Name: Skuteczne unaczynienie organoidów nerkowych poprzez docelomiczne przeszczepienie zarodków kurczaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj metodę docelomicznego przeszczepienia organoidów nerkowych do zarodków kurczaków, która w ciągu 8 dni indukuje unaczynienie i wspiera dojrzewanie tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy George'owi Galarisowi (LUMC, Leiden, Holandia) za pomoc w wstrzykiwaniu zarodków kurzych. Dziękujemy za wsparcie ze strony Saskii van der Wal-Maas (Wydział Anatomii i Embriologii, LUMC, Lejda, Holandia), Conny van Munsteren (Wydział Anatomii i Embriologii, LUMC, Lejda, Holandia), Manon Zuurmond (LUMC, Lejda, Holandia) oraz Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Holandia). M. Koning jest wspierany przez "Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC". Prace te były częściowo wspierane przez Fundusz Uniwersytetu w Lejdzie "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fund" GWF2019-02. Prace te są wspierane przez partnerów z Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) oraz Health Holland, Top Sector Life Sciences & Health. C.W. van den Berg i T.J. Rabelink są wspierani przez The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine jest wspierane przez granty Novo Nordisk Foundation (NNF21CC0073729).

Zgodnie z holenderskim prawem, zgoda komitetu ds. dobrostanu zwierząt nie była wymagana dla tych badań.
1. Przygotowanie organoidów nerkowych pochodzących z hiPSC do przeszczepu
<ol>
	<li>Różnicowanie hiPSC od organoidów nerkowych za pomocą protokołu opracowanego przez Takasato et al.4,18,31. Hodować organoidy zgodnie z niniejszym protokołem na poliestrowych wkładkach do hodowli komórkowych z porami 0,4 μm (wkładki do hodowli komórkowych) do 7 + 12 dnia różnicowania. Każda wkładka do hodowli komórkowej będzie zawierała trzy organoidy.</li>
	<li>Usuń organoidy z wkładki do hodowli komórkowej.
	<ol>
		<li>Zrób otwór w środku błony wkładki do hodowli komórkowej za pomocą pary kleszczy preparacyjnych. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj trzy nacięcia w błonie od otworu pośrodku do krawędzi wkładki do hodowli komórkowej, przecinając między organoidami. Spowoduje to powstanie trzech kawałków błony, z których każdy ma dołączony jeden organoid, które są nadal połączone z wkładką do hodowli komórkowej na ich zewnętrznej krawędzi.</li>
		<li>Chwyć jeden z kawałków błony blisko jej zewnętrznej krawędzi za pomocą kleszczy i oderwij go od wkładki do hodowli komórkowej. Umieść kawałek membrany z dołączonym organoidem na szalce Petriego. Dodaj kilka kropli soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) bez wapnia i magnezu (DPBS-/-) firmy Dulbecco do organoidu, aby uniknąć odwodnienia. Powtórz tę czynność dla pozostałych dwóch organoidów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetnij organoidy na pół, przytrzymując ich błonę na miejscu kleszczami i przecinając je na pół obosieczną żyletką ze stali nierdzewnej (cały organoid jest zbyt duży, aby celom mógł się pomieścić na tym etapie rozwoju). Delikatnie zepchnij dwie połówki organoidu z membrany za pomocą dysektora opony twardej. Wyrzuć błonę i pozostaw organoidy w DPBS-/- do czasu przeszczepu. 
	UWAGA: Do przeszczepu należy przygotować maksymalnie trzy organoidy na raz, aby uniknąć stresu dla organoidów przed przeszczepem. Idealnie byłoby, gdyby jedna osoba przygotowywała organoidy, podczas gdy inna wykonywała przeszczep.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zarodków kurcząt do przeszczepu
<ol>
	<li>Wysiaduj zapłodnione białe jaja leghorn. Rozpocznij inkubację jaj w różnicowaniu organoidów nerkowych w 7 + 8 dniu, aby zapewnić prawidłowy czas przeszczepu.
	<ol>
		<li>Umieść zapłodnione jaja białego leghorna (Gallus domesticus) poziomo na uchwycie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A; dzień 0), zaznaczając ołówkiem środek strony skierowanej do góry. 
		UWAGA: Jako uchwyty do inkubacji jaj można użyć wykonanych na zamówienie plastikowych uchwytów lub kartonów na jajka.</li>
		<li>Umieść uchwyt z jajami w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 38 ± 1 ºC (<klasa silna="xfig">Rysunek 1A; dzień 0).</li>
		<li>Wysiaduj jaja przez 3 dni, utrzymując napełniony zbiornik na wodę w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utwórz okno w skorupce jajka w 3 dniu inkubacji.
	<ol>
		<li>W 3 dniu inkubacji umieść mały kawałek (~1 cm x 0,5 cm) przezroczystej taśmy na spiczastej końcówce jaja (mały koniec). Zrób mały otwór w skorupce jajka na środku przezroczystej taśmy, stukając w nią ostrym końcem nożyczek do preparowania.</li>
		<li>Wprowadzić igłę 19 G na strzykawce o pojemności 5 ml do otworu pod kątem 45°, unikając uszkodzenia woreczka żółtkowego, i odessać 2-3 ml białka z jaja, aby obniżyć zarodek do wnętrza jaja. Uszczelnij otwór drugim kawałkiem (~1 cm x 0,5 cm) przezroczystej taśmy.</li>
		<li>Umieść duży kawałek (~5 cm x 5 cm) przezroczystej taśmy na zaznaczonej ołówkiem, skierowanej do góry stronie jajka. Zrób otwór w skorupce jajka w środku przezroczystej taśmy, stukając w nią ostrym końcem nożyczek do preparowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A; Dzień 3).</li>
		<li>Zaczynając od tego otworu, wytnij małe okrągłe okienko w skorupce jajka za pomocą zakrzywionych nożyczek preparacyjnych. Spójrz przez to okno, aby zlokalizować zarodek, a następnie powiększ okno, aby zoptymalizować dostęp do zarodka (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A; Dzień 3).</li>
		<li>Usuń wszelkie duże kawałki skorupki jaja, które mogły spaść na zarodek za pomocą kleszczy. Usuń mniejsze kawałki, umieszczając kilka kropli DPBS z wapniem i magnezem (DPBS+/+) na zarodku za pomocą plastikowej pipety transferowej, a następnie zasysając DPBS+/+ ze skorupką jajka do pipety.</li>
		<li>Dodaj trzy krople DPBS+/+ uzupełnione 0,5% penicyliny/streptomycyny do jaja za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia.</li>
		<li>Ostrożnie uszczelnij okno dużym kawałkiem (~5 cm x 5 cm) przezroczystej taśmy przed umieszczeniem jaja z powrotem w inkubatorze do 4 dnia inkubacji, kiedy zarodek jest w stadium Hamburger-Hamilton 23-24 (HH 23-24)32. 
		UWAGA: Uszczelnienie okienka jest bardzo ważne, aby uniknąć odwodnienia i śmierci zarodka.</li>
		<li>Codziennie sprawdzaj zarodki pod kątem żywotności, patrząc na nie przez taśmę (nie usuwaj taśmy, aby uniknąć odwodnienia). W pierwszych dniach inkubacji kolor żółtka jaja zmienia się z jasnego na matowożółty po śmierci zarodka. Wyrzuć martwe zarodki.</li>
		<li>Utrzymuj miskę na wodę w inkubatorze napełnioną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przeszczep wewnątrzcelomiczny w 4 dniu inkubacji
<ol>
	<li>Uzyskanie dostępu do jamy celomicznej
	<ol>
		<li>Odetnij taśmę od okna zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi.</li>
		<li>Umieść jajko pod mikroskopem preparacyjnym na gumowym uchwycie lub kartonie na jajka.</li>
		<li>Zarodek kurczaka znajduje się teraz w HH 23-24 i leży na lewym boku, prawą stroną skierowaną w stronę widza (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A; Dzień 4). Zlokalizuj prawe skrzydło i zawiązek nogi zarodka, ponieważ celom będzie dostępny między tymi dwoma pąkami kończyn. W obszarze między prawym skrzydłem a zawiązkiem nogi utwórz kolejno otwór w błonie witeliny, kosmówce i owodni, przytrzymując je dwiema parami kleszczy preparacyjnych i delikatnie ciągnąc je w przeciwnych kierunkach. 
		UWAGA: Błona witelinowa jest pierwszą błoną, która pojawia się po otwarciu jaja, a w niektórych przypadkach jest już uszkodzona po wykonaniu okna w 3 dniu. Jeśli zarodek jest obrócony, leżąc na prawym boku z lewym bokiem skierowanym w stronę widza (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A; dzień 4), konieczne jest odwrócenie go, aby umożliwić przeszczep. Aby to zrobić, wykonaj duży otwór w błonie błony witelinowej i kosmówkowej, a następnie ostrożnie obróć zarodek za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Sprawdź, czy dostęp do jamy celomicznej jest niezakłócony: delikatnie chwyć krawędź ściany ciała między skrzydłem a pąkiem kończyny za pomocą kleszczy preparacyjnych i lekko pociągnij w kierunku widza. Jama celomiczna musi być wyraźnie widoczna. Ostrożnie włóż, ale cienkie narzędzie (np. drut wolframowy w uchwycie na mikroskalpel) do jamy celomicznej. 
		UWAGA: Jeśli włożenie narzędzia do jamy celomicznej nie jest możliwe, oznacza to, że jedna lub więcej błon nie została prawidłowo otwarta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>transplantacja
	<ol>
		<li>Umieść pół organoidu w jaju na wierzchu allantois za pomocą dysektora opony twardej.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy preparacyjnych ostrożnie chwyć krawędź ściany ciała i pociągnij ją lekko w kierunku widza, aby widoczny był otwór do celomu. 
		UWAGA: Unikaj uszkadzania naczyń krwionośnych w ścianie ciała.</li>
		<li>Delikatnie przesuń organoid w kierunku i przez otwór w ścianie ciała do celonu za pomocą drutu wolframowego w uchwycie na mikroskalpel. Popchnij organoid lekko czaszką, aby umieścić go w celomie. Jest teraz widoczny tuż za pąkiem skrzydła (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A; Dzień 4).</li>
		<li>Dodaj trzy krople DPBS+/+ do jajka za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia.</li>
		<li>Ostrożnie uszczelnij okno dużym kawałkiem (~5 cm x 5 cm) przezroczystej taśmy przed umieszczeniem jaja z powrotem w inkubatorze do 12 dnia inkubacji (8 dni po przeszczepie).</li>
		<li>Codziennie sprawdzaj zarodki pod kątem żywotności, patrząc na nie przez taśmę (nie usuwaj taśmy, aby uniknąć odwodnienia). Wyrzuć martwe zarodki. 
		UWAGA: W miarę wzrostu zarodków i ich błon kosmówkowo-omoczniowych stają się one wyraźniej widoczne przez taśmę. Brak ruchu przez zarodek oraz zapadnięte lub rzadkie naczynia krwionośne są oznaką śmierci zarodka.</li>
		<li>Codziennie sprawdzaj zbiornik na wodę w inkubatorze i utrzymuj go napełnionym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wstrzyknięcie fluorescencyjnie znakowanej lektyny
<ol>
	<li>Przygotowanie do wstrzyknięcia
	<ol>
		<li>Szklane igły do mikroiniekcji należy wykonać, wciągając szklane mikrokapilary do ściągacza do mikropipet z następującymi ustawieniami: Ciepło 533, Ciągnięcie 60, Prędkość 150, Czas 200. Patrząc przez mikroskop preparacyjny, ostrożnie odłamać końcówki igieł do mikroiniekcji za pomocą kleszczy preparacyjnych, aby utworzyć otwór. 
		UWAGA: Wymagane ustawienia ściągacza do mikropipet mogą się różnić w zależności od urządzenia.</li>
		<li>Zmontuj układ wtryskowy. Weź dwa kawałki silikonowej rurki o długości 38 cm i połącz je ze sobą, umieszczając między nimi filtr 0,2 μm. Włóż ustnik do końca rurki, która jest połączona z wylotem filtra (rurka silikonowa 1), a łącznik do końca rurki, który jest połączony z wlotem filtra (rurka silikonowa 2). Na koniec włóż igłę do mikroiniekcji do łącznika (Rysunek 1B).</li>
		<li>Rozcieńczyć znakowaną fluorescencyjnie soczewkę aglutyninę kulinarynową (LCA) za pomocą DPBS-/- do stężenia 2,5 mg mL-1 w probówce 0,5 ml i wirować przez ~30 s w mikrowirówce, aby przesunąć agregaty na dno probówki.</li>
		<li>Odpipetować pipetą 20 μl LCA na kawałek parafilmu.</li>
		<li>Odessać 20 μl LCA z parafilmu do igły mikrokapilarnej zmontowanego systemu iniekcyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>zastrzyk
	<ol>
		<li>Odetnij taśmę od okna zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi. Umieść jajko pod mikroskopem preparacyjnym w gumowym uchwycie.</li>
		<li>Oceń unaczynienie i zlokalizuj żyły, które można odróżnić od tętnic po ich nieco jaśniejszym czerwonym kolorze (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A; dzień 12). Aby poprawić dostęp do układu krwionośnego, ostrożnie powiększ okno, tnąc zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi. Wybierz żyłę do wstrzyknięcia na podstawie dostępności i rozmiaru.</li>
		<li>Wprowadzić końcówkę igły mikrokapilarnej do wybranej żyły pod kątem 0°-20º. Upewnij się, że igła znajduje się w żyle, delikatnie przesuwając końcówkę z boku na bok. Delikatnie i równomiernie wdmuchnąć w układ wtryskowy, aby wstrzyknąć LCA (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A; dzień 12). 
		UWAGA: Jeśli igła w żyle znajduje się we właściwej pozycji, powinna pozostać w granicach żyły.</li>
		<li>Umieść jajo z powrotem w inkubatorze na 10 minut, aby LCA mógł krążyć. 
		UWAGA: W tym czasie nie ma potrzeby zamykania jajka taśmą.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Zbieranie przeszczepionych organoidów w 12 dniu inkubacji
<ol>
	<li>Poświęcenie zarodka kurczaka
	<ol>
		<li>Umieść jajko w gumowym uchwycie na ławce. Odetnij taśmę od okna zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi. Następnie przeciąć błony otaczające zarodek zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi. 
		UWAGA: Do tego kroku nie jest wymagany mikroskop preparacyjny.</li>
		<li>Wyjmij zarodek z jaja za pomocą perforowanej łyżki i natychmiast odetnij zarodek za pomocą nożyczek. Umieścić ciało zarodka na szalce Petriego pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lokalizowanie i zbieranie organoidów
	<ol>
		<li>Umieść zarodek na plecach na szalce Petriego i rozłóż jego kończyny.</li>
		<li>Ostrożnie otwórz ścianę brzuszną zarodka wzdłuż osi podłużnej za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Zlokalizuj organoid wewnątrz zarodka. Organoid najczęściej przyczepia się do prawego płata wątroby, albo na końcu ogona, albo czaszkowo tuż pod klatką piersiową (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A; dzień 12). Dlatego zaleca się rozpoczęcie od przyjrzenia się tym lokalizacjom.</li>
		<li>Po zlokalizowaniu organoidu usuń go z zarodka, przecinając go mikronożyczkami. Umieść organoid i tkankę kurczaka, która jest z nim nieuchronnie przyczepiona, na szalce Petriego pod mikroskopem preparacyjnym. Usuń jak najwięcej tkanki kurczaka za pomocą obosiecznej żyletki ze stali nierdzewnej.</li>
		<li>Przetwarzaj organoid w zależności od pożądanej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Barwienie immunofluorescencyjne w całości
<ol>
	<li>Umieścić przeszczepiony organoid na płytce 24-dołkowej i umieścić w 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Przemyć 3x DPBS-/-.</li>
	<li>Przepuszczalność i zablokowanie organoidu w 300 μl roztworu blokującego (0,3% Triton-X w DPBS-/- zawierającym 10% surowicy osła) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę przeciwciał pierwszorzędowych: dla jednego organoidu rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe NPHS1 (owca-α-człowiek, rozcieńczenie 1:100), CD31 (mysz-α-człowiek, rozcieńczenie 1:100) i LTL (biotyna sprzężona, rozcieńczenie 1:300) w 300 μl roztworu blokującego. Dodać mieszaninę przeciwciał do organoidu i inkubować przez 72 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć 3x z 0,3% TritonX w DPBS-/-.</li>
	<li>Przygotować mieszankę przeciwciał drugorzędowych: dla jednego organoidu rozcieńczyć przeciwciał α a drugorzędowe Alexa Fluor 647 (rozcieńczenie 1:500), α osła Alexa Fluor 488 (rozcieńczenie 1:500) i streptawidynę Alexa Fluor 405 (rozcieńczenie 1:200) w 300 μl roztworu blokującego. Dodaj mieszaninę przeciwciał drugorzędowych do organoidu i inkubuj przez 2-4 godziny w temperaturze pokojowej. Przykryj folią aluminiową, aby uniknąć wystawienia przeciwciał drugorzędowych na działanie światła.</li>
	<li>Umyć 3x za pomocą DPBS-/-.</li>
	<li>Osadź organoid w ~30 μl podłoża montażowego w naczyniu ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i pozostaw do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej, przykryty folią aluminiową. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Obraz za pomocą mikroskopu konfokalnego.</li>
</ol>

<ol><li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).</li>
<li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li>
<li>Kim, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-edited+human+kidney+organoids+reveal+mechanisms+of+disease+in+podocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development.</a> Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Hale, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+organoid-derived+human+glomeruli+for+personalised+podocyte+disease+modelling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening.</a> Nature Communications. 9 (1), 5167(2018).</li>
<li>Vanslambrouck, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+metanephric+specification+to+functional+proximal+tubule+enables+toxicity+screening+and+infectious+disease+modelling+in+kidney+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 5943(2022).</li>
<li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+from+nephrotic+disease-derived+iPSCs+identify+impaired+NEPHRIN+localization+and+slit+diaphragm+formation+in+kidney+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes.</a> Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).</li>
<li>Forbes, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-iPSC-derived+kidney+organoids+show+functional+validation+of+a+ciliopathic+renal+phenotype+and+reveal+underlying+pathogenetic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms.</a> American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).</li>
<li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715(2015).</li>
<li>Cruz, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cystogenesis+reveals+a+critical+role+of+microenvironment+in+human+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease.</a> Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).</li>
<li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+injury+and+repair+in+kidney+organoids+reveals+that+homologous+recombination+governs+tubular+intrinsic+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair.</a> Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772(2022).</li>
<li>Hiratsuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid-on-a-chip+model+of+human+ARPKD+reveals+mechanosensing+pathomechanisms+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Scencei+Advances%22%5BJournal%5D)">Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery.</a> Scencei Advances. 8 (38), eabq0866(2022).</li>
<li>Dorison, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+generated+using+an+allelic+series+of+NPHS2+point+variants+reveal+distinct+intracellular+podocin+mistrafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking.</a> Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).</li>
<li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li>
<li>Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor+is+an+essential+molecule+for+mouse+kidney+development%3A+glomerulogenesis+and+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis.</a> The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).</li>
<li>Sison, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular+structure+and+function+require+paracrine%2C+not+autocrine%2C+VEGF-VEGFR-2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).</li>
<li>Ryan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+deficiencies+in+renal+organoids+and+ex+vivo+kidney+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis.</a> Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).</li>
<li>vanden Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+subcapsular+transplantation+of+PSC-derived+kidney+organoids+induces+neo-vasculogenesis+and+significant+glomerular+and+tubular+maturation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li>
<li>Sharmin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+podocytes+mature+into+vascularized+glomeruli+upon+experimental+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).</li>
<li>Bantounas, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functioning+nephrons+by+implanting+human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).</li>
<li>vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+size-selective+glomerular+sieving+in+transplanted+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).</li>
<li>Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avians+as+a+model+system+of+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Avians as a model system of vascular development.</a> Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).</li>
<li>Jankovic, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+capacity+of+the+chicken+embryo.+I.+Relationship+between+the+maturation+of+lymphoid+tissues+and+the+occurrence+of+cell-mediated+immunity+in+the+developing+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo.</a> Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).</li>
<li>Alkie, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+innate+immunity+in+chicken+embryos+and+newly+hatched+chicks%3A+a+disease+control+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Avian+Pathology%22%5BJournal%5D)">Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective.</a> Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).</li>
<li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+normal+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Annalls+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transplantation of normal embryonic tissues.</a> Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).</li>
<li>Rawles, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+melanophores+from+embryonic+mouse+tissues+grown+in+the+coelom+of+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).</li>
<li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+tuning+the+extracellular+environment+accelerates+the+derivation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).</li>
<li>Koning, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenesis+in+kidney+organoids+upon+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation.</a> NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40(2022).</li>
<li>Hamburger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+and+axial+self-differentiation+of+transplanted+limb+primordia+of+2-day+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).</li>
<li>Dossel, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+method+of+intracelomic+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New method of intracelomic grafting.</a> Science. 120 (3111), 262-263 (1954).</li>
<li>Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).</li>
<li>Aleksandrowicz, E., Herr, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethical+euthanasia+and+short-term+anesthesia+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22ALTEX%22%5BJournal%5D)">Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo.</a> ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACUC%5BTitle%5D)+AND+%22Guideline%3A+The+Use+and+Euthanasia+Procedures+of+Chicken%2FAvian+Embryos%22%5BJournal%5D)">ACUC.</a> Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , Available from: 
 
 <a target="_blank" href="https://www.cpp.edu/research/research-compliance/iacuc/docs/iacuc-guidelines-on-euthanasia-of-chicken-and-embryos.pdf
	">https://www.cpp.edu/research/research-compliance/iacuc/docs/iacuc-guidelines-on-euthanasia-of-chicken-and-embryos.pdf
	</a> (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W artykule przedstawiono protokół docelomicznego przeszczepiania organoidów nerkowych pochodzących z hiPSC w zarodkach kurcząt. Po przeszczepie organoidy są unaczyniane przez perfundowane naczynia krwionośne, które składają się z kombinacji EC pochodzących z ludzkich organoidów i kurczaków. Są one rozprowadzane po całym organoidzie i atakują struktury kłębuszków nerkowych, umożliwiając interakcję między EC a podocytami. Wcześniej wykazano, że prowadzi to do zwiększonego dojrzewania organoidowych struktur kłębuszkowych i ...

Wykazano, że organoidy nerkowe pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) mają potencjał do badań rozwojowych1,2,3,4, badanie toksyczności5,6, oraz modelowanie chorób5,7,8,9,10,11,12,13. Jednak ich zastosowanie do tych i ewentualnych celów klinicznych transplantacji jest ograniczone przez brak sieci naczyniowej. Podczas rozwoju nerek embrionalnych podocyty, komórki mezangialne i komórki śródbłonka naczyniowego (EC) oddziałują na siebie, tworząc skomplikowaną strukturę kłębuszka nerkowego. Bez tej interakcji bariera filtracji kłębuszkowej, składająca się z podocytów, błony podstawnej kłębuszków nerkowych (GBM) i EC, nie może rozwijać się prawidłowo14,15,16. Chociaż organoidy nerkowe in vitro zawierają pewne EC, nie tworzą one prawidłowej sieci naczyniowej i z czasem zanikają17. Nic więc dziwnego, że organoidy pozostają niedojrzałe. Przeszczep u myszy indukuje unaczynienie i dojrzewanie organoidów nerkowych18,19,20,21. Niestety jest to pracochłonny proces, który nie nadaje się do analizy dużej liczby organoidów.
Kurze embriony są wykorzystywane do badania unaczynienia i rozwoju od ponad wieku22. Są łatwo dostępne, wymagają niewielkiej konserwacji, nie mają w pełni funkcjonalnego układu odpornościowego i mogą rozwijać się normalnie po otwarciu skorupki jajka23,24,25,26. Wykazano, że przeszczepianie organoidów na błonę kosmówkowo-omoczniową (CAM) prowadzi do unaczynienia27. Jednak czas trwania przeszczepu na CAM, jak również poziom dojrzałości przeszczepu, są ograniczone przez tworzenie CAM, które trwa do 7 dnia embrionalnego. W związku z tym niedawno opracowano metodę skutecznego unaczyniania i dojrzewania organoidów nerkowych poprzez docelomiczny przeszczep w zarodkach kurczaków28. Od lat 30. XX wieku wiadomo, że celomiczna jama zarodków kurczaków jest środowiskiem sprzyjającym różnicowaniu tkanek embrionalnych29,30. Dostęp do niego można uzyskać na wczesnym etapie rozwoju embrionalnego i pozwala na stosunkowo nieograniczoną ekspansję przeszczepu we wszystkich kierunkach.
Ten artykuł przedstawia protokół przeszczepu organoidów nerkowych pochodzących z hiPSC w jamie celomicznej zarodków kurcząt dnia 4. Ta metoda indukuje unaczynienie i przyspieszone dojrzewanie organoidów w ciągu 8 dni. Wstrzyknięcie znakowanej fluorescencyjnie soczewki culinaris aglutynininy (LCA) przed złożeniem w ofierze zarodków umożliwia wizualizację perfundowanych naczyń krwionośnych w organoidach za pomocą mikroskopii konfokalnej.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; Filtr m: Filtr strzykawkowy Whatman Puradisc 30 0,2 i mikro; m</td><td>Naczynia ze</td> szklanym dnem Whatman <td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>35 mm&nbsp;</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Zespoły probówek aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177-5EA</td><td>Zawiera silikonowe rurki, ustnik i łącznik</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny: Laserowy mikroskop konfokalny Leica White Light&nbsp;</td><td>Leica</td><td>TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne, proste. Tytan, zakrzywiony, z drobnymi ostrymi końcówkami</td><td>Hammacher Karl</td><td>HAMMHTC091-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne, typ prosty. Tytan, prosty, z drobnymi ostrymi końcówkami</td><td>Hammacher Karl</td><td>HAMMHTC090-11</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny&nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>355110</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne, zakrzywione, OP-special, bardzo ostre/ostre</td><td>Hammacher Karl</td><td>HAMMHSB391-10</td><td></td></tr><tr><td>Serum osła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Osioł-&alfa;-mysz Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-212-02</td><td>rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Osioł-&alfa;-owca Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21448</td><td>rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Dwustronne żyletki ze stali nierdzewnej</td><td>Electron Microsopy Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, wapń, magnez (DPBS-/-)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu (DPBS+/+)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Kartony na jajka lub uchwyty na jajka na zamówienie&nbsp;</td><td>NA</td><td>NA Zapłodnione</td><td></td></tr><tr><td>jaja białych leghornów (Gallus Gallus Domesticus)&nbsp;</td><td>Drost Loosdrecht B.V.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Elbanton BV</td><td>ET-3 combi</td><td></td></tr><tr><td>Lotus Tetragonolobus lektyna (LTL) Biotynylowane</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1325</td><td>rozcieńczenie 1:300</td></tr><tr><td>Mikronożyczki, proste, ostre/ostre, długość cięcia 10 mm</td><td>Hammacher Karl</td><td>HAMMHSB500-09</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokapilary: Cienkościenne szklane kapilary 1,5 mm, żarnik</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-3</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Firma</td><td>Model P-97</td><td>Używamy następujących ustawień: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200</td></tr><tr><td>Uchwyt na mikroskalpel: Castroviejo uchwyt na ostrze i szpilki, 12 cm, okrągła rękojeść, stożkowe szczęki 10 mm.</td><td>Euronexia</td><td>L-120</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe: Prolong Gold Antifade Mountant&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Olivecrona opona twarda dissekcja 18 cm&nbsp;</td><td>Reda</td><td>41146-18</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp;</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS234526B</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna 5 000 U/ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Łyżka perforowana&nbsp;</td><td>Euronexia</td><td>S-20-P</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 60 x 15 mm&nbsp;</td><td>CELLSTAR</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe pipety transferowe&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PP89SB</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone mysie przeciwciało anty-ludzkie CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>555444</td><td>rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Soczewka znakowana rodaminą Lens Culinaris Agglutinin (LCA)</td><td>Vector Laboratories</td><td>RL-1042</td><td>Ten produkt został niedawno wycofany z produkcji. Vectorlabs nadal produkuje Dylight 649 znakowane LCA (DL-1048-1) i LCA znakowane fluoresceiną (FL-1041-5)</td></tr> <tr><td>Owcze przeciwciało anty-ludzkie NPHS1</td><td>R& Systemy D</td><td>AF4269</td><td>rozcieńczenie 1:100</td></tr><tr><td>Sterylne igły podskórne, 19 G</td><td>BD mikrolance</td><td>301500</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna Alexa Fluor 405</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S32351</td><td>rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml</td><td>BD Szmaragd</td><td>307731</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta taśma&nbsp;</td><td>Tesa</td><td>4124</td><td>Dostępny w większości sklepów z narzędziami</td></tr><tr><td>Triton X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Drut wolframowy, średnica 0,25 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>010404.H2</td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczne unaczynienie organoidów nerkowych poprzez docelomiczne przeszczepienie zarodków kurczaków

Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos

Organoidy nerkowe pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych zawierają struktury podobne do nefronów, które do pewnego stopnia przypominają te w dorosłej nerce. Niestety, ich zastosowanie kliniczne jest utrudnione ze względu na brak funkcjonalnego unaczynienia, a co za tym idzie ograniczone dojrzewanie in vitro. Przeszczepienie organoidów nerkowych w jamie celomicznej zarodków kurczaków indukuje unaczynienie przez perfundowane naczynia krwionośne, w tym tworzenie naczyń włosowatych kłębuszków nerkowych i przyspiesza ich dojrzewanie. Technika ta jest bardzo wydajna, pozwalająca na przeszczepianie i analizę dużej liczby organoidów. W artykule opisano szczegółowy protokół intracelomicznego przeszczepiania organoidów nerkowych w zarodkach kurczaków, a następnie wstrzyknięcia znakowanej fluorescencyjnie lektyny w celu zabarwienia perfundowanego naczynia krwionośnego oraz pobrania przeszczepionych organoidów do analizy obrazowej. Metoda ta może być wykorzystana do indukowania i badania unaczynienia i dojrzewania organoidów w celu znalezienia wskazówek dotyczących wzmocnienia tych procesów in vitro i poprawy modelowania chorób.

Metoda i harmonogram różnicowania hiPSC w organoidy nerek, inkubacji zapłodnionych jaj kurzych, transplantacji organoidów nerek, wstrzyknięcia LCA oraz odzyskania organoidów zostały przedstawione na Rysunku 1A. Ważne jest odpowiednie skoordynowanie czasu różnicowania organoidów i inkubacji jaj kurzych, tak aby różnicowanie rozpoczęło się 15 dni przed inkubacją. Czynności wykonywane w 0, 3, 4 i 12 dniu inkubacji zostały zilustrowane na fotografiach pod osią czasu. Organoidy są transplantowane...

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół przeszczepu organoidów nerkowych w jamie celomicznej zarodków kurczaków. Metoda ta indukuje unaczynienie i przyspieszone dojrzewanie organoidów w ciągu 8 dni i może być wykorzystana do skutecznego badania tych procesów.

Skuteczne unaczynienie organoidów nerkowych poprzez docelomiczne przeszczepienie zarodków kurczaków

Kidney organoids derived from human induced pluripotent stem cells contain nephron-like structures that resemble those in the adult kidney to a certain ...

Organoidy nerkowe hodowane in vitro pozostają niedojrzałe, co ogranicza ich zastosowanie. A ta metoda przeszczepu wewnątrzcelomicznego indukuje unaczynienie i przyspiesza dojrzewanie organoidów. Procedura jest bardzo wydajna, pozwala na przeszczepienie i analizę dużej liczby organoidów w jednym eksperymencie.Po przygotowaniu organoidów nerkowych pochodzących z HIPSC i inkubacji zapłodnionych jaj leghorn utwórz okno w skorupce jaja w trzecim dniu inkubacji. Umieść mały kawałek przezroczystej taśmy na spiczastej końcówce jajka. Zrób mały otwór w skorupce jajka na środku przezroczystej taśmy, stukając w nią ostrym końcem nożyczek do preparowania.Następnie włóż igłę o rozmiarze 19 na pięciomililitrowej strzykawce do otworu pod kątem 45 stopni. Odessać od dwóch do trzech mililitrów albuminy z komórki jajowej, aby obniżyć zarodek wewnątrz komórki jajowej. Zakryj otwór drugim kawałkiem przezroczystej taśmy, a następnie umieść duży kawałek przezroczystej taśmy na ołówku oznaczonym po stronie jajka skierowanej do góry.Zrób otwór w skorupce jajka na środku przezroczystej taśmy, stukając w nią ostrym końcem nożyczek do preparowania. Wytnij małe okrągłe okienko w skorupce jajka z tego otworu za pomocą zakrzywionych nożyczek do preparowania. Spójrz przez to okno, aby zlokalizować zarodek.Następnie powiększ okno, aby zoptymalizować dostęp do zarodka. Usuń wszelkie duże kawałki skorupki jaja, które mogły spaść na zarodek za pomocą kleszczy. Usuń mniejsze kawałki, umieszczając kilka kropli DPBS z wapniem i magnezem na zarodku za pomocą plastikowej pipety transferowej, a następnie zasysając DPBS ze skorupką jajka do pipety.Za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia dodaj do komórki jajowej trzy krople DPBS, uzupełnione 0,5% streptomycyną penicyliny. Ostrożnie uszczelnij okno dużym kawałkiem przezroczystej taśmy przed umieszczeniem jaja z powrotem w inkubatorze do czwartego dnia inkubacji. Odetnij taśmę od okna zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi.Umieść jajko pod mikroskopem preparacyjnym na gumowym uchwycie lub kartonie na jajka. Zarodek kurczaka znajduje się obecnie w stadium Hamburgera-Hamiltona od 23 do 24 i leży na lewym boku z prawą stroną skierowaną w stronę widza. Zlokalizuj prawe skrzydło i zawiązek nogi zarodka, ponieważ celom będzie oceniany między tymi dwoma zawiązkami kończyn.W obszarze między prawym skrzydłem a zawiązkiem nogi utwórz kolejno otwór w błonie witeliny, kosmówce i owodni, przytrzymując je dwiema parami kleszczy preparacyjnych i delikatnie ciągnąc je w przeciwnych kierunkach. Sprawdź, czy jest niezakłócony dostęp do jamy celomicznej. Delikatnie chwyć krawędź ściany ciała między skrzydłem a pączkiem kończyny za pomocą kleszczy preparacyjnych i pociągnij ją lekko w kierunku widza.Jama celomiczna musi być wyraźnie widoczna. Ostrożnie włóż, ale cienkie narzędzie do jamy celomicznej. Umieść pół organoidu w jaju na wierzchu allantois za pomocą dysektora opony twardej.Za pomocą kleszczy preparacyjnych ostrożnie chwyć krawędź ściany ciała i pociągnij ją lekko w kierunku widza, aby widoczny był otwór do celu. Delikatnie przesuń organoid w kierunku i przez otwór w ścianie ciała do celum za pomocą drutu wolframowego i uchwytu na mikroskalpel. Popchnij organoid lekko do czaszki, aby umieścić go w środku.Jest teraz widoczny tuż za pąkiem skrzydła. Dodaj trzy krople DPBS do jajka za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia. Ostrożnie uszczelnij okno dużym kawałkiem przezroczystej taśmy przed umieszczeniem jaja z powrotem w inkubatorze do 12 dnia inkubacji.Odetnij taśmę od okna zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi. Umieść jajko pod mikroskopem preparacyjnym w gumowym uchwycie. Oceń unaczynienie i zlokalizuj żyły, które można odróżnić od tętnic po nieco jaśniejszym czerwonym kolorze.Aby poprawić dostęp do układu krwionośnego, ostrożnie powiększ okno, przecinając je zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi. Po wybraniu żyły należy wprowadzić końcówkę igły mikrokapilarnej do żyły pod kątem od zera do 20 stopni. Upewnij się, że igła znajduje się w żyle, delikatnie przesuwając końcówkę z boku na bok.Delikatnie i równomiernie wdmuchnąć do systemu iniekcyjnego, aby wstrzyknąć aglutyninę do soczewki. I umieść jajo z powrotem w inkubatorze na 10 minut, aby mogło krążyć. Umieść jajko w gumowym uchwycie na ławce.Następnie przeciąć błony otaczające zarodek zakrzywionymi nożyczkami preparacyjnymi. Wyjmij zarodek z jaja za pomocą perforowanej łyżki i natychmiast odetnij zarodek za pomocą nożyczek. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść ciało zarodka na szalce Petriego.Umieść zarodek na plecach na szalce Petriego i rozłóż jego kończyny. Ostrożnie otwórz ścianę brzuszną zarodka wzdłuż osi podłużnej za pomocą kleszczy. Zlokalizuj organoid wewnątrz zarodka.Organoid najczęściej przyczepia się do prawego płata wątroby, albo na końcu rozpieszcza, albo czaszkowo, tuż poniżej klatki piersiowej. Dlatego warto zacząć od przyjrzenia się tym lokalizacjom. Po zlokalizowaniu organoidu usuń go z zarodka, przecinając go mikronożyczkami.Umieść organoid w tkance kurczaka, która jest nieuchronnie do niego przyczepiona, na szalce Petriego pod mikroskopem preparacyjnym. Usuń jak najwięcej tkanki kurczaka za pomocą obosiecznej żyletki ze stali nierdzewnej. Immunofluorescencyjne obrazy nieprzeszczepionego organoidu nerkowego i przeszczepionego organoidu nerkowego zawierają zarówno struktury kłębuszkowe, jak i rurkowe.W nieprzeszczepionych organoidach obecne są niektóre ludzkie komórki śródbłonka. W przeszczepionym organoidzie perfundowana sieć naczyniowa jest widoczna w całym organoidzie. Powiększone obrazy obszarów pudełkowych pokazują trzy typy komórek śródbłonka, które można rozróżnić w przeszczepionych organoidach: perfundowane ludzkie komórki śródbłonka, nieperfundowane ludzkie komórki śródbłonka i perfundowane komórki śródbłonka pochodzące z kurczaka.W nieprzeszczepionych organoidach komórki śródbłonka otaczają struktury kłębuszków nerkowych, ale ich nie atakują. Jednak w przeszczepionych organoidach struktury kłębuszkowe są unaczynione przez perfundowane naczynia włosowate. Przeszczepione organoidy mogą być analizowane przy użyciu różnych technik w zależności od celu eksperymentu.Bezpośrednie porównanie z nieprzeszczepionymi grupą kontrolną może zapewnić wgląd w proces unaczynienia i dojrzewania.

efficient-vascularization-kidney-organoids-through-intracelomic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy przedstawiamy metodę transplantacji ludzkich komórek macierzystych do różnych obszarów ośrodkowego układu nerwowego zarodka kurczaka. Stanowi to model in vivo do oceny proliferacji i różnicowania różnych typów ludzkich komórek macierzystych w środowisku tkanki embrionalnej.

Ksenotransplantacja ludzkich komórek macierzystych do zarodka kurczaka

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodologię umożliwiającą długotrwałą hodowlę embrionów ptaków ex-ovo. Technika ta jest idealna do eksperymentów podłużnych, które wymagają pełnej dostępności optycznej i/lub sterylnego transportu embrionów ptaków.

System hodowli embrionów kurzych ex-ovo odpowiedni do obrazowania i zastosowań mikrochirurgicznych

Ten film opisuje metodę badania rozwoju narządów za pomocą ulepszonego zestawu ksenotransplantacji na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) z ptasich embrionów. Metoda ta pozwala na rozwój w pełni unaczynionych, hodowanych narządów embrionalnych i organoidów.

Organotypowa hodowla nerek na CAM kurczaka: technika przeszczepiania mysich eksplantatów nerek na CAM kurczaka w celu wywołania powstania architektury naczyń nerkowych

Źródło: Delalande, J., et.al. Podwójne znakowanie komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych w zarodkach kurczaków za pomocą szczepienia cewy nerwowejpiskląt GFP i wstrzyknięcia barwnika karbocyjaninowego DiI. J. Vis. Exp. (2015)Ten film pokazuje przeszczepienie cewy nerwowej dawcy znakowanej GFP z dopasowanego etapu transgenicznego zarodka kurczaka do zarodka biorcy na poziomie somitów od jednego do siedmiu, a następnie znakowanie naczyniowe przy użyciu lipofilowego barwnika...

Wizualizacja sieci nerwowych i naczyniowych w zarodku kurczaka

Tutaj informujemy o podwójnym znakowaniu komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych za pomocą wewnątrzgatunkowego szczepienia rurki nerwowejGFP w połączeniu z wewnątrznaczyniowym wstrzyknięciem DiI. Ta eksperymentalna technika pozwala nam jednocześnie wizualizować i badać rozwój układu nerwowego (jelitowego) wywodzącego się z NCC i układu naczyniowego podczas organogenezy.

Podwójne znakowanie komórek grzebienia nerwowego i naczyń krwionośnych w zarodkach kurczaków za pomocą szczepienia cewy nerwowejpiskląt GFP i wstrzyknięcia barwnika karbocyjaniny DiI

Ten protokół opisuje metodę izolowania i hodowli podstaw metanefrycznych z embrionów myszy.

Sekcja i hodowla embrionalnej nerki myszy

Ten artykuł przedstawia zaktualizowane podejście do klasycznego systemu chimery kury przepiórczej do badania formowania się narządów, poprzez połączenie nowatorskich procedur eksperymentalnych in vitro i in ovo.

Dwuetapowe podejście do badania wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim: paradygmat organogenezy grasicy i przytarczyc

Rak jasnokomórkowy nerki z przerzutami jest chorobą, która nie posiada kompleksowego modelu zwierzęcego do dokładnych badań przedklinicznych. Protokół ten ilustruje dwa nowatorskie modele zwierzęce choroby: ortotopowo wszczepiony model myszy i model błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka, z których oba wykazują przerzuty do płuc przypominające przypadki kliniczne.

Porównanie modelu przerzutowego raka jasnokomórkowego nerki ustalonej w nerce myszy i na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurczaka

Ta praca opisuje dwie metody badania rozwoju narządów, ulepszone ustawienie ksenotransplantacji na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) z ptasich embrionów, które pozwala na unaczynienie hodowanych narządów embrionalnych i organoidów oraz nowatorską metodę hodowli narządów w stałym kierunku z zmodyfikowanymi warunkami eksperymentalnymi, która pozwala na obrazowanie konfokalne w wysokiej rozdzielczości w trybie poklatkowym.

Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe

Ogólnym celem tego artykułu jest opisanie, jak przeprowadzić wewnątrzkomórkową iniekcję in ovo materiałów egzogennych do zarodków kurcząt. Takie podejście jest bardzo przydatne do badania biologii rozwoju zarodków kurczaków.

In Ovo Iniekcja donaczyniowa w zarodkach kurczaka

Tutaj prezentujemy protokół do wszczepiania organoidów ludzkiego mózgu na wielu etapach dojrzewania do błony kosmówkowo-omoczniowej pisklęcia (CAM). Organoidy mózgowe hodowano zgodnie z niekierowanymi standardowymi protokołami.

Wczesne niekierowane modelowanie niszy nerwowo-naczyniowej organoidu ludzkiego mózgu w permisywnej błonie moczowo-omoczniowej zarodka pisklęcia

Poznaj metodę docelomicznego przeszczepienia organoidów nerkowych do zarodków kurczaków, która w ciągu 8 dni indukuje unaczynienie i wspiera dojrzewanie tkanek.

Skuteczne unaczynienie organoidów nerkowych poprzez docelomiczne przeszczepienie zarodków kurczaków

Przeglądaj więcej filmów