Charakterystyka gojenia się ran nabłonkowych in vivo przy użyciu parzydełkowego organizmu modelowego Clytia hemisphaerica

Protokół ten umożliwia wizualizację komórek nabłonkowych podczas gojenia się ran u żywych zwierząt. Pozwala nam zobaczyć, jak komórki zachowują się w swoim naturalnym, złożonym środowisku. Technika ta wprowadza odczynniki do macierzy zewnątrzkomórkowej i cytoplazmy komórki w celu zbadania wpływu tych odczynników na rozprzestrzenianie się i migrację komórek podczas gojenia się ran u żywych zwierząt.

Gojenie się ran nabłonkowych i Clytia niezwykle przypomina gojenie się u bardziej złożonych zwierząt. Dlatego z tego systemu możemy się wiele dowiedzieć o mechanizmach gojenia się ran i o tym, jak one powstały. Procedury te zademonstrują Elizabeth Lee i technik badawczy Emily Watto.

Aby rozpocząć proces nawijania, przygotuj zmodyfikowaną pipetę transferową, przecinając końcówkę pipety nożyczkami, tworząc powiększony otwór o średnicy około 0,5 do 0,7 centymetra. Za pomocą zmodyfikowanej pipety transferowej umieść meduzę pobraną z ustalonych kolonii polipów na szkiełku depresyjnym, z parasolem meduzy X skierowanym do góry. Upewnij się, że zwierzę pokryte jest tylko wystarczającą ilością sztucznej wody morskiej lub ASW.

Aby utworzyć mikrorany wewnątrz i między komórkami, umieść szkiełko nakrywkowe na zwierzęciu. Szkiełko nakrywkowe uciska mezogleę, a odbicie ściśniętej tkanki lekko rozsuwa komórki. Wyobraź sobie zwierzę natychmiast, aby obserwować powstałe mikrorany.

Aby utworzyć małe rany nabłonkowe, umieść meduzę na szkiełku depresyjnym z parasolem medusa X skierowanym do góry, używając zmodyfikowanej pipety transferowej, jak pokazano wcześniej. Za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów delikatnie porysuj powierzchnię meduzy. Delikatne zadrapania mogą spowodować pęknięcia w błonie podstawnej.

Przykryj zwierzę szkiełkiem nakrywkowym do obrazowania. Umieszczenie szkiełka nakrywkowego jest czasami wystarczające, aby utworzyć małe rany nabłonkowe nawet bez drapania. Przygotuj igłę do mikroiniekcji, używając mikropipety i szklanej rurki kapilarnej, postępując zgodnie z krokami opisanymi w tekście.

Umieść pustą igłę do mikroiniekcji w uchwycie do mikroiniekcji przymocowanym do mikromanipulatora i odetnij końcówkę igły tak, aby otwór wynosił około 20 do 40 mikronów. Ustaw ciśnienie trzymania na mikrowtryskiwaczu na zero, a ciśnienie wyrzutu na około 20 funtów na cal kwadratowy. Ustaw mikrowtryskiwacz tak, aby dostarczał dwusekundowy impuls powietrza.

Aby utworzyć duże rany nabłonkowe, umieść meduzę na szkiełku depresyjnym, jak pokazano wcześniej. Za pomocą mikromanipulatora wyreguluj końcówkę igły do mikroiniekcji tak, aby pozostawała tuż nad wodą, ostrożnie zanurzając końcówkę w wodzie, a następnie chowając ją tak, aby znajdowała się blisko powierzchni nabłonka meduzy. Pulsuj powietrzem, naciskając start na wtryskiwaczu.

Powtórz impuls w tym samym miejscu dwa do czterech razy, w zależności od szerokości końcówki. Większe końcówki wymagają mniej impulsów. Przykryj ranne zwierzę szkiełkiem nakrywkowym do obrazowania dużych ran.

Dostosuj ostrość do parasola x. Sześciokątne komórki powinny być czyste. Ręcznie zidentyfikuj ranę, aby ją zobrazować.

Uruchom program, który zbiera obrazy w postaci filmu w czasie rzeczywistym lub taki, który zbiera serię obrazów w regularnych odstępach czasu. Monitoruj postępy, aby upewnić się, że obszar rany nie znika z pola widzenia, a komórki będące przedmiotem zainteresowania pozostają ostre. Do wstrzykiwania barwników i leków należy wykonać igłę do mikroiniekcji, postępując zgodnie z krokami opisanymi w tekście.

Wypełnić igłę do mikroiniekcji za pomocą długiej końcówki pipety nadmiarem barwnika lub leku do wstrzykiwań do meduzy. Używając zmodyfikowanej pipety do przenoszenia, umieść meduzę z parasolem pomocniczym skierowanym do góry w naczyniu do wstrzykiwań z polidimetylosiloksanu lub PDMS, z wystarczającą ilością ASW, aby przykryć zwierzę. Umieść naczynie na stoliku mikroskopu preparacyjnego.

Skoncentruj się na końcówce igły do mikroiniekcji i wsuń ją do wody w pobliżu meduzy. Za pomocą mikromanipulatora wciśnij igłę w naczynie, aż się wygnie i złamie. Tworzenie otworu końcówki o wielkości około 10 do 20 mikronów.

Za pomocą mikromanipulatora włóż końcówkę igły przez parasol pomocniczy do mezoglei bez nakłuwania parasola X. Na mikrowtryskiwaczu ustaw ciśnienie trzymania na zero, a ciśnienie wtrysku poniżej lub równe 20 funtów na cal kwadratowy. Wstrzyknąć do jednego lub dwóch kwadrantów, wypełniając każdy z nich plamką barwnika lub leku mniej więcej jedną czwartą powierzchni tego kwadrantu.

W zależności od tego, jaki barwnik lub lek jest wstrzykiwany, zwierzęta umieszcza się w zlewce ze świeżym ASW, aby umożliwić dyfuzję i inkubację barwnika lub leku. W celu obrazowania zamontuj meduzę na szkiełku depresyjnym za pomocą zmodyfikowanej pipety transferowej, ustawiając zwierzę z parasolem X skierowanym do góry. Na tym etapie zwierzęta mogą zostać zranione, aby przetestować działanie wstrzykniętego odczynnika.

Mikrorany wewnątrz i między komórkami tworzyły małe blaszki podczas zamykania rany. Po tym nastąpił skurcz, a rany zagoiły się w mniej niż minutę. Małe rany nabłonkowe również goiły się poprzez tworzenie blaszek i wydłużanie kontaktów blaszkowatych.

Szybkie i postępujące zamykanie rany poprzedzało skurcz tkanek wzdłuż nowo powstałego szwu rany. Znormalizowany tempo gojenia się dwóch małych ran wyrażony jako procent całkowitej powierzchni rany w czasie wskazywał na pewną zmienność w dynamice zamykania ran. Dane z 14 różnych ran wykorzystano do ustalenia średniej krzywej gojenia się ran u zwierząt nieleczonych.

W małej ranie z uszkodzeniem błony podstawnej komórki brzeżne rozprzestrzeniają się wokół uszkodzonego obszaru, a szczelina zamyka się skurczem sznurka torebki. Kiedy tkanka była odwodniona lub zbyt uszkodzona, aby można ją było naprawić, ruchy komórek mogły się zatrzymać lub cały arkusz komórek mógł pęknąć. Duże rany goiły się w kilku etapach.

Wygładzenie krawędzi po skurczach na brzegu, tworzeniu się blaszek i rozszerzaniu się lamelipodiów powoduje zbiorową migrację komórek na brzegu i kilka poziomów komórek od niego oddalonych, co zamykało duże luki. Barwienie jądrowe i membranowe uzyskano poprzez mikrowstrzyknięcie odczynników do ECM. Mikroiniekcja cytochalazyny B hamowała powstawanie blaszek po zranieniu.

Ze zwierzętami należy obchodzić się delikatnie. Podczas wstrzykiwania odczynników należy upewnić się, że końcówka igły do mikroiniekcji znajduje się w mezoglei i nie przeszła przez zwierzę przez całą drogę. Obecnie zwierzęta transgeniczne są wytwarzane z fluorescencyjnymi białkami znacznikowymi, połączona fluorescencja i różnicowa interferencyjna mikroskopia kontrastowa dadzą jeszcze wyraźniejszy obraz zdarzeń komórkowych w gojeniu się ran nabłonkowych.