Podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc z myszy RyR2R2474S Knock-In z kataecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym

Metoda ta pomoże nam ujawnić właściwości elektrofizjologiczne i mechanizmy rozmazów z zatrzymaniem komór związanych z chorobami takimi jak katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy. Korzystając z tej techniki, możemy uzyskać potencjał błonowy i międzykomórkowe sygnały wapnia jednocześnie w różnych zaprogramowanych protokołach stymulacji elektrycznej, co jest szczególnie przydatne do badania mechanizmów leżących u podstaw i dynamiki choroby arytmicznej serca, takiej jak CPVT. Aby pomyślnie przeprowadzić ten eksperyment, upewnij się, że masz dobrze ukrwione serce, prawidłowe ładowanie barwnika, rozprzęganie wzbudzenia-skurczu i staranne ustawienia aparatu.

Aby rozpocząć, skonfiguruj system mapowania optycznego i włącz kamerę, aby uzyskać stabilną temperaturę próbkowania na poziomie minus 50 stopni Celsjusza. Umieść zebrane serce myszy w zimnym roztworze CREB, aby spowolnić metabolizm i chronić serce. Usuń otaczającą tkankę aorty.

Użyj specjalnie wykonanej igły kaniulowej, aby ją kaniulować i przymocuj za pomocą jedwabnego szwu 4-0. Teraz perfuzjuj serce za pomocą systemu Langendorffa ze stałą prędkością od 3,5 do 4,0 mililitrów na minutę. Włóż małą plastikową rurkę do lewej komory, aby uwolnić przekrwienie roztworu w komorze, aby uniknąć nadmiernego obciążenia wstępnego i zamocuj plastikową rurkę w igle kaniulowej.

Następnie umieść dwa przewody w perfuzacie w kąpieli i włącz zasilanie skrzynki wzmacniacza elektrokardiogramu i kontrolera stymulacji elektrycznej. Następnie rozpocznij przywołany elektrokardiogram lub oprogramowanie EKG i stale monitoruj EKG. Kolejne kroki wykonuj w ciemności, gdy serce osiągnie stan stabilny.

Mieszaninę roztworu bróbstatyny CREBs należy stale wprowadzać do serca przez 10 minut, aby rozłączyć skurcz od wzbudzenia i uniknąć artefaktów skurczu podczas filmowania. Następnie za pomocą czerwonej latarki zbadaj serce, aby potwierdzić całkowite ustąpienie skurczów. Perfuzję serca roztworem roboczym Rhod-2 AM przez 15 minut w systemie perfuzyjnym Langendorffa po rozprzęgnięciu skurczu wzbudzenia.

Utrzymuj dopływ tlenu podczas wewnątrzkomórkowego ładowania barwnikiem wapniowym. Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków z pluronicznego F-127, włóż pułapkę bąbelkową do systemu perfuzyjnego. Rozcieńczyć 10 mikrolitrów roztworu podstawowego RH 237 w 50 mililitrach perfuzatu i ładować przez 10 minut.

Po zakończeniu ładowania podwójnego barwnika zrób sekwencję zdjęć. Upewnij się, że sygnały napięcia i wapnia są odpowiednie do analizy. Włącz dwie diody LED dla świateł wzbudzenia i dostosuj ich intensywność do odpowiedniego zakresu.

Umieść serce pod urządzeniem wykrywającym, upewniając się, że jest dobrze oświetlone przez dwie diody LED regulujące średnicę plamki świetlnej do dwóch centymetrów. Ustaw odległość roboczą między obiektywem a sercem na 10 centymetrów, aby uzyskać żądaną częstotliwość próbkowania i rozdzielczość przestrzenną. Otwórz oprogramowanie do próbkowania sygnału, aby jednocześnie sterować kamerą i przechwytywać sygnały napięcia i wapnia.

Uruchom stymulator pola MyoPacer i ustaw wzorzec stymulacji na logikę tranzystora tranzystorowego z dwoma milisekundami czasu trwania stymulacji na impuls. Ustaw początkową intensywność na 0.3 wolta. Umieść parę platynowych elektrod przymocowanych do nasierdzia wierzchołka lewej komory.

Zastosuj 30 kolejnych bodźców S1 o częstotliwości 10 Hz, aby przetestować próg napięcia rozkurczowego serca za pomocą oprogramowania do rejestracji EKG. Stopniowo zwiększaj amplitudę napięcia, aż do uzyskania wychwytywania jeden do jednego. Zaimplementuj protokół S1-S1 do pomiaru przemian wapnia lub potencjału czynnościowego oraz właściwości restytucyjnych.

Ćwicz kolejno tempo pracy serca, zaczynając od podstawowej długości cyklu wynoszącej 100 milisekund. Zmniejsz długość cyklu o 10 milisekund w każdej kolejnej sekwencji, aż osiągnie 50 milisekund. Jednocześnie zainicjuj mapowanie optyczne przed stymulacją.

Aby zmierzyć efektywny okres refrakcji komorowej za pomocą protokołu bodźcowego S1-S2, zacznij od cyklu stymulacji S1-S1 o długości 100 milisekund. Połącz S2 w 60 milisekundach i zmniejszaj o dwa milisekundy krok, aż S2 nie uchwyci ektopowego zespołu QRS. W przypadku indukcji arytmii podawaj ciągłą stymulację impulsów 50 Hz i wykonaj ten sam epizod stymulacji po odczekaniu dwusekundowej przerwy w spoczynku.

Uważnie monitoruj zapisy elektrokardiogramu w ciągłym okresie stymulacji wysokiej częstotliwości, aby natychmiast rozpocząć jednoczesne zapisy mapowania optycznego, gdy generowana jest interesująca fala arytmiczna. Kontynuuj przechwytywanie obrazów za pomocą kamery ze sprzężeniem z ładunkiem zwielokrotnionym elektronami. W oprogramowaniu do akwizycji obrazów naciśnij Wybierz folder i załaduj obrazy, aby rozpocząć półautomatyczny proces analizy ogromnych danych wideo.

Wprowadź prawidłowe parametry pobierania próbek do analizy. Ręcznie ustaw próg obrazu i wybierz obszar zainteresowania. Zastosuj filtr przestrzenny Gaussa o wymiarach trzy na trzy piksele, filtr Savitzky'ego-Golaya i korekcję linii bazowej cylindra.

Następnie naciśnij Przetwarzaj obrazy, aby usunąć linię bazową i obliczyć parametry elektrofizjologiczne, takie jak APD-80 i CATD-50. Ustaw czas inicjacji czasu trwania potencjału czynnościowego na szczycie i punkcie końcowym na 80% repolaryzacji w celu obliczenia APD-80. Podobnie zdefiniuj czas rozpoczęcia przejściowego czasu trwania wapnia jako szczyt, w którym punktem końcowym jest 80% relaksacji.

Pokazano typowe ślady na mapach cieplnych APD-80 i CATD-80. Izoproterenol skraca APD-80 i myszy typu dzikiego i katecholaminergicznego polimorficznego częstoskurczu komorowego lub CPVT, ale nie stwierdzono różnicy po prowokacji izoproterenolem. U myszy CATD-80 i CPVT występował dłużej niż u typu dzikiego po prowokacji izoproterenolem, podczas gdy przed leczeniem nie było znaczenia.

Zgodnie z sygnałami napięciowymi, serca typu dzikiego i CPVT miały taką samą zdolność przewodzenia przez nasierdzie na początku i po interwencji izoproterenolu. Mapy cieplne wykazały, że myszy CPVT mają taką samą zdolność przewodzenia jak myszy typu dzikiego przed i po prowokacji izoproterenolem. Analiza alternatywnej amplitudy wapnia wykazała, że sygnały wapniowe w sercach typu dzikiego pozostawały stabilne na początku badania podczas kolejnych stymulacji S1-S1 przy 14,29 i 16,67 herców, podczas gdy serca CPVT wykazywały naprzemienne zależne od częstotliwości.

Po prowokacji izoproterenolem serca CPVT wykazywały zależne od częstotliwości przemiany i sygnał wapniowy podczas stymulacji S1-S1, podczas gdy serca typu dzikiego nie były dotknięte. Analiza arytmii Tachy sugerowała, że zarówno serca typu dzikiego, jak i CPVT wykazują normalne przewodzenie podczas stymulacji impulsów 50 Hz na początku badania. Po obfitości z izoproterenolem, serca CPVT wykazywały wirniki o wysokiej częstotliwości po 50 Hz burst, podczas gdy serca typu dzikiego utrzymywały normalne przewodzenie.

Zgodnie z tą procedurą, typy adogen i myszy typu dzikiego są używane do zilustrowania właściwości elektrofizjologicznych i funkcjonalnych w tych modelach lub w wynalazku farmaceutycznym. Mapowanie optyczne jest potężnym narzędziem do badania arytmii serca, jednak nie może być stosowane klinicznie ze względu na ograniczenie barwnika fluorescencyjnego w ramach rozprzęgania skurczu wzbudzenia. Wraz z rozwojem fluorescencji właściwej dla różnych cząsteczek docelowych w ramach rozwoju technologii obliczeniowej o wysokiej prędkości obrotowej, technika mapowania optyku serca z pewnością osiągnie tylko zastosowania.