Name: Podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc z myszy RyR2R2474S Knock-In z kataecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc myszy z mutacją RyR2R2474S w badaniu kataecholaminergicznego polimorficznego częstoskurczu komorowego. Ta metoda umożliwia jednoczesny pomiar potencjału błonowego i sygnałów wapniowych, co pozwala zrozumieć mechanizmy arytmii serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81700308 do XO i 31871181 do ML, a 82270334 do XT), Program Wsparcia Nauki i Technologii Prowincji Sichuan (CN) (2021YJ0206 do XO, 23ZYZYTS0433 i 2022YFS0607 do XT oraz 2022NSFSC1602 do TC) oraz Państwowe Kluczowe Laboratorium Chemii i Inżynierii Molekularnej Zasobów Medycznych (Guangxi Normal University) (CMEMR2017-B08 do XO), MRC (G10031871181 do ML02647, G1002082, ML), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE w Oksfordzie (ML).

Do eksperymentów wykorzystywane są samce 10 do 14-tygodniowych myszy typu dzikiego lub myszy RyR2-R2474S/+ (tło C57BL/6) o wadze 20-25 g. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich użytkowania Południowo-Zachodniego Uniwersytetu Medycznego w Syczuanie w Chinach (zatwierdzenie nr 20160930) zgodnie z krajowymi wytycznymi, zgodnie z którymi działa instytucja.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Roztwory podstawowe
	<ol>
		<li>Roztwór podstawowy blibistatyny: Dodać 1 ml 100% dimetylosulfotlenku (DMSO) do oryginalnej kolby zawierającej 2,924 mg (-) blabistatyny w proszku, aby osiągnąć stężenie 10 mM.</li>
		<li>Wskaźnik napięcia RH237 roztwór podstawowy: Dodać 1 ml 100% DMSO do oryginalnej kolby z 1 mg proszku RH237, aby osiągnąć stężenie 2,01 mM.</li>
		<li>Wskaźnik wapnia Roztwór podstawowy Rhod-2 AM: Dodaj 1 ml 100% DMSO do 1 mg proszku Rhod-2 AM, aby osiągnąć stężenie 0,89 mM.</li>
		<li>Roztwór podstawowy Pluronic F127: Dodać 1 ml 100% DMSO do 200 mg Pluronic F127, aby osiągnąć stężenie 20% w/v (0,66 mM).</li>
		<li>Podwielokrotnić roztwory podstawowe do probówek PCR o pojemności 200 μl w 21-51 μl (21 μl RH237, 31 μl Rhod-2 AM i 51 μl bibistatyny) do jednorazowego lub podwójnego użytku, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Następnie owinąć roztwory folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C, z wyjątkiem roztworu podstawowego Pluronic F127 umieszczonego w ciemnym pomieszczeniu w temperaturze otoczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór perfuzyjny
	<ol>
		<li>Roztwór Krebsa (w mM): Przygotować 1 l roztworu Krebsa (NaCl 119, NaHCO3 25, NaH2PO4 1,0, KCl 4,7, MgCl2 1,05, CaCl2 1,35 i glukoza 10).</li>
		<li>Przefiltrować roztwór za pomocą aseptycznego filtra igłowego 0,22 μm i natlenić 95% O2/5% CO2 .</li>
		<li>Pobrać 40 ml roztworu Krebsa do probówki odśrodkowej o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C w celu dalszej izolacji serca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>System perfuzyjny Langendorffa i urządzenie do mapowania optycznego
	<ol>
		<li>Skonfiguruj system perfuzyjny Langendorffa.
		<ol>
			<li>Włącz łaźnię wodną i ustaw temperaturę na 37 °C.</li>
			<li>Umyj system perfuzyjny Langendorff 1 litrem wody dejonizowanej.</li>
			<li>Roztworu należy wylać z przewodu doborowego i dostosować szybkość wypływu do 3,5-4 ml/min. Następnie natlenić perfuzat gazemO2/CO2 (95%/5%) w temperaturze 37 °C. 
			UWAGA: Bąbelki nigdy nie są dozwolone w systemie perfuzyjnym.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj system mapowania optycznego.
		<ol>
			<li>Zainstaluj kamerę EMCCD (512 × 512 pikseli), obiektyw (40-krotne powiększenie), diody elektroluminescencyjne (LED) rozdzielające długość fali, monitor elektrokardiogramu (EKG) i elektrodę stymulacyjną (<klasa silna="xfig">Rysunek 1).</li>
			<li>Dostosuj odpowiednią odległość roboczą od obiektywu do pozycji serca.</li>
			<li>Ustaw dwie diody LED w pozycji przekątnej wanny termostatycznej, aby uzyskać równomierne oświetlenie, zapewniając długość fali 530 nm do generowania światła wzbudzającego. Użyj filtra napylanego ET525/50, aby usunąć wszelkie światło spoza pasma dla diod LED.</li>
			<li>Wyreguluj przełącznik uchwytu, aby uzyskać równy kwadrat powierzchni docelowej, dzięki czemu obrazy napięcia i wapnia będą odpowiednio wyświetlane na interfejsie nabywczym.</li>
			<li>Obróć przysłonę obiektywu do maksymalnej średnicy, aby uniknąć wycieku voltage lub sygnały wapniowe.</li>
			<li>Ustaw obiektyw aparatu na odpowiedniej wysokości, ponieważ zapewnia on dobrą odległość roboczą od wanny termostatycznej, najczęściej stosuje się 10 cm.</li>
			<li>Włącz kamerę, aby uzyskać stabilną temperaturę próbkowania na poziomie -50 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Procedury
<ol>
	<li>Żniwo, kaniulacja i perfuzja serca myszy
	<ol>
		<li>Dootrzewnowo wstrzyknąć zwierzętom roztwór awertyny (1,2%, 0,5-0,8 ml) i heparynę (200 jednostek), aby zminimalizować cierpienie i odruch bólowy oraz zapobiec tworzeniu się skrzepów krwi. Po 15 minutach należy złożyć zwierzęta w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
		<li>Otwórz klatkę piersiową nożyczkami, ostrożnie zbierz serce i umieść je w zimnym roztworze Krebsa (4 °C, 95% O2, 5% CO2 ), aby spowolnić metabolizm i chronić serce.</li>
		<li>Usuń otaczającą tkankę aorty, kaniuluj aortę za pomocą specjalnie wykonanej igły kaniulującej (średnica zewnętrzna: 0,8 mm, średnica wewnętrzna: 0,6 mm, długość: 27 mm) i przymocuj ją za pomocą jedwabnego szwu 4-0.</li>
		<li>Perfuzja serca za pomocą systemu Langendorffa ze stałą prędkością 3,5-4,0 ml/min i utrzymywanie temperatury na poziomie 37 ± 1 °C. 
		UWAGA: Wszystkie kolejne zabiegi są wykonywane w tym stanie.</li>
		<li>Włóż małą plastikową rurkę (o średnicy 0,7 mm, długości 20 mm) do lewej komory, aby uwolnić przekrwienie roztworu w komorze i uniknąć nadmiernego obciążenia wstępnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozprzęgacz wzbudzenia-skurczu i podwójnego ładowania barwnikiem
	<ol>
		<li>Włożyć dwa przewody do perfuzatu w kąpieli, włączyć zasilanie skrzynki wzmacniacza EKG i sterownika stymulacji elektrycznej, a następnie uruchomić oprogramowanie EKG, do którego się odnosi, i monitorować EKG w sposób ciągły.</li>
		<li>Kolejne kroki wykonuj w ciemności, gdy serce osiągnie stan stabilny (serce bije rytmicznie z prędkością ~400 uderzeń na minutę).</li>
		<li>Zmieszaj 50 μl 10 mM roztworu podstawowego bróbstatyny z 50 ml roztworu Krebsa, aby osiągnąć stężenie 10 μM. Stale perfuzuj mieszaninę roztworu blebbisatyny i Krebsa do serca przez 10 minut, aby rozłączyć skurcz od wzbudzenia i uniknąć artefaktów skurczu podczas filmowania.</li>
		<li>Użyj czerwonej latarki, aby sprawdzić, czy skurcz serca całkowicie ustaje, ponieważ skurcz wpłynie na jakość ładowania barwnika.</li>
		<li>Po rozprzęgnięciu wzbudzenia-skurczu zmieszać 15 μl roztworu podstawowego Rhod-2 AM z 15 μl roztworu podstawowego Pluronic F127 w 50 ml roztworu Krebsa, aby osiągnąć końcowe stężenia 0,267 μM Rhod-2 AM i 0,198 μM Pluronic F127. Następnie perfuzję serca w sposób ciągły roztworem roboczym Rhod-2 AM przez 15 minut w systemie perfuzyjnym Langendorffa.</li>
		<li>Utrzymuj dopływ tlenu podczas wewnątrzkomórkowego ładowania barwnikiem wapniowym. Ponieważ pęcherzyki łatwo tworzą się w Pluronic F127, włóż pułapkę bąbelkową do systemu perfuzyjnego, aby uniknąć embolizacji gazowej naczyń wieńcowych.</li>
		<li>Rozcieńczyć 10 μl roztworu podstawowego RH237 w 50 ml perfuzatu do osiągnięcia końcowego stężenia przy 0,402 μM i wykonywać ładowanie przez 10 minut.</li>
		<li>Pod koniec ładowania podwójnym barwnikiem wykonaj sekwencję zdjęć, aby upewnić się, że zarówno sygnały napięcia, jak i wapnia są odpowiednie do analizy (brak interakcji między dwoma sygnałami).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mapowanie optyczne i indukcja arytmii 
	UWAGA: Mapowanie optyczne rozpoczyna się po ustaniu skurczu i odpowiednim obciążeniu barwnikiem, a serce jest kolejno perfundowane, jak w krokach opisanych powyżej w 2.1 (4).
	<ol>
		<li>Włącz dwie diody LED dla świateł wzbudzenia i dostosuj ich intensywność w odpowiednim zakresie (wystarczająco mocnym do oświetlenia i stosunkowo prostego filmowania, ale niezbyt wytrzymałym na prześwietlenie).</li>
		<li>Umieść serce pod urządzeniem wykrywającym, upewnij się, że jest odpowiednio oświetlone dwiema diodami LED i dostosuj średnicę plamki świetlnej do 2 cm.</li>
		<li>Ustaw odległość roboczą od obiektywu do serca na 10 cm, uzyskując częstotliwość próbkowania prawie 500 Hz i rozdzielczość przestrzenną 120 x 120 μm na piksel.</li>
		<li>Otwórz oprogramowanie do próbkowania sygnału, aby sterować kamerą cyfrowo w celu jednoczesnego przechwytywania sygnałów napięcia i wapnia.</li>
		<li>Uruchom stymulator pola mięśniotwórczego i ustaw wzorzec stymulacji na Transistor Transistor Logic (TTL), czas trwania stymulacji 2 ms dla każdego impulsu i 0,3 V jako intensywność początkową.</li>
		<li>Użyj 30 kolejnych bodźców S1 10 Hz, aby przetestować próg napięcia rozkurczowego serca sterowany przez oprogramowanie do rejestracji EKG. Stopniowo zwiększaj amplitudę napięcia, aż do uzyskania wychwytywania 1:1 (sprawdź falę QRS z monitora EKG, sygnały potencjału czynnościowego (AP) i stanów przejściowych wapnia (CaT)).</li>
		<li>Po określeniu progu napięcia, nadążaj za sercem z intensywnością 2-krotności progu napięcia rozkurczowego za pomocą pary platynowych elektrod przymocowanych do nasierdzia wierzchołka lewej komory (LV) (ELVA).</li>
		<li>Zaimplementuj protokół S1S1 do pomiaru przemian wapnia lub potencjału czynnościowego i właściwości restytucyjnych. Ćwicz kolejno tempo pracy serca przez podstawową długość cyklu wynoszącą 100 ms, zmniejszając długość cyklu o 10 ms w każdej następnej sekwencji, aż do osiągnięcia 50 ms. Każdy epizod to 30 następujących po sobie bodźców o szerokości impulsu 2 ms. W tym samym czasie rozpocznij mapowanie optyczne przed stymulacją (czas próbkowania obejmuje ~10 rytmów zatokowych i czas trwania stymulacji).</li>
		<li>Aby zmierzyć efektywny okres refrakcji komorowej (ERP) przy użyciu protokołu bodźca S1S2, zacznij od cyklu stymulacji S1S1 o długości 100 ms z S2 sprzężonym co 60 ms ze stopniowym zmniejszaniem o 2 ms, aż S2 nie uchwyci ektopowego zespołu QRS.</li>
		<li>W przypadku indukcji arytmii należy przeprowadzić nieustanne impulsy 50 Hz (50 ciągłych stymulacji elektrycznych o szerokości impulsu 2 ms) i wykonać ten sam epizod stymulacji po 2-sekundowym okresie spoczynku.</li>
		<li>Uważnie obserwuj zapisy EKG w ciągłym okresie stymulacji o wysokiej częstotliwości, tak aby jednoczesne zapisy mapowania optycznego mogły rozpocząć się natychmiast po wygenerowaniu interesującej arytmicznej fali EKG (ponieważ większość zaburzeń rytmu serca jest wywoływana przez stymulację elektryczną, sygnały optyczne są próbkowane 2-3 s przed stymulacją impulsową w przypadku utraty ważnych zdarzeń sercowych).</li>
		<li>Obraz za pomocą kamery EMCCD (częstotliwość próbkowania: 500 Hz, rozmiar piksela: 64 x 64).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>analiza danych
	<ol>
		<li>Wczytywanie obrazu i przetwarzanie sygnału
		<ol>
			<li>Naciśnij Wybierz folder i załaduj obrazy, aby załadować obrazy do oprogramowania do akwizycji obrazów w celu półautomatycznej analizy ogromnych danych wideo zgodnie z konfiguracją i protokołem opisanym wcześniej15,16.</li>
			<li>Wprowadź poprawne parametry próbkowania (takie jak rozmiar w pikselach i liczba klatek na sekundę).</li>
			<li>Ustaw próg obrazu poprzez ręczne wprowadzanie i wybierz obszar zainteresowania (ROI).</li>
			<li>Zaimplementuj filtr przestrzenny Gaussa 3 x 3 piksele, filtr Savitzky'ego-Goaly'ego i korekcję linii bazowej cylindra.</li>
			<li>Naciśnij przycisk Process Images, aby usunąć linię bazową i obliczyć parametry elektrofizjologiczne, takie jak APD80 i CaTD50.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Analiza parametrów elektrofizjologicznych
		<ol>
			<li>Ustaw czas inicjacji APD na szczycie i punkt końcowy na 80% repolaryzacji (APD80) w celu obliczenia APD80. Podobnie, czas rozpoczęcia CaTD jest zdefiniowany jako szczyt, a punkt końcowy jest zdefiniowany jako 80% relaksacji.</li>
			<li>Pomiar prędkości przewodzenia (CV) zależy od rozmiaru piksela i czasu przewodzenia potencjału czynnościowego między dwoma lub więcej pikselami. Oblicz średnią prędkość ze wszystkich wybranych pikseli - jest to średnia prędkość przewodzenia wybranego obszaru. Generuj jednocześnie odpowiednie mapy izochronne, aby uzyskać wyraźny obraz kierunku przewodzenia. 
			UWAGA: O'Shea et al.15 szczegółowo opisali pomiar CV.</li>
			<li>W przypadku analizy alternanów i arytmii, alternany wapnia definiuje się jako ciągłą dużą i małą amplitudę piku występującą naprzemiennie. Użyj współczynnika amplitudy piku, aby ocenić nasilenie alternanów zależnych od częstotliwości (1-A2/A1). Zastosuj mapy fazowe do analizy złożonych arytmii, takich jak częstoskurcz komorowy (VT). Szukaj wirników, które pojawiają się wyraźnie w określonym obszarze, gdy wirniki się przesuwają.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Priori, S. G., Chen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+dysfunction+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+handling+and+arrhythmogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis.</a> Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).</li>
<li>Goddard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+consequences+of+the+P2328S+mutation+in+the+ryanodine+receptor+%28RyR2%29+gene+in+genetically+modified+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Physiological consequences of the P2328S mutation in the ryanodine receptor (RyR2) gene in genetically modified murine hearts.</a> Acta Physiologica. 194 (2), 123-140 (2008).</li>
<li>Sabir, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternans+in+genetically+modified+langendorff-perfused+murine+hearts+modeling+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alternans in genetically modified langendorff-perfused murine hearts modeling catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Frontiers in Physiology. 1, 126(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Matthews, G. D., Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Ca2%2B+homeostasis%2C+atrial+arrhythmogenesis%2C+and+sinus+node+dysfunction+in+murine+hearts+modeling+RyR2+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Abnormal Ca2+ homeostasis, atrial arrhythmogenesis, and sinus node dysfunction in murine hearts modeling RyR2 modification.</a> Frontiers in Physiology. 4, 150(2013).</li>
<li>Leenhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+in+children.+A+7-year+follow-up+of+21+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in children. A 7-year follow-up of 21 patients.</a> Circulation. 91 (5), 1512-1519 (1995).</li>
<li>Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+cardiac+ryanodine+receptor+gene+%28hRyR2%29+underlie+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) underlie catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 103 (2), 196-200 (2001).</li>
<li>Wehrens, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+deficiency+and+defective+calcium+release+channel+%28ryanodine+receptor%29+function+linked+to+exercise-induced+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death.</a> Cell. 113 (7), 829-840 (2003).</li>
<li>Novak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+abnormalities+in+iPSC-derived+cardiomyocytes+generated+from+CPVT1+and+CPVT2+patients+carrying+ryanodine+or+calsequestrin+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional abnormalities in iPSC-derived cardiomyocytes generated from CPVT1 and CPVT2 patients carrying ryanodine or calsequestrin mutations.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 2006-2018 (2015).</li>
<li>Napolitano, C., Mazzanti, A., Bloise, R., Priori, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CACNA1C-related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22GeneReviews%22%5BJournal%5D)">CACNA1C-related disorders.</a> GeneReviews. Adam, M. P. , University of Washington. Seattle. (1993).</li>
<li>Makita, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+calmodulin+mutations+associated+with+congenital+arrhythmia+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation.+Cardiovascular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (4), 466-474 (2014).</li>
<li>Gomez-Hurtado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+CPVT-associated+calmodulin+mutation+in+CALM3+%28CALM3-A103V%29+activates+arrhythmogenic+Ca+waves+and+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%2C+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Novel CPVT-associated calmodulin mutation in CALM3 (CALM3-A103V) activates arrhythmogenic Ca waves and sparks.</a> Circulation, Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (8), (2016).</li>
<li>Wleklinski, M. J., Kannankeril, P. J., Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+tissue+mechanisms+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Journal of Physiology. 598 (14), 2817-2834 (2020).</li>
<li>Neco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+effect+of+increased+diastolic+Ca2%2B+release+and+decreased+sinoatrial+node+activity+in+a+mouse+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Paradoxical effect of increased diastolic Ca2+ release and decreased sinoatrial node activity in a mouse model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> Circulation. 126 (4), 392-401 (2012).</li>
<li>Bogdanov, K. Y., Vinogradova, T. M., Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinoatrial+nodal+cell+ryanodine+receptor+and+Na%28%2B%29-Ca%282%2B%29+exchanger%3A+molecular+partners+in+pacemaker+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Sinoatrial nodal cell ryanodine receptor and Na(+)-Ca(2+) exchanger: molecular partners in pacemaker regulation.</a> Circulation Research. 88 (12), 1254-1258 (2001).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ElectroMap%3A+High-throughput+open-source+software+for+analysis+and+mapping+of+cardiac+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">ElectroMap: High-throughput open-source software for analysis and mapping of cardiac electrophysiology.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1389(2019).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> Journal of Physiology. 529, 171-188 (2000).</li>
<li>Rybashlykov, D., Brennan, J., Lin, Z., Efimov, I. R., Syunyaev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+low-cost+cardiac+optical+mapping+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Open-source low-cost cardiac optical mapping system.</a> PLoS One. 17 (3), 0259174(2022).</li>
<li>Lucas-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+stereochemical+assignment+and+fluorescence+tuning+of+the+small+molecule+tool%2C+%28-%29-blebbistatin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Absolute stereochemical assignment and fluorescence tuning of the small molecule tool, (-)-blebbistatin.</a> European Journal of Organic Chemistry. 2005 (9), 1736-1740 (2005).</li>
<li>Ponsaerts, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myosin+II+ATPase+inhibitor+blebbistatin+prevents+thrombin-induced+inhibition+of+intercellular+calcium+wave+propagation+in+corneal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The myosin II ATPase inhibitor blebbistatin prevents thrombin-induced inhibition of intercellular calcium wave propagation in corneal endothelial cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (11), 4816-4827 (2008).</li>
<li>Jou, C., Spitzer, K., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+%26+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology & Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li>
<li>Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanical+uncoupler+blebbistatin+is+associated+with+significant+electrophysiological+effects+in+the+isolated+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).</li>
<li>O'Shea, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+optical+mapping+data+using+ElectroMap%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of optical mapping data using ElectroMap.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59663(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+of+dual+calcium+and+voltage+optical+mapping+in+healthy+and+hypertrophied+murine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">A dataset of dual calcium and voltage optical mapping in healthy and hypertrophied murine hearts.</a> Scientific Data. 8 (1), 314(2021).</li>
<li>Lei, M., Huang, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmogenesis%3A+a+tale+of+two+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmogenesis: a tale of two clocks.</a> Cardiovascular Research. 116 (14), e205-e209 (2020).</li>
<li>Mal Baudot,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+genetic+ablation+of+L-type+Cav1.3+%CE%B11D+and+T-type+Cav3.1+%CE%B11G+Ca2%2B+channels+disrupts+heart+automaticity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant genetic ablation of L-type Cav1.3 α1D and T-type Cav3.1 α1G Ca2+ channels disrupts heart automaticity.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18906(2020).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZO-1+regulates+intercalated+disc+composition+and+atrioventricular+node+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">ZO-1 regulates intercalated disc composition and atrioventricular node conduction.</a> Circulation Research. 127 (2), e28-e43 (2020).</li>
<li>Glukhov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calsequestrin+2+deletion+causes+sinoatrial+node+dysfunction+and+atrial+arrhythmias+associated+with+altered+sarcoplasmic+reticulum+calcium+cycling+and+degenerative+fibrosis+within+the+mouse+atrial+pacemaker+complex1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Calsequestrin 2 deletion causes sinoatrial node dysfunction and atrial arrhythmias associated with altered sarcoplasmic reticulum calcium cycling and degenerative fibrosis within the mouse atrial pacemaker complex1.</a> European Heart Journal. 36 (11), 686-697 (2015).</li>
<li>Torrente, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventricular+SK2+upregulation+following+angiotensin+II+challenge%3A+Modulation+by+p21-activated+kinase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Ventricular SK2 upregulation following angiotensin II challenge: Modulation by p21-activated kinase-1.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 164, 110-125 (2022).</li>
<li>Dong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dual+calcium-voltage+optical+mapping+in+murine+sinoatrial+preparation+with+optogenetic+pacing%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for dual calcium-voltage optical mapping in murine sinoatrial preparation with optogenetic pacing.</a> Frontiers in Physiology. 10, 954(2019).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+transverse+cardiac+slicing+and+optical+mapping+in+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A protocol for transverse cardiac slicing and optical mapping in murine heart.</a> Frontiers in Physiology. 10, 755(2019).</li>
<li>Hoeker, G. S., Katra, R. P., Wilson, L. D., Plummer, B. N., Laurita, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+calcium+release+in+tissue+from+the+failing+canine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous calcium release in tissue from the failing canine heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), H1235-H1242 (2009).</li>
<li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 280 (5), H2053-H2060 (2001).</li>
<li>Johnson, P. L., Smith, W., Baynham, T. C., Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+caused+by+combination+of+Di-4+ANEPPS+and+Fluo3%2F4+for+simultaneous+measurements+of+transmembrane+potentials+and+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Errors caused by combination of Di-4 ANEPPS and Fluo3/4 for simultaneous measurements of transmembrane potentials and intracellular calcium.</a> Annals of Biomedical Engineering. 27 (4), 563-571 (1999).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

Opierając się na naszym doświadczeniu, kluczem do udanego mapowania optycznego serca myszy z podwójnym barwnikiem jest dobrze przygotowane rozwiązanie i serce, obciążenie barwnikiem, osiągnięcie najlepszego stosunku sygnału do szumu i redukcja artefaktu ruchu.
Przygotowanie roztworu Roztwór Krebsa jest niezbędny do udanego eksperymentu na sercu. Roztwory podstawowe MgCl2 i CaCl2 (1 mol/l) przygotowuje się z wyprzedzeniem, biorąc pod uwagę ich absorpc...

Dziedziczna choroba serca katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy (CPVT) objawia się epizodami polimorficznego częstoskurczu komorowego (PVT) po aktywności fizycznej, stresie lub prowokacji katecholaminą, które mogą przekształcić się w potencjalnie śmiertelne migotanie komór1,2,3,4. Ostatnie dowody po pierwszym raporcie jako zespół kliniczny w 1995 r. implikowały mutacje w siedmiu genach, wszystkie zaangażowane w sarkoplazmatyczne siatkowate (SR) magazynują uwalnianie Ca2 + w tym stanie: najczęściej zgłaszany RYR2 kodujący receptor ryanodine 2 (RyR2) kanałów uwalniania Ca2 + 5,6, FKBP12.67, CASQ2 kodujący sercową kalsekwetrynę8, TRDN kodujący skrzyżowane białko SR triadin9 oraz CALM19, CALM210 i CALM3 identycznie kodujące calmodulin11,12. Te wzorce genotypowe przypisują zdarzenia arytmiczne nieuregulowanemu patologicznemu uwalnianiu SR przechowuje Ca2 + 12.
Spontaniczne uwolnienie Ca2+ z SR może być wykryte jako iskry Ca2+ lub fale Ca2+, co aktywuje wymiennik Na+/Ca2+ (NCX). Wymiennik jednego Ca2+ na trzy Na+ generuje prąd wewnętrzny, który przyspiesza depolaryzację rozkurczową i doprowadza napięcie membrany do progu potencjału czynnościowego (AP). U myszy knock-in RyR2 zwiększona aktywność RyR2R4496C w węźle zatokowo-przedsionkowym (SAN) prowadzi do nieoczekiwanego zmniejszenia automatyzmu SAN o zależny od Ca2 + spadek wyczerpania ICa, L i SR Ca2 + podczas rozkurczu, identyfikując subkomórkowe zmiany patofizjologiczne przyczyniające się do dysfunkcji SAN u pacjentów z CPVT13,14. Wystąpienie powiązanych kardiomiocytów cytozylotycznych fal Ca2 + jest bardziej prawdopodobne po wzroście cytozolu tła [Ca2 +] po uczuleniu RyR przez katecholaminę, w tym izoproterenol (ISO), prowokację.
Szczegółowe zmiany kinetyczne w sygnalizacji Ca2+ po uwolnieniu Ca2+ za pośrednictwem RyR2 w odpowiedzi na aktywację potencjału czynnościowego (AP), które mogą być przyczyną obserwowanych komorowych zaburzeń rytmu serca w nienaruszonych modelach CPVT serca, pozostają do ustalenia dla pełnego zakresu zgłoszonych genotypów RyR212. W artykule przedstawiono konfigurację oprzyrządowania i procedurę eksperymentalną do wysokoprzepustowego mapowania sygnałów Ca2 + i potencjałów transbłonowych (Vm) w mysich sercach typu dzikiego (WT) i heterozygotycznego RyR2-R2474S/+, w połączeniu z zaprogramowaną stymulacją elektryczną przed i po prowokacji izoproterenolem. Protokół ten zapewnia metodę mechanistycznego badania choroby CPVT w izolowanych sercach myszy.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mu; m filtr strzykawkowy</td><td>Fabryka sprzętu medycznego Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>Nie dotyczy</td><td>Do filtrowania roztworu</td></tr><tr><td>15 ml probówki wirówkowej</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. Chiny</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipety Pasteura</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd. Chiny</td><td>00900026</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>B. Braun Medical Inc.</td><td>YZB/GER-5474-2014</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L Rurka PCR</td><td>Sangon Biotech Co., Ltd. Szanghaj. Chiny</td><td>F611541-0010</td><td>Aliquote roztwory podstawowe&nbsp; aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania</td></tr><tr><td>50 ml probówki wirówkowej</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. Chiny</td><td>CFT011500</td><td>Przechowuj roztwór Tyrode w temperaturze 4 & stopni; C do kontrolnej izolacji serca</td></tr><tr><td>Filtr 585/40 nm</td><td>Technologia Chroma</td><td>N/A</td><td>Filtr sygnału wapniowego</td></tr><tr><td>Filtr długoprzepustowy 630 nm</td><td>Technologia Chroma</td><td>G15604AJ</td><td>Filtr sygnału napięciowego</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-tribromoetanol)</td><td>Sigma-Aldrich Poole, Dorset, Wielka Brytania</td><td>T48402-100G</td><td>Aby zminimalizować cierpienie i odruch bólowy</td></tr><tr><td>Blebbistatyna</td><td>Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, Stany Zjednoczone</td><td>SLBV5564</td><td>Rozprzęgacz wzbudzenia-skurczu do&nbsp; eliminacji artefaktów ruchu podczas mapowania</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone</td><td>SLBK1794V</td><td>Dla rozwiązania Tyrode</td></tr><tr><td>Wanna termostatyczna wykonana na zamówienie</td><td>MappingLab, Wielka Brytania</td><td>TBC-2.1</td><td>Aby utrzymać temperaturę roztworu</td></tr> <tr><td>perfuzyjnegoDimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>(RNBT7442)Rozpuszczalnik</td> <td>do barwników</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumonta</td><td>Fabryka sprzętu medycznego Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>Oprogramowanie YAF030</td><td></td></tr><tr><td>ElectroMap</td><td>University of Birmingham</td><td>N/A</td><td>Kwantyfikacja parametrów elektrycznych</td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, Stany Zjednoczone</td><td>A18G150001</td><td>Pozyskiwanie obrazów sygnałów optycznych</td></tr><tr><td>Filtr napylany ET525/36</td><td>Technologia Chroma</td><td>319106</td><td>Filtr wzbudzenia</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone</td><td>SLBT4811V</td><td>Dla roztworu Tyrode'a</td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, Chiny</td><td>(H51021209)</td><td>Aby zapobiec zakrzepom krwi w tętnicy wieńcowej</td></tr><tr><td>&nbsp; Kleszcze do tęczówki</td><td>Fabryka sprzętu medycznego Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>YAA010</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>MedChemExpress, Carlsbad, CA, Stany Zjednoczone</td><td>HY-B0468/CS-2582</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone</td><td>SLBS5003</td><td>Dla rozwiązania Tyrode</td></tr><tr><td>MacroLED</td><td>Cairn Research, Faversham, Wielka Brytania</td><td>7355/7356</td><td>Światło wzbudzenia sond fluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Źródło światła MacroLED</td><td>Cairn Research, Faversham, Wielka Brytania</td><td>7352</td><td>Kontroluj diody LED</td></tr><tr><td>Nożyczki Mayo Fabryka</td><td>sprzętu medycznego Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Szanghaj, Chiny</td><td>YBC010</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MetaMorph Molecular Devices</td><td>Nie dotyczy</td><td>Próbkowanie sygnałów optycznych</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone</td><td>BCBS6841V</td><td>Dla rozwiązania Tyrode'a</td></tr><tr><td>MICRO3-1401</td><td>Cambridge Electronic Design limited, Wielka Brytania</td><td>M5337</td><td>Podłącz stymulator elektryczny i oprogramowanie Spike2</td></tr><tr><td>Stymulator pola MyoPacer EP</td><td>Ion Optix Co, Milton, MA, Stany Zjednoczone</td><td>S006152</td><td>Stymulator elektryczny</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone</td><td>SLBS2340V</td><td>Dla rozwiązania Tyrode'a</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp; </td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone</td><td>BCBW9042</td><td>Dla rozwiązania Tyrode</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone</td><td>SLBX3605</td><td>Dla rozwiązania Tyrode</td></tr><tr><td>NeuroLog System</td><td>Digitimer</td><td>NL905-229</td><td>Do wzmacniacza EKG</td></tr><tr><td>OmapScope5</td><td>MappingLab, Wielka Brytania</td><td>Nie dotyczy</td><td>Alternany wapnia i analiza arytmii</td></tr><tr><td>Nożyczki okulistyczne</td><td>Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, Chiny</td><td>T4-3904</td><td></td></tr><tr><td>OptoSplit</td><td>Cairn Research, Faversham, Wielka Brytania</td><td>6970</td><td>Podziel światło emisyjne do wykrywania Ca2+ i Vm&nbsp jednocześnie</td></tr><tr><td>Pompa perystalyczna</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, Chiny, </td><td>BT100-2J</td><td>Do pompowania roztworu</td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010060</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, Stany</td><td>Zjednoczone 1899021</td><td>Aby zwiększyć obciążenie za pomocą Rhod2AM</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>1971387</td><td>Barwnik wrażliwy</td></tr><tr><td>na napięcie Rhod-2 AM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA, Stany Zjednoczone</td><td>1890519</td><td>Wskaźnik wapnia</td></tr><tr><td>Rurka z żelem krzemionkowym</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, Chiny,</td> <td>96402-16</td><td>Połącz się z pompą perystaltyczną</td></tr><tr><td>Szew jedwabny</td><td>Yuankang Medical Instrument Co., Ltd., Yangzhou, Chiny</td><td>20172650032</td><td>Aby naprawić aortę</td></tr><tr><td>Spike2</td><td>Cambridge Electronic Design limited, Wielka Brytania</td><td>Nie dotyczy</td><td>Rejestrowanie i analizowanie danych EKG</td></tr><tr><td>Stymulacja elektroda</td><td>MappingLab, Wielka Brytania</td><td>SE1600-35-2020</td><td></td></tr><tr><td>T510lpxr</td><td>Technologia Chroma</td><td>312461</td><td>Do źródła światła</td></tr><tr><td>T565lpxr</td><td>Technologia Chroma</td><td></td><td>321343 Do źródła światła</td></tr></tbody></table>

podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc z myszy ryr2r2474s knock-in z kataecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym

Dual-Dye Optical Mapping of Hearts from RyR2R2474S Knock-In Mice of Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia

Pro-arytmiczne zaburzenie serca katecholaminergiczne polimorficzne częstoskurcze komorowe (CPVT) objawia się jako epizody polimorficznego częstoskurczu komorowego po aktywności fizycznej, stresie lub prowokacji katecholaminami, które mogą przekształcić się w potencjalnie śmiertelne migotanie komór. Serce myszy jest szeroko rozpowszechnionym gatunkiem do modelowania dziedzicznych chorób arytmicznych serca, w tym CPVT. Jednoczesne optyczne mapowanie potencjału transbłonowego (Vm) i stanów przejściowych wapnia (CaT) z serc myszy z perfuzją Langendorffa może wyjaśnić mechanizmy leżące u podstaw arytmogenezy. W porównaniu z badaniem na poziomie komórkowym, technika mapowania optycznego może testować niektóre parametry elektrofizjologiczne, takie jak określenie aktywacji, prędkość przewodzenia, czas trwania potencjału czynnościowego i czas trwania CaT. W artykule przedstawiono konfigurację oprzyrządowania i procedurę eksperymentalną wysokoprzepustowego mapowania optycznego CaT i Vm w mysich sercach typu dzikiego i heterozygotycznego RyR2-R2474S/+, w połączeniu z zaprogramowaną stymulacją elektryczną przed i w trakcie prowokacji izoproterenolem. Podejście to wykazało wykonalną i wiarygodną metodę mechanistycznego badania choroby CPVT w preparacie serca myszy ex vivo.

Mapowanie optyczne było w ciągu ostatniej dekady popularnym podejściem w badaniu złożonych arytmii serca. Układ do mapowania optycznego składa się z kamery EMCCD, zapewniającej częstotliwość próbkowania do 1 000 Hz i rozdzielczość przestrzenną 74 x 74 µm dla każdego piksela. Pozwala to na uzyskanie dość wysokiego stosunku sygnału do szumu podczas próbkowania sygnału (Rysunek 1). Gdy serce perfundowane metodą Langendorffa osiągnie stan stabilny, a ładowanie barwników zostanie zakończone, serc...

Ten protokół wprowadza dwubarwne optyczne mapowanie serc myszy uzyskanych od zwierząt typu dzikiego i knock-in dotkniętych katacholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym, w tym elektrofizjologiczne pomiary napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych Ca2+ o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej.

Podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc z myszy RyR2R2474S Knock-In z kataecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym

The pro-arrhythmic cardiac disorder catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) manifests as polymorphic ventricular tachycardia episodes ...

Metoda ta pomoże nam ujawnić właściwości elektrofizjologiczne i mechanizmy rozmazów z zatrzymaniem komór związanych z chorobami takimi jak katecholaminergiczny polimorficzny częstoskurcz komorowy. Korzystając z tej techniki, możemy uzyskać potencjał błonowy i międzykomórkowe sygnały wapnia jednocześnie w różnych zaprogramowanych protokołach stymulacji elektrycznej, co jest szczególnie przydatne do badania mechanizmów leżących u podstaw i dynamiki choroby arytmicznej serca, takiej jak CPVT. Aby pomyślnie przeprowadzić ten eksperyment, upewnij się, że masz dobrze ukrwione serce, prawidłowe ładowanie barwnika, rozprzęganie wzbudzenia-skurczu i staranne ustawienia aparatu.Aby rozpocząć, skonfiguruj system mapowania optycznego i włącz kamerę, aby uzyskać stabilną temperaturę próbkowania na poziomie minus 50 stopni Celsjusza. Umieść zebrane serce myszy w zimnym roztworze CREB, aby spowolnić metabolizm i chronić serce. Usuń otaczającą tkankę aorty.Użyj specjalnie wykonanej igły kaniulowej, aby ją kaniulować i przymocuj za pomocą jedwabnego szwu 4-0. Teraz perfuzjuj serce za pomocą systemu Langendorffa ze stałą prędkością od 3,5 do 4,0 mililitrów na minutę. Włóż małą plastikową rurkę do lewej komory, aby uwolnić przekrwienie roztworu w komorze, aby uniknąć nadmiernego obciążenia wstępnego i zamocuj plastikową rurkę w igle kaniulowej.Następnie umieść dwa przewody w perfuzacie w kąpieli i włącz zasilanie skrzynki wzmacniacza elektrokardiogramu i kontrolera stymulacji elektrycznej. Następnie rozpocznij przywołany elektrokardiogram lub oprogramowanie EKG i stale monitoruj EKG. Kolejne kroki wykonuj w ciemności, gdy serce osiągnie stan stabilny.Mieszaninę roztworu bróbstatyny CREBs należy stale wprowadzać do serca przez 10 minut, aby rozłączyć skurcz od wzbudzenia i uniknąć artefaktów skurczu podczas filmowania. Następnie za pomocą czerwonej latarki zbadaj serce, aby potwierdzić całkowite ustąpienie skurczów. Perfuzję serca roztworem roboczym Rhod-2 AM przez 15 minut w systemie perfuzyjnym Langendorffa po rozprzęgnięciu skurczu wzbudzenia.Utrzymuj dopływ tlenu podczas wewnątrzkomórkowego ładowania barwnikiem wapniowym. Aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków z pluronicznego F-127, włóż pułapkę bąbelkową do systemu perfuzyjnego. Rozcieńczyć 10 mikrolitrów roztworu podstawowego RH 237 w 50 mililitrach perfuzatu i ładować przez 10 minut.Po zakończeniu ładowania podwójnego barwnika zrób sekwencję zdjęć. Upewnij się, że sygnały napięcia i wapnia są odpowiednie do analizy. Włącz dwie diody LED dla świateł wzbudzenia i dostosuj ich intensywność do odpowiedniego zakresu.Umieść serce pod urządzeniem wykrywającym, upewniając się, że jest dobrze oświetlone przez dwie diody LED regulujące średnicę plamki świetlnej do dwóch centymetrów. Ustaw odległość roboczą między obiektywem a sercem na 10 centymetrów, aby uzyskać żądaną częstotliwość próbkowania i rozdzielczość przestrzenną. Otwórz oprogramowanie do próbkowania sygnału, aby jednocześnie sterować kamerą i przechwytywać sygnały napięcia i wapnia.Uruchom stymulator pola MyoPacer i ustaw wzorzec stymulacji na logikę tranzystora tranzystorowego z dwoma milisekundami czasu trwania stymulacji na impuls. Ustaw początkową intensywność na 0.3 wolta. Umieść parę platynowych elektrod przymocowanych do nasierdzia wierzchołka lewej komory.Zastosuj 30 kolejnych bodźców S1 o częstotliwości 10 Hz, aby przetestować próg napięcia rozkurczowego serca za pomocą oprogramowania do rejestracji EKG. Stopniowo zwiększaj amplitudę napięcia, aż do uzyskania wychwytywania jeden do jednego. Zaimplementuj protokół S1-S1 do pomiaru przemian wapnia lub potencjału czynnościowego oraz właściwości restytucyjnych.Ćwicz kolejno tempo pracy serca, zaczynając od podstawowej długości cyklu wynoszącej 100 milisekund. Zmniejsz długość cyklu o 10 milisekund w każdej kolejnej sekwencji, aż osiągnie 50 milisekund. Jednocześnie zainicjuj mapowanie optyczne przed stymulacją.Aby zmierzyć efektywny okres refrakcji komorowej za pomocą protokołu bodźcowego S1-S2, zacznij od cyklu stymulacji S1-S1 o długości 100 milisekund. Połącz S2 w 60 milisekundach i zmniejszaj o dwa milisekundy krok, aż S2 nie uchwyci ektopowego zespołu QRS. W przypadku indukcji arytmii podawaj ciągłą stymulację impulsów 50 Hz i wykonaj ten sam epizod stymulacji po odczekaniu dwusekundowej przerwy w spoczynku.Uważnie monitoruj zapisy elektrokardiogramu w ciągłym okresie stymulacji wysokiej częstotliwości, aby natychmiast rozpocząć jednoczesne zapisy mapowania optycznego, gdy generowana jest interesująca fala arytmiczna. Kontynuuj przechwytywanie obrazów za pomocą kamery ze sprzężeniem z ładunkiem zwielokrotnionym elektronami. W oprogramowaniu do akwizycji obrazów naciśnij Wybierz folder i załaduj obrazy, aby rozpocząć półautomatyczny proces analizy ogromnych danych wideo.Wprowadź prawidłowe parametry pobierania próbek do analizy. Ręcznie ustaw próg obrazu i wybierz obszar zainteresowania. Zastosuj filtr przestrzenny Gaussa o wymiarach trzy na trzy piksele, filtr Savitzky'ego-Golaya i korekcję linii bazowej cylindra.Następnie naciśnij Przetwarzaj obrazy, aby usunąć linię bazową i obliczyć parametry elektrofizjologiczne, takie jak APD-80 i CATD-50. Ustaw czas inicjacji czasu trwania potencjału czynnościowego na szczycie i punkcie końcowym na 80% repolaryzacji w celu obliczenia APD-80. Podobnie zdefiniuj czas rozpoczęcia przejściowego czasu trwania wapnia jako szczyt, w którym punktem końcowym jest 80% relaksacji.Pokazano typowe ślady na mapach cieplnych APD-80 i CATD-80. Izoproterenol skraca APD-80 i myszy typu dzikiego i katecholaminergicznego polimorficznego częstoskurczu komorowego lub CPVT, ale nie stwierdzono różnicy po prowokacji izoproterenolem. U myszy CATD-80 i CPVT występował dłużej niż u typu dzikiego po prowokacji izoproterenolem, podczas gdy przed leczeniem nie było znaczenia.Zgodnie z sygnałami napięciowymi, serca typu dzikiego i CPVT miały taką samą zdolność przewodzenia przez nasierdzie na początku i po interwencji izoproterenolu. Mapy cieplne wykazały, że myszy CPVT mają taką samą zdolność przewodzenia jak myszy typu dzikiego przed i po prowokacji izoproterenolem. Analiza alternatywnej amplitudy wapnia wykazała, że sygnały wapniowe w sercach typu dzikiego pozostawały stabilne na początku badania podczas kolejnych stymulacji S1-S1 przy 14,29 i 16,67 herców, podczas gdy serca CPVT wykazywały naprzemienne zależne od częstotliwości.Po prowokacji izoproterenolem serca CPVT wykazywały zależne od częstotliwości przemiany i sygnał wapniowy podczas stymulacji S1-S1, podczas gdy serca typu dzikiego nie były dotknięte. Analiza arytmii Tachy sugerowała, że zarówno serca typu dzikiego, jak i CPVT wykazują normalne przewodzenie podczas stymulacji impulsów 50 Hz na początku badania. Po obfitości z izoproterenolem, serca CPVT wykazywały wirniki o wysokiej częstotliwości po 50 Hz burst, podczas gdy serca typu dzikiego utrzymywały normalne przewodzenie.Zgodnie z tą procedurą, typy adogen i myszy typu dzikiego są używane do zilustrowania właściwości elektrofizjologicznych i funkcjonalnych w tych modelach lub w wynalazku farmaceutycznym. Mapowanie optyczne jest potężnym narzędziem do badania arytmii serca, jednak nie może być stosowane klinicznie ze względu na ograniczenie barwnika fluorescencyjnego w ramach rozprzęgania skurczu wzbudzenia. Wraz z rozwojem fluorescencji właściwej dla różnych cząsteczek docelowych w ramach rozwoju technologii obliczeniowej o wysokiej prędkości obrotowej, technika mapowania optyku serca z pewnością osiągnie tylko zastosowania.

dual-dye-optical-mapping-hearts-from-ryr2r2474s-knock-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje technikę o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej do obrazowania optycznego przemieszczania się potencjału czynnościowego na powierzchni serca szczura perfundowanego metodą Langendorffa z wykorzystaniem barwnika potencjometrycznego (di-8-ANEPPS).

Mapowanie optyczne serc szczurzych perfundowanych metodą Langendorffa

Niniejszy raport zawiera szczegółowy opis metodologii i wyników jednoczesnego endokardialnego i epikardialnego mapowania optycznego wzbudzenia elektrycznego w nienaruszonym lewym przedsionku serca owczego perfundowanego metodą Langendorffa podczas indukowanego rozciąganiem migotania przedsionków.

Optyczne mapowanie wysokiej rozdzielczości wsierdzia i osierdzia w owczym modelu migotania przedsionków wywołanego rozciąganiem

Niniejszy artykuł opisuje podstawowe procedury przeprowadzania eksperymentów mapowania optycznego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa z wykorzystaniem panoramicznego systemu obrazowania oraz podwójnej modalności obrazowania (napięciowego i wapniowego).

Multiparametryczne mapowanie optyczne serca królika perfundowanego metodą Langendorffa

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedurę sekcji, konfigurację aparatury oraz warunki eksperymentalne podczas mapowania optycznego potencjału błonowego (Vm) i wewnątrzkomórkowych przejściowych zmian stężenia wapnia (CaT) w nienaruszonych, izolowanych sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa.

Mapowanie optyczne potencjałów czynnościowych i przejściowych zmian stężenia wapnia w sercu myszy

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół i sprzęt niezbędny do podwójnego optycznego mapowania potencjału transbłonowego (Vm) i wolnej retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego (SR) Ca2+ w sercu królika z perfundacją Langendorffa. Metoda ta pozwala na bezpośrednią obserwację i kwantyfikację dynamiki Vm i SR Ca2+ w nienaruszonym sercu.

Mapowanie optyczne retikulum wewnątrzsarkoplazmatycznego Ca2+ i potencjału transbłonowego w sercu królika perfundowanym metodą Langendorffa

Tutaj prezentujemy protokół optycznego mapowania aktywności elektrycznej z prawego przedsionka myszy, a zwłaszcza węzła zatokowo-przedsionkowego, w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.

Mapowanie optyczne węzła zatokowo-przedsionkowego myszy w wysokiej rozdzielczości

Ten protokół opisuje elektrofizjologiczną ocenę przedsionków myszy za pomocą optycznego systemu mapowania o wysokiej rozdzielczości czasowej i przestrzennej, w tym podwójne zapisy napięcia membranowego i Ca2+ przejściowego pod zaprogramowaną stymulacją przez specjalistyczny cewnik elektrodowy.

Elektrofizjologiczna ocena przedsionków myszy z mapowaniem optycznym o wysokiej rozdzielczości

Prezentujemy metodologię izolacji mysich miocytów oraz sposób uzyskiwania śladów napięcia lub wapnia jednocześnie ze śladami skracania sarkomeru za pomocą fotometrii fluorescencyjnej z jednoczesnymi cyfrowymi pomiarami geometrii komórek.

Obrazowanie optyczne izolowanych mysich miocytów komorowych

Ten protokół opisuje procedurę cięcia i hodowli ludzkich wycinków serca do przedklinicznych testów leków oraz szczegółowo opisuje użycie mapowania optycznego do jednoczesnego rejestrowania napięcia transbłonowego i wewnątrzkomórkowych sygnałów wapnia z tych wycinków.

Przedkliniczna ocena elektrofizjologii serca za pomocą optycznego mapowania dwunapięciowego i wapniowego ludzkich organotypowych wycinków serca

Ta praca opisuje metodę kontrolowania rytmu serca nienaruszonych mysich serc transgenicznych myszy z rodopsyną kanałową-2 (ChR2) za pomocą lokalnej fotostymulacji za pomocą mikro-LED i jednoczesnego optycznego mapowania potencjału błony nasierdziowej.

Zaawansowane zarządzanie rytmem serca poprzez zastosowanie optogenetycznej fotostymulacji wieloośrodkowej w mysich sercach

Poznaj podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc myszy z mutacją RyR2R2474S w badaniu kataecholaminergicznego polimorficznego częstoskurczu komorowego. Ta metoda umożliwia jednoczesny pomiar potencjału błonowego i sygnałów wapniowych, co pozwala zrozumieć mechanizmy arytmii serca.

Podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc z myszy RyR2R2474S Knock-In z kataecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym (Wideo) | JoVE Journal

Podwójnie barwnikowe mapowanie optyczne serc z myszy RyR2^R2474S Knock-In z kataecholaminergicznym polimorficznym częstoskurczem komorowym

Przeglądaj więcej filmów