Name: Fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Poznaj fluororespirometrię wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni. Ta metoda pozwala mierzyć zużycie tlenu oraz produkcję ATP i reaktywnych form tlenu w celu analizy efektywności metabolicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za hojne wsparcie ze strony John and Debbie Oxley Endowed Chair for Equine Sports Medicine oraz Grayson Jockey Club Research Foundation.

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego w Oklahomie. W badaniu wykorzystano cztery wałachy pełnej krwi angielskiej (17,5 ± 1,3 roku, 593 ± 45 kg) w celu uzyskania reprezentatywnych wyników.
1. Pobieranie próbki z biopsji mięśni szkieletowych
<ol>
	<li>Uzyskaj biopsję mięśni szkieletowych (postępuj zgodnie z techniką sterylną) ze środka mięśnia półścięgnistego (lub innego mięśnia będącego przedmiotem zainteresowania), używając igły do biopsji 12 G University College Hospital (UCH) (patrz tabela materiałów) podczas lekkiej sedacji i używając znieczulenia miejscowego zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem11.</li>
	<li>Natychmiast przenieść próbki z biopsji do fiolek z lodowatym roztworem pożywki transportowej do biopsji (2,77 mM CaK2-EGTA, 7,23 mM K2-EGTA, 20 mM imidazolu, 20 mM tauryny, 50 mM K-MES, 0,5 mM ditiotreitolu, 6,56 mM MgCl2, 5,77 mM ATP i 15 mM fosfokreatyny, dostosowanej do pH 7,1; patrz tabela materiałów). Transport do laboratorium w celu analizy. 
	UWAGA: Zapoznaj się z Doerrier et al.15, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania podłoża transportowego do biopsji.</li>
	<li>Wyizoluj mitochondria z próbek biopsji za pomocą dostępnego w handlu zestawu, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów). Końcowy bufor do przechowywania nie powinien zawierać substratów, takich jak ADP, ATP i bursztynian, które są częścią testu respirometrycznego.</li>
	<li>Zawiesić końcową osadę izolowanych mitochondriów, używając 80 μl pożywki zawiesinowej (225 mM mannitolu, 75 mM sacharozy i 1 mM EGTA; patrz tabela materiałów) na 100 mg mięśnia użytego do izolacji mitochondriów.</li>
	<li>Należy zminimalizować odstęp czasu od momentu wykonania biopsji do izolacji mitochondriów i utrzymywać próbki w temperaturze 0-4 °C przez cały okres ich przetwarzania, aż do momentu dodania do respirometrów o wysokiej rozdzielczości. 
	UWAGA: Wstępne badania wykazały, że zawiesiny izolowanych mitochondriów zaczynają tracić zdolność funkcjonalną po około 2 godzinach, gdy są utrzymywane w temperaturze 0-4 °C.</li>
</ol>
2. Konfiguracja respirometru o wysokiej rozdzielczości
<ol>
	<li>Respirometry o wysokiej rozdzielczości służą do ilościowego określania oddychania mitochondrialnego i powiązanych procesów. Użyj oprogramowania sterującego dostarczonego przez producenta (patrz tabela materiałów), aby sterować respirometrem, kalibrować czujniki i zbierać surowe dane. Analizuj próbki w dwóch egzemplarzach dla każdego warunku testowego. 
	UWAGA: We wszystkich przypadkach zalecane miareczkowanie i końcowe stężenia odczynników opisane w niniejszym protokole opierają się na komorze respirometrycznej o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Strumień tłaO2 i punkt zerowy czujnikaO2 należy oznaczać co 2-4 tygodnie poprzez szeregowe miareczkowanie ditionititu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Należy zachować te stałe kalibracji dla kolejnych testów, aż do powtórzenia kalibracji. 
	UWAGA: W przeciwieństwie do wcześniej opublikowanych procedur wykorzystujących przepuszczalne włókna mięśniowe11,12,13,16, w których hiperoksja (250-500 μM) jest konieczna, aby uniknąć ograniczenia dyfuzji O2 do mitochondriów, izolowane mitochondria można ocenić przy użyciu zakresu 50-200 μM O2. Można to osiągnąć po prostu poprzez umożliwienie zrównoważenia mediów oddechowych z powietrzem w pomieszczeniu przed dodaniem zawiesiny mitochondrialnej (tj. po codziennej kalibracji jednopunktowej). Podobnie, ponowne natlenienie komory oddechowej można osiągnąć, po prostu otwierając komorę, aż wystarczająca ilość tlenu z otoczenia rozpuści się w mediach respirometrycznych, aby podnieść stężenie tlenu do pożądanego poziomu.</li>
	<li>Napełnić komory respirometru pożywką bezmagnezową (0,5 mM EGTA, 60 mM K-laktobionianu, 20 mM tauryny, 10 mM KH2PO4, 20 mM HEPES, 110 mM sacharozy i 1 g/l albuminy surowicy bydlęcej [BSA] zasadniczo wolnej od kwasów tłuszczowych, dostosowanej do pH 7,1; patrz Tabela Materiałów). 
	UWAGA: Zapoznaj się z Komlodi et al.17, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania podłoża oddechowego.
	<ol>
		<li>Ustawić temperaturę inkubacji instrumentu na 38 °C, aby odzwierciedlić temperaturę podstawową mięśni szkieletowych koni, a następnie ustawić mieszanie pożywki oddechowej na 800 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego obracającego się na dnie komory respirometru.</li>
		<li>Wyłącz oświetlenie komory, aby uniknąć zakłóceń z czujnikami fluorescencyjnymi.</li>
		<li>Zasil elektrodę tlenową napięciem polaryzacyjnym 800 mV i wzmocnij uzyskany sygnał z ustawieniem wzmocnienia 1.</li>
		<li>Rejestruj stężenie tlenu co 2 s, oblicz strumień tlenu jako ujemne nachylenie pomiaru tlenu w ciągu ostatnich 40 s (20 punktów danych) i podaj jako pmol x s-1 x ml roztworu do inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skalibruj sondę lambda, pozwalając mediom zrównoważyć się z powietrzem w pomieszczeniu. Obliczyć referencyjne ciśnienie parcjalne tlenu na podstawie ciśnienia atmosferycznego zmierzonego za pomocą respirometru o wysokiej rozdzielczości i standardowego stężenia tlenu w atmosferze.</li>
</ol>
3. Pomiar potencjału błony mitochondrialnej za pomocą TMRM
<ol>
	<li>Użyj "zielonych" czujników fluorescencyjnych (dominująca długość fali 530 nm), aby określić ilościowo sygnał fluorescencyjny z komory oddechowej. Zasilaj czujniki napięciem 400-500 mV; Uzyskany sygnał jest wzmacniany wzmocnieniem 1:1 000, 
	UWAGA: Określone ustawienia muszą być zoptymalizowane dla poszczególnych instrumentów, aby uchwycić oczekiwany sygnał w zakresie liniowym czujnika.</li>
	<li>Dodać TMRM (4 μl z 1 mM roztworu dla końcowego stężenia 2 μM; patrz tabela materiałów) przed dodaniem mitochondriów.</li>
	<li>Skalibruj sygnał fluorescencyjny za pomocą prostej dwupunktowej kalibracji sygnału fluorescencyjnego (napięcia) w funkcji ilości dodanego fluoroforu (mM), przed dodaniem mitochondriów. 
	UWAGA: Użyj funkcji kalibracji sygnału fluorescencyjnego w oprogramowaniu sterującym maszyną, aby skalibrować ten sygnał. Surowy sygnał z sondy fluorescencyjnej może wymagać 30 minut lub więcej na ustabilizowanie się w celu zarejestrowania drugiego punktu kalibracji.</li>
	<li>Przeprowadzić końcową kalibrację sygnału TMRM po zakończeniu protokołu miareczkowania respirometrycznego, dostarczając kilka miareczkowań czynnika rozprzęgającego (cyjanek karbonylu m-chlorofenylohydrazon; 2 μl na miareczkowanie), aż nie zaobserwuje się dalszego wzrostu sygnału fluorescencyjnego TMRM, co wskazuje na całkowite załamanie potencjału błony mitochondrialnej (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1). 
UWAGA: Ta wartość sygnału fluorescencyjnego jest uważana za równą potencjałowi transbłonowemu 0 mV i służy jako punkt odniesienia dla względnych wartości potencjału błonowego zarejestrowanych podczas protokołu miareczkowania respirometrycznego.</li>
</ol>
4. Pomiar produkcji ATP za pomocą zieleni magnezowej (MgG)
<ol>
	<li>Użyj "niebieskich" czujników fluorescencyjnych (dominująca długość fali 465 nm), aby określić ilościowo sygnał fluorescencyjny z komory oddechowej. Zasil te czujniki dla poszczególnych instrumentów, aby przechwycić oczekiwany sygnał w zakresie liniowym czujnika.</li>
	<li>Wykonaj konfigurację chemiczną i kalibrację sygnału fluorescencyjnego MgG po dodaniu mitochondriów, ale przed dodaniem jakichkolwiek substratów. Dodać 8 μl 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do komory respirometrycznej w celu chelatowania kationów (w szczególności Ca2+), które konkurowałyby z Mg2+ o wiązanie z MgG, a następnie dodać 4 μl 1 mM MgG (1,1 μM) do komory oddechowej.</li>
	<li>Skalibruj surowy sygnał fluorescencji za pomocą sekwencyjnych miareczkowania 10 x 2 μl 100 mM MgCl2, pozostawiając 1 minutę między miareczkowaniami w celu ustabilizowania sygnału fluorescencyjnego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). 
	UWAGA: Proces ten, który jest zakończony w trybie offline po zakończeniu testu i przy użyciu szablonów dostarczonych przez producenta maszyny i powiązanego oprogramowania, wytwarza krzywą drugiego rzędu stężenia magnezu do sygnału fluorescencyjnego (oczekiwana r2 > 0,98), która zostanie użyta ze znaną ilością ADP dodaną do komory respirometrycznej i wcześniej ustalonymi wartościami Kd w celu określenia odpowiedniego stężenia ATP11.</li>
<li>Określ szybkość syntezy ATP, która jest nachyleniem stężenia ATP w czasie w całym protokole (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
</ol>
5. Pomiar produkcji mitochondrialnej ROS za pomocą Amplex UltraRed (AmR)
<ol>
	<li>Użyj "zielonych" czujników fluorescencyjnych (dominująca długość fali 530 nm), aby określić ilościowo sygnał fluorescencyjny z komory oddechowej. Zasilaj czujniki napięciem 300-400 mV; Uzyskany sygnał jest wzmacniany ze wzmocnieniem 1:1,000. Zoptymalizuj określone ustawienia dla poszczególnych instrumentów, aby uchwycić oczekiwany sygnał w zakresie liniowym czujnika. 
	UWAGA: W przypadku stosowania pożywek oddechowych bez MgCl2 należy go dodać (20-60 μL ze 100 mM MgCl2 w celu uzyskania 1-3 μM MgCl2) przed dodaniem odczynników do testu AmR.</li>
	<li>Wykonaj konfigurację chemiczną i wstępną kalibrację testu AmR przed dodaniem mitochondriów. Dodać 30 μmoli DTPA (6 μl 5 mM roztworu) do chelatowanych kationów, które mogą zakłócać reakcję, następnie dodać dysmutazę ponadtlenkową (2 μl roztworu podstawowego o stężeniu 5 000 U/ml w celu przekształcenia anionów ponadtlenkowych wH2O2w celu bardziej kompleksowego wykrywania wytwarzania reaktywnego tlenu), peroksydazę chrzanową (5 μl roztworu podstawowego o stężeniu 500 U/ml), i Amplex UltraRed (2 μl 10 mM roztworu podstawowego) (patrz tabela materiałów) w celu wytworzenia odpowiednio 5 U/mL, 1 U/ml i 10 μM w komorze respirometrycznej.</li>
	<li>Poczekaj, aż sygnał fluorescencyjny się ustabilizuje, a następnie dodaj 0,2 μmola nadtlenku wodoru (5 μl 40 μM roztworu świeżego dziennie) dwa razy, w odstępie około 5 minut. 
	UWAGA: Sygnał fluorescencyjny przed i po dwóch miareczkowaniachH2O2zapewnia trzypunktową liniową krzywą kalibracyjną systemu (oczekiwana r2 > 0,95), której nachylenie odzwierciedla ogólną reakcję systemu w raportowaniu związku między sygnałem fluorescencyjnym a produkcją (lub dodawaniem)H2O2. Użyj funkcji kalibracji sygnału fluorescencyjnego w oprogramowaniu sterującym maszyny, aby skalibrować ten sygnał.</li>
	<li>Wykonaj dodatkowe kalibracje dwupunktowe (5 μl roztworu 40 μM codziennie świeżego) przez cały czas trwania testu, aby umożliwić dostosowanie reakcji testu w miarę zmian chemicznych respirometrii w trakcie trwania testu, z konkretnym czasem tych punktów kalibracji według uznania badacza (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4).</li>
</ol>
6. Pomiar oddychania mitochondrialnego
<ol>
	<li>Dodać 15 μl izolowanej zawiesiny mitochondriów (krok 1.4) do każdej 2 ml komory inkubacyjnej, tak aby wyniki reprezentowały wydajność mitochondrialną 18,75 mg mięśni. Uszczelnić komorę inkubacyjną. Wstrząsać próbkę między każdym miareczkowaniem, aby utrzymać równomierną zawiesinę próbki.</li>
	<li>Zmierz zużycie tlenu resztkowego (ROX) przed dodaniem jakichkolwiek substratów. Odejmij tę wartość (zwykle mniejszą niż 0,2 pmol O2 x s-1 x mL-1) od wartości zużycia tlenu dla każdego kroku w protokole miareczkowania substratu/rozprzęgacza/inhibitora (SUIT)11 po zakończeniu protokołu. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby sygnały zarówno z sondy lambda, jak i czujnika fluorescencji mogły ustabilizować się przez co najmniej 1 minutę (zgodnie ze stabilnym obliczonym nachyleniem sygnałów czujnika pierwotnego), ponieważ ogólny stan oddychania jest zmieniany przez miareczkowanie w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Dotyczy to wszystkich etapów miareczkowania.</li>
	<li>Użyj kombinezonu ogólnego przeznaczenia, który pozwala na wstępną charakterystykę funkcji mitochondriów mięśni szkieletowych koni. Rozpocząć od sekwencyjnego miareczkowania pirogronianu (5 μl 2 M roztworu wodnego), glutaminianu (10 μl 2 M roztworu wodnego) i jabłczanu (10 μl 0,4 M roztworu wodnego) (patrz tabela materiałów) do każdej komory w celu wytworzenia dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADH) i pobudzenia oddychania niefosforylującego (nieszczelnego) wspieranego przez NADH utleniony przez kompleks I (LN) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, <silna klasa="xfig">Rysunek 3 i <silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Dodać ADP (20 μl 500 mM roztworu wodnego; patrz tabela materiałów) w celu pobudzenia oddychania fosforylującego przez kompleks I (PN).</li>
	<li>Dodać bursztynian (20 μl 1 M roztworu wodnego; patrz tabela materiałów) w celu wytworzenia oddychania fosforylującego poprzez połączenie kompleksu I i kompleksu II (P,N+S). 
	UWAGA: Przy połączeniu oddychania zarówno przez Kompleks I, jak i Kompleks II, zużycie tlenu może być wystarczająco wysokie, aby zużyć większość tlenu rozpuszczonego w pożywce inkubacyjnej. Jeśli stężenieO2 spadnie poniżej 50 μM, należy ponownie natlenić pożywkę inkubacyjną, rozszczelniając komorę inkubacyjną, aż zmierzone stężenieO2 wzrośnie powyżej 150 μM. Powtórz ten krok w razie potrzeby, aby utrzymać wystarczającą ilośćO2 do oddychania mitochondrialnego.</li>
	<li>Dodać rotenon (2 μl 0,1 mM roztworu etanolu; patrz tabela materiałów) do bloku kompleksu I. Powstały strumień tlenu reprezentuje zdolność kompleksu II do wspierania mitochondrialnego zużycia tlenu poprzez utlenianie samego bursztynianu (P S). 
	UWAGA: Rotenon jest substancją trującą. Stosuj standardowe zabezpieczenia laboratoryjne i unikaj połknięcia lub wdychania.</li>
	<li>Obliczyć średnią wartość dla danego warunku doświadczalnego dla poszczególnych komór respirometrycznych zawierających podwielokrotności pojedynczej biopsji. 
	UWAGA: Obliczenia pochodne, takie jak współczynniki kontroli strumienia (FCR), są cenne w identyfikacji względnych zmian w różnych ścieżkach i obejmująwyciek FCR (LN/PN), FCRN (PN/PN+S) i FCRS (PS/PN+S). Obliczona wydajność fosforylacji oksydacyjnej (1-LN/PN+S) pozwala oszacować ogólny wpływ oddychania nieszczelnego dostosowanego do całkowitej wydolności oddechowej.</li>
</ol>

<ol><li>Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+in+muscle+approaching+maximal+rates+of+oxygen+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+and+Science+in+Sports+and+Exercise%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism in muscle approaching maximal rates of oxygen utilization.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 27 (1), 54-59 (1995).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGnaiger%2C+E+%22Mitochondrial+Pathways+and+Respiratory+Control.+An+Introduction+to+OXPHOS+Analysis.+4th+edn%22">Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th edn</a>. , Oroboros MiPNet Publications. Innsbruck. (2014).</li>
<li>Ehrenberg, B., Montana, V., Wei, M. D., Wuskell, J. P., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+potential+can+be+determined+in+individual+cells+from+the+nernstian+distribution+of+cationic+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane potential can be determined in individual cells from the nernstian distribution of cationic dyes.</a> Biophysical Journal. 53 (5), 785-794 (1988).</li>
<li>Chinopoulos, C., Kiss, G., Kawamata, H., Starkov, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+ADP-ATP+exchange+in+relation+to+mitochondrial+transmembrane+potential+and+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Measurement of ADP-ATP exchange in relation to mitochondrial transmembrane potential and oxygen consumption.</a> Methods in Enzymology. 542, 333-348 (2014).</li>
<li>Krumschnabel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+measurement+of+mitochondrial+respiration+and+hydrogen+peroxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution measurement of mitochondrial respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 245-261 (2015).</li>
<li>Lemieux, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function+is+altered+in+horse+atypical+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function is altered in horse atypical myopathy.</a> Mitochondrion. 30, 35-41 (2016).</li>
<li>Houben, R., Leleu, C., Fraipont, A., Serteyn, D., Votion, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+muscle+mitochondrial+respiratory+capacity+in+Standardbred+racehorses+as+an+aid+to+predicting+exertional+rhabdomyolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Determination of muscle mitochondrial respiratory capacity in Standardbred racehorses as an aid to predicting exertional rhabdomyolysis.</a> Mitochondrion. 24, 99-104 (2015).</li>
<li>Votion, D. M., Gnaiger, E., Lemieux, H., Mouithys-Mickalad, A., Serteyn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+fitness+and+mitochondrial+respiratory+capacity+in+horse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Physical fitness and mitochondrial respiratory capacity in horse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (4), 34890(2012).</li>
<li>Votion, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+mitochondrial+respiratory+function+in+response+to+endurance+training+and+endurance+racing%5BTitle%5D)+AND+%22Equine+Veterinary+Journal+Supplement%22%5BJournal%5D)">Alterations in mitochondrial respiratory function in response to endurance training and endurance racing.</a> Equine Veterinary Journal Supplement. (38), 268-274 (2010).</li>
<li>Tosi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+capacity+in+horses+suffering+from+polysaccharide+storage+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Altered mitochondrial oxidative phosphorylation capacity in horses suffering from polysaccharide storage myopathy.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 50 (5), 379-390 (2018).</li>
<li>Davis, M. S., Fulton, M. R., Popken, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+hyperthermia+and+acidosis+on+equine+skeletal+muscle+mitochondrial+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Exercise+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of hyperthermia and acidosis on equine skeletal muscle mitochondrial oxygen consumption.</a> Comparative Exercise Physiology. 17 (2), 171-179 (2021).</li>
<li>Latham, C. M., Fenger, C. K., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAPID+COMMUNICATION%3A+Differential+skeletal+muscle+mitochondrial+characteristics+of+weanling+racing-bred+horses1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">RAPID COMMUNICATION: Differential skeletal muscle mitochondrial characteristics of weanling racing-bred horses1.</a> Journal of Animal Science. , (2019).</li>
<li>White, S. H., Warren, L. K., Li, C., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submaximal+exercise+training+improves+mitochondrial+efficiency+in+the+gluteus+medius+but+not+in+the+triceps+brachii+of+young+equine+athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Submaximal exercise training improves mitochondrial efficiency in the gluteus medius but not in the triceps brachii of young equine athletes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 14389(2017).</li>
<li>White, S. H., Wohlgemuth, S., Li, C., Warren, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+communication%3A+Dietary+selenium+improves+skeletal+muscle+mitochondrial+biogenesis+in+young+equine+athletes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Rapid communication: Dietary selenium improves skeletal muscle mitochondrial biogenesis in young equine athletes.</a> Journal of Animal Science. 95 (9), 4078-4084 (2017).</li>
<li>Doerrier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+FluoRespirometry+and+OXPHOS+protocols+for+human+cells%2C+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+muscle%2C+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution FluoRespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 31-70 (2018).</li>
<li>Li, C., White, S. H., Warren, L. K., Wohlgemuth, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+on+mitochondrial+function+in+skeletal+muscle+of+American+American+Quarter+Horses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of aging on mitochondrial function in skeletal muscle of American American Quarter Horses.</a> Journal of Applied Physiology. 121 (1), 299-311 (2016).</li>
<li>Komlodi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mitochondrial+incubation+media+for+measurement+of+respiration+and+hydrogen+peroxide+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production.</a> Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioenergetic+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial physiology.</a> Bioenergetic Communications. , (2020).</li>
<li>Li Puma, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+oxygen+concentration+influences+rates+of+mitochondrial+hydrogen+peroxide+release+from+cardiac+and+skeletal+muscle+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Regulatory%2C+Integrated%2C+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Experimental oxygen concentration influences rates of mitochondrial hydrogen peroxide release from cardiac and skeletal muscle preparations.</a> American Journal of Physiology: Regulatory, Integrated, and Comparative Physiology. 318 (5), 972-980 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów związanym z tym manuskryptem.

Dodanie sygnałów fluorescencyjnych do standardowego wyjścia respirometru o wysokiej rozdzielczości dostarcza cennych informacji na temat fizjologii mitochondriów, ale skrupulatna kalibracja sygnału fluorescencyjnego ma kluczowe znaczenie dla jakości danych. Pierwotne protokoły stosowania MgG sugerują, że krzywe kalibracyjne wygenerowane podczas obliczania stałych dysocjacji magnez-adenylan mogą być stosowane do kolejnych testów4; jednak sygnał fluorescencyjny z MgG może nie być wystarczająco odtwa...

Mitochondria komórek eukariotycznych wytwarzają większość ATP wykorzystywanego przez komórki do pracy i konserwacji1. Kluczowym etapem w mitochondrialnej produkcji ATP jest konwersja tlenu do wody, a zatem zdolność metaboliczna mitochondriów i związanych z nimi komórek jest często określana ilościowo poprzez pomiar zużycia tlenu2. Jednak fizjologia mitochondriów jest bardziej złożona niż prosty proces zużycia tlenu, a poleganie wyłącznie na tym punkcie końcowym zapewnia niepełną ocenę wpływu funkcji i dysfunkcji mitochondriów na zdrowie komórek. Pełna charakterystyka funkcji mitochondriów wymaga oceny nie tylko zużycia tlenu, ale także produkcji ATP, a także reaktywnych form tlenu (ROS).
Dodatkowe pomiary kluczowych funkcji mitochondriów mogą być realizowane równolegle z pomiarem oddychania za pomocą określonych fluoroforów. Metylester metylowy tetrametylorodaminy (TMRM) jest kationowym fluoroforem, który gromadzi się w macierzy mitochondrialnej proporcjonalnie do mitochondrialnego potencjału napięcia transbłonowego, powodując spadek intensywności fluorescencji z powodu tej akumulacji3. TMRM może być używany jako wskaźnik względnych zmian potencjału błony mitochondrialnej lub może być używany do ilościowego określania precyzyjnych zmian napięcia transbłonowego z dodatkowymi eksperymentami w celu określenia stałych, które umożliwiają konwersję sygnału fluorescencyjnego na mV. Zieleń magnezowa (MgG) jest fluoroforem, który fluoryzuje po związaniu z Mg2+ i jest używany do pomiarów syntezy ATP w oparciu o zróżnicowane powinowactwo ADP i ATP do dwuwartościowego kationu magnezu 4. Badacze muszą określić specyficzne stałe powinowactwa/dysocjacji (Kd) zarówno dla ADP, jak i ATP w określonych warunkach analitycznych, aby przekształcić zmiany fluorescencji MgG na zmianę stężenia ATP. Amplex UltraRed (AmR) to fluorofor używany do pomiaru produkcji nadtlenku wodoru i innych ROS podczas oddychania mitochondrialnego5. W wyniku reakcji międzyH2O2a AmR (katalizowaną przez peroksydazę chrzanową) powstaje rezorufina, którą można wykryć przez fluorescencję przy 530 nM. Każdy z tych testów można dodać indywidualnie do testów oddychania mitochondrialnego w czasie rzeczywistym, aby zapewnić jednoczesne pomiary odpowiednich aspektów fizjologii mitochondriów, zapewniając w ten sposób bezpośrednie powiązanie między oddychaniem a wydajnością mitochondriów.
Konie są zdolne do bardzo wysokiego zużycia tlenu dla danej masy, częściowo ze względu na bardzo wysoką zawartość mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni, co czyni tę tkankę bardzo istotną do badania fizjologii mitochondriów. Wraz z rozwojem respirometrii o wysokiej rozdzielczości, badania wykorzystujące tę nowatorską technologię pomogły określić wkład mitochondriów mięśni szkieletowych koni zarówno w niezwykłą zdolność wysiłkową koni, jak i patofizjologię chorób mięśni szkieletowych6,7,8,9,10,11,12,13,14. Badania funkcji mitochondriów mięśni szkieletowych koni są szczególnie korzystne, ponieważ pozyskiwanie dużych ilości tej tkanki jest nieuleczalne. W ten sposób zwierzęta konne mogą nie tylko dostarczyć wystarczającą ilość tkanki do pełnej charakterystyki funkcji mitochondriów, ale także służyć jako podłużne kontrole dla wysokiej jakości, mechanistycznych badań nad fizjologią mitochondriów. Z tego powodu opracowano dodatkowe testy w celu ilościowego określenia potencjału błony mitochondrialnej, syntezy ATP i produkcji ROS, które uzupełniają pomiar zużycia tlenu w tej tkance, w celu zapewnienia bardziej solidnej charakterystyki fizjologii mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Life Technologies</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Węglan wapnia</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>DatLab 7.0</td><td>Oroboros Inc</td><td></td><td>Oprogramowanie do obsługi fluororespirometru O2K</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>DTPA</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>D1133</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>H7523</td><td></td></tr><tr><td>Peroksydaza chrzanowa</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P8250</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>516813</td><td>Musi być świeży codziennie przed badaniem</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich ( MilliporeSigma)</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K-MES</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Zieleń magnezowa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M3733</td><td></td></tr><tr><td>Jabłczan</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich ( MilliporeSigma)</td><td>M9647</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji mitochondriów</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>MITOISO1</td><td></td></tr><tr><td>O2K fluororespirometr</td><td>Oroboros Inc</td><td></td><td>Wiele jednostek wymaganych do jednoczesnego wykonywania pełnego spektrum testów.</td></tr><tr><td>Fosfokreatyna</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Laktobionian potasu</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>L2398</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>P2256</td><td>Musi być świeży codziennie przed oznaczeniem</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynian</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Dysmutaza ponadtlenkowa</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>S8160</td><td></td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Pompa do miareczkowania</td><td>Oroboros Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki do miareczkowania</td><td>Oroboros Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Sigma-Aldrich (MilliporeSigma)</td><td>T5428</td><td></td></tr><tr><td>Igła do biopsji UCH</td><td>Millenium Surgical Corp</td><td>72-238067</td><td>Dostępne w różnych rozmiarach</td></tr></tbody></table>

fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości

High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

Funkcja mitochondriów - fosforylacja oksydacyjna i generowanie reaktywnych form tlenu - jest kluczowa zarówno dla zdrowia, jak i choroby. Dlatego pomiar funkcji mitochondriów ma fundamentalne znaczenie w badaniach biomedycznych. Mięśnie szkieletowe są solidnym źródłem mitochondriów, szczególnie u zwierząt o bardzo wysokiej wydolności tlenowej, takich jak konie, co czyni je idealnymi obiektami do badania fizjologii mitochondriów. W artykule przedstawiono zastosowanie respirometrii o wysokiej rozdzielczości z jednoczesną fluorometrią, ze świeżo zebranymi mitochondriami mięśni szkieletowych, w celu ilościowego określenia zdolności do utleniania substratów w różnych stanach mitochondrialnych i określenia względnych zdolności różnych elementów oddychania mitochondrialnego. Ester metylowy tetrametylorodaminy stosuje się do wykazania wytwarzania potencjału błony mitochondrialnej wynikającego z utleniania substratu, w tym do obliczenia względnej wydajności mitochondriów poprzez obliczenie względnego potencjału błonowego generowanego na jednostkę jednoczesnego strumienia tlenu. Konwersja ADP do ATP powoduje zmianę stężenia magnezu w komorze reakcyjnej, ze względu na różne powinowactwo adenylanów do magnezu. Dlatego zieleń magnezowa może być używana do pomiaru szybkości syntezy ATP, co pozwala na dalsze obliczanie wydajności fosforylacji oksydacyjnej (stosunek fosforylacji do utleniania [P/O]). Wreszcie, zastosowanie Amplex UltraRed, który w połączeniu z nadtlenkiem wodoru wytwarza produkt fluorescencyjny (rezorufinę), pozwala na ilościowe określenie produkcji reaktywnych form tlenu podczas oddychania mitochondrialnego, a także związku między produkcją ROS a równoczesnym oddychaniem. Techniki te pozwalają na solidną kwantyfikację fizjologii mitochondriów w wielu różnych symulowanych warunkach, rzucając w ten sposób światło na wkład tego krytycznego składnika komórkowego zarówno w zdrowie, jak i chorobę.

Zaproponowany stan referencyjny to zdrowy, prowadzący siedzący tryb życia koń rasy Thoroughbred (bez zwiększonej sprawności wynikającej z obowiązkowych ćwiczeń), a próbka świeżego mięśnia pobrana z centrum mięśnia posturalnego, zawierająca wysoki odsetek bogatych w mitochondria włókien mięśni szkieletowych typu I i inkubowana w warunkach zbliżonych do metabolizmu spoczynkowego (tj. 38 °C i pH 7.0). W tych warunkach badacz może spodziewać się wartości LN wynoszących 2,71 ± 0,90, wartości PN równych 6...

Konie mają wyjątkową zdolność do ćwiczeń aerobowych, co sprawia, że mięśnie szkieletowe koni są ważną tkanką zarówno do badania fizjologii ćwiczeń koni, jak i fizjologii mitochondriów ssaków. W artykule opisano techniki kompleksowej oceny funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni.

Fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

Protokoły te pozwalają badaczom wyjść poza zwykły pomiar zużycia tlenu w mitochondriach, a zamiast tego pozwalają na pomiar kluczowych mitochondrialnych produktów końcowych, ATP i reaktywnych form tlenu. Główną zaletą tej techniki jest to, że badacz może zmierzyć wydajność mitochondriów, bezpośrednio porównując tempo zużycia tlenu z tempem produkcji produktu końcowego. Czy produktem końcowym jest ATP czy tlen reaktywny.Techniki te wymagają bardzo starannej dbałości o szczegóły, szczególnie w unikaniu pęcherzyków. Niezależnie od tego, czy znajdują się w komorze oddechowej, czy w strzykawkach do miareczkowania, pęcherzyki są Twoim wrogiem, ponieważ sprawiają, że pomiary są mniej precyzyjne. Po wykonaniu biopsji mięśni szkieletowych.Napełnij komory respirometru pożywką niezawierającą magnezu i uszczelnij komorę inkubacyjną. Ustaw temperaturę inkubacji instrumentu na 38 stopni Celsjusza, aby przedstawić podstawową temperaturę mięśni szkieletowych koni. I ustaw mieszanie mediów oddechowych na 750 obr./min za pomocą mieszadła magnetycznego obracającego się na dnie komory respirometru.Następnie wyłącz oświetlenie komory, aby uniknąć zakłóceń z czujnikami fluorescencyjnymi. Zasil elektrodę

high-resolution-fluoro-respirometry-of-equine-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Tutaj próbka mięśnia czworogłowego jest pobierana od znieczulonej świni, a mitochondria są izolowane przez wirowanie różnicowe. Następnie określa się częstość oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego I, II i IV za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Izolacja nienaruszonych mitochondriów od mięśni szkieletowych za pomocą wirowania różnicowego w celu pomiarów respirometrycznych o wysokiej rozdzielczości

Ten protokół przedstawia zbiór sarkomerów, wapnia i makroskopowych danych geometrycznych z aktywnie kurczącego się trabecula serca ex vivo. Te równoczesne pomiary są możliwe dzięki integracji trzech modalności obrazowania.

Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

Ocena fosforylacji oksydacyjnej za pomocą respirometrów o wysokiej rozdzielczości stała się integralną częścią analizy funkcjonalnej mitochondriów i metabolizmu energii komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokoły analizy metabolizmu energii komórkowej za pomocą respirometrów komorowych i mikropłytkowych o wysokiej rozdzielczości oraz omawiamy kluczowe zalety każdego urządzenia.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce to metoda badania ruchów domen białek w czasie rzeczywistym. Modyfikacja tej techniki pod kątem jej zastosowania w komórkach natywnych umożliwia teraz wykrywanie i śledzenie ruchów pojedynczego czujnika napięcia z bramkowanych napięciem kanałów Ca2+ w mysich izolowanych włóknach mięśni szkieletowych.

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Poznaj fluororespirometrię wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w mięśniach szkieletowych koni. Ta metoda pozwala mierzyć zużycie tlenu oraz produkcję ATP i reaktywnych form tlenu w celu analizy efektywności metabolicznej.

Fluororespirometria mięśni szkieletowych koni w wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów