Stosowanie odczynników referencyjnych w celu potwierdzenia odporności testów uwalniania cytokin w celu przewidywania bezpieczeństwa przeciwciał monoklonalnych

Testowanie bezpieczeństwa nowych leków ma kluczowe znaczenie, a ten protokół opisuje, w jaki sposób używać zwalidowanych standardów do oceny odtwarzalności, niezawodności i potencjalnych ograniczeń platformy CRS. Technika ta została zwalidowana z tymi odczynnikami w 11 różnych laboratoriach i w międzynarodowym badaniu zespołowym, w którym zaobserwowano podobne wzorce reakcji, co usprawniło wysiłki na rzecz harmonizacji i odtwarzalności. Zastosowania tej techniki obejmują poprawę oceny ryzyka CRS dla nowych przeciwciał terapeutycznych, a także pomogą przygotować się do klinicznego leczenia potencjalnych skutków ubocznych.

Prace te mają na celu poprawę odtwarzalności i harmonizacji, a demonstracja wizualna zwiększa szanse na odtwarzalność. Rozpocznij od rozpuszczenia zawartości ampułek z odczynnikiem odniesienia w jednym mililitrze sterylnej wody destylowanej i pozostaw na 5 do 10 minut ponownego nawodnienia. Następnie odpowiednio wymieszaj każdy roztwór przeciwciała przed przeniesieniem go do sterylnej probówki z nakrętką.

Następnie rozcieńczyć każde rozpuszczone przeciwciało i przetestować przeciwciało do 10 mikrogramów na mililitr w sterylnym PBS. Weź sterylną, niepoddawaną działaniu TC, polipropylenową 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania z dnem w kształcie litery U i dodaj 100 mikrolitrów pożądanego rozcieńczonego roztworu przeciwciał do wyznaczonych dołków płytki. Następnie inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed wykonaniem testu fazy stałej.

Po pobraniu minimum 30 mililitrów obwodowej krwi pełnej do probówki z heparyną, należy ją kilkakrotnie odwrócić, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie próbki krwi z heparyną sodową. Odłożyć 15 mililitrów próbki krwi pełnej w osobnej probówce do wykorzystania później w teście krwi pełnej w fazie wodnej. Rozcieńczyć pozostałe 15 mililitrów krwi pełnej, dodając równą objętość pożywki PBS lub pożywki RPMI 1640 bez surowicy.

Delikatnie ułóż rozcieńczoną krew na wierzchu 15 mililitrów podłoża o gradiencie gęstości w 50-mililitrowej probówce. Odwirować probówkę za pomocą odchylanego wirnika bez hamulca i zmniejszonego przyspieszenia przy 500 G i temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby rozdzielić krew na różne składniki. Po odwirowaniu gradient gęstości oddzieli się jako górna warstwa osocza, a następnie cienka warstwa kożuchy zawierająca PBMC i dolna warstwa zawierająca erytrocyty i granulocyty wielojądrzaste, w tym neutrofile i eozynofile.

Ostrożnie usuń górną warstwę plazmy, a następnie następną warstwę, aby zebrać PBMC. Do prania ponownie zawieś zebraną sierść kożuchową w 10 mililitrach PBS lub pożywki RPMI 1640 bez surowicy. Odwirować probówkę zaczynając od 500 G przez 10 minut, aby osadzać komórki.

Wyrzucić supernatant i ponownie powtórzyć mycie. Następnie ponownie zawieś powstały osad w dwóch mililitrach kompletnego podłoża RPMI. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie PBMC do 1 miliona komórek na mililitr w pełnym RPMI.

Do testu uwalniania cytokin krwi pełnej w fazie wodnej należy pobrać próbkę krwi pełnej wcześniej odłożoną na bok, dodać 190 mikrolitrów próbki do studzienek 96-dołkowej płytki polistyrenowej z dnem w kształcie litery U, przeciwciał do obróbki cieplnej i odczynników referencyjnych wstępnie rozcieńczonych do 100 mikrogramów na mililitr w PBS i dodać 10 mikrolitrów pożądanego rozcieńczonego przeciwciała do wyznaczonych studzienek zawierających 190 mikrolitrów krwi pełnej. Inkubować płytkę przez 48 godzin w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Do testu uwalniania cytokin PBMC w fazie stałej należy uzyskać wcześniej przygotowane płytki powlekane.

Za pomocą pipety wielokanałowej wyrzucić roztwór przeciwciała z powlekanych płytek. Po napełnieniu zbiornika odczynnika PBS należy trzykrotnie przemyć płytkę 200 mikrolitrami PBS w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał monoklonalnych. Do każdej studzienki dodać 200 mikrolitrów wcześniej przygotowanej zawiesiny PBMC.

Inkubować płytkę przez 48 godzin w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 48-godzinnej inkubacji z kontrolnymi i testowymi przeciwciałami monoklonalnymi odwirować płytki w temperaturze 400 G przez pięć minut. Zebrać kondycjonowaną komórkowo pożywkę lub osocze bez naruszania osadu komórkowego.

Zebrany supernatant lub osocze zamrozić w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wyniki testu PBMC w fazie stałej wykazały, że przeciwciała kontroli dodatniej indukowały znacznie wysokie poziomy cytokin w porównaniu z dopasowanymi kontrolami izotypu. Zaobserwowano również, że superagonista anty-CD28 indukował znacznie większą zmianę uwalniania interleukiny-2 lub IL-2 niż jej dopasowany izotyp, podczas gdy anty-CD3 i anty-CD52, nadal indukując ekspresję IL-2, powodowały mniejsze zmiany krotne.

W teście fazy wodnej krwi pełnej poziom wykrywalnych cytokin był stosunkowo mniejszy niż w teście fazy stałej, ale charakteryzował się większą wrażliwością na stymulację przez anty-CD52.