Fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości

Konie mają wyjątkową zdolność do ćwiczeń aerobowych, co sprawia, że mięśnie szkieletowe koni są ważną tkanką zarówno do badania fizjologii ćwiczeń koni, jak i fizjologii mitochondriów ssaków. W artykule opisano techniki kompleksowej oceny funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni.

Protokoły te pozwalają badaczom wyjść poza zwykły pomiar zużycia tlenu w mitochondriach, a zamiast tego pozwalają na pomiar kluczowych mitochondrialnych produktów końcowych, ATP i reaktywnych form tlenu. Główną zaletą tej techniki jest to, że badacz może zmierzyć wydajność mitochondriów, bezpośrednio porównując tempo zużycia tlenu z tempem produkcji produktu końcowego. Czy produktem końcowym jest ATP czy tlen reaktywny.

Techniki te wymagają bardzo starannej dbałości o szczegóły, szczególnie w unikaniu pęcherzyków. Niezależnie od tego, czy znajdują się w komorze oddechowej, czy w strzykawkach do miareczkowania, pęcherzyki są Twoim wrogiem, ponieważ sprawiają, że pomiary są mniej precyzyjne. Po wykonaniu biopsji mięśni szkieletowych.

Napełnij komory respirometru pożywką niezawierającą magnezu i uszczelnij komorę inkubacyjną. Ustaw temperaturę inkubacji instrumentu na 38 stopni Celsjusza, aby przedstawić podstawową temperaturę mięśni szkieletowych koni. I ustaw mieszanie mediów oddechowych na 750 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego obracającego się na dnie komory respirometru.

Następnie wyłącz oświetlenie komory, aby uniknąć zakłóceń z czujnikami fluorescencyjnymi. Zasil elektrodę tlenową napięciem polaryzacyjnym 800 miliwoltów i wzmocnij uzyskany sygnał z ustawieniem wzmocnienia na jeden. Rejestruj stężenie tlenu co dwie sekundy i obliczaj strumień tlenu jako ujemne nachylenie pomiaru tlenu w ciągu kolejnych 40 sekund.

Następnie skalibruj sondę lambda, pozwalając mediom zrównoważyć się z powietrzem w pomieszczeniu. Obliczyć referencyjne ciśnienie parcjalne tlenu na podstawie ciśnienia atmosferycznego zmierzonego za pomocą respirometru o wysokiej rozdzielczości i standardowego stężenia tlenu w atmosferze. Użyj zielonych czujników fluorescencyjnych, aby określić ilościowo sygnał fluorescencyjny z komory oddechowej.

Zasil czujniki napięciem od 400 do 500 miliwoltów, a uzyskany sygnał zostanie wzmocniony ze wzmocnieniem od 1 do 1 000. Następnie dodaj TMRM do komory oddechowej przed dodaniem mitochondriów i skalibruj sygnał fluorescencyjny za pomocą prostej dwupunktowej kalibracji sygnału fluorescencyjnego w stosunku do ilości dodanego fluoroforu przed dodaniem mitochondriów. Przeprowadzić końcową kalibrację sygnału TMRM po zakończeniu protokołu miareczkowania respirometrycznego, dostarczając kilka miareczkowań środka rozprzęgającego, aż nie zaobserwuje się dalszego wzrostu sygnału fluorescencyjnego TMRM wskazującego na całkowite załamanie potencjału błony mitochondrialnej.

Użyj niebieskich czujników fluorescencyjnych do ilościowego określenia sygnału fluorescencyjnego z komory oddechowej i zasil te czujniki dla poszczególnych instrumentów, aby przechwycić oczekiwany sygnał w zakresie liniowym czujnika. Dodaj osiem mikrolitrów dwumilimolowego EDTA do komory oddechowej, aby chelatować kationy, które konkurowałyby z jonami magnezu o wiązanie z zielenią magnezową. Następnie dodaj cztery mikrolitry jednego milimolowego magnezu zielonego do komory oddechowej.

Skalibruj surowy sygnał fluorescencyjny za pomocą sekwencyjnych miareczkowania 100 milimolowego chlorku magnezu o wymiarach 10 na 2 mikrolitry, pozostawiając jedną minutę między miareczkowaniami na ustabilizowanie sygnału fluorescencyjnego. Określ szybkość syntezy ATTP, która jest nachyleniem stężenia ATP w czasie w całym protokole. Użyj zielonych czujników fluorescencyjnych, aby określić ilościowo sygnał fluorescencyjny z komory oddechowej.

Zasilaj czujniki napięciem od 300 do 400 miliwoltów. Uzyskany sygnał zostaje wzmocniony wzmocnieniem od 1 do 1 000. Zoptymalizuj określone ustawienia dla poszczególnych instrumentów, aby uchwycić oczekiwany sygnał w zakresie liniowym czujnika.

Przed dodaniem mitochondriów należy przeprowadzić konfigurację chemiczną i wstępną kalibrację testu Amplex UltraRed. Dodaj 30 mikromoli DTPA, aby chelatować kationy, które mogą zakłócać reakcję. Następnie dodać dysmutazę ponadtlenkową lub peroksydazę zębatą i Amplex UltraRed do komory respirometrycznej.

Poczekaj, aż sygnał fluorescencyjny się ustabilizuje. Następnie dwukrotnie dodaj 0,2 mikromola nadtlenku wodoru w odstępie pięciu minut. Wykonaj dodatkowe dwupunktowe kalibracje w trakcie trwania testu, aby umożliwić regulację reakcji testu, ponieważ skład chemiczny respirometrii zmienia się w trakcie trwania testu, z określonym czasem tych punktów kalibracji według uznania badacza.

Wirować próbkę, aby utrzymać jednolitą zawiesinę próbki i dodać 15 mikrolitrów izolowanej zawiesiny mitochondriów do każdej dwumililitrowej komory inkubacyjnej, tak aby wyniki reprezentowały wydajność mitochondriów 18,75 miligramów mięśni. Przed dodaniem jakichkolwiek substratów należy zmierzyć zużycie tlenu resztkowego i odjąć tę wartość od wartości zużycia tlenu na każdym etapie miareczkowania inhibitora odsprzężonego z substratem lub protokołu SUIT po zakończeniu. Użyj kombinezonu ogólnego przeznaczenia, który pozwala na wstępną charakterystykę funkcji mitochondriów mięśni szkieletowych koni.

Zacznij od sekwencyjnego miareczkowania pirogronianu, glutaminianu i jabłczanu do siebie w każdej komorze, aby wytworzyć dinukleotyd nikotynamidoadeninowy i stymulować oddychanie niefosforylujące wspierane przez NADH utleniony przez złożony wyciek na bazie jednego. Następnie dodaj ADP, aby stymulować oddychanie fosforylujące poprzez oddychanie fosforylujące kompleks jeden. Dodaj bursztynian, aby wytworzyć oddychanie fosforylujące, łącząc oddychanie fosforylujące kompleksu pierwszego i kompleksu dwa Dodaj rotenon, aby zablokować kompleks jeden.

Powstały strumień tlenu reprezentuje zdolność kompleksu drugiego do wspierania mitochondrialnego zużycia tlenu przez utlenianie samego bursztynianu. Pokazano ślad respirometryczny o wysokiej rozdzielczości oddychania mitochondrialnego mięśni szkieletowych koni i względnego potencjału błonowego. Wartości oddychania mitochondriów inkubowanych z TMRM są niższe ze względu na hamujące działanie tego fluoroforu.

Pokazano oddychanie mitochondrialne i syntezę ATTP mięśni szkieletowych koni zawierających wysoki procent bogatych w mitochondria włókien mięśni szkieletowych typu pierwszego i inkubowanych w warunkach zbliżonych do metabolizmu spoczynkowego. Przedstawiono ślad respirometryczny oddychania mitochondrialnego mięśni szkieletowych koni i produkcji nadtlenku wodoru. Respirometria o wysokiej rozdzielczości wymaga dużo cierpliwości.

Osoba przeprowadzająca test będzie miała wiele punktów czasowych, w których będzie musiała dokonać oceny dotyczącej tego, czy osiągnięto stan ustalony i czy może nastąpić następny krok. Zademonstrowaliśmy tylko jeden protokół miareczkowania. Istnieją dziesiątki innych protokołów, które można zastosować w ten sam sposób, aby odpowiedzieć na konkretne pytania dotyczące metabolizmu mitochondrialnego.