Name: Produkcja ludzkich neuronów indukowanych neurogeniną 2 w trójwymiarowym bioreaktorze zawiesinowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Poznaj protokół różnicowania neuronów z ludzkich komórek iPSC w trójwymiarowym bioreaktorze zawiesinowym. Ta metoda zapewnia wysoką wydajność komórkową i niską zmienność między partiami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt EBiSC2 otrzymał dofinansowanie od Wspólnego Przedsięwzięcia (JU) Inicjatywy Leków Innowacyjnych (JU) na podstawie umowy o grant nr 821362. Wspólne Przedsięwzięcie otrzymuje wsparcie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji "Horyzont 2020" oraz EFPIA. Dziękujemy Nadine J. Smandzich, Helene D. M. Hemmer, Johnn-Majd Balsters i Vanessie M. Nalewaja za pomoc w analizach immunocytochemicznych i ekspresji genów, a także Heike Arthen za doskonałe wsparcie techniczne. Ponadto dziękujemy Stephanie Bur za stworzenie programu bioreaktorów. Rysunek 2A został utworzony za pomocą BioRender.com.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Wcześniej wykazano, że ektopowa ekspresja neuronalnego czynnika transkrypcyjnego NGN2 przyspiesza wczesne etapy różnicowania neuronów i indukuje zaangażowanie linii neuronalnej w hiPSC w ciągu 1 tygodnia od hodowli 12,13,20. W niniejszej pracy opisano szczegółowy protokół różnicowania hiPSC BIONi010-C-13 z edytowanymi genami w neurony iNGN2 przy użyciu bioreaktora laboratoryjnego.
Bioreaktor CERO 3D to bioreaktor o małej objętości z czterema szczelinami na specjalistyczne rurki, każda o maksymalnej pojemności 50 ml. Temperatura i poziom CO2 są stale kontrolowane, a parametry uprawy (np. prędkość obrotowa i czas) są regulowane dla każdej rury, niezależnie umożliwiając użytkownikom równoległe stosowanie kilku podejść do różnicowania. Zintegrowane łamacze fal na wewnętrznej ściance rury pozwalają na zakłócenia medium przy niskim naprężeniu ścinającym i utrzymują agregaty 3D w zawieszeniu podczas kontrolowanego obrotu. Ograniczony dostęp do składników odżywczych, a także wymuszone interakcje 3D komórka-komórka i komórka-macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), mogą znacząco wpływać na różnicowanie i zachowanie komórek 24,25,26,27.
Hodowla komórek jako agregatów 3D w zawiesinie zwiększa te interakcje komórkowe, naśladując w ten sposób bardziej zbliżone środowisko in vivo tkanek lub narządów28. Jednoczesne zaburzenie ośrodka reguluje wielkość agregatu pod wpływem tarcia mechanicznego, poprawia wymianę gazową i zmniejsza gradient składników odżywczych i odpadów w rurze, zachowując jednocześnie fizjologicznie odpowiednie gradienty wewnątrz agregatów 29,30,31,32,33,34. Chociaż zmiany podłoża są wykonywane ręcznie, bioreaktor laboratoryjny zmniejsza koszty pracy i eksploatacji w porównaniu ze statycznymi kolbami hodowlanymi. Bioreaktor ma również kilka zalet w porównaniu z w pełni zautomatyzowanymi bioreaktorami z mieszadłem, ponieważ konstrukcja bez wirnika zmniejsza hydrodynamiczne naprężenia ścinające na powierzchni agregatu, poprawiając w ten sposób nie tylko przeżywalność komórek, ale także ograniczając wpływ naprężeń ścinających na wrażliwe iPSC, różnicowanie komórek i funkcję 35,36,37,38.
Bioreaktory z kołem pionowym, w których komórki są mieszane przez duży wirnik pionowy, a także bioreaktory z ruchem kołysanym wykorzystujące napompowane worki hodowlane przymocowane do platformy z napędem silnikowym, stanowią alternatywne platformy zawieszenia 3D. Chociaż nadmiernie przetestowano je pod kątem hodowli hiPSCs 17,18,19,39,40, niewiele wiadomo na temat ich zastosowania w podejściach do różnicowania neuronów, a doniesienia ograniczają się do udanej ekspansji neuronalnych komórek prekursorowych ssaków i ludzi w bioreaktorach z mieszadłem 41,42,43,44 , przy czym nieliczna liczba badań koncentrowała się na dojrzewaniu44,45. Ogólnie rzecz biorąc, zautomatyzowane platformy zawieszenia 3D mają tę zaletę, że są w pełni zautomatyzowane i sterowane komputerowo zmiany medium, zmniejszając w ten sposób różnice w obsłudze i minimalizując ryzyko zanieczyszczenia. Ponadto parametry składników odżywczych, takie jak stężenie mleczanu i glukozy, mogą być stale monitorowane. Jednak stworzenie tych systemów często wymaga znacznych inwestycji początkowych, powierzchni laboratoryjnej i przeszkolenia wykwalifikowanego personelu. Bioreaktor laboratoryjny stanowi kompaktową i łatwą w użyciu alternatywę do hodowli komórek w zawiesinie, ale nie zapewnia jednoczesnego monitorowania składników odżywczych.
Podobnie jak w przypadku większości protokołów stosowanych do hodowli komórek na platformach zawiesinowych 3D, początkowe formowanie agregatów stanowi krytyczny krok. hiPSC są hodowane jako przylegające monowarstwy, a następnie przenoszone jako zawiesiny jednokomórkowe do środowiska 3D. Aby zminimalizować utratę komórek na tym etapie, należy wziąć pod uwagę kilka aspektów. Konstrukcja probówek ze zintegrowanymi łamaczami fal oznacza, że wymagana jest minimalna objętość hodowli wynosząca 10 ml na probówkę, aby zapewnić optymalne zakłócenia medium. W związku z tym w perspektywie długoterminowej nie należy podcinać krytycznego wolumenu. Ponadto wysoce zalecana jest początkowa gęstość wysiewu wynosząca 7,5 miliona komórek na 10 ml objętości kultury i prędkość obrotowa 60 obr./min w celu utworzenia stabilnych agregatów w krótkim okresie, chociaż adaptacje mogą być konieczne w zależności od linii komórkowej.
Po przeniesieniu hiPSC do zawiesiny, w ciągu 24 godzin powinny powstać agregaty. Pierwsza zmiana podłoża jest krytyczna, ponieważ agregaty są małe i mogą nie osiadać prawidłowo. Czas sedymentacji agregatów może być wydłużony, ale nie powinien przekraczać więcej niż 10 minut, ponieważ agregaty mogą zacząć zbijać się w bryły i rosnąć w niejednorodny sposób. Podczas aspiracji w probówce należy pozostawić minimalną objętość kultury wynoszącą 5 ml i unikać wszelkich zakłóceń pożywki. Niemniej jednak w początkowych fazach należy spodziewać się utraty komórek i agregatów. Liczba komórek wskazuje na stałą wydajność komórek w ciągu pierwszych 2 dni w hodowli, co wskazuje, że wysoka zdolność proliferacyjna hiPSC kompensuje początkową utratę komórek. Po zawieszeniu, delikatna uprawa i perturbacja prowadzą do powstania agregatów o jednorodnej wielkości, które z czasem zaczynają rosnąć.
Różnicowanie neuronów przeprowadzono zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem opartym na nadekspresji NGN2 indukowanej doksycykliną13, a poszczególne etapy zoptymalizowano pod kątem hodowli 3D. Neuronalny czynnik transkrypcyjny NGN2 jest dobrze opisanym czynnikiem różnicowania neuronów i znacznie przyspiesza indukcję neuronów 11,13,46. Podczas gdy konwencjonalne wzorce ze zdefiniowanymi czynnikami wzrostu trwają od kilku tygodni do miesięcy 7,8,9, ekspresja NGN2 indukuje los komórek neuronalnych w ciągu kilku dni. Oprócz skróconego czasu uprawy, protokół nie zależy ani od drogich czynników wzrostu, ani od matryc powlekających dla początkowej kultury zawiesinowej, co dodatkowo obniża koszty uprawy.
Co więcej, bezpośrednie porównanie napędzanej przez NGN2 generacji niedojrzałych neuronów w kulturach adherentnych i zawiesinowych wykazało 1,36-krotny wzrost liczby komórek po 4 dniach hodowli przy użyciu bioreaktoralaboratoryjnego 20, podczas gdy oczekuje się, że objętość pożywki potrzebna do wytworzenia 1 miliona komórek zostanie zmniejszona o połowę. Wykorzystanie bioreaktora stacjonarnego do generowania neuronów iNGN2 może być zatem korzystne, ponieważ można wyprodukować większą liczbę komórek przy krótszym czasie i kosztach obsługi. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, zaangażowanie linii neuronalnej zaobserwowano na wczesnym etapie. Po 2 dniach indukcji NGN2 widoczna była głęboka ekspresja klasycznych markerów neuronalnych, takich jak TUBB3, MAP2 i MAPT, co potwierdza możliwość zastosowania bioreaktora laboratoryjnego do indukcji neuronów. Zgodnie z tym protokołem, około 6,2 miliona niedojrzałych neuronów iNGN2 można uzyskać z 1 miliona hiPSC w ciągu 4 dni od hodowli. Jednak wydajność wyjściowa może się różnić w zależności od partii i zależeć od objętości kultury zawiesinowej podczas siewu.
Aby jeszcze bardziej zwiększyć plon, czas uprawy został wydłużony o dodatkowe 3 dni; Jednakże, chociaż agregaty stały się większe, stały się również bardzo zwarte i nie mogły być prawidłowo oddzielone w celu kriokonserwacji lub ponownego powlekania. Pomimo postępów w podejściu do hodowli 3D, przylegające hodowle neuronów 2D są nadal złotym standardem w analizach funkcjonalnych, takich jak układy mikroelektrod lub obrazowanie wapnia. Singularyzacja komórek jest zatem ważnym warunkiem wstępnym dla jednorodnie rozmieszczonej monowarstwy neuronalnej i sieci neuronalnej. Silniejsze mechaniczne oderwanie komórek lub ostre odczynniki dysocjacyjne mogą być stosowane w celu zapewnienia singularizacji, ale z potencjalnym wpływem na żywotność komórek, fizjologię i zdolność ponownego przyłączenia47,48. Jeśli chodzi o konieczność posiadania pojedynczych komórek do dalszych analiz i dojrzewania, agregaty zostały zdysocjowane po 4 dniach w zawiesinie, a neurony iNGN2 (dzień 2) uległy krioprezerwacji. Różnicowanie i charakterystyka neuronów iNGN2 po rozmrożeniu potwierdziły rosnącą dojrzałość kultur neuronalnych i tworzenie się gęstej sieci neuronowej.
Dostarczony protokół daje dużą liczbę neuronów iNGN2. Należy jednak wziąć pod uwagę kilka ograniczeń. Podobnie jak w przypadku większości platform do hodowli zawiesinowych, przeniesienie hiPSC z hodowli przylegającej 2D do środowiska 3D ma kluczowe znaczenie i często wiąże się z głęboką utratą komórek. Oczekuje się dalszych znacznych strat komórek i agregatów podczas zmian pożywki. W porównaniu z platformami zautomatyzowanymi, czas obsługi i ryzyko zanieczyszczenia przy użyciu bioreaktora stołowego są wydłużone, ponieważ wymiana medium musi być wykonywana ręcznie. Oprócz braku automatyzacji, bioreaktor laboratoryjny nie oferuje możliwości monitorowania składników odżywczych, a maksymalna pojemność 50 ml na probówkę ogranicza potencjał skalowania protokołu. Na koniec ważne jest, aby zauważyć, że chociaż NGN2 przyspiesza zaangażowanie linii neuronalnej, czas dojrzewania końcowego nie ulega skróceniu i nadal wymaga długotrwałej hodowli przez kilka tygodni. Biorąc pod uwagę znaczenie wsparcia astrocytarnego dla funkcji neuronów, przywiązania i przeżycia 49,50,51, należy rozważyć podejścia oparte na kokulturze, które mogą być nawet niezbędne do długoterminowej hodowli.
Podsumowując, protokół różnicowania 2D został z powodzeniem przeniesiony do środowiska 3D w celu szybkiego i powtarzalnego generowania neuronów iNGN2 poprzez wdrożenie bioreaktora stacjonarnego. Opisany protokół pozwala na uzyskanie dużej ilości dobrej jakości neuronów pochodzących z iPSC, które mogą służyć jako punkt wyjścia do złożonych testów modelowych, wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności na dużą skalę.

Zaburzenia neurologiczne są główną przyczyną niepełnosprawności na całym świecie1. Dotyczy to jednej na sześć osób, a liczba zachorowań stale rośnie. Związane z tym obciążenie finansowe dla społeczeństw i ich systemów opieki zdrowotnej jest ogromne. Ocena 30 krajów europejskich w 2010 r. oszacowała roczne koszty związane z zaburzeniami psychicznymi i neurologicznymi na 800 mld euro2. Rosnące obciążenie społeczno-ekonomiczne wymaga skutecznych strategii leczenia i chociaż nasza wiedza na temat patofizjologii chorób znacznie wzrosła, przełożenie na kliniki jest często niewystarczające. Ogólnie rzecz biorąc, tylko 12% farmaceutyków wchodzi do badań klinicznych, z czego ponad 80% kończy się niepowodzeniem na późniejszych etapach, głównie z powodu nieskuteczności lub nieprzewidzianej toksyczności3,4. Powody są różne, ale ograniczona możliwość przejścia z testów na zwierzętach w fazach przedklinicznych do badań na ludziach coraz częściej wysuwa się na pierwszy plan5. Ludzkie modele komórkowe i tkankowe in vitro mogą wypełnić lukę w translacji międzygatunkowej, a postępy w technologii pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka (hiPSC) mają ogromny potencjał w tym zakresie. hiPSC są szeroko stosowane w badaniach podstawowych i mają wspólne zasadnicze cechy z embrionalnymi komórkami macierzystymi (hESC), takie jak prawie nieograniczona zdolność do samoodnawiania się i zdolność do różnicowania się we wszystkie trzy listki zarodkowe 6, przy jednoczesnym obejściu problemów etycznych związanych z niszczeniem zarodków.
Uzyskanie komórek nerwowych z hESC, a później hiPSC, było kamieniem milowym w badaniach nad mózgiem. Początkowe protokoły różnicowania opierały się na zastosowaniu czynników wzrostu naśladujących krytyczne etapy podczas embriogenezy, z których większość obejmowała podwójne hamowanie SMAD w zawiesinie lub hodowlach przylegających7,8,9. Dojrzałe neurony zostały z powodzeniem wygenerowane, ale kilka wad tych protokołów nadal utrudnia ich szerokie zastosowanie w opracowywaniu leków, takich jak niska wydajność i duża zmienność generowanych neuronów między partiami, a także duże obciążenie pracą związane z długim czasem hodowli. Poprawę osiągnięto dzięki wymuszonej ekspresji czynników transkrypcyjnych krytycznie zaangażowanych w neurogenezę, a członkowie rodziny neurogenin (NGN), w szczególności NGN2, zostali zidentyfikowani jako skuteczne sterowniki10. Ektopowa ekspresja NGN2 w hiPSC za pośrednictwem lentiwirusa znacznie przyspieszyła wczesne etapy różnicowania neuronów i indukowała los komórek neuronalnych w ciągu zaledwie 1 tygodnia11. Późniejsze końcowe dojrzewanie w kokulturach z astrocytami dało funkcjonalne neurony o wysokiej czystości i ilości o powtarzalnych właściwościach. Następnie zastosowano ukierunkowaną na miejsce edycję genów locus bezpiecznej przystani miejsca integracji wirusa związanego z adenowirusem 1 (AAVS1) w celu utworzenia linii hiPSC ze stabilną i indukowaną doksycykliną kasetą ekspresyjną dla NGN212,13, minimalizując w ten sposób niepożądane skutki uboczne dostarczania lentiwirusa.
Solidne i efektywne różnicowanie neuronów neurogeniny 2 (iNGN2) indukowanych doksycykliną ma ogromny potencjał dla wysokoprzepustowych fenotypowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności10,14,15; a w ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczne postępy w bioprzetwarzaniu, wdrażając bioreaktory do skalowalnej ekspansji i różnicowania komórek16,17,18,19. Jednak większość protokołów różnicowania jest zoptymalizowana pod kątem kultur przylegających, a translacja na środowisko trójwymiarowe (3D) często wymaga niezbędnych modyfikacji. Ostatnio doniesiono o udanym zastosowaniu laboratoryjnego bioreaktora 3D o zredukowanych cechach naprężeń ścinających do ekspansji hiPSC i powtarzalnego różnicowania na hepatocyty, kardiomiocyty i neurony20. W tym przypadku przedstawiono szczegółowy protokół generowania i charakterystyki neuronów iNGN2 przy użyciu identycznego laboratoryjnego bioreaktora 3D.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol 50 mM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>11528926</tr><tr><td>60 mm Nunclon Delta Surface</td><td>Nunc</td><td>734-2040</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało tubulinowe anty-beta III [TU-20] (rozcieńczenie 1:1,000)</td><td>Abcam&nbsp; &nbsp;</td><td>AB7751&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biosystemy stosowane&nbsp; Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>10400745</tr><tr><td>Suplement B-27 (50x)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11530536</td><td>suplement bez surowicy (50x)</td></tr><tr><td>BIONi010-C-13 linia hiPSC</td><td>Europejski Bank dla indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (EBiSC), BIONEER jako deponent</td><td>SAMEA103988285</td><td>Bioneer jest deponentem w EBiSC i właścicielem linii hiPSC.</td></tr><tr><td>Biorender&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td>Biorender.com</tr><tr><td>Klasa hodowli komórkowej BSA</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>12330023</tr><tr><td>Inkubator CERO 3D & Bioreaktor</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800000</td><td></td></tr><tr><td>CEROtubes Probówki do hodowli komórkowych 50 mL</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800005</td><td></td></tr><tr><td>Citavi 6</td><td>Swiss Academic Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoStor CS10</td><td>Stemcell</td><td>7930</td><td>pożywka zamrażająca zawierająca 10% DMSO</td></tr><tr><td>Cytofix Fixation Solution</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>554655</td><td>roztwór utrwalający zawierający 4% paraformaldehydu&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI (BARWIENIE UTRWALONYCH KOMÓREK NUCBLUE)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>12333553</tr><tr><td>Chlorowodorek doksycykliny (DOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3447</td><td></td></tr><tr><td>DPBS bez wapnia i magnezu (DPBS -/-)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS z Wapniem i Magnezem (DPBS +/+)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11580456</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (-/-)</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, suplement GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>EVOS XL System obrazowania komórek rdzeniowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat anty-mysie IgG (H+L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050-038</td><td>stabilizowany dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy</td></tr><tr><td>ImageJ 1.51v&nbsp;</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór insuliny ludzki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278l</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAP2 Przeciwciało monoklonalne (rozcieńczenie 1: 300)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>13-1500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Zredukowany czynnik wzrostu, bez czerwieni fenolowej&nbsp;</td><td>Nauki przyrodnicze Corning&nbsp;</td><td>356231</td><td>matryca błony podstawnej</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11140035 Zestaw optycznych folii samoprzylepnych MicroAmp&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Naukowy&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td>10095714</tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell</td><td>85850</td><td>bezfeederowe podłoże do konserwacji iPSC&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>bez serum Suplement na bazie Bottensteina s Preparat N-1</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>11570556</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS2</td><td>Nikon Instruments Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter-NC200</td><td>ChemoMetec A/S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pochodzenie 2021</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do trwałej ondulacji/płukania&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td></td><td></td>554723</tr><tr><td>Test podkładowy TUBB3(Hs00801390_s1)</td><td>Test podstawowy Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Test podkładowy GAPDH (Hs99999905_m1)</td>Test gruntowy <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>GUSB (Hs99999908_m1)</td>Test gruntowy <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Test gruntowy HPRT1 (Hs99999909_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr> Test <tr><td>podkładowy MAP2 (Hs00258900_m1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Test podkładowy MAPT (Hs00902194_m1)</td>Test podkładowy <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Test wstępny POU5F1 (Hs04260367_gH)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11620099</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornityna 0,01%</td><td>Merck</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Micro Kit (50)-Zestaw</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td>Zestaw do izolacji RNA oparty na kolumnie</td></tr><tr><td>Bufor RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Bufor do lizy komórek</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>12539059</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase</td><td>Gibco</td><td>11599686</td><td>enzym dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>TAQMAN FAST ADVANCED MASTER MIX</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>11380912</td><td>qPCR master mix</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzym</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta</td><td>Via1 ChemoMetec A/S</td><td>941-0012</td><td></td></tr><tr><td>Filtrowane końcówki do pipet o szerokim otworze</td><td>Thermo Fisher Naukowe</td><td>10088880</td><td></td></tr><tr><td>X20 OPTYCZNE 96-DOŁKOWE SZYBKIE PRZEZROCZYSTE PŁYTKI REAKCYJNE&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15206343</td><td></td></tr><tr><td>dichlorowodorek Y-27632, inhibitor kinazy Rho (inhibitor ROCK)</td><td>Abcam</td><td>ab120129</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja ludzkich neuronów indukowanych neurogeniną 2 w trójwymiarowym bioreaktorze zawiesinowym

Production of Human Neurogenin 2-Inducible Neurons in a Three-Dimensional Suspension Bioreactor

Pochodzenie komórek linii neuronalnej z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) było kamieniem milowym w badaniach nad mózgiem. Od czasu ich pierwszego pojawienia się, protokoły są stale optymalizowane i są obecnie szeroko stosowane w badaniach i opracowywaniu leków. Jednak bardzo długi czas trwania tych konwencjonalnych protokołów różnicowania i dojrzewania oraz rosnące zapotrzebowanie na wysokiej jakości hiPSC i ich neuronowe pochodne zwiększają potrzebę przyjęcia, optymalizacji i standaryzacji tych protokołów do produkcji na dużą skalę. W niniejszej pracy przedstawiono szybki i skuteczny protokół różnicowania genetycznie zmodyfikowanych, indukowanych doksycykliną neurogeniny 2 (iNGN2) hiPSC do neuronów przy użyciu laboratoryjnego trójwymiarowego (3D) bioreaktora zawiesinowego.
Krótko mówiąc, jednokomórkowe zawiesiny iNGN2-hiPSC mogły tworzyć agregaty w ciągu 24 godzin, a zaangażowanie linii neuronalnej zostało wywołane przez dodanie doksycykliny. Agregaty zostały zdysocjowane po 2 dniach indukcji, a komórki zostały albo kriokonserwowane, albo ponownie posiane w celu końcowego dojrzewania. Wygenerowane neurony iNGN2 wcześnie wykazywały ekspresję klasycznych markerów neuronalnych i tworzyły złożone sieci neurytyczne w ciągu 1 tygodnia po ponownym posiewie, co wskazuje na rosnącą dojrzałość kultur neuronalnych. Podsumowując, przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku do szybkiego generowania neuronów pochodzących z hiPSC w środowisku 3D, który ma ogromny potencjał jako punkt wyjścia do modelowania chorób, fenotypowych wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków i testów toksyczności na dużą skalę.

W etapach początkowych adherentne hodowle hiPSC są odrywane, dysocjowane do pojedynczych komórek i przenoszone do zawiesiny (Rysunek 2). Agregaty formują się w ciągu 24 h i stale zwiększają swoją wielkość. Po 2 dniach indukcji transgenu wczesne neurony mogą zostać kriokonserwowane do późniejszych eksperymentów.
Utrzymująca się proliferacja podczas pierwszych dni w zawiesinie prowadzi do wzrostu liczby komórek, która osiąga szczyt po 2 dniach indukcji (Rycina 3A,B). Równolegle z proliferacją zaczynają rosnąć agregaty. W porównaniu z dniem 0, średnica wykazuje wzrost o 50% w dniu 2 i prawie podwaja się w dniu 5 (Rycina 3D). Chociaż zwiększająca się średnica ogranicza dostawy składników odżywczych do wnętrza agregatów, żywotność komórek nie ulega pogorszeniu w dniu 2 ani w dniu 5 różnicowania (Rycina 3C). Jednak przedłużona hodowla w zawiesinie trwająca ponad 4 dni nie zwiększa dalszej wydajności komórek, ponieważ agregaty stają się coraz bardziej odporne na singularizację enzymatyczną (Rycina 3B).
Po kriokonserwacji komórki z drugiego dnia są rozmrażane i wysiewane na szalki pokryte poli-L-ornityną (PLO)-lamininą w celu końcowej maturacji. Co do zasady komórki bardzo dobrze przywierają po rozmrożeniu i wczesnym etapie zaczynają wydłużać neuryty. Temporalny profil ekspresji genów, a także barwienie immunocytochemiczne na markery neuronalne TUBB3 i MAP2, potwierdzają tożsamość komórek neuronalnych (Rycina 4A,B). Oprócz rosnącego poziomu TUBB3 i MAP2, kultury neuronalne są wzbogacone w transkrypty białka tau związanego z mikrotubulami (MAPT), kodującego białko neuronalne zaangażowane w stabilizację aksonów, i wykazują jednoczesny spadek ekspresji regulującego pluripotencję czynnika transkrypcyjnego POU5F1. Co więcej, w ciągu pierwszego tygodnia po rozmrożeniu tworzy się gęsta sieć neurytów (Rycina 4C). Te zmiany morfologiczne, w połączeniu z profilem transkrypcyjnym, sugerują postępującą maturację kultur neuronalnych.
<img alt="Schemat indukcji neuronalnej z osią czasu; przedstawiono etapy bioreaktora, hodowli i dojrzewania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Generowanie neuronów iNGN2 pochodzących z hiPSC przy użyciu bioreaktora laboratoryjnego. (A) Schematyczny przegląd paradygmatu różnicowania, wyróżniający kluczowe etapy hodowli komórkowej. (B-F) Obrazy w polu jasnym wizualizują (B) hiPSC oraz (C,D) tworzenie się agregatów w bioreaktorze laboratoryjnym. (E,F) Neurony iNGN2 wydłużają neuryty i przechodzą zmiany morfologiczne podczas różnicowania. Pasek skali = 100 µm. Skróty: BMM = macierz błony podstawnej; iPSC-MM = pożywka do utrzymania hiPSC; PLO = poli-L-ornityna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces agregacji komórek w ciągu 5 dni; obrazy mikroskopowe, wykresy wydajności, żywotności i wielkości agregatów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wydajność i żywotność komórek podczas formowania i wzrostu agregatów. (A) Obrazy w polu jasnym przedstawiają formowanie się agregatów w ciągu 2 dni hodowli w bioreaktorze laboratoryjnym, a także wzrost wielkości agregatów w czasie. Pasek skali = 500 µm. (B) Ilościowe oznaczenie wydajności komórek i (C) ich żywotności w trakcie przebiegu różnicowania. Wykresy słupkowe przedstawiają średnią + SD z czterech niezależnych eksperymentów. (D) Średnicę, będącą wskaźnikiem wielkości agregatów, wyznaczono półautomatycznie przy użyciu oprogramowania open-source ImageJ (wersja 1.53). Najpierw obrazy w polu jasnym przekształcono w obrazy binarne, a następnie poddano dalszej ocenie za pomocą narzędzia analyze particles, stosując następujące parametry: size &gt; 2,500 µm2, circularity 0.45-1, exclude edges oraz include holes. Linie poziome wskazują średnią ± SD z pięciu niezależnych procesów różnicowania. Pojedyncze kropki reprezentują średnią z poszczególnych eksperymentów różnicowania z co najmniej 20 agregatami w każdym punkcie czasowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres ekspresji genów, mikroskopia fluorescencyjna, wykres słupkowy sieci neurytów, różnicowanie komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65085/65085fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Charakterystyka neuronów iNGN2 pochodzących z hiPSC. Czasowy profil ekspresji genów dla genów neuronalnych TUBB3, MAP2, oraz MAPT, a także genu związanego z pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi POU5F1. Względne poziomy ekspresji znormalizowano względem genów referencyjnych GAPDH, HPRT1, oraz GUSB. Jako kalibrator wybrano nieróżnicowane hiPSC (dzień -2). Symbole geometryczne oznaczają średnią ± SD z czterech niezależnych różnicowań. (B) Reprezentatywne obrazy neuronów iNGN2 w 7. dniu po rozmrożeniu (dzień -2 + 7), barwione pod kątem beta-III-tubuliny (TUBB3, magenta) i białka MAP2 (MAP2, cyjan). Jądra komórkowe skontrastowano barwnikiem DAPI. Paski skali = 100 µm. (C) Ocena sieci neurytów na obrazach w polu jasnym kultur neuronalnych po rozmrożeniu. Całkowitą długość neurytów określono na obszarze 930,82 × 698,11 µm2 przy użyciu programu ImageJ (wersja 1.53). Po dostosowaniu jasności i kontrastu obrazy przekształcono w obrazy 8-bitowe, a kolory odwrócono. Następnie neuryty poddano szkieletyzacji, a następnie przeanalizowano przy użyciu wtyczek ImageJ „Skeletonize” i „Analyze Skeleton” odpowiednio. Całkowitą długość neurytów podzielono przez liczbę som w badanym obszarze, aby uzyskać średnią długość neurytów na komórkę. Wykresy słupkowe przedstawiają średnią + SD z trzech niezależnych eksperymentów. Skróty: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65085/65085fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł opisuje protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w laboratoryjnym bioreaktorze zawiesinowym 3D.

Produkcja ludzkich neuronów indukowanych neurogeniną 2 w trójwymiarowym bioreaktorze zawiesinowym

The derivation of neuronal lineage cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) marked a milestone in brain research. Since their first ...

Wykorzystanie bioreaktorów do translacji indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub protokołów hodowli IPSC z 2D na 3D umożliwia generowanie dużej liczby komórek do zastosowań na dużą skalę, takich jak wysokoprzepustowe badania przesiewowe. Ten protokół szybkiego różnicowania neuronów w fizjologicznym środowisku 3D poprawia interakcje między komórkami startowymi i zapewnia wysoką wydajność komórek w krótszym czasie przy niskiej zmienności między partiami = partiami, zmniejszając w ten sposób koszty i czas. Europejski Bank Indukowanych Pluripotencjalnych Komórek Macierzystych stosuje podobne podejścia do szybkiego i opłacalnego generowania zróżnicowanych komórek w wielu liniach, w tym innych komórek mózgowych i kardiomiocytów.Rozpocznij wstępną uprawę, gdy indukowana przez człowieka pluripotencjalna komórka macierzysta lub ludzka hodowla iPSC jest zlewająca się w 60 do 80%. Całkowicie odessać pożywkę z ludzkich iPSC i delikatnie przepłukać komórki dwukrotnie 1X DPBS. Dodaj dwa mililitry podgrzanego roztworu trypsyny EDTA do sześciocentymetrowej szalki Petriego i inkubuj komórki przez trzy minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze.Następnie delikatnie postukaj w szalki, aby ułatwić oderwanie komórek lub inkubuj przez jedną do dwóch minut dłużej, jeśli komórki się nie odłączają. Następnie ponownie zawieś komórki w każdym naczyniu, dodając pięć mililitrów pożywki konserwacyjnej IPSC z inhibitorem ROCK. Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej lub 50-mililitrowej probówki i delikatnie wymieszaj, pipetując, aby zapewnić pojedynczą komórkę.Określ liczbę komórek w 100 mikrolitrach zawiesiny komórek za pomocą automatycznego licznika komórek i przenieś żądaną objętość zawiesiny komórek do 50-mililitrowej probówki. Odwirować komórki w temperaturze 300 G przez trzy minuty. Następnie odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w dwóch mililitrach pożywki konserwacyjnej IPSC bez podajnika z inhibitorem ROCK.Napełnij każdą 50-mililitrową tubkę 18 mililitrami pożywki. Następnie dozuj 20 mililitrów zawiesiny komórek do każdej probówki bioreaktora. Umieść rurki w systemie bioreaktora i ustaw parametry uprawy na nieograniczony czas.Uruchom program uprawy wstępnej za pomocą wyświetlacza bioreaktora. Aby zmienić pożywkę następnego dnia, pozwól kruszywu osiąść w probówkach bioreaktora na około pięć minut, a następnie ostrożnie zasysaj supernatant. Dodać 15 mililitrów świeżej, bezpodajnej pożywki konserwacyjnej IPSC bez inhibitora ROCK na probówkę i kontynuować uprawę w bioreaktorze laboratoryjnym przez 24 godziny.Aby rozpocząć różnicowanie neuronów, pozwól agregatowi osiąść w probówkach bioreaktora i ostrożnie odessaj supernatant z komórek, pozostawiając około pięciu mililitrów supernatantu w probówce. Następnie dodaj 35 mililitrów pożywki do indukcji neuronalnej składającej się z pożywki neuropodstawowej i dwóch mikrogramów na mililitr doksycykliny. Umieść probówki z powrotem w bioreaktorze stołowym i kontynuuj uprawę.Wykonuj zmiany nośników codziennie przez dwa dni, jak pokazano wcześniej. Po zaessaniu supernatantu, jak pokazano wcześniej, przenieść agregaty do sterylnej probówki o pojemności 15 mililitrów lub 50 mililitrów i delikatnie przepłukać agregaty dwa razy DPBS. Ostrożnie zassać supernatant tak bardzo, jak to możliwe, nie naruszając agregatów.Następnie dodaj od dwóch do pięciu mililitrów wstępnie podgrzanego enzymu dysocjacji komórek do osadu, w zależności od wielkości osadu, i inkubuj komórki przez około 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Delikatnie zawieszaj osadzone agregaty co dwie minuty, aż do ich dysocjacji. Dodaj wstępnie podgrzane podłoże neurobazalne, trzykrotnie większą objętość niż poprzednio dodany enzym dysocjacji komórek, i ostrożnie ponownie zawieś komórki, aby zapewnić ich singularyzację.Określ liczbę komórek i przenieś odpowiednią objętość zawiesiny komórek do kriokonserwacji do probówki o pojemności 15 mililitrów lub 50 mililitrów. Wirować do komórek o sile 300 G przez trzy minuty. Odessać supernatant i delikatnie zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej objętości pożywki zamrażającej zawierającej 10% dimetylosulfotlenku.Podwielokrotnić zawiesinę komórkową w odpowiednich fiolkach do kriokonserwacji. Natychmiast przenieść fiolki do wstępnie schłodzonego, wolno zamrażającego pojemnika wypełnionego 2-propanolem i umieścić pojemnik w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na noc. Umieść fiolki w temperaturze minus 150 stopni Celsjusza następnego dnia w celu długotrwałego przechowywania.Po odłączeniu, wyizolowaniu i przeniesieniu do zawiesiny przylegających kultur ludzkich iPSC agregaty uformowały się w ciągu 24 godzin i kontynuowały wzrost. Po dwóch dniach indukcji transgenu wczesne neurony można było poddać krioprezerwacji w celu późniejszego dojrzewania. Zaobserwowano trwałą proliferację ludzkich iPSC w pierwszych dniach w zawiesinie, a liczba hodowli komórkowych osiągnęła szczyt po dwóch dniach indukcji.Jednak długotrwała hodowla przez ponad cztery dni w zawiesinie nie poprawiła wydajności komórek, ponieważ agregaty stawały się coraz bardziej odporne na singularyzację enzymatyczną. Co więcej, w porównaniu z dniem zero, średnica agregatu wzrosła o 50% w drugim dniu i prawie podwoiła się w piątym dniu. Chociaż zwiększanie średnicy ogranicza dopływ składników odżywczych do agregatów, żywotność komórek nie uległa zmianie w drugim lub piątym dniu różnicowania.Czasowy profil ekspresji genów, a także barwienie immunochemiczne markerów neuronalnych beta trójki tubuliny i białka związanego z mikrotubulami (MAP2) potwierdziły tożsamość komórek neuronalnych komórek kriokonserwowanych w drugiej dobie. Ponadto kultury neuronalne zostały wzbogacone w transkrypty białka tau związane z mikrotubulami lub MAPT i wykazały jednoczesny spadek ekspresji czynnika transkrypcyjnego regulującego pluripotencję POU5F1 W ciągu pierwszego tygodnia po rozmrożeniu utworzyła się gęsta sieć neurytyczna, co również sugerowało rosnące dojrzewanie kultur neuronalnych. Protokół ten stanowi podstawę do translacji na duże i w pełni zautomatyzowane bioreaktory, które wykazują dalszy znaczny wzrost wydajności komórek dla przyszłych zastosowań na dużą skalę.Po udowodnieniu z neurogeniną 2, zastosowanie liniowych czynników transkrypcyjnych determinujących w celu przyspieszenia różnicowania zostało zastosowane do wielu różnych typów komórek i chorób, aby ułatwić modelowanie iPSC.

production-human-neurogenin-2-inducible-neurons-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie samoorganizującego się rusztowania trójwymiarowego do hodowli ludzkich komórek progenitorowych neuronów. Przedstawiamy protokół uwalniania komórek z rusztowań w celu ich późniejszej analizy, np. za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół ten może zostać dostosowany do innych typów komórek w celu przeprowadzenia szczegółowych badań mechanistycznych.

Hodowla ludzkich komórek progenitorowych neuronów w trójwymiarowym samoorganizującym się hydrożelu peptydowym

Protokoły różnicowania neuronalnego pluripotencjalnych ludzkich komórek macierzystych (hPSCs) są często czasochłonne i wymagają zaawansowanych umiejętności w hodowli komórkowej. W niniejszej pracy dostosowaliśmy procedurę różnicowania opartą na małych cząsteczkach do formatu płytek wielodobojowych, co umożliwia prostą, szybką i wydajną generację ludzkich neuronów w sposób kontrolowany.

Szybka i wydajna generacja neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w formacie płyt wielodołkowych

Ten film demonstruje różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w neurony dopaminergiczne, aby dostarczyć modelu do badania choroby Parkinsona. HESC są hodowane w pożywce do indukcji neuronalnej na płytce mikrodołkowej w celu utworzenia neurosfer 3D. Są one następnie hodowane w pożywce do indukcji neuronalnej, aby promować różnicowanie w dopaminergiczne neurony progenitorowe. Końcowe dojrzewanie neuronów zachodzi we wstawce hodowlanej w warunkach granicy faz...

Wytwarzanie dopaminergicznych organoidów neuronalnych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Bezpośrednie przeprogramowanie neuronów generuje neurony, które utrzymują wiek początkowej komórki somatycznej. W tym miejscu opisujemy pojedynczą metodę opartą na wektorach do generowania indukowanych neuronów z fibroblastów skóry uzyskanych od dorosłych dawców ludzkich.

Proste generowanie wysokowydajnej kultury indukowanych neuronów z dorosłych fibroblastów skóry człowieka

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

To badanie przedstawia i opisuje protokoły do uzyskania dwóch specyficznych ludzkich organoidów nerwowych jako odpowiedniego i dokładnego modelu do badania: 1) rozwoju glejaka u człowieka w obrębie ludzkich organoidów nerwowych wyłącznie u ludzi oraz 2) różnicowania dopaminergicznego neuronów generującego trójwymiarowy organoid.

Ludzkie organoidy nerwowe do badania raka mózgu i chorób neurodegeneracyjnych

Ten protokół zapewnia kompleksową procedurę wytwarzania ludzkiego organoidu nerwu ruchowego pochodzącego z komórek iPS poprzez spontaniczne składanie solidnego pakietu aksonów przedłużonego z sferoidy w chipie do hodowli tkankowej.

Trójwymiarowe generowanie organoidów nerwów ruchowych

Interakcje neuron-glej w neurodegeneracji nie są dobrze poznane z powodu nieodpowiednich narzędzi i metod. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowane protokoły uzyskiwania indukowanych neuronów, komórek prekursorowych oligodendrocytów i oligodendrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz podajemy przykłady wartości tych metod w zrozumieniu wkładu specyficznego typu komórki w chorobie Alzheimera.

Generowanie ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Tutaj prezentujemy protokół do produkcji 3D-drukowanych biologicznie kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC. Ten model kokultury, wygenerowany w rusztowaniu hydrożelowym w formatach 96- lub 384-dołkowych, wykazuje wysoką żywotność po wydrukowaniu i wzrost neurytów w ciągu 7 dni oraz pokazuje ekspresję markerów dojrzałości dla obu typów komórek.

Trójwymiarowe biodrukowanie ludzkich kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC do zastosowań przesiewowych

Poznaj protokół różnicowania neuronów z ludzkich komórek iPSC w trójwymiarowym bioreaktorze zawiesinowym. Ta metoda zapewnia wysoką wydajność komórkową i niską zmienność między partiami.

Produkcja ludzkich neuronów indukowanych neurogeniną 2 w trójwymiarowym bioreaktorze zawiesinowym

Przeglądaj więcej filmów