15 września 2023
Użycie referencyjnych odczynników do testów uwalniania cytokin pozwala na bardziej powtarzalne i standaryzowane profile bezpieczeństwa in vitro immunoterapeutycznych przeciwciał monoklonalnych. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób testy uwalniania cytokin mogą być stosowane wraz z referencyjnym panelem odczynników do przewidywania bezpieczeństwa niektórych terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych.
Testowanie bezpieczeństwa nowych leków ma kluczowe znaczenie, a ten protokół opisuje, w jaki sposób używać zwalidowanych standardów do oceny odtwarzalności, niezawodności i potencjalnych ograniczeń platformy CRS. Technika ta została zwalidowana z tymi odczynnikami w 11 różnych laboratoriach i w międzynarodowym badaniu zespołowym, w którym zaobserwowano podobne wzorce reakcji, co usprawniło wysiłki na rzecz harmonizacji i odtwarzalności. Zastosowania tej techniki obejmują poprawę oceny ryzyka CRS dla nowych przeciwciał terapeutycznych, a także pomogą przygotować się do klinicznego leczenia potencjalnych skutków ubocznych.
Prace te mają na celu poprawę odtwarzalności i harmonizacji, a demonstracja wizualna zwiększa szanse na odtwarzalność. Rozpocznij od rozpuszczenia zawartości ampułek z odczynnikiem odniesienia w jednym mililitrze sterylnej wody destylowanej i pozostaw na 5 do 10 minut ponownego nawodnienia. Następnie odpowiednio wymieszaj każdy roztwór przeciwciała przed przeniesieniem go do sterylnej probówki z nakrętką.
Następnie rozcieńczyć każde rozpuszczone przeciwciało i przetestować przeciwciało do 10 mikrogramów na mililitr w sterylnym PBS. Weź sterylną, niepoddawaną działaniu TC, polipropylenową 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania z dnem w kształcie litery U i dodaj 100 mikrolitrów pożądanego rozcieńczonego roztworu przeciwciał do wyznaczonych dołków płytki. Następnie inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed wykonaniem testu fazy stałej.
Po pobraniu minimum 30 mililitrów obwodowej krwi pełnej do probówki z heparyną, należy ją kilkakrotnie odwrócić, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie próbki krwi z heparyną sodową. Odłożyć 15 mililitrów próbki krwi pełnej w osobnej probówce do wykorzystania później w teście krwi pełnej w fazie wodnej. Rozcieńczyć pozostałe 15 mililitrów krwi pełnej, dodając równą objętość pożywki PBS lub pożywki RPMI 1640 bez surowicy.
Delikatnie ułóż rozcieńczoną krew na wierzchu 15 mililitrów podłoża o gradiencie gęstości w 50-mililitrowej probówce. Odwirować probówkę za pomocą odchylanego wirnika bez hamulca i zmniejszonego przyspieszenia przy 500 G i temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby rozdzielić krew na różne składniki. Po odwirowaniu gradient gęstości oddzieli się jako górna warstwa osocza, a następnie cienka warstwa kożuchy zawierająca PBMC i dolna warstwa zawierająca erytrocyty i granulocyty wielojądrzaste, w tym neutrofile i eozynofile.
Ostrożnie usuń górną warstwę plazmy, a następnie następną warstwę, aby zebrać PBMC. Do prania ponownie zawieś zebraną sierść kożuchową w 10 mililitrach PBS lub pożywki RPMI 1640 bez surowicy. Odwirować probówkę zaczynając od 500 G przez 10 minut, aby osadzać komórki.
Wyrzucić supernatant i ponownie powtórzyć mycie. Następnie ponownie zawieś powstały osad w dwóch mililitrach kompletnego podłoża RPMI. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie PBMC do 1 miliona komórek na mililitr w pełnym RPMI.
Do testu uwalniania cytokin krwi pełnej w fazie wodnej należy pobrać próbkę krwi pełnej wcześniej odłożoną na bok, dodać 190 mikrolitrów próbki do studzienek 96-dołkowej płytki polistyrenowej z dnem w kształcie litery U, przeciwciał do obróbki cieplnej i odczynników referencyjnych wstępnie rozcieńczonych do 100 mikrogramów na mililitr w PBS i dodać 10 mikrolitrów pożądanego rozcieńczonego przeciwciała do wyznaczonych studzienek zawierających 190 mikrolitrów krwi pełnej. Inkubować płytkę przez 48 godzin w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Do testu uwalniania cytokin PBMC w fazie stałej należy uzyskać wcześniej przygotowane płytki powlekane.
Za pomocą pipety wielokanałowej wyrzucić roztwór przeciwciała z powlekanych płytek. Po napełnieniu zbiornika odczynnika PBS należy trzykrotnie przemyć płytkę 200 mikrolitrami PBS w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał monoklonalnych. Do każdej studzienki dodać 200 mikrolitrów wcześniej przygotowanej zawiesiny PBMC.
Inkubować płytkę przez 48 godzin w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po 48-godzinnej inkubacji z kontrolnymi i testowymi przeciwciałami monoklonalnymi odwirować płytki w temperaturze 400 G przez pięć minut. Zebrać kondycjonowaną komórkowo pożywkę lub osocze bez naruszania osadu komórkowego.
Zebrany supernatant lub osocze zamrozić w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Wyniki testu PBMC w fazie stałej wykazały, że przeciwciała kontroli dodatniej indukowały znacznie wysokie poziomy cytokin w porównaniu z dopasowanymi kontrolami izotypu. Zaobserwowano również, że superagonista anty-CD28 indukował znacznie większą zmianę uwalniania interleukiny-2 lub IL-2 niż jej dopasowany izotyp, podczas gdy anty-CD3 i anty-CD52, nadal indukując ekspresję IL-2, powodowały mniejsze zmiany krotne.
W teście fazy wodnej krwi pełnej poziom wykrywalnych cytokin był stosunkowo mniejszy niż w teście fazy stałej, ale charakteryzował się większą wrażliwością na stymulację przez anty-CD52.
Niniejszy artykuł opisuje protokół wykorzystania testów uwalniania cytokin (CRS) z zastosowaniem reagentów referencyjnych w celu oceny profilu bezpieczeństwa terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych. Metoda ta ma na celu zwiększenie powtarzalności i standaryzacji testów bezpieczeństwa w różnych laboratoriach.
Solidne testy uwalniania cytokin (CRA) są niezbędne do oceny ryzyka związanych z kandydackimi immunostymulującymi przeciwciałami monoklonalnymi przed rozpoczęciem badań klinicznych, ponieważ umożliwiają wczesną identyfikację ryzyka wystąpienia zespołu uwalniania cytokin (CRS). Stosowanie zestandaryzowanych odczynników referencyjnych w różnych laboratoriach bezpośrednio rozwiązuje problemy z powtarzalnością i harmonizacją, wspierając pewne decyzje dotyczące rozwoju portfolio. Podejście to zwiększa wiarygodność prognostyczną przedklinicznych danych dotyczących bezpieczeństwa, redukując ryzyko biologiczne na późnych etapach i ułatwiając porównywalność wyników między ośrodkami.
Niniejszy protokół CRA oparty na odczynnikach referencyjnych integruje etapy od wczesnego odkrywania po przedkliniczną ocenę bezpieczeństwa, wspierając identyfikację wiodących związków oraz postęp dostosowany do poziomu ryzyka.