowania dalszej wizualizacji. Dzięki farmakologii sieciowej znaleziono łącznie 19 składników i 134 cele FP związane ze składnikami.
Po dopasowaniu celów związanych z FP z celami związanymi z hiperlipidemią, 62 zidentyfikowano jako potencjalne cele FP przeciwko hiperlipidemii. Sieć interakcji białek białkowych została skonstruowana przez String i Cytoscape. Wyniki wzbogacenia GO sugerują, że procesy biologiczne i funkcja molekularna FP przeciwko hiperlipidemii były głównie związane z ekspresją genów i wiązaniem białek.
Wzbogacenie projektu KEGG dowiodło, że FP może wpływać na metabolizm lipidów i miażdżycę. Analizę OPLSDA wykorzystano do zbadania separacji metabolitów między grupami myszy z kontrolą negatywną, dietą wysokotłuszczową i wysokimi dawkami FP, co wykazało, że te same próbki grupowe grupowały się razem, a różne próbki grupowe dobrze się różniły. W sumie 16 i sześć metabolitów zidentyfikowano jako metabolity różnicowe w FP wpływające na myszy z HFD w osoczu i wątrobie.
Mapy cieplne naniesione przez MetaboAnalyst 5.0 wykazały, że wszystkie zróżnicowane metabolity w osoczu i wątrobie uległy zmianie w grupie diety wysokotłuszczowej, a większość z nich uległa odwróceniu w grupie FP. Metabolizm tryptofanu w osoczu był znacząco zaburzony. Metabolizm tauryny i hipoturyny był istotnie zaburzony w wątrobie.
Zróżnicowane metabolity zostały zaimportowane do wtyczki MetScape w Cytoscape i dopasowane do genów piasty zidentyfikowanych w farmakologii sieciowej w celu zebrania sieci genów enzymów reakcji złożonej. Ponadto skonstruowano sieć szlaków metabolitów docelowych dla składników. Dokowanie molekularne wykorzystano do analizy ich interakcji w miejscu aktywnym ligandów.
Technologia ta jest kompleksową metodą uruchamiania farmakologicznych składników genetycznych tradycyjnej medycyny chińskiej. Dostarcza nowego pomysłu na badania nad lekami z kompletnymi składnikami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Niniejszy protokół przedstawia kompleksowe podejście do badania mechanizmów i celów działania Fructus Phyllanthi w leczeniu hiperlipidemii, z wykorzystaniem farmakologii sieciowej oraz metabolomiki. Zintegrowana metoda pozwala na przełamanie ograniczeń tradycyjnych podejść i znajduje zastosowanie w analizie terapii opartych na lekach naturalnych.
Integracja farmakologii sieciowej z metabolomiką umożliwia systematyczną minimalizację ryzyka w badaniu mechanizmów działania produktów naturalnych na wczesnym etapie odkrywania, co zwiększa pewność predykcyjną w wyborze celów i szlaków w ramach portfeli badań nad chorobami metabolicznymi. Podejście to dostarcza praktycznych informacji służących do selekcji wieloskładnikowych środków terapeutycznych oraz dostosowywania wyników badań do wymagań badań translacyjnych. Taki schemat pracy usprawnia procesy decyzyjne w przedsiębiorstwie poprzez powiązanie oddziaływań związek-cel z mierzalnymi efektami metabolicznymi.
Ta zintegrowana metoda łączy wczesny etap odkrywania leków, identyfikację związków wiodących oraz badania przedkliniczne, wiążąc sieci zależności związek-cel z walidacją metabolomiczną w modelach chorób.