Produkcja ludzkich neuronów indukowanych neurogeniną 2 w trójwymiarowym bioreaktorze zawiesinowym

Wykorzystanie bioreaktorów do translacji indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub protokołów hodowli IPSC z 2D na 3D umożliwia generowanie dużej liczby komórek do zastosowań na dużą skalę, takich jak wysokoprzepustowe badania przesiewowe. Ten protokół szybkiego różnicowania neuronów w fizjologicznym środowisku 3D poprawia interakcje między komórkami startowymi i zapewnia wysoką wydajność komórek w krótszym czasie przy niskiej zmienności między partiami = partiami, zmniejszając w ten sposób koszty i czas. Europejski Bank Indukowanych Pluripotencjalnych Komórek Macierzystych stosuje podobne podejścia do szybkiego i opłacalnego generowania zróżnicowanych komórek w wielu liniach, w tym innych komórek mózgowych i kardiomiocytów.

Rozpocznij wstępną uprawę, gdy indukowana przez człowieka pluripotencjalna komórka macierzysta lub ludzka hodowla iPSC jest zlewająca się w 60 do 80%. Całkowicie odessać pożywkę z ludzkich iPSC i delikatnie przepłukać komórki dwukrotnie 1X DPBS. Dodaj dwa mililitry podgrzanego roztworu trypsyny EDTA do sześciocentymetrowej szalki Petriego i inkubuj komórki przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze.

Następnie delikatnie postukaj w szalki, aby ułatwić oderwanie komórek lub inkubuj przez jedną do dwóch minut dłużej, jeśli komórki się nie odłączają. Następnie ponownie zawieś komórki w każdym naczyniu, dodając pięć mililitrów pożywki konserwacyjnej IPSC z inhibitorem ROCK. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej lub 50-mililitrowej probówki i delikatnie wymieszaj, pipetując, aby zapewnić pojedynczą komórkę.

Określ liczbę komórek w 100 mikrolitrach zawiesiny komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i przenieś żądaną objętość zawiesiny komórek do 50-mililitrowej probówki. Odwirować komórki w temperaturze 300 G przez trzy minuty. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach pożywki konserwacyjnej IPSC bez podajnika z inhibitorem ROCK.

Napełnij każdą 50-mililitrową tubkę 18 mililitrami pożywki. Następnie dozuj 20 mililitrów zawiesiny komórek do każdej probówki bioreaktora. Umieść rurki w systemie bioreaktora i ustaw parametry uprawy na nieograniczony czas.

Uruchom program uprawy wstępnej za pomocą wyświetlacza bioreaktora. Aby zmienić pożywkę następnego dnia, pozwól kruszywu osiąść w probówkach bioreaktora na około pięć minut, a następnie ostrożnie zasysaj supernatant. Dodać 15 mililitrów świeżej, bezpodajnej pożywki konserwacyjnej IPSC bez inhibitora ROCK na probówkę i kontynuować uprawę w bioreaktorze laboratoryjnym przez 24 godziny.

Aby rozpocząć różnicowanie neuronów, pozwól agregatowi osiąść w probówkach bioreaktora i ostrożnie odessaj supernatant z komórek, pozostawiając około pięciu mililitrów supernatantu w probówce. Następnie dodaj 35 mililitrów pożywki do indukcji neuronalnej składającej się z pożywki neuropodstawowej i dwóch mikrogramów na mililitr doksycykliny. Umieść probówki z powrotem w bioreaktorze stołowym i kontynuuj uprawę.

Wykonuj zmiany nośników codziennie przez dwa dni, jak pokazano wcześniej. Po zaessaniu supernatantu, jak pokazano wcześniej, przenieść agregaty do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów lub 50 mililitrów i delikatnie przepłukać agregaty dwa razy DPBS. Ostrożnie zassać supernatant tak bardzo, jak to możliwe, nie naruszając agregatów.

Następnie dodaj od dwóch do pięciu mililitrów wstępnie podgrzanego enzymu dysocjacji komórek do osadu, w zależności od wielkości osadu, i inkubuj komórki przez około 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Delikatnie zawieszaj osadzone agregaty co dwie minuty, aż do ich dysocjacji. Dodaj wstępnie podgrzane podłoże neurobazalne, trzykrotnie większą objętość niż poprzednio dodany enzym dysocjacji komórek, i ostrożnie ponownie zawieś komórki, aby zapewnić ich singularyzację.

Określ liczbę komórek i przenieś odpowiednią objętość zawiesiny komórek do kriokonserwacji do probówki o pojemności 15 mililitrów lub 50 mililitrów. Wirować do komórek o sile 300 G przez trzy minuty. Odessać supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki zamrażającej zawierającej 10% dimetylosulfotlenku.

Podwielokrotnić zawiesinę komórkową w odpowiednich fiolkach do kriokonserwacji. Natychmiast przenieść fiolki do wstępnie schłodzonego, wolno zamrażającego pojemnika wypełnionego 2-propanolem i umieścić pojemnik w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na noc. Umieść fiolki w temperaturze minus 150 stopni Celsjusza następnego dnia w celu długotrwałego przechowywania.

Po odłączeniu, wyizolowaniu i przeniesieniu do zawiesiny przylegających kultur ludzkich iPSC agregaty uformowały się w ciągu 24 godzin i kontynuowały wzrost. Po dwóch dniach indukcji transgenu wczesne neurony można było poddać krioprezerwacji w celu późniejszego dojrzewania. Zaobserwowano trwałą proliferację ludzkich iPSC w pierwszych dniach w zawiesinie, a liczba hodowli komórkowych osiągnęła szczyt po dwóch dniach indukcji.

Jednak długotrwała hodowla przez ponad cztery dni w zawiesinie nie poprawiła wydajności komórek, ponieważ agregaty stawały się coraz bardziej odporne na singularyzację enzymatyczną. Co więcej, w porównaniu z dniem zero, średnica agregatu wzrosła o 50% w drugim dniu i prawie podwoiła się w piątym dniu. Chociaż zwiększanie średnicy ogranicza dopływ składników odżywczych do agregatów, żywotność komórek nie uległa zmianie w drugim lub piątym dniu różnicowania.

Czasowy profil ekspresji genów, a także barwienie immunochemiczne markerów neuronalnych beta trójki tubuliny i białka związanego z mikrotubulami (MAP2) potwierdziły tożsamość komórek neuronalnych komórek kriokonserwowanych w drugiej dobie. Ponadto kultury neuronalne zostały wzbogacone w transkrypty białka tau związane z mikrotubulami lub MAPT i wykazały jednoczesny spadek ekspresji czynnika transkrypcyjnego regulującego pluripotencję POU5F1 W ciągu pierwszego tygodnia po rozmrożeniu utworzyła się gęsta sieć neurytyczna, co również sugerowało rosnące dojrzewanie kultur neuronalnych. Protokół ten stanowi podstawę do translacji na duże i w pełni zautomatyzowane bioreaktory, które wykazują dalszy znaczny wzrost wydajności komórek dla przyszłych zastosowań na dużą skalę.

Po udowodnieniu z neurogeniną 2, zastosowanie liniowych czynników transkrypcyjnych determinujących w celu przyspieszenia różnicowania zostało zastosowane do wielu różnych typów komórek i chorób, aby ułatwić modelowanie iPSC.