Skuteczne unaczynienie organoidów nerkowych poprzez docelomiczne przeszczepienie zarodków kurczaków

Organoidy nerkowe hodowane in vitro pozostają niedojrzałe, co ogranicza ich zastosowanie. A ta metoda przeszczepu wewnątrzcelomicznego indukuje unaczynienie i przyspiesza dojrzewanie organoidów. Procedura jest bardzo wydajna, pozwala na przeszczepienie i analizę dużej liczby organoidów w jednym eksperymencie.

Po przygotowaniu organoidów nerkowych pochodzących z HIPSC i inkubacji zapłodnionych jaj leghorn utwórz okno w skorupce jaja w trzecim dniu inkubacji. Umieść mały kawałek przezroczystej taśmy na spiczastej końcówce jajka. Zrób mały otwór w skorupce jajka na środku przezroczystej taśmy, stukając w nią ostrym końcem nożyczek do preparowania.

Następnie włóż igłę o rozmiarze 19 na pięciomililitrowej strzykawce do otworu pod kątem 45 stopni. Odessać od dwóch do trzech mililitrów albuminy z komórki jajowej, aby obniżyć zarodek wewnątrz komórki jajowej. Zakryj otwór drugim kawałkiem przezroczystej taśmy, a następnie umieść duży kawałek przezroczystej taśmy na ołówku oznaczonym po stronie jajka skierowanej do góry.

Zrób otwór w skorupce jajka na środku przezroczystej taśmy, stukając w nią ostrym końcem nożyczek do preparowania. Wytnij małe okrągłe okienko w skorupce jajka z tego otworu za pomocą zakrzywionych nożyczek do preparowania. Spójrz przez to okno, aby zlokalizować zarodek.

Następnie powiększ okno, aby zoptymalizować dostęp do zarodka. Usuń wszelkie duże kawałki skorupki jaja, które mogły spaść na zarodek za pomocą kleszczy. Usuń mniejsze kawałki, umieszczając kilka kropli DPBS z wapniem i magnezem na zarodku za pomocą plastikowej pipety transferowej, a następnie zasysając DPBS ze skorupką jajka do pipety.

Za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia dodaj do komórki jajowej trzy krople DPBS, uzupełnione 0,5% streptomycyną penicyliny. Ostrożnie uszczelnij okno dużym kawałkiem przezroczystej taśmy przed umieszczeniem jaja z powrotem w inkubatorze do czwartego dnia inkubacji. Odetnij taśmę od okna zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi.

Umieść jajko pod mikroskopem preparacyjnym na gumowym uchwycie lub kartonie na jajka. Zarodek kurczaka znajduje się obecnie w stadium Hamburgera-Hamiltona od 23 do 24 i leży na lewym boku z prawą stroną skierowaną w stronę widza. Zlokalizuj prawe skrzydło i zawiązek nogi zarodka, ponieważ celom będzie oceniany między tymi dwoma zawiązkami kończyn.

W obszarze między prawym skrzydłem a zawiązkiem nogi utwórz kolejno otwór w błonie witeliny, kosmówce i owodni, przytrzymując je dwiema parami kleszczy preparacyjnych i delikatnie ciągnąc je w przeciwnych kierunkach. Sprawdź, czy jest niezakłócony dostęp do jamy celomicznej. Delikatnie chwyć krawędź ściany ciała między skrzydłem a pączkiem kończyny za pomocą kleszczy preparacyjnych i pociągnij ją lekko w kierunku widza.

Jama celomiczna musi być wyraźnie widoczna. Ostrożnie włóż, ale cienkie narzędzie do jamy celomicznej. Umieść pół organoidu w jaju na wierzchu allantois za pomocą dysektora opony twardej.

Za pomocą kleszczy preparacyjnych ostrożnie chwyć krawędź ściany ciała i pociągnij ją lekko w kierunku widza, aby widoczny był otwór do celu. Delikatnie przesuń organoid w kierunku i przez otwór w ścianie ciała do celum za pomocą drutu wolframowego i uchwytu na mikroskalpel. Popchnij organoid lekko do czaszki, aby umieścić go w środku.

Jest teraz widoczny tuż za pąkiem skrzydła. Dodaj trzy krople DPBS do jajka za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia. Ostrożnie uszczelnij okno dużym kawałkiem przezroczystej taśmy przed umieszczeniem jaja z powrotem w inkubatorze do 12 dnia inkubacji.

Odetnij taśmę od okna zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi. Umieść jajko pod mikroskopem preparacyjnym w gumowym uchwycie. Oceń unaczynienie i zlokalizuj żyły, które można odróżnić od tętnic po nieco jaśniejszym czerwonym kolorze.

Aby poprawić dostęp do układu krwionośnego, ostrożnie powiększ okno, przecinając je zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi. Po wybraniu żyły należy wprowadzić końcówkę igły mikrokapilarnej do żyły pod kątem od zera do 20 stopni. Upewnij się, że igła znajduje się w żyle, delikatnie przesuwając końcówkę z boku na bok.

Delikatnie i równomiernie wdmuchnąć do systemu iniekcyjnego, aby wstrzyknąć aglutyninę do soczewki. I umieść jajo z powrotem w inkubatorze na 10 minut, aby mogło krążyć. Umieść jajko w gumowym uchwycie na ławce.

Następnie przeciąć błony otaczające zarodek zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi. Wyjmij zarodek z jaja za pomocą perforowanej łyżki i natychmiast odetnij zarodek za pomocą nożyczek. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść ciało zarodka na szalce Petriego.

Umieść zarodek na plecach na szalce Petriego i rozłóż jego kończyny. Ostrożnie otwórz ścianę brzuszną zarodka wzdłuż osi podłużnej za pomocą kleszczy. Zlokalizuj organoid wewnątrz zarodka.

Organoid najczęściej przyczepia się do prawego płata wątroby, albo na końcu rozpieszcza, albo czaszkowo, tuż poniżej klatki piersiowej. Dlatego warto zacząć od przyjrzenia się tym lokalizacjom. Po zlokalizowaniu organoidu usuń go z zarodka, przecinając go mikronożyczkami.

Umieść organoid w tkance kurczaka, która jest nieuchronnie do niego przyczepiona, na szalce Petriego pod mikroskopem preparacyjnym. Usuń jak najwięcej tkanki kurczaka za pomocą obosiecznej żyletki ze stali nierdzewnej. Immunofluorescencyjne obrazy nieprzeszczepionego organoidu nerkowego i przeszczepionego organoidu nerkowego zawierają zarówno struktury kłębuszkowe, jak i rurkowe.

W nieprzeszczepionych organoidach obecne są niektóre ludzkie komórki śródbłonka. W przeszczepionym organoidzie perfundowana sieć naczyniowa jest widoczna w całym organoidzie. Powiększone obrazy obszarów pudełkowych pokazują trzy typy komórek śródbłonka, które można rozróżnić w przeszczepionych organoidach: perfundowane ludzkie komórki śródbłonka, nieperfundowane ludzkie komórki śródbłonka i perfundowane komórki śródbłonka pochodzące z kurczaka.

W nieprzeszczepionych organoidach komórki śródbłonka otaczają struktury kłębuszków nerkowych, ale ich nie atakują. Jednak w przeszczepionych organoidach struktury kłębuszkowe są unaczynione przez perfundowane naczynia włosowate. Przeszczepione organoidy mogą być analizowane przy użyciu różnych technik w zależności od celu eksperymentu.

Bezpośrednie porównanie z nieprzeszczepionymi grupą kontrolną może zapewnić wgląd w proces unaczynienia i dojrzewania.