Name: Charakterystyka gojenia się ran nabłonkowych in vivo przy użyciu parzydełkowego organizmu modelowego Clytia hemisphaerica (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj metodę tworzenia i obrazowania ran nabłonkowych u żywej meduzy Clytia hemisphaerica. Technika mikroinjekcji barwników i leków pozwala badać dynamikę gojenia w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

E.E.L.L. jest wspierany przez grant z National Science Foundation PRFB 2011010. Chcielibyśmy podziękować Tsuyoshi Momose i Evelyn Houliston za pomoc w założeniu naszych kolonii Clytia, Jean-Baptiste Reynier za zebranie obrazów gojenia się mikroran, Harry'emu Kyriazesowi za budowę pseudo-kreisel tanks oraz Elizabeth Baldo za utrzymanie siedliska Clytia. Rysunek 1B został utworzony za pomocą BioRender.com.

1. Hodowla zwierząt
<ol>
	<li>Hodować kolonie polipów Clytia&#160;na szkiełkach mikroskopowych&#160;oraz meduzy w sztucznej wodzie morskiej (ASW) w temperaturze 18 °C w systemie dla rybek zebrafish, wykorzystując zbiorniki 2 L dla kolonii polipów oraz specjalnie wykonane zbiorniki typu pseudo-kreisel o pojemności 5 L dla meduz (Rycina dodatkowa 1)51. ASW składa się z 4% roztworu Instant Ocean w zdejonizowanej (DI) H2O.</li>
	<li>Karmić zwierzęta codziennie 2-3-dniowymi artemiami zgodnie z opisem51. 
	UWAGA: Obrazowanie gojenia ran jest łatwiejsze, jeśli zwierzęta nie były niedawno karmione, ponieważ do pola widzenia uwalniane jest mniej zanieczyszczeń z przewodu pokarmowego.</li>
	<li>Pobierać młode meduzy z uformowanych kolonii polipów w razie potrzeby, umieszczając kolonie na noc w beczkerze 2 L wypełnionym 1 L ASW. Do wszystkich eksperymentów dotyczących gojenia ran należy używać 2-3-tygodniowych meduz żeńskich. Propagacja Clytia została szczegółowo opisana w innym opracowaniu51.</li>
</ol>
2. Zadawanie ran
<ol>
	<li>Tworzenie mikrourazów wewnątrz i pomiędzy komórkami (20-500&#160;µm2)
	<ol>
		<li>Przygotuj zmodyfikowaną pipetę transferową, odcinając końcówkę nożyczkami, aby uzyskać większy otwór (o średnicy 0,5-0,7 cm). 
		UWAGA: Otwór w pipecie powinien być wystarczająco szeroki, aby uniknąć uszkodzenia zwierzęcia.</li>
		<li>Używając zmodyfikowanej pipety transferowej, umieść meduzę na szkiełku zagłębnikowym tak, aby exumbrella meduzy była skierowana do góry, dodając tyle ASW, aby tylko przykryć zwierzę.</li>
		<li>Nałóż na zwierzę szkiełko cover slip i natychmiast wykonaj obrazowanie (opis obrazowania znajduje się poniżej). Szkiełko cover slip ściska mezogleę, a sprężyste powrotne odkształcenie uciśniętej tkanki wytwarza siłę, która lekko rozsuwa komórki52. Objawia się to natychmiast jako szczeliny między poszczególnymi komórkami oraz uszkodzenia wewnątrz niektórych z nich (Rysunek 1B,B', Rysunek 2 oraz Rysunek 3A-C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie małych ran nabłonkowych (0,02-0,125&#160;mm2)
	<ol>
		<li>Używając zmodyfikowanej pipety transferowej (jak opisano powyżej), umieść meduzę na szkiełku zagłębnikowym z exumbrellą skierowaną do góry.</li>
		<li>Używając końcówki pipety 200 µL, delikatnie podrap powierzchnię meduzy. Delikatne drapanie może również spowodować przerwanie błony podstawnej, co jest łatwo zauważalne22. Przykryj zwierzę szkiełkiem cover slip do obrazowania. Alternatywnie, samo nałożenie szkiełka cover slip jest czasem wystarczające do stworzenia małych ran nabłonkowych, nawet bez drapania (Rysunek 1C,C', Rysunek 2 oraz Rysunek 3A-C). 
		UWAGA: Podczas drapania powierzchni meduzy nie naciskaj zbyt mocno, ponieważ uszkadza to ECM i tworzy nierówną powierzchnię — komórki nabłonkowe migrujące po nierównej powierzchni są trudniejsze do utrzymania w ostrości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie dużych ran nabłonkowych (0,5-0,9&#160;mm2)
	<ol>
		<li>Przygotuj igłę do mikroiniekcji za pomocą wyciągarki do mikropipet i szklanej rurki kapilarnej (krok 5.2). Umieść pustą igłę do mikroiniekcji w uchwycie mikroinjektora przymocowanym do mikromanipulatora. Odetnij końcówkę igły tak, aby otwór miał około 20-40 µm. 
		&#8203;UWAGA: Odcięte igły do dużych ran nabłonkowych można przechowywać i używać ponownie, aby zwiększyć powtarzalność między eksperymentami.</li>
		<li>Ustaw ciśnienie podtrzymujące w mikroinjektorze na zero, a ciśnienie wyrzutu na około 20 PSI. Ustaw mikroinjektor tak, aby dostarczał 2-sekundowy impuls powietrza. 
		UWAGA: Ciśnienie wyrzutu może wymagać dostrojenia w zależności od średnicy otworu igły (tj. mniejsze końcówki wymagają wyższego ciśnienia, a większe niższego).</li>
		<li>Umieść meduzę z exumbrellą skierowaną do góry na szkiełku zagłębnikowym na stole mikroskopu stereotypowego, dodając tyle ASW, aby tylko przykryć zwierzę. Używając mikromanipulatora, ustaw końcówkę igły do mikroiniekcji tak, aby znajdowała się tuż nad wodą. Aby to zrobić, ostrożnie zanurz końcówkę w wodzie (woda może wniknąć do końcówki pipety), a następnie wycofaj ją tak, aby znajdowała się blisko powierzchni nabłonka meduzy. 
		UWAGA: Końcówka powinna być ustawiona nad jednym kwadrantem meduzy. Kanały radialne dzielą dzwon meduzy na cztery wyraźne kwadranty. Celowanie w kwadrant pozwoli na uzyskanie czystszego obrazowania, ponieważ gonady i kanały radialne zostaną wykluczone z obszaru rany.</li>
		<li>Wypuść impuls powietrza, naciskając start w inżektorze. Powtórz impuls w tym samym miejscu od dwóch do czterech razy, w zależności od szerokości końcówki. Większe końcówki wymagają mniejszej liczby impulsów. 
		UWAGA: Widoczne powinno być wgniecenie w wodzie/meduzie spowodowane impulsem powietrza.</li>
		<li>Przykryj zranione zwierzę szkiełkiem cover slip w celu obrazowania dużych ran (Rysunek 1D,D').</li>
		<li>Postępuj zgodnie z poniższymi krokami (sekcja 3) w celu obrazowania gojenia ran nabłonkowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Nieuszkodzona i uszkodzona warstwa nabłonka egzuumbrelli u meduzy Clytia. (A) Schemat budowy ciała meduzy Clytia. (A') Nieuszkodzony nabłonek egzuumbrelli meduzy widziany z góry. (B) Schemat &#160;mikrourazów pojedynczych komórek (czerwone poszarpane kształty), komórki nabłonkowe zaznaczono kolorem niebieskim. (B') Mikrourazy pojedynczych komórek. (C) Schemat niewielkiego urazu nabłonka (czerwony poszarpany kształt). (C') Niewielki uraz nabłonka. (D) Schemat dużego urazu nabłonka (czerwony poszarpany kształt). (D') Duży uraz nabłonka. Wszystkie obrazy uzyskano za pomocą mikroskopii DIC. Paski skali w (A'-C'): 50 µm. Pasek skali w (D'): 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Rany o różnej wielkości i uszkodzona błona podstawna. Przedstawiono typową małą ranę nabłonkową exumbrella, z oznaczeniami wskazującymi lamellipodia tworzące się z komórek marginalnych. Dodatkowo widoczne są mikrouszkodzenia wewnątrz i pomiędzy komórkami nabłonkowymi. Należy zwrócić uwagę na niewielkie przerwanie błony podstawnej w górnej części rany. Film 4 przedstawia gojenie się tej rany. Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
3. Obrazowanie gojenia ran nabłonkowych
<ol>
	<li>Upewnij się, że mikroskop został skalibrowany do oświetlenia Köhlera53&#160;oraz prawidłowo ustawiony do mikroskopii kontrastowej różnicowej (DIC)54. Komórki nabłonkowe są niemal niewidoczne przy zastosowaniu standardycznej optyki (Rycina 3D,E).</li>
	<li>Ustaw ostrość na exumbrella. Mimo że jest to cienka warstwa, komórki heksagonalne powinny być wyraźne. 
	UWAGA: Exumbrella i subumbrella są oddzielone grubą mezogleą, która jest wspierana przez włókna pionowe. Komórki subumbrelli znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania co kanały promieniste. Jeśli początkowo ustawiono ostrość na warstwę subumbrelli, należy powoli przesuwać płaszczyznę ogniskowania przez mezogleę i włókna pionowe, aż do odnalezienia exumbrelli.</li>
	<li>Ręcznie zidentyfikuj ranę do obrazowania. W przypadku dużych ran użyj obiektywu 10x. W przypadku mniejszych ran oraz ran pojedynczych komórek użyj obiektywu 20x.</li>
	<li>Uruchom program, który rejestruje obrazy w formie filmu w czasie rzeczywistym lub zbiera serię obrazów w regularnych odstępach czasu. Monitoruj postępy, aby upewnić się, że obszar rany nie przesuwa się poza pole widzenia, a interesujące komórki pozostają w ostrości.
	<ol>
		<li>Rany pojedynczych komórek zamykają się w ciągu minuty; dlatego ich zamykanie należy rejestrować za pomocą filmu.</li>
		<li>Aby uchwycić szczegóły dynamiki komórkowej w przypadku małych ran, zbieraj obrazy mniej więcej co 10 s. Zamykanie małych ran trwa od 20 do 50 min, w zależności od ich wielkości.</li>
		<li>Nie obrazuj nieuszczelnionych szkiełek przez więcej niż 45 min, ponieważ odparowywanie wody ze szkiełka z czasem prowadzi do śmierci zwierzęcia i pękania komórek.</li>
		<li>W przypadku dłuższej obserwacji uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego wazeliną, aby ograniczyć parowanie. 
		&#8203;UWAGA: Niektóre meduzy mogą pulsować na szkiełku, co zakłóca obrazowanie. W takim przypadku umieszczenie zwierząt w 1:10 rozcieńczeniu 1% Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine), dostosowanym do pH 7.5 w ASW, służy jako skuteczny środek znieczulający i nie wykazuje widocznego wpływu na gojenie w przedziale czasowym 1 h. Jednak zwierzęta zginą, jeśli pozostaną w Tricaine przez kilka godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Wykonanie niewielkiej rany w nabłonku exumbrellarnym. (A) Delikatne zadrapanie exumbrelli końcówką pipety 200 µL w celu wywołania niewielkiej&#160;rany nabłonkowej. (B) Nałożenie szkiełka zakryciowego jest czasami wystarczające do powstania niewielkich ran nabłonkowych. (C) Meduza umieszczona na szkiełku zagłębnikowym. (D) Obraz niewielkiej rany nabłonkowej bez optyki DIC oraz (E) z optyką DIC. Paski skali: 50 µm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
4. Analiza
<ol>
	<li>Przygotowanie plików obrazów 
	UWAGA: Do przetwarzania plików obrazów należy używać programu FIJI/ImageJ z aktualnymi wtyczkami BioFormat.
	<ol>
		<li>Przed rejestracją stosu obrazów należy ustawić skalę na odpowiedni stosunek pikseli do mikrona: Analyze &#62; Set Scale. Jest to niezbędne do wyznaczenia rzeczywistych pomiarów wielkości w późniejszych analizach.</li>
		<li>Często zwierzę lekko przemieszcza się na szkiełku mikroskopowym; dlatego, aby wyeliminować dryf w filmach, należy zarejestrować obrazy, korzystając z wtyczki FIJI linear stack alignment with SIFT: Plugins &#62; Registration &#62; Linear Stack Alignment with SIFT.</li>
		<li>Zarejestrowany stos należy zapisać jako plik .avi: File &#62; Save As &#62; AVI… W oknie pop-up należy ustawić liczbę klatek na sekundę (animowane ryciny w niniejszej pracy ustawiono na 10 fps) i kliknąć OK. Plik wynikowy należy wykorzystać do analizy gojenia rany.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza powierzchni rany
	<ol>
		<li>Używając narzędzia lasso w programie FIJI/ImageJ, należy obrysować ranę, prowadząc linię wzdłuż krawędzi komórek. Powierzchnię rany, która została właśnie obrysowana, mierzy się za pomocą kombinacji Command+M lub CTRL+M.</li>
		<li>Pomiar powierzchni rany należy powtarzać co 10 klatek. Pomiary z programu FIJI/ImageJ można następnie przedstawić na wykresie w programie Prism 9 (Rycina 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig04.jpg" /> 
Rycina 4: Analiza powierzchni małych ran nabłonkowych. (A) Przykład gojenia się małej rany nabłonkowej w ciągu 10 min. (B) Przykład gojenia się innej rany nabłonkowej w ciągu 21 min. Fioletowe obrysy na A,B odpowiadają pomiarom powierzchni ran wykonanym za pomocą narzędzia lasso w programie FIJI/ImageJ. (C) Znormalizowana redukcja powierzchni rany w czasie dla A. (D) Znormalizowana redukcja powierzchni rany w czasie dla B. (E) Średnia redukcja powierzchni rany w czasie dla 14 małych ran. n = 14. Słupki błędów wyznaczone jako średnia ± SEM. Paski skali: 50 µm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
5. Iniekcje do mezoglei
<ol>
	<li>Przygotowanie szalki do iniekcji
	<ol>
		<li>Przygotuj polidimetylosiloksan (PDMS), łącząc bazę PDMS i czynnik sieciujący w stosunku masowym 10 części bazy do 1 części czynnika sieciującego. Mieszaj intensywnie do całkowitego połączenia bazy i czynnika sieciującego.</li>
		<li>Aby usunąć pęcherzyki powietrza, umieść mieszaninę w komorze próżniowej na 15 min. Wlej mieszaninę do szalki Petriego o średnicy 60 mm z nakrętkami od probówek do mikrocentryfugi, które utrzymają formę w miejscu. Natychmiast umieść formę na nakrętkach od probówek w 45&#176; ustawić pod kątem i przymocować taśmą. Forma składa się z trzech ułożonych jeden na drugim, przesuniętych szkiełek przedmiotowych, sklejonych tak, aby w końcowej naczyniu do iniekcji powstały wypustki.</li>
		<li>Umieść całą formę, odlew oraz mieszaninę w piekarniku w temperaturze 60 &#176;C przez 2 h w celu utwardzenia elastomeru. Zdjąć formę, aby otrzymać gotową płytkę wtryskową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie mikropipet (wyciąganie mikropipet)*
	<ol>
		<li>Za pomocą mikroelektrodowego wyciągacza (pullera) zaprojektuj program wyciągania. Zastosuj program jednostopniowy o wysokiej prędkości. Temperatura powinna być zbliżona do wyniku testu RAMP dla szkła.55,56Sprawdź, czy otrzymane mikropipety mają długie, jednorodne zwężenia. 
		UWAGA: Należy używać cienkościennych kapilar borokrzemowych o średnicy zewnętrznej 1,0 mm, średnicy wewnętrznej 0,75 mm i długości 10 cm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wtryskiwanie barwników i leków
	<ol>
		<li>Wykonaj igłę do mikroiniekcji (zgodnie z powyższą instrukcją).</li>
		<li>Napełnij mikroigłę do mikroiniekcji za pomocą długiej końcówki do pipety, używając nadmiarowej objętości barwnika lub leku przeznaczonego do wstrzyknięcia do meduzy. 
		UWAGA: Dla Clytia, dimetylosulfotlenek&#160;(DMSO) należy przechowywać w &#60;rozcieńczenie 1:100 w ASW, ponieważ wyższe stężenia DMSO hamują gojenie ran. W przypadku wstrzykiwania bezbarwnego roztworu można dodać roztwór Fast Green FCF (rozcieńczenie 1:100 0,1% Fast Green FCF w ASW), aby umożliwić wizualizację wstrzykiwanego płynu.</li>
		<li>Używając zmodyfikowanej pipety transferowej w opisany wyżej sposób, umieść meduzę podparasolem skierowanym do góry w naczyniu do iniekcji z PDMS z ilością ASW wystarczającą do zakrycia zwierzęcia (Rysunek 5C). Umieść szalkę na stole stereomikroskopu. 
		UWAGA: Ograniczenie nadmiaru ASW zapobiega pływaniu meduzy w szalce i pozwala na skuteczniejsze wstrzyknięcia.</li>
		<li>Skup się na końcówce igły do mikroiniekcji i wprowadź ją do wody w pobliżu meduzy. Za pomocą mikromanipulatora dociśnij igłę do dna naczynia, aż wygnie się i złamie. Otwór tej końcówki ma średnicę około 10-20 &#181;m. 
		UWAGA: Igły tej można używać wielokrotnie do wstrzykiwań tego samego barwnika/leku w tym samym dniu. Zaleca się stosowanie nowej końcówki każdego dnia oraz dla różnych barwników/leków.</li>
		<li>Za pomocą mikromanipulatora wprowadź końcówkę igły przez subumbrella do mezoglei, nie przebijając exumbrella. 
		UWAGA: Zauważalne będzie zmarszczenie/fałdowanie nabłonka. Po wprowadzeniu igły do meduzy zmarszczenie/fałdowanie ustaje.</li>
		<li>W mikroinjektorze ustaw ciśnienie podtrzymujące na zero, a ciśnienie wtrysku na wartość ≤20 PSI. Wykonaj iniekcję w jednym lub dwóch kwadrantach, wypełniając każdy z nich plamką barwnika lub leku o powierzchni stanowiącej w przybliżeniu 1/4 powierzchni danego kwadrantu. 
		UWAGA: W zależności od rozmiaru meduzy, w pojedynczych miejscach wstrzyknięcia należy stosować odpowiednio większe lub mniejsze objętości. Przepełnienie meduzy prowadzi do poważnych uszkodzeń nabłonka, a nawet do śmierci zwierzęcia.</li>
		<li>W zależności od stosowanego barwnika lub leku, zwierzęta umieszcza się w zlewce ze świeżym ASW, aby umożliwić dyfuzję barwnika lub leku oraz inkubację.</li>
		<li>Do obrazowania należy przymocować meduzę do szkiełka z wgłębieniem za pomocą zmodyfikowanej pipety transferowej, ustawiając zwierzę tak, aby egzoumbrella była skierowana ku górze (Rycina 5). Na tym etapie zwierzęta mogą zostać poddane zranieniu w celu przetestowania działania wstrzykniętego odczynnika.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig05.jpg" /> 
Rysunek 5: Układ do iniekcji w celu wprowadzenia barwników lub leków do ECM. (A) Układ do iniekcji. (B) Zbliżenie układu do iniekcji pokazujące orientację igły do mikroiniekcji (kąt około 45° względem zwierzęcia w szalce). (C) Zbliżenie silikonowej szalki do iniekcji z meduzą w niewielkiej ilości ASW przygotowaną do iniekcji. (D) Igła do mikroiniekcji załadowana Fast Green FCF wprowadzana do mezoglei meduzy przez podparasol. (E) Widok po iniekcji Fast Green FCF u zamocowanej meduzy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Nic do ujawnienia.

W tym artykule przedstawiono metodologię obrazowania ran in vivo w Clytia, stosunkowo nowym modelowym organizmie bezkręgowców 40,43,58. Istnieje kilka czynników, które sprawiają, że system ten jest unikalnym i potężnym narzędziem badawczym, różniącym się od innych modeli używanych do badania gojenia się ran i ponownego nabłonkowania. Po pierwsze, nabłonek jednowarstwowy jest przymocowany do przezroczystego ECM, co przypomina testy hodowli tkankowej in vitro (ryc. 1, ryc. 2, ryc. 3, ryc. 4). Podobnie jak w testach in vitro, komórki można obrazować w wysokiej rozdzielczości. Jednak w przeciwieństwie do hodowli tkankowej, istnieje autentyczne środowisko komórkowe i ECM, dzięki czemu gojenie się ran można postrzegać w kontekście złożonych zdarzeń sygnalizacyjnych, które występują u żywego rannego zwierzęcia. Po drugie, Clytia nie ma reakcji zapalnych, migrujących fibroblastów, naczyń krwionośnych i krwi. Pozwala to na badanie procesu reepitelializacji in vivo przy braku nakładających się zdarzeń, które występują u bardziej złożonych dorosłych zwierząt podczas gojenia się ran59. Po trzecie, ECM jest bezkomórkowy (film uzupełniający 1) i duży, co umożliwia łatwy dostęp za pomocą igły do mikroiniekcji (Rysunek 5 i Rysunek 6). Korzystając z tego podejścia, naukowcy mogą przetestować wpływ odczynników farmakologicznych, które zaburzają strukturę ECM lub sygnalizację, na gojenie się ran in vivo. Odczynniki mogą być również wprowadzane do komórek nabłonkowych i można ocenić ich wpływ na gojenie się ran in vivo. Po czwarte, istnieją protokoły tworzenia mutantów i zwierząt transgenicznych w systemie Clytia 42,43,44,45. Gojenie się ran in vivo można zatem zaobserwować u zwierząt ze zwiększoną/zmniejszoną ekspresją genów będących przedmiotem zainteresowania.
W tej technice składa się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, jak pokazano na rysunku 3, konieczne jest użycie mikroskopu, który jest prawidłowo skonfigurowany do mikroskopii DIC, ponieważ płaskie, przezroczyste komórki nabłonka są prawie niewidoczne przy użyciu standardowej mikroskopii świetlnej. Ważne jest również, aby rozwinąć umiejętność delikatnego ranienia zwierząt, tak aby nabłonek został uszkodzony bez żłobienia ECM. Podobnie delikatny dotyk jest konieczny w przypadku mikroiniekcji materiałów do ECM, ponieważ rozległe uszkodzenia zwierzęcia podczas wstrzykiwania mogą zagrozić późniejszej analizie gojenia się ran. Chociaż techniki te wymagają nauki, nawet początkujący studenci szybko opanowali je w laboratorium Malamy. Rzeczywiście, protokoły te zostały wykorzystane do zademonstrowania migracji komórek na studiach licencjackich na Uniwersytecie w Chicago.
Dla optymalnego obrazowania ważne jest, aby zwierzę się nie poruszało, a wybrany obszar rany nie wychodził poza pole widzenia. Jeśli zwierzęta pulsują, leczenie trikainą zgodnie z opisem jest bardzo skuteczne. W przypadku dryfowania często konieczna jest ręczna zmiana położenia próbki. Ruchy te można wyeliminować z końcowego filmu za pomocą funkcji rejestracji w FIJI/ImageJ.
Ograniczeniem tego systemu jest to, że nie jest możliwe stworzenie identycznych ran, ponieważ rany różnią się zarówno kształtem, jak i rozmiarem przy użyciu opisanych tutaj metod. W związku z tym określenie ilościowe dokładnego tempa zamykania się ran lub migracji komórek może być trudne. Markery pozycyjne, takie jak ziarna węgla, przyklejają się do odsłoniętego ECM u rannego zwierzęcia i mogą być używane do pomiaru szybkości zbiorowej migracji komórek w dużych ranach (nie pokazano). W przypadku analizy małych zamknięć ran, nawet przy zmiennym rozmiarze i kształcie rany, istnieje ograniczony zakres szybkości zamykania ran tej wielkości (ryc. 4). Możliwe jest zatem ilościowe wykrycie działania promotorycznych lub represyjnych odczynników farmakologicznych.
Chociaż praca ta opisuje charakterystykę gojenia się ran przy użyciu tylko mikroskopii DIC, te same podejścia można zastosować do obrazowania gojenia za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej. Aby w tym pomóc, istnieją protokoły generowania transgenicznych zwierząt, w których różne białka komórkowe i zewnątrzkomórkowe są znakowane fluorescencyjnie. Równoczesne obrazowanie za pomocą DIC i fluorescencji, w połączeniu z zaburzeniami gojenia się ran za pomocą środków farmakologicznych lub zmutowanych linii, będzie skutecznym podejściem do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw procesu gojenia się ran w nabłonku.

Arkusze komórek nabłonkowych pokrywają zewnętrzną powierzchnię wszystkich metazoanów, wyściełają organy wewnętrzne i dzielą ciało zwierzęcia na odrębne przedziały. Nabłonek oddziela również ciało wewnętrzne od środowiska zewnętrznego i chroni je przed uszkodzeniami i infekcjami. W związku z tym pojawienie się warstw nabłonkowych było istotną częścią ewolucji zwierząt wielokomórkowych, a warstwy nabłonkowe są widoczne u wszystkich zwierząt, od kręgowców po najbardziej podstawowe metazoany1. Nabłonek niektórych narządów jest pojedynczą warstwą, na przykład w workach powietrznych płuc, naczyniach krwionośnych i jelitach2, a także w naskórku bezkręgowców, takich jak planaria i parzydełkowce3. W innych tkankach, takich jak skin4 i cornea5 kręgowców, nabłonek jest warstwowy, co oznacza, że istnieje wiele warstw komórek nabłonka2. We wszystkich przypadkach najbardziej podstawowa warstwa nabłonkowa jest przymocowana do błony podstawnej, arkusza białkowego, który tworzy wyspecjalizowany region macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)6,7,8.
Naruszenia w nabłonku muszą być szybko naprawione, aby odtworzyć ciągłą warstwę nabłonka. Uszkodzenie nabłonka następuje podczas naturalnych procesów, takich jak złuszczanie się komórek nabłonka w jelitach,9,10 oraz w wyniku zapalenia lub urazu fizycznego. Kiedy pojedyncza komórka nabłonkowa jest uszkodzona, musi albo sama się naprawić, albo zostać wyeliminowana, aby umożliwić otaczającym komórkom przyczepienie się do siebie i zamknięcie otworu11,12. W ranach większych niż rozmiar pojedynczej komórki komórki nabłonkowe muszą się poruszać, aby dotrzeć do siebie i naprawić arkusz13. Można to osiągnąć poprzez rozprzestrzenianie się komórek, jeśli przerwy są małe lub mogą wymagać migracji komórek nabłonka z brzegów rany w celu zamknięcia szczeliny rany; Ten ostatni proces nazywa się reepitelializacją14,15. W tkankach embrionalnych komórki nabłonkowe rozprzestrzeniają się i migrują, aby zamknąć rany lub są przeciągane przez szczelinę przez skurcz aktomiozyny, które tworzą się między komórkami na brzegu rany, w mechanizmie przypominającym sznurek torebkowy16. W wielu dorosłych tkankach reepitelializacja polega na migracji spójnych arkuszy komórkowych, w których komórki utrzymują swoje połączenia z sąsiednimi komórkami14,17,18. W innych tkankach połączenia komórka:komórka są rozmontowywane, a komórki nabłonkowe zachowują się bardziej jak komórki mezenchymalne, poruszając się w skoordynowany, ale niezależny sposób do obszaru rany podczas reepitelializacji14,19,20,21.
Ruchy komórek nabłonkowych są regulowane przez złożone interakcje między migrującymi komórkami oraz między komórkami a ECM. Chociaż istnieje ogromna ilość literatury eksperymentalnej poświęconej mechanizmom aktywacji ran komórek nabłonka i późniejszej migracji, wiele wciąż pozostaje do odkrycia. Na przykład początkowy sygnał, który aktywuje komórki nabłonka do migracji w odpowiedzi na ranę, nie został ostatecznie zidentyfikowany22, ani nie jest w pełni zrozumiałe, w jaki sposób aktyna jest ponownie wykorzystywana do tworzenia lamellipodia po stronie komórek nabłonka znajdujących się najbliżej rany22,23,24,25,26,27. Zbiorcza migracja komórek wymaga, aby informacje z komórek w miejscu rany były udostępniane komórkom znajdującym się dalej od rany, a ścieżka komunikacji jest nadal niejasna28. Połączenia komórka:komórka i załączniki komórka:ECM muszą zostać zdemontowane i zreformowane, ponieważ komórki w arkuszu zmieniają swoje rozmieszczenie, ale regulacja tego procesu jest słabo zrozumiała14,29. Postęp w tych i innych powiązanych kwestiach jest ważny nie tylko ze względu na podstawowy problem biologiczny, ale także ze względu na kliniczne znaczenie prawidłowego gojenia się ran. Choroby, które upośledzają zdolność komórek nabłonka do prawidłowej migracji, skutkują przewlekłymi ranami; Przykładem jest choroba genetyczna pęcherzowego oddzielania się naskórka, w której geny zaangażowane w przyłączanie się komórek nabłonka do ECM są zmutowane, co powoduje kruchość skóry, która łuszczy się i tworzy pęcherze. Reepitelializacja jest również zagrożona w naturalnie starzejących się tkankach30,31. Lepsze zrozumienie jest zatem niezbędne do opracowania interwencji mających na celu poprawę wyników gojenia się ran.
Migracja komórek nabłonkowych w procesie gojenia ran została zbadana przy użyciu zarówno metod in vitro, jak i organizmów modelowych. Większość badań nad gojeniem się ran i mechanizmami migracji komórek przeprowadzono w hodowli tkankowej, w której monowarstwy pojedynczego typu komórek nabłonkowych są hodowane na podłożu zastępującym ECM. Monowarstwy komórek są albo drapane, albo hodowane za pomocą szablonów, aby utworzyć przerwy o określonych kształtach i rozmiarach, a następnie obserwowane32,33,34. Model in vitro pozwala na idealną wizualizację zachowania komórek, a także na zmianę właściwości substratu, wystawienie komórek na działanie leków oraz czynników abiotycznych i biotycznych oraz na transfekcję komórek z konstruktami, które wyrażają lub tłumią różne interesujące geny. Jednak to redukcjonistyczne podejście może nie uchwycić niektórych ważnych parametrów związanych z zachowaniem komórek nabłonkowych w kontekście in vivo, w tym komunikacji między różnymi typami komórek i zdarzeń sygnalizacyjnych, które występują w klasie ECM<sup="xref">11. Modele in vivo zapewniają autentyczny kontekst rany, z wieloma typami komórek, nakładającymi się szlakami sygnałowymi i złożonym ECM35. Jednym z takich modeli do badań nad gojeniem się ran jest mouse19, w którym ostatnie osiągnięcia pozwoliły naukowcom obserwować komórki naskórka podczas gojenia się ran pełnej grubości u żywych zwierząt36. Mysz i inne systemy in vivo stanowią jednak wyzwanie dla badań nad ponownym nabłonkowaniem. Po pierwsze, wielką zaletą obserwacji zachowania komórek w naturalnym kontekście jest złożoność czasowo nakładających się na siebie zdarzeń, które zachodzą podczas gojenia się ran kręgowców, w tym krzepnięcia krwi, rekrutacji komórek odpornościowych i stanu zapalnego, rekrutacji fibroblastów i dedyferencjacji komórek, rewaskularyzacji i przebudowy ECM. Ponadto nieprzezroczyste tkanki utrudniają obrazowanie. Larwy Drosophila i systemy naskórka danio pręgowanego37,38 przezwyciężyły niektóre z tych trudności ze względu na ich względną prostotę39.
Nasze laboratorium niedawno wprowadziło nowy model do badania gojenia się ran nabłonkowych: meduza (meduza) forma hydrozoan cnidarian Clytia hemisphaerica (Clytia)40. Clytia jest wyłaniającym się organizmem modelowym z w pełni zsekwencjonowanym i opisanym genomem41, transkryptomem pojedynczej komórki RNAseq class42 oraz protokołami modyfikacji genomu (mutageneza i transgeneza)43,44,45. Parzydełkowców są jedną z najstarszych istniejących linii, które mają warstwy nabłonkowe, więc zrozumienie gojenia się ran parzydełkowców daje wgląd w ścieżki przodków, które zapewniały integralność nabłonka. Dla tych ścieżek, które zostały zachowane w całym drzewie życia, Clytia oferuje ekscytujący nowy system do badania dynamiki komórek nabłonkowych i funkcjonalnej regulacji gojenia się ran in vivo.
Nabłonek pokrywający górną powierzchnię Clytia medusa (exumbrella) to monowarstwa przezroczystych, płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych o szerokości około 50 μm i grubości 1-2 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Są one podłączone do ECM zwanego mezogleą - "galaretką" meduzy. Mezoglea jest składowo podobna do ECM występującego u innych zwierząt46,47,48 w tym kręgowce, ma błonę podstawną40 i jest całkowicie przezroczysta. Warstwa nabłonkowa w Clytia medusa może być łatwo zarysowana lub zraniona (patrz poniżej). Prostota i przezroczystość nabłonka i ECM pozwala na obrazowanie komórek i ich ruchów w wysokiej rozdzielczości podczas gojenia. Ostatnio Kamran i wsp. szczegółowo scharakteryzowali gojenie się małych ran w nabłonku Clytia40. Wykazano, że gojenie u Clytia następuje poprzez pełzanie po komórkach oparte na blamelipodiach, rozprzestrzenianie się komórek i zbiorową migrację komórek, a także zamykanie sznurka torebki, co jest bardziej typowe dla systemów embrionalnych (chociaż wcześniej obserwowano w strukturach dorosłych zwierząt, takich jak rogówka49). Gojenie się ran Clytia jest niezwykle szybkie, co zaobserwowano w innych systemach, które nie wykazują reakcji zapalnej40,50. Gojenie w exumbrella Clytia jest całkowicie zależne od ruchów istniejących komórek nabłonka - żadne komórki nie namnażają się ani nie migrują przez ECM do miejsca rany (film uzupełniający 1). Wszystkie te odkrycia sugerują, że Clytia jest użytecznym systemem modelowym do badania gojenia się ran nabłonkowych. Rzeczywiście, łatwość obrazowania komórek nabłonkowych w Clytia podczas gojenia się ran doprowadziła do odkrycia, że blaszki komórek nabłonka rozciągają się i rozprzestrzeniają na obszarach odsłoniętego ECM, o ile istnieje nienaruszona błona podstawna; Jeśli błona podstawna jest uszkodzona, gojenie nabłonka przełącza się na mechanizm sznurka torebkowego40. Była to pierwsza demonstracja mechanizmu leżącego u podstaw decyzji o zamknięciu za pomocą pełzania opartego na lamellipodiach w porównaniu z zamknięciem sznurka torebki, podkreślając znaczenie określonych interakcji komórka:ECM w leczeniu i obserwacji komórek w ich naturalnym kontekście.
Poniżej opisane są protokoły tworzenia i obrazowania mikroran jednokomórkowych, małych ran, które zamykają się głównie przez rozprzestrzenianie się komórek, oraz dużych ran, które wymagają zbiorowej migracji komórek do zamknięcia. Ponadto opisano protokół wprowadzania małych cząsteczek do ECM i komórek nabłonkowych, co pozwala na eksperymentalne zakłócenia przypuszczalnych szlaków regulacyjnych gojenia się ran.

<table><tbody><tr><td>20500 Mikroskop ACE EKE Światłowodowe źródło światła</td><td>Kramer Scientific Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam 506 mono</td><td>ZEISS</td><td>426557-0000-000-MA285</td><td></td></tr><tr><td>Rurki kapilarne</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW1004</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalazyna B</td><td>Abcam</td><td>ab143482</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice depresyjne</td><td>Amscope</td><td>BS-C12</td><td></td></tr><tr><td>DMR z opcjami DIC i fluorescencyjną lampą halogenową</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian</td><td>Sigma</td><td>Aldrich E10521-10G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Thermo Scientific</td><td>A16520-06</td><td></td></tr><tr><td>FM1-43</td><td>Biotium</td><td>70022</td><td>Wzbudzenie/emisja: 480/598 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Wzbudzenie/emisja: 361/497 nm&nbsp;</td></tr><tr><td>imageJ</td><td>Końcówki do</td> mikroładowarek NIH <td></td><td></td></tr><tr><td>(0,5-10 &mu; L /2-20 &mu; L)</td> <td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>3301R / M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Szklana osłona mikroskopu (22X40-1,5)</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544-BP</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego (60 mm x 15 mm)</td><td>Fisherbrand</td><td>FB085713A</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle v2</td><td>World Precision Instruments</td><td>5430-ALL</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatyczna pompa PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Odkurzacz z poliwęglanu, eksykator</td><td>Bel-art</td><td>F42025-0000</td><td></td></tr><tr><td>Prism 9</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMI Sv11 Luneta preparcyjna</td><td>ZEISS</td><td>STEMI SV11</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184</td><td>Dow Silicones</td><td>1024001</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Z-Hab mini system</td><td>Pentair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN Oprogramowanie mikroskopowe</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

charakterystyka gojenia się ran nabłonkowych in vivo przy użyciu parzydełkowego organizmu modelowego clytia hemisphaerica

Characterizing Epithelial Wound Healing In Vivo Using the Cnidarian Model Organism Clytia hemisphaerica

Wszystkie organy zwierzęce, od skóry przez oczy po jelita, pokryte są arkuszami komórek nabłonkowych, które pozwalają im utrzymać homeostazę, jednocześnie chroniąc je przed infekcją. Nic więc dziwnego, że zdolność do naprawy ran nabłonkowych ma kluczowe znaczenie dla wszystkich metazoanów. Gojenie się ran nabłonkowych u kręgowców obejmuje nakładające się procesy, w tym reakcje zapalne, unaczynienie i reepitelializację. Regulacja tych procesów obejmuje złożone interakcje między komórkami nabłonkowymi, sąsiednimi komórkami i macierzą zewnątrzkomórkową (ECM); ECM zawiera białka strukturalne, białka regulatorowe i aktywne małe cząsteczki. Ta złożoność, w połączeniu z faktem, że większość zwierząt ma nieprzezroczyste tkanki i niedostępne ECM, sprawia, że gojenie się ran jest trudne do zbadania u żywych zwierząt. Wiele prac nad gojeniem się ran nabłonkowych wykonuje się zatem w systemach hodowli tkankowych, w których pojedynczy typ komórek nabłonkowych jest platerowany jako monowarstwa na sztucznej matrycy. Clytia hemisphaerica (Clytia) stanowi unikalne i ekscytujące uzupełnienie tych badań, umożliwiając badanie gojenia się ran nabłonkowych u nienaruszonego zwierzęcia z autentycznym ECM. Nabłonek ektodermalny Clytia jest pojedynczą warstwą dużych płaskonabłonkowych komórek nabłonkowych, umożliwiającą obrazowanie w wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopii różnicowego kontrastu zakłócającego (DIC) u żywych zwierząt. Brak migrujących fibroblastów, naczyń krwionośnych lub reakcji zapalnych umożliwia analizę krytycznych zdarzeń w reepitelializacji in vivo. Można analizować gojenie się różnego rodzaju ran, w tym mikroran jednokomórkowych, małych i dużych ran nabłonkowych oraz ran uszkadzających błonę podstawną. W tym systemie można zaobserwować tworzenie się blaszek, kurczenie się sznurka torebki, rozciąganie komórek i zbiorową migrację komórek. Ponadto za pośrednictwem ECM można wprowadzać środki farmakologiczne w celu modyfikowania interakcji komórka:ECM i procesów komórkowych in vivo. Praca ta pokazuje metody tworzenia ran u żywej Clytia, rejestrowania filmów gojenia i badania mechanizmów gojenia poprzez mikrowstrzykiwanie odczynników do ECM.

Zgodnie z powyższymi protokołami wykonano obrazowanie pojedynczych mikrourazów komórkowych, małych ran oraz dużych ran. Zarejestrowane stosy plików obrazów zapisano w formacie .avi.
W filmie 1 można zaobserwować zamykanie się mikrourazów pomiędzy komórkami i w obrębie komórek (Rycina 1 i Rycina 2). Podczas procesu zamykania obserwuje się małe lamellipodia, po których następują skurcz i gojenie. Odpady są usuwane i uwalniane do wody. Gojenie kończy się w ciągu minuty lub krócej.
W filmach 2 i 3 małe rany o różnych kształtach goją się poprzez tworzenie lamellipodiów, rozszerzanie kontaktów lamellipodialnych oraz rozprzestrzenianie się komórek na brzegu rany, zgodnie z wcześniejszymi opisami40 (Rysunek 1 i Rysunek 2). Komórki w warstwach znajdujących się za komórkami brzeżnymi nie uczestniczą w gojeniu ran o tej wielkości&#160;, nie występuje również kolektywna migracja komórek. Szybkiemu i postępującemu zamykaniu się szczelin nabłonkowych towarzyszy skurcz tkanki wzdłuż nowo powstałego szwu rany40. Przedstawiono znormalizowaną szybkość gojenia tych dwóch ran, wyrażoną jako procent pierwotnej powierzchni w czasie (Rysunek 4C,D). Chociaż w dynamice zamykania się ran występuje pewna zmienność, uśrednienie procentowego zamknięcia powierzchni w czasie dla 14 ran o różnych kształtach o powierzchni od 0,02-0,125 mm2 pozwala na wyznaczenie średniej krzywej gojenia ran u zwierząt nieleczonych (Rysunek 4E).
Uszkodzenia błony podstawnej są wyraźnie widoczne, gdy do nich dochodzi (Rycina 2). W Filmie 4 komórki znajdujące się na brzegu małej rany z uszkodzoną błoną podstawną rozprzestrzeniają się wokół uszkodzonego obszaru, a zamknięcie szczeliny następuje poprzez skurcz typu sznurka zaciskowego.
Jeśli tkanka jest odwodniona lub zbyt uszkodzona, aby ulec regeneracji, ruchy komórek mogą ustać lub cała warstwa komórek może pęknąć (Film 5 i Film 6). Zjawisko to występuje zazwyczaj po długim czasie obrazowania (45 minut lub więcej). Jeśli pękanie komórek następuje na wczesnym etapie obrazowania, próbka zostaje odrzucona.
Jak pokazano w Movie 7, duże rany goją się w kilku etapach. Najpierw krawędź rany staje się gładka i regularna z powodu skurczów na obrzeżu, co zgłaszano we wcześniejszych doniesieniach57. Następnie widoczne jest tworzenie się lamellipodiów przez komórki na brzegu rany, przy czym lamellipodia przesuwają się do przodu, aby zmaksymalizować kontakt z sąsiednimi lamellipodiami. Śledzenie jąder komórkowych w komórkach na brzegu rany oraz w kilku warstwach za komórkami brzeżnymi pokazuje, że duże przerwy zamykają się poprzez kolektywną migrację komórek40. Komórki nigdy się nie oddzielają, lecz przemieszczają się wspólnie jako arkusz.
Wprowadzenie barwników i czynników farmakologicznych może być potężnym narzędziem służącym do analizy mechanizmów biologicznych. Wiele substancji nie przenika do organizmów *Clytia* (nie pokazano), prawdopodobnie ze względu na warstwę śluzu pokrywającą powierzchnię zwierzęcia. Można jednak zastosować mikroiniekcję w celu bezpośredniego wprowadzenia cząsteczek do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), co pozwala na zaburzenie struktury ECM lub zakłócenie procesów regulacyjnych w jej obrębie. Ponadto barwniki i inne cząsteczki mogą przenikać do komórek nabłonkowych od strony podstawnej. Na przykład, Rycina 6 wykazuje barwienie jąder komórkowych barwnikiem Hoechst, barwienie błon komórkowych barwnikiem FM1-43 oraz hamowanie tworzenia lamellipodiów przez cytochalasynę B po mikroiniekcji tych odczynników do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Wprowadzenie tych cząsteczek do ECM i komórek nabłonkowych przed wywołaniem uszkodzenia pozwala&#160;eksperymenty badające wpływ narzędzi farmakologicznych na proces gojenia.
<img alt="Rycina 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65081/65081fig06.jpg" /> 
Rycina 6: Komórki nabłonkowe meduzy po mikroiniekcji barwników lub czynników farmakologicznych. (A) Komórki nabłonkowe przedstawione na górnym panelu 5 min po iniekcji 20 µM Hoechst (jądra) i 50 µM FM1-43 (błony).(B,C) Gojenie rany po iniekcji kontrolnego DMSO w stosunku 1:1,000 (B) lub 100 µM cytochalasyny B (C). Rany wykonano 15 min po iniekcji. Obrazy wykonano 5 min po zranieniu. Tworzenie lamellipodiów jest hamowane przez cytochalasynę B. Uważa się, że widoczne często między komórkami w obszarze rany „włókna” są wynikiem naprężenia rozciągającego błonę podstawną — nie barwią się one falloidyną (nie pokazano). Paski skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/65081fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Film 1: Film poklatkowy obrazujący gojenie mikrourazu pojedynczej komórki. Czas upływu: 20 s. Częstotliwość klatek: 10 fps. Pasek skali: 50 &#181;m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie1.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 2: Film poklatkowy gojenia niewielkiej rany nabłonkowej. Upływ czasu: 9 min 54 s. Częstotliwość klatek: 10 fps. Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie2.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 3: Film poklatkowy gojenia się niewielkiej rany nabłonkowej. Ta rana jest większa i ma bardziej nieregularny kształt niż rana w Filmie 2. Upływ czasu: 20 min 54 s. Częstotliwość klatek: 10 fps. Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie3.mp4" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 4: Film poklatkowy gojenia się małej rany oraz mikrorany z przerwaniem błony podstawnej. Lamellipodia rozprzestrzeniają się wokół przerwania błony podstawnej, choć mogą przemieszczać się nad pozostałą częścią ECM. Po otoczeniu obszaru rany z uszkodzeniem błony podstawnej, skurcz typu „sznurka w woreczku” (purse string contraction) przyciąga komórki nad ten obszar. Upływ czasu: 19 min 4 s. Częstotliwość klatek: 10 fps. Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie4.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 5: Komórki obumierające w niewielkiej ranie nabłonkowej. Śmierć komórek wynika prawdopodobnie z odwodnienia zwierzęcia. Upływ czasu: 4 min 24 s. Częstotliwość klatek: 10 fps. Pasek skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie5.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 6: Mała rana nabłonkowa nie ulega całkowitemu zagojeniu. Upływ czasu: 42 min 32 s. Częstotliwość klatek: 10 fps. Pasek skali: 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie6.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Film 7: Gojenie dużego uszkodzenia nabłonka. Upływ czasu: 25 min 29 s. Częstotliwość klatek: 10 fps. Pasek skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/Movie7.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Rysunek dodatkowy 1: Schematy wymiarów zbiornika dla Clytia. Wizualizacja 3D wykonanych na zamówienie zbiorników dla Clytia. (A) Widok z przodu i z tyłu. (B) Widok z boku. Wycięcie w elemencie zaznaczonym na zielono jest przykryte nylonową siatką.&#160;Woda wpływa do zbiornika bezpośrednio nad siatkę, przepływa nad nią i tworzy prąd okrężny.&#160;Woda opuszcza system przez otwór w elemencie końcowym zaznaczonym na niebiesko.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Film dodatkowy 1: Akomórkowa macierz pozakomórkowa u Clytia. seria obrazów Z (Z-stack) Clytia wykonana przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Seria początkowo koncentruje się na egzumbreli, a następnie skanuje macierz pozakomórkową (ECM) co 10 µm aż do endodermy płytki i subumbreli. Obrazy z użyciem DIC (lewo) oraz barwienia jąder Hoechst (prawo) wykazują brak komórek w ECM. Pasek skali: 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65081/SupplementalMovie1.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten artykuł opisuje metodę tworzenia ran w nabłonku żywej Clytia hemisphaerica medusa i obrazowania gojenia ran w wysokiej rozdzielczości in vivo. Dodatkowo przedstawiono technikę wprowadzania barwników i leków w celu zakłócenia procesów sygnalizacyjnych w komórkach nabłonka i macierzy zewnątrzkomórkowej podczas gojenia się ran.

Charakterystyka gojenia się ran nabłonkowych in vivo przy użyciu parzydełkowego organizmu modelowego Clytia hemisphaerica

All animal organs, from the skin to eyes to intestines, are covered with sheets of epithelial cells that allow them to maintain homeostasis while ...

Protokół ten umożliwia wizualizację komórek nabłonkowych podczas gojenia się ran u żywych zwierząt. Pozwala nam zobaczyć, jak komórki zachowują się w swoim naturalnym, złożonym środowisku. Technika ta wprowadza odczynniki do macierzy zewnątrzkomórkowej i cytoplazmy komórki w celu zbadania wpływu tych odczynników na rozprzestrzenianie się i migrację komórek podczas gojenia się ran u żywych zwierząt.Gojenie się ran nabłonkowych i Clytia niezwykle przypomina gojenie się u bardziej złożonych zwierząt. Dlatego z tego systemu możemy się wiele dowiedzieć o mechanizmach gojenia się ran i o tym, jak one powstały. Procedury te zademonstrują Elizabeth Lee i technik badawczy Emily Watto.Aby rozpocząć proces nawijania, przygotuj zmodyfikowaną pipetę transferową, przecinając końcówkę pipety nożyczkami, tworząc powiększony otwór o średnicy około 0,5 do 0,7 centymetra. Za pomocą zmodyfikowanej pipety transferowej umieść meduzę pobraną z ustalonych kolonii polipów na szkiełku depresyjnym, z parasolem meduzy X skierowanym do góry. Upewnij się, że zwierzę pokryte jest tylko wystarczającą ilością sztucznej wody morskiej lub ASW.Aby utworzyć mikrorany wewnątrz i między komórkami, umieść szkiełko nakrywkowe na zwierzęciu. Szkiełko nakrywkowe uciska mezogleę, a odbicie ściśniętej tkanki lekko rozsuwa komórki. Wyobraź sobie zwierzę natychmiast, aby obserwować powstałe mikrorany.Aby utworzyć małe rany nabłonkowe, umieść meduzę na szkiełku depresyjnym z parasolem medusa X skierowanym do góry, używając zmodyfikowanej pipety transferowej, jak pokazano wcześniej. Za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów delikatnie porysuj powierzchnię meduzy. Delikatne zadrapania mogą spowodować pęknięcia w błonie podstawnej.Przykryj zwierzę szkiełkiem nakrywkowym do obrazowania. Umieszczenie szkiełka nakrywkowego jest czasami wystarczające, aby utworzyć małe rany nabłonkowe nawet bez drapania. Przygotuj igłę do mikroiniekcji, używając mikropipety i szklanej rurki kapilarnej, postępując zgodnie z krokami opisanymi w tekście.Umieść pustą igłę do mikroiniekcji w uchwycie do mikroiniekcji przymocowanym do mikromanipulatora i odetnij końcówkę igły tak, aby otwór wynosił około 20 do 40 mikronów. Ustaw ciśnienie trzymania na mikrowtryskiwaczu na zero, a ciśnienie wyrzutu na około 20 funtów na cal kwadratowy. Ustaw mikrowtryskiwacz tak, aby dostarczał dwusekundowy impuls powietrza.Aby utworzyć duże rany nabłonkowe, umieść meduzę na szkiełku depresyjnym, jak pokazano wcześniej. Za pomocą mikromanipulatora wyreguluj końcówkę igły do mikroiniekcji tak, aby pozostawała tuż nad wodą, ostrożnie zanurzając końcówkę w wodzie, a następnie chowając ją tak, aby znajdowała się blisko powierzchni nabłonka meduzy. Pulsuj powietrzem, naciskając start na wtryskiwaczu.Powtórz impuls w tym samym miejscu dwa do czterech razy, w zależności od szerokości końcówki. Większe końcówki wymagają mniej impulsów. Przykryj ranne zwierzę szkiełkiem nakrywkowym do obrazowania dużych ran.Dostosuj ostrość do parasola x. Sześciokątne komórki powinny być czyste. Ręcznie zidentyfikuj ranę, aby ją zobrazować.Uruchom program, który zbiera obrazy w postaci filmu w czasie rzeczywistym lub taki, który zbiera serię obrazów w regularnych odstępach czasu. Monitoruj postępy, aby upewnić się, że obszar rany nie znika z pola widzenia, a komórki będące przedmiotem zainteresowania pozostają ostre. Do wstrzykiwania barwników i leków należy wykonać igłę do mikroiniekcji, postępując zgodnie z krokami opisanymi w tekście.Wypełnić igłę do mikroiniekcji za pomocą długiej końcówki pipety nadmiarem barwnika lub leku do wstrzykiwań do meduzy. Używając zmodyfikowanej pipety do przenoszenia, umieść meduzę z parasolem pomocniczym skierowanym do góry w naczyniu do wstrzykiwań z polidimetylosiloksanu lub PDMS, z wystarczającą ilością ASW, aby przykryć zwierzę. Umieść naczynie na stoliku mikroskopu preparacyjnego.Skoncentruj się na końcówce igły do mikroiniekcji i wsuń ją do wody w pobliżu meduzy. Za pomocą mikromanipulatora wciśnij igłę w naczynie, aż się wygnie i złamie. Tworzenie otworu końcówki o wielkości około 10 do 20 mikronów.Za pomocą mikromanipulatora włóż końcówkę igły przez parasol pomocniczy do mezoglei bez nakłuwania parasola X. Na mikrowtryskiwaczu ustaw ciśnienie trzymania na zero, a ciśnienie wtrysku poniżej lub równe 20 funtów na cal kwadratowy. Wstrzyknąć do jednego lub dwóch kwadrantów, wypełniając każdy z nich plamką barwnika lub leku mniej więcej jedną czwartą powierzchni tego kwadrantu.W zależności od tego, jaki barwnik lub lek jest wstrzykiwany, zwierzęta umieszcza się w zlewce ze świeżym ASW, aby umożliwić dyfuzję i inkubację barwnika lub leku. W celu obrazowania zamontuj meduzę na szkiełku depresyjnym za pomocą zmodyfikowanej pipety transferowej, ustawiając zwierzę z parasolem X skierowanym do góry. Na tym etapie zwierzęta mogą zostać zranione, aby przetestować działanie wstrzykniętego odczynnika.Mikrorany wewnątrz i między komórkami tworzyły małe blaszki podczas zamykania rany. Po tym nastąpił skurcz, a rany zagoiły się w mniej niż minutę. Małe rany nabłonkowe również goiły się poprzez tworzenie blaszek i wydłużanie kontaktów blaszkowatych.Szybkie i postępujące zamykanie rany poprzedzało skurcz tkanek wzdłuż nowo powstałego szwu rany. Znormalizowany tempo gojenia się dwóch małych ran wyrażony jako procent całkowitej powierzchni rany w czasie wskazywał na pewną zmienność w dynamice zamykania ran. Dane z 14 różnych ran wykorzystano do ustalenia średniej krzywej gojenia się ran u zwierząt nieleczonych.W małej ranie z uszkodzeniem błony podstawnej komórki brzeżne rozprzestrzeniają się wokół uszkodzonego obszaru, a szczelina zamyka się skurczem sznurka torebki. Kiedy tkanka była odwodniona lub zbyt uszkodzona, aby można ją było naprawić, ruchy komórek mogły się zatrzymać lub cały arkusz komórek mógł pęknąć. Duże rany goiły się w kilku etapach.Wygładzenie krawędzi po skurczach na brzegu, tworzeniu się blaszek i rozszerzaniu się lamelipodiów powoduje zbiorową migrację komórek na brzegu i kilka poziomów komórek od niego oddalonych, co zamykało duże luki. Barwienie jądrowe i membranowe uzyskano poprzez mikrowstrzyknięcie odczynników do ECM. Mikroiniekcja cytochalazyny B hamowała powstawanie blaszek po zranieniu.Ze zwierzętami należy obchodzić się delikatnie. Podczas wstrzykiwania odczynników należy upewnić się, że końcówka igły do mikroiniekcji znajduje się w mezoglei i nie przeszła przez zwierzę przez całą drogę. Obecnie zwierzęta transgeniczne są wytwarzane z fluorescencyjnymi białkami znacznikowymi, połączona fluorescencja i różnicowa interferencyjna mikroskopia kontrastowa dadzą jeszcze wyraźniejszy obraz zdarzeń komórkowych w gojeniu się ran nabłonkowych.

characterizing-epithelial-wound-healing-vivo-using-cnidarian-model

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Skóra dorosłego C. elegans jest łatwym modelem do badań nad reakcjami na rany nabłonkowe, w tym zamykaniem ran, tworzeniem blizn i odpornością wrodzoną.

Metody leczenia ran skóry i oznaczania reakcji na rany u C. elegans

Keratocyty danio pręgowanego migrują w arkuszach komórkowych z eksplantatów i dostarczają modelu in vitro do badania mechanizmów zbiorowej migracji komórek w kontekście gojenia się ran nabłonkowych. Protokoły te szczegółowo opisują skuteczny sposób ustanawiania pierwotnych kultur eksplantatów do wykorzystania w zbiorczych testach migracji komórek.

Eksplantaty keratocytów danio pręgowanego w celu zbadania zbiorowej migracji komórek i reepitelializacji w gojeniu się ran skórnych

Opisane tutaj jest ustanowienie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów reakcji na uszkodzenia tkanek nabłonkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku.

Opracowanie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo do badania naprawy ran nabłonkowych w rodzimym mikrośrodowisku

Ten manuskrypt opisuje, w jaki sposób zmiany przypominające nacięcia wykonane na monowarstwach hodowanych komórek nabłonkowych wygodnie modelują gojenie się ran in vitro, umożliwiając obrazowanie za pomocą konfokalnej lub laserowej mikroskopii skaningowej, i które mogą dostarczyć wysokiej jakości danych ilościowych i jakościowych do badania zarówno zachowania komórek, jak i mechanizmów związanych z migracją.

Mikroskopowe metody oceny migracji komórek nabłonka podczas gojenia się ran in vitro

Ten protokół opisuje metodę polegającą na otarciu powierzchni oka myszy i śledzeniu procesu gojenia się ran. Protokół wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka powierzchniowego oka u znieczulonych myszy.

Otarcie nabłonka rogówki z zadziorem ocznym jako model gojenia się ran rogówki

Poliploidyzacja wywołana raną to zachowana strategia naprawy tkanek, w której komórki rosną zamiast dzielić, aby zrekompensować utratę komórek. Oto szczegółowy protokół, w jaki sposób wykorzystać muszkę owocową jako model do pomiaru ploidalności i jej regulacji genetycznej w naprawie ran nabłonkowych.

Model Drosophila do badania poliploidyzacji indukowanej raną

Ten protokół opisuje, jak generować obustronne rany wycinające o pełnej grubości u myszy oraz jak następnie monitorować, zbierać i przygotowywać rany do analizy morfometrycznej. Dołączono szczegółowy opis sposobu wykorzystania seryjnych odcinków histologicznych do definiowania, precyzyjnego określania ilościowego i wykrywania wad morfometrycznych.

Mysi model gojenia ran wycinających i histologiczna morfometryczna analiza ran

Tutaj opisany jest protokół tworzenia centralnej rany po otarciu nabłonka rogówki u myszy za pomocą trepanacji i kija golfowego. Ten model gojenia się ran rogówki jest wysoce powtarzalny i jest obecnie wykorzystywany do oceny upośledzonego gojenia się ran rogówki w kontekście chorób.

Model ścierania nabłonka do badania gojenia się ran rogówki

Obecny protokół pokazuje różne etapy związane z uszkodzeniem rogówki embrionalnego pisklęcia in ovo. Regenerujące się lub w pełni odbudowane rogówki mogą być analizowane pod kątem potencjału regeneracyjnego przy użyciu różnych technik komórkowych i molekularnych po zabiegu zranienia.

Badanie bezbliznowatej regeneracji tkanek w zarodkach zranionych rogówek piskląt

Ten protokół skupia się na uszkadzaniu powierzchni oka danio pręgowanego poprzez ścieranie, aby ocenić późniejsze zamknięcie rany na poziomie komórkowym. Podejście to wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka rogówki i wykorzystuje skaningową mikroskopię elektronową do śledzenia zmian w morfologii komórek podczas zamykania rany.

Gojenie się ran rogówki danio pręgowanego: od ścierania do analizy obrazowej zamknięcia rany

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji komórek proliferujących podobnych do macierzystych u meduzy Cladonema. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ z pełnym montowaniem z markerem komórek macierzystych pozwala na wykrycie komórek macierzystych, a znakowanie 5-etynylo-2'-deoksyurydyną umożliwia identyfikację komórek proliferujących. Razem można wykryć aktywnie proliferujące komórki macierzyste.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ i znakowanie 5-etynylo-2'-deoksyurydyny komórek macierzystych w meduzie hydrozoan Cladonema pacificum

Poznaj metodę tworzenia i obrazowania ran nabłonkowych u żywej meduzy Clytia hemisphaerica. Technika mikroinjekcji barwników i leków pozwala badać dynamikę gojenia w czasie rzeczywistym.

Charakterystyka gojenia się ran nabłonkowych in vivo przy użyciu parzydełkowego organizmu modelowego Clytia hemisphaerica

Przeglądaj więcej filmów