Name: Izolacja i hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej za pomocą innowacyjnej metody wolnej od ksenogenu w terapii u ludzi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli ludzkich komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej wolnej od ksenogenu. Technika ta zapewnia bezpieczeństwo biologiczne w terapii komórkowej i jest prosta w replikacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

hASC zostały wyizolowane z tkanki tłuszczowej brzucha zdrowej kobiety, która przeszła rekonstrukcję piersi za pomocą autologicznych płatów brzusznych (głębokie dolne płaty perforacyjne nadbrzusza, [DIEP]) w Szpitalu Uniwersyteckim w Lozannie, CHUV, Lozanna, Szwajcaria. Odrzucona część płata oraz tkanka tłuszczowa została pozyskana po podpisaniu przez pacjenta świadomej zgody. Wszystkie protokoły zostały sprawdzone i zatwierdzone przez szpitalny Dział Biobanku DAL (numer 314 GGC) oraz komisje bioetyczne zgodnie z Deklaracją Helsińską.
UWAGA: Wszystkie kroki muszą być wykonywane pod okapem z przepływem laminarnym i w warunkach aseptycznych. Należy zawsze nosić rękawice i fartuchy laboratoryjne do ochrony osobistej, a wszystkie powierzchnie należy myć odpowiednimi środkami biobójczymi. Nadmiar tkanek należy odpowiednio zutylizować jako odpady biomedyczne.
1. Potrzebne materiały i przygotowanie roztworów hodowlanych
<ol>
	<li>Do izolacji, ekspansji i krioprezerwacji komórek zaopatrz się w następujące instrumenty: sterylne nożyczki; sterylne skalpele; sterylna pęseta; 10-centymetrowa szalka Petriego; probówki 15 ml; kolby T25; komora Burkera; kriowialisty; pojemnik do zamrażania komórek; mikroskop optyczny z obiektywami o powiększeniu 4x i 10x; i wahadłowa wirówka kubełkowa.</li>
	<li>Do immunofenotypowania należy zaopatrzyć się w następujące przyrządy i odczynniki: probówki FACS, sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS); Minimalna pożywka egzogenna (DMEM) firmy Dulbecco; hPL; siarczek dimetylu; i trypsyna wolna od zwierząt.</li>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę hodowlaną, uzupełniając DMEM 5% hPL bez heparyny. Przechowuj podłoże w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni i zawsze używaj go w ciepłym (od temperatury pokojowej do 37 °C). Postępując zgodnie z wytycznymi GMP dotyczącymi produkcji leków komórkowych przeznaczonych do terapii u ludzi, nie należy dodawać żadnych antybiotyków do pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Przygotować pożywkę zamrażającą zawierającą 20% hPL i 10% siarczku dimetylu w DMEM.</li>
</ol>
2. Izolacja hASC z próbki tkanki tłuszczowej
<ol>
	<li>Próbkę tkanki tłuszczowej należy poddać obróbce w ciągu 6 godzin od jej uzyskania. Przed przystąpieniem do ustalonej metody izolacji mechanicznej wolnej od ksenogenów, należy przemyć tkankę 2x PBS przez 10 minut, aż do uwolnienia tkanki łącznej i krwi.</li>
	<li>Pobraną próbkę tkanki tłuszczowej z operacji abdominoplastycznej należy przechowywać w PBS w temperaturze 4°C do czasu przetworzenia, a w każdym razie nie dłużej niż 24 godziny, aby nie uszkodzić żywotności hASC.</li>
	<li>Pokrój tkankę tłuszczową na mniejsze kawałki o długości około 1cm2 za pomocą sterylnych nożyczek.</li>
	<li>Za pomocą skalpela rozetnij każdy kawałek na małe fragmenty o średnicy <5 mm i rozproszyj pięć z nich na 10 cm szalce Petriego (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A).</li>
	<li>Aby przymocować każdy fragment, użyj skalpela, aby wykonać nacięcia na plastikowej powierzchni, przeciągając każdy fragment, aż mocno przyklei się do szalki Petriego. Użyj pęsety, aby poradzić sobie z fragmentem (Rysunek 2B).</li>
	<li>Delikatnie dodaj 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej, aby pokryć wszystkie fragmenty bez ich odłączania.</li>
	<li>Inkubować płytki Petriego w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . hASC będą migrować z tkanki i zostaną wybrane ze względu na ich przyleganie do tworzywa sztucznego bez trawienia enzymatycznego.</li>
	<li>Do momentu zbiegu komórek monitoruj ekspansję hASC pod mikroskopem optycznym przy 4-krotnym powiększeniu raz dziennie. Gdy hASC zaczynają wychodzić z tkanki, pojawiają się jako małe skupiska wokół fragmentów tkanki o typowej morfologii podobnej do fibroblastów. hASC są wybierane ze względu na ich zdolność do przylegania do powierzchni tworzywa sztucznego. Co 72 godziny usuwaj jak najwięcej pożywki i zastąp ją świeżą, kompletną pożywką w celu usunięcia resztek komórek.</li>
	<li>Pozostaw fragmenty tkanki na miejscu do pierwszego przejścia komórek, czyli zwykle po 7 dniach.</li>
</ol>
3. Hodowla hASC po fazie izolacji
<ol>
	<li>Gdy kultura hASC osiągnie zbieżność 70%-80%, hASC są gotowe do odłączenia i dalszej rozbudowy, aby można je było wykorzystać do innych eksperymentów lub długoterminowego przechowywania.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pęsety usuń i wyrzuć wszystkie kawałki tkanki z szalki Petriego. Wyjąć i wyrzucić wyczerpane podłoże, uważając, aby nie dotknąć hASC, aby ich nie odłączyć.</li>
	<li>Ostrożnie umyj komórki raz 10 ml PBS. Dodać 1 ml 1x trypsyny wolnej od zwierząt i pozostawić szalkę Petriego w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 5 minut.</li>
	<li>Sprawdź pod mikroskopem optycznym przy 4-krotnym powiększeniu, czy wszystkie komórki się odłączyły; w przeciwnym razie pozostaw szalkę Petriego na dodatkowe 2 minuty w inkubatorze i na koniec delikatnie postukaj w plastikową powierzchnię, aby ułatwić odklejenie komórek.</li>
	<li>Zatrzymaj działanie trypsyny, dodając 2 ml kompletnej pożywki i zbierz wszystkie komórki w probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>W celu usunięcia pozostałej trypsyny należy odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant, zawiesić komórki w 5 ml kompletnej pożywki i przenieść zawiesinę komórek do nowej kolby T25. Utrzymuj hASC w kulturze i rozwijaj je, aż będą potrzebne.</li>
</ol>
4. Badanie immunofenotypu metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Gdy posiew hASC osiągnie zbieżność 70%-80%, należy odłączyć hASC, jak opisano wcześniej w sekcji 3.</li>
	<li>Po zebraniu komórek zawiesić je w 1 ml kompletnej pożywki i policzyć porcję za pomocą licznika komórek pod mikroskopem optycznym przy 10-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Odwirować hASC przy 300 x g przez 5 minut i zawiesić je na 1 x 106 komórek/ml buforu FACS. Przenieść 100 μl zawiesiny zawierającej 1 x10 5 komórek do jednej probówki FACS. Użyj jednej probówki FACS dla każdego badanego antygenu oraz jeszcze jednej dla każdej kontroli izotypowej.</li>
	<li>Wybarwić komórki 100 μl następujących przeciwciał rozcieńczonych w buforze FACS: anty-CD73 (1:1,000, IgG1, znakowane FITC), anty-CD105 (1:200, IgG1, znakowane PE); anty-CD34 (1:66, IgG1, znakowane FITC); anty-CD45 (1:66, IgG1, znakowane FITC); oraz kontrole izotypowe dla każdego fluoroforu, IgG1 znakowane FITC (1:1,000) i IgG1 PE znakowane (1:50).</li>
	<li>Inkubować próbki przez 1 godzinę w ciemności z mieszaniem w temperaturze 4 °C. Odwirować probówki o stężeniu 300 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i zawiesić komórki w 500 μl buforu FACS.</li>
	<li>Oceń immunofenotyp komórki za pomocą przyrządu do cytometrii przepływowej, rejestrując 50 000 zdarzeń dla każdej probówki wewnątrz bramki wybranej w celu wykluczenia resztek komórek. Obliczyć procent komórek wykazujących ekspresję jako różnicę w stosunku do specyficznej kontroli izotypowej.</li>
</ol>
5. Test proliferacji hASC
<ol>
	<li>Gdy kultura hASC osiągnie zbieżność 70%-80%, odłącz hASC zgodnie z opisem w sekcji 3.</li>
	<li>Po zebraniu komórek zawiesić je w 1 ml kompletnej pożywki i policzyć porcję za pomocą licznika komórek pod mikroskopem optycznym przy 10-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Wysiew 5 x 102 hASC w 200 μl kompletnego podłoża w 96-dołkowych przezroczystych płytkach. Zasiej komórki w kontrpróbach technicznych, z jednym dołkiem na każdy punkt czasowy.</li>
	<li>Po 3 dniach od wysiewu rozpocznij wykrywanie proliferacji komórek za pomocą zestawu do oznaczania proliferacji, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, zastąp pożywkę hodowlaną 100 μl świeżej pożywki dodanej do 20 μl odczynnika do oznaczania na basenik. Inkubować hASC przez 2,5 h w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w celu wytworzenia odczynnika, a następnie wykryć absorbancję przy 490 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Wyraż proliferację hASC jako procentową absorbancję po usunięciu absorbancji ślepej próby.</li>
</ol>
6. Kriokonserwacja i przechowywanie hASC
<ol>
	<li>Odłączyć ogniwa zgodnie z opisem w sekcji 3 i policzyć podwielokrotność za pomocą licznika komórek pod mikroskopem optycznym przy 10-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Odwirować komórki o masie 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić komórki za pomocą mieszanki zamrażającej o gęstości 1 x 106 hASCs/ml i przenieść 1 ml roztworu komórkowego do jednego kriowialu.</li>
	<li>Umieść kriowiale w temperaturze -80 °C w pojemniku do zamrażania, który obniża temperaturę o 1 °C/min, a następnie przenieś kriowiale do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>

<ol><li>Naderi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regenerative+role+of+adipose-derived+stem+cells+%28ADSC%29+in+plastic+and+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery.</a> International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).</li>
<li>Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+human+platelet+lysate+%28hPL%29+the+ideal+candidate+to+substitute+the+foetal+bovine+serum+for+cell-therapy+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Is human platelet lysate (hPL) the ideal candidate to substitute the foetal bovine serum for cell-therapy translational research.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 426(2021).</li>
<li>Condé-Green, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shift+toward+mechanical+isolation+of+adipose-derived+stromal+vascular+fraction%3A+Review+of+upcoming+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery.+Global+Open%22%5BJournal%5D)">Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: Review of upcoming techniques.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 4 (9), 1017(2016).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+Implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies.</a> Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).</li>
<li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+adipose-derived+stem+cells+and+collagenase+in+fat+tissue+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Aesthetic+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Safety of adipose-derived stem cells and collagenase in fat tissue preparation.</a> Aesthetic Plastic Surgery. 37 (4), 802-808 (2013).</li>
<li>Spees, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalized+antigens+must+be+removed+to+prepare+hypoimmunogenic+mesenchymal+stem+cells+for+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Internalized antigens must be removed to prepare hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 9 (5), 747-756 (2004).</li>
<li>Fadel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+obtainment+and+isolation+of+two+mesenchymal+stem+cell+sources+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cirurgica+Brasileria%22%5BJournal%5D)">Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep.</a> Acta Cirurgica Brasileria. 26 (4), 267-273 (2011).</li>
<li>Markarian, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adipose-derived+stem+cells%3A+A+comparison+among+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation of adipose-derived stem cells: A comparison among different methods.</a> Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).</li>
<li>Sherman, L. S., Condé-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-free+method+for+isolation+and+expansion+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (154), e59419(2019).</li>
<li>Lalu, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+cell+therapy+with+mesenchymal+stromal+cells+%28SafeCell%29%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis+of+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): A systematic review and meta-analysis of clinical trials.</a> PLoS One. 7 (10), 47559(2012).</li>
<li>Escobar, C. H., Chaparro, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xeno-free+extraction%2C+culture%2C+and+cryopreservation+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Xeno-free extraction, culture, and cryopreservation of human adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (3), 358-365 (2016).</li>
<li>Vaidya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet-C+irradiation+for+inactivation+of+viruses+in+foetal+bovine+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet-C irradiation for inactivation of viruses in foetal bovine serum.</a> Vaccine. 36 (29), 4215-4221 (2018).</li>
<li>Kyllönen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+serum+conditions+on+osteogenic+differentiation+of+human+adipose+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effects of different serum conditions on osteogenic differentiation of human adipose stem cells in vitro.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (1), 17(2013).</li>
<li>Schallmoser, K., Henschler, R., Gabriel, C., Koh, M. B. C., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+quality+requirements+of+human+platelet+lysate%3A+A+position+statement+from+the+Working+Party+on+Cellular+Therapies+of+the+International+Society+of+Blood+Transfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Production and quality requirements of human platelet lysate: A position statement from the Working Party on Cellular Therapies of the International Society of Blood Transfusion.</a> Trends in Biotechnology. 38 (1), 13-23 (2020).</li>
<li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+to+substitute+fetal+bovine+serum+in+hMSC+expansion+for+translational+applications%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate to substitute fetal bovine serum in hMSC expansion for translational applications: A systematic review.</a> Journal of Translational Medicine. 18 (1), 351(2020).</li>
<li>Guiotto, M., Raffoul, W., Hart, A. M., Riehle, M. O., di Summa, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+acts+synergistically+with+laminin+to+improve+the+neurotrophic+effect+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate acts synergistically with laminin to improve the neurotrophic effect of human adipose-derived stem cells on primary neurons.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 658176(2021).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Cowper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+as+a+functional+substitute+for+fetal+bovine+serum+in+the+culture+of+human+adipose+derived+stromal%2Fstem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate as a functional substitute for fetal bovine serum in the culture of human adipose derived stromal/stem cells.</a> Cells. 8 (7), 724(2019).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+and+prevention+of+graft-versus-host+disease%3A+Experiments+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Hematology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for the treatment and prevention of graft-versus-host disease: Experiments and practice.</a> Annals of Hematology. 92 (10), 1295-1308 (2013).</li>
<li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+metal+micro+and+nano-particles+on+hASCs%3A+An+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Effects of metal micro and nano-particles on hASCs: An in vitro model.</a> Nanomaterials. 7 (8), 212(2017).</li>
<li>Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stromal+vascular+fraction+cells%3A+Update+on+clinical+utility+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Eukaryotic+Gene+Expression%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stromal vascular fraction cells: Update on clinical utility and efficacy.</a> Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+medium+composition+and+translational+adult+bone+marrow-derived+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell culture medium composition and translational adult bone marrow-derived stem cell research.</a> Stem Cells. 24 (5), 1409-1410 (2006).</li>
<li>Perez-Ilzarbe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ex+vivo+expansion+culture+conditions+of+mesenchymal+stem+cells+for+human+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Comparison of ex vivo expansion culture conditions of mesenchymal stem cells for human cell therapy.</a> Transfusion. 49 (9), 1901-1910 (2009).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Shah, F. S., Wu, X., Dietrich, M., Rood, J., Gimble, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-enzymatic+method+for+isolating+human+adipose+tissue-derived+stromal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">A non-enzymatic method for isolating human adipose tissue-derived stromal stem cells.</a> Cytotherapy. 15 (8), 979-985 (2013).</li>
<li>Becherucci, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+in+mesenchymal+stromal+cell+expansion+according+to+a+GMP+grade+protocol%3A+A+cell+factory+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate in mesenchymal stromal cell expansion according to a GMP grade protocol: A cell factory experience.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 124(2018).</li>
<li>Blande, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+mesenchymal+stem+cell+expansion+in+animal+serum-free+medium+supplemented+with+autologous+human+platelet+lysate%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue mesenchymal stem cell expansion in animal serum-free medium supplemented with autologous human platelet lysate.</a> Transfusion. 49 (12), 2680-2685 (2009).</li>
<li>Castegnaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+platelet+lysate+on+the+functional+and+molecular+characteristics+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effect of platelet lysate on the functional and molecular characteristics of mesenchymal stem cells isolated from adipose tissue.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (2), 105-114 (2011).</li>
<li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+review+and+meta-analysis+on+the+use+of+human+platelet+lysate+for+mesenchymal+stem+cell+cultures%3A+Comparison+with+fetal+bovine+serum+and+considerations+on+the+production+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Systematic review and meta-analysis on the use of human platelet lysate for mesenchymal stem cell cultures: Comparison with fetal bovine serum and considerations on the production protocol.</a> Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 142(2022).</li>
<li>Palombella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+lysate+as+a+potential+clinical-translatable+supplement+to+support+the+neurotrophic+properties+of+human+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human platelet lysate as a potential clinical-translatable supplement to support the neurotrophic properties of human adipose-derived stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 432(2020).</li>
<li>Krähenbühl, S. M., Grognuz, A., Michetti, M., Raffoul, W., Applegate, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+human+adipose-derived+stem+cell+expansion+and+stability+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Enhancement of human adipose-derived stem cell expansion and stability for clinical use.</a> International Journal of Stem Cell Research & Therapy. 2 (1), 007(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej przyciągnęły zainteresowanie badań translacyjnych w ciągu ostatniej dekady ze względu na ich obfitość, szybkie i niedrogie metody izolacji, wysoki wskaźnik proliferacji in vitro/in vivo oraz właściwości macierzyste/różnicujące 18,19,20. W rezultacie, hASC są uważane za doskonałego kandydata na strategie komórkowe w medycynie regeneracyjnej21<...

W ostatnich dziesięcioleciach, rosnące zapotrzebowanie na innowacyjne terapie terapeutyczne spowodowało znaczne wysiłki i inwestycje w dziedzinie medycyny translacyjnej1. Produkty komórkowe wiążą się z ryzykiem określonym przez źródło komórki, proces produkcyjny (izolacja, ekspansja lub modyfikacja genetyczna) oraz suplementy niekomórkowe (enzymy, czynniki wzrostu, suplementy hodowlane i antybiotyki), a te czynniki ryzyka zależą od konkretnego wskazania terapeutycznego. Na jakość, bezpieczeństwo i skuteczność produktu końcowego mogą mieć duży wpływ wyżej wskazane elementy2. Terapia komórkami macierzystymi wymaga przestrzegania zasad bezpieczeństwa biologicznego; Potencjalne ryzyko przenoszenia patogenów z produktami pochodzenia zwierzęcego w hodowli komórkowej może być problematyczne, dlatego niezbędne jest dokładne przetestowanie każdego produktu wprowadzanego do produkcji3.
Tradycyjna metoda izolowania ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (hASC) obejmuje trawienie enzymatyczne przeprowadzane za pomocą kolagenazy, a następnie etapy płukania przez wirowanie4. Podczas gdy izolacja enzymatyczna jest ogólnie uważana za bardziej wydajną niż inne techniki mechaniczne pod względem wydajności i żywotności komórek, stosowane składniki pochodzenia zwierzęcego, takie jak kolagenaza, są uważane za więcej niż minimalnie manipulowane przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków. Oznacza to, że istnieje znacznie zwiększone ryzyko wystąpienia reakcji immunologicznych lub przeniesienia choroby, co ogranicza translację terapii hASC do warunków klinicznych5,6.
Trawienie oparte na trypsynach to kolejny enzymatyczny protokół izolowania ASC. Opisano różne techniki z niewielkimi modyfikacjami pod względem stężenia trypsyny, szybkości wirowania i czasu inkubacji. Niestety, metoda ta nie jest dobrze opisana, a w literaturze brakuje porównań, szczególnie z protokołami izolacji mechanicznej7. Jednak pod względem przekładalności podejścia trypsyna ma te same wady co kolagenaza.
Alternatywne metody izolacji w celu uzyskania ASC, oparte na siłach mechanicznych i bez dodatku enzymów, polegają na szybkim wirowaniu (800 x g lub 1,280 x g, 15 min) fragmentów tkanki tłuszczowej. Następnie osad inkubuje się z buforem do lizy czerwonych krwinek (5 min), po czym następuje kolejny etap wirowania przy 600 x g przed ponownym zawieszeniem w pożywce hodowlanej. Pomimo większej liczby komórek wyizolowanych w pierwszych dniach w porównaniu z metodami eksplantacji, poprzednie badanie wykazało niższą proliferację lub jej brak po drugim tygodniu hodowli8.
Poza tym, dalsze manipulacje z dodanymi pożywkami ksenogenicznymi, takimi jak płodowa surowica bydlęca (FBS), która jest używana jako dodatek czynnika wzrostu do hodowli komórkowej, wiąże się ze zwiększonym ryzykiem reaktywności immunologicznej i narażeniem na infekcje wirusowe, bakteryjne lub prionowe pacjenta gospodarza9,10. Reakcje immunologiczne i rozwój wysypki pokrzywkowej zostały już opisane u osób otrzymujących kilka dawek mezenchymalnych komórek macierzystych wytwarzanych za pomocą FBS11. Ponadto FBS jest poddawany zmienności między partiami, co może mieć wpływ na jakość produktu końcowego12.
Zgodnie z wytycznymi dobrej praktyki produkcyjnej (GMP), należy unikać dysocjacji tkanek enzymatycznych, a FBS należy zastąpić suplementami wolnymi od ksenogenów. Te kroki, wraz z bardziej wiarygodnymi i powtarzalnymi protokołami, są niezbędne do wsparcia stosowania terapii komórkowej3,13.
W tym kontekście, ludzki lizat płytkowy (hPL) został zasugerowany jako substytut FBS, ponieważ jest to suplement bezkomórkowy, zawierający białko, wzbogacony w czynnik wzrostu, i został wcześniej wprowadzony wśród produktów komórkowych klasy klinicznej jako dodatek pożywki do hodowli i ekspansji komórek in vitro14,15. Ponieważ hPL jest produktem pochodzenia ludzkiego, jest często stosowany jako substytut FBS podczas hodowli in vitro hASC przeznaczonych do zastosowań klinicznych, zmniejszając w ten sposób problemy dotyczące reakcji immunologicznych i infekcji związanych z translatowalnością FBS15,16.
Pomimo wyższych kosztów produkcji, już wykazano, że w porównaniu do FBS, hPL wspiera żywotność komórek dla wielu typów komórek, zwiększa proliferację, opóźnia starzenie, zapewnia stabilność genomu i zachowuje immunofenotyp komórkowy nawet w późnych przejściach komórkowych; wszystkie te elementy wspierają przejście na ten suplement do hodowli<klasa sup="xref">11.
Celem tej pracy było opracowanie ustandaryzowanego protokołu do izolacji i hodowli hASC metodą całkowicie bezzwierzęcą, bez modyfikacji fizjologii komórki i właściwości macierzystych w porównaniu do klasycznych hASC hodowanych przez FBS (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>euroclone</td><td>et5015b</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD105</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560839</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555821</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>BD555482</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>BD561254</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Roztwór płuczący (bufor FACS)</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-222</td><td></td></tr><tr><td>Aparat BD Accuri C6 (przyrząd do cytometrii przepływowej)</td><td>BD zgodnie z</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>komorą Burkera</td><td>Blaubrand</td><td>717810</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik do zamrażania komórek</td><td>corning</td><td>CLS432002</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Test proliferacji komórek</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell Pojemnik do zamrażania</td><td>Corning</td><td></td><td></td>CLS432002</tr><tr><td>Cryovials</td><td>clearline</td><td>390701</td><td></td></tr><tr><td>Siarczek dimetylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel jednorazowego ostrza</td><td>Paragon</td><td>BS 2982</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - wysoki poziom glukozy</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki lizat płytkowy FD (klasa GMP)</td> <td>Stemulate</td><td>PL-NH-500</td><td></td></tr><tr><td>Nieskończony spektrofotometr F50</td><td></td> <td>Tecan-Mikroskop</td><td></td></tr> <tr><td>optyczny z obiektywami o powiększeniu 4x i 10x</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 10 cm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne skalpele</td><td>Reda</td><td>07104-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sterylne</td><td>Bochem</td><td>4071</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta sterylna</td><td>Bochem</td><td>1152</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka kubełkowa wahadłowa</td><td>Kolby Sigma</td><td>3-16K</td><td></td></tr><tr><td>T25</td><td>Greiner bio-one</td><td>6910170</td><td></td></tr><tr><td>TrypLe (substytut trypsyny bez zwierząt)</td><td>GIBCO</td><td>12604-013</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej za pomocą innowacyjnej metody wolnej od ksenogenu w terapii u ludzi

Isolation and Culture of Human Adipose-Derived Stem Cells With an Innovative Xenogeneic-Free Method for Human Therapy

Biorąc pod uwagę rosnący wpływ terapii komórkami macierzystymi, pojawiły się obawy dotyczące bezpieczeństwa biologicznego w związku z potencjalnym skażeniem lub przenoszeniem infekcji w związku z wprowadzeniem produktów pochodzenia zwierzęcego podczas manipulacji in vitro. Składniki ksenogenne, takie jak kolagenaza lub płodowa surowica bydlęca, powszechnie stosowane na etapach izolacji i ekspansji komórek, mogą być związane z potencjalnym ryzykiem reaktywności immunologicznej lub infekcji wirusowej, bakteryjnej i prionowej u pacjentów otrzymujących. Zgodnie z wytycznymi dobrej praktyki wytwarzania należy unikać chemicznej dysocjacji tkanek, a płodową surowicę bydlęcą (FBS) można zastąpić suplementami niezawierającymi ksenogenów. Ponadto, aby zapewnić bezpieczeństwo produktów komórkowych, ważne jest określenie bardziej wiarygodnych i odtwarzalnych metod. Opracowaliśmy innowacyjną, całkowicie wolną od ksenogenu metodę izolacji i ekspansji in vitro ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej bez zmiany ich właściwości w porównaniu ze standardowymi protokołami hodowli kolagenazy FBS. W tym przypadku wyizolowano ludzkie komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (hASC) z tkanki tłuszczowej jamy brzusznej. Próbkę mechanicznie rozdrobniono nożyczkami/skalpelem, podano mikropreparowaniu i mechanicznie zdyspergowano na 10-centymetrowej szalce Petriego, a następnie przygotowano z nacięciami skalpela w celu ułatwienia przyczepiania się fragmentów tkanek i migracji hASC. Po przeprowadzeniu etapów mycia wybrano hASC ze względu na ich przyleganie do tworzywa sztucznego bez trawienia enzymatycznego. Wyizolowane hASC hodowano z pożywką uzupełnioną 5% ludzkim lizatem płytkowym wolnym od heparyny i odłączono od substytutu trypsyny niepochodzącego od zwierząt. Zgodnie ze wskazówkami Dobrej Praktyki Wytwarzania (GMP) dotyczącymi wytwarzania produktów komórkowych przeznaczonych do terapii u ludzi, w żadnych pożywkach hodowlanych nie stosowano antybiotyków.

Stosując opisaną powyżej metodę izolacji, pomyślnie uzyskano hASC z próbek tkanki tłuszczowej brzucha bez użycia kolagenazy. Ponadto hASC namnożono w całkowicie ksenogennych warunkach w obecności hPL, bez żadnych innych komponentów pochodzenia zwierzęcego. Poniższe wyniki potwierdzają skuteczność protokołu i zostały uzyskane z hASC hodowanych równolegle z hPL oraz z FBS jako warunkiem kontrolnym.
Po początkowym pojawieniu się klastrów, hASCs wykazywały klasyczny wrzecionowaty kształt, były mni...

Produkty ksenogeniczne (chemiczne lub pochodzenia zwierzęcego) wprowadzone do etapów przygotowania/manipulacji terapii komórkowej są związane ze zwiększonym ryzykiem reaktywności immunologicznej i transmisji patogennej u pacjentów gospodarza. W tym artykule opisano całkowicie wolną od ksenogenów metodę izolacji i ekspansji in vitro ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.

Izolacja i hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej za pomocą innowacyjnej metody wolnej od ksenogenu w terapii u ludzi

Considering the increasing impact of stem cell therapy, biosafety concerns have been raised regarding potential contamination or infection transmission ...

Nasza niezależna od egzogenów metoda izolacji i ekspansji in vitro ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej jest odpowiedzią na obawy dotyczące bezpieczeństwa biologicznego związane z terapią komórkową, gdy rozważa się jej zastosowanie translacyjne. Nasze metody izolacji i rozbudowy są łatwe do odtworzenia, szybkie i mają niskie wymagania techniczne, dzięki czemu są przydatne dla każdego. Badamy strategię terapii opartej na ludzkich tłuszczowych komórkach macierzystych w celu naprawy nerwów obwodowych.Jednak nasza technika może być szeroko stosowana, gdy potrzebne są nowe komórki macierzyste tkanki tłuszczowej w różnych konfiguracjach badań klinicznych. Zachowaliśmy prostotę, aby zachować łatwiejszą produkcję. Sterylność należy uważnie obserwować od sali operacyjnej do momentu hodowli komórek.W przypadku manipulacji próbkami i fragmentami, mikrorozwarstwienie jest narażone na zanieczyszczenie. Po pobraniu próbki tkanki tłuszczowej z chirurgii plastycznej jamy brzusznej, za pomocą sterylnych nożyczek należy pokroić ją na kawałki o powierzchni około jednego centymetra kwadratowego. Za pomocą skalpela mikro rozetnij każdy kawałek na mniejsze fragmenty i rozproszyj pięć fragmentów na 10-centymetrowej szalce Petriego.Do mocowania fragmentu użyj skalpela, aby wykonać nacięcia na plastikowej powierzchni i przeciągnij każdy fragment. Delikatnie dodaj 10 mililitrów kompletnej pożywki hodowlanej, aby pokryć wszystkie fragmenty bez ich odrywania i inkubować szalkę Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Monitoruj codzienną ekspansję ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (HASC) pod mikroskopem optycznym, aż komórki staną się zlewne.Wymieniaj pożywkę na świeżą, kompletną pożywkę co 72 godziny, aby usunąć resztki komórek i pozwól im rosnąć do pierwszego przejścia. Gdy posiew HASC osiągnie zbieżność od 70 do 80%, usuń i wyrzuć wszystkie kawałki tkanki za pomocą sterylnej pęsety. Wyrzuć również wyczerpaną pożywkę, unikając oderwania się HASC od szalki Petriego.Ostrożnie umyj komórki 10 mililitrami PBS. Po usunięciu PBS dodaj jeden mililitr trypsyny wolnej od zwierząt i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Sprawdzić, czy komórki nie zostały oderwane pod mikroskopem optycznym i w razie potrzeby inkubować jeszcze przez dwie minuty.Aby podeprzeć odłączenie komórki, delikatnie postukaj w plastikową powierzchnię. Zatrzymaj działanie trypsyny, dodając dwa mililitry kompletnej pożywki i zbierz wszystkie komórki w 15-mililitrowej probówce. Usuń pozostałą trypsynę przez odwirowanie.Po odrzuceniu supernatantu zawiesić komórki w pożywce o objętości pięciu mililitrów i przenieść zawiesinę komórek do nowej kolby T25. W celu kriokonserwacji należy policzyć podwielokrotność odłączonych komórek za pomocą licznika komórek pod mikroskopem optycznym. Odwirować komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut.Po odrzuceniu supernatantu zawiesić komórki w mieszance zamrażającej o gęstości od jednego razy 10 do szóstych komórek na mililitr i przenieść jeden mililitr zawiesiny komórek do jednej fiolki kriogenicznej. Umieść fiolki kriogeniczne w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w pojemniku do zamrażania, który obniża temperaturę o jeden stopień Celsjusza na minutę, a następnie przenieś fiolki kriogeniczne do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania. W początkowym wyglądzie klastra HASC wykazywały klasyczny kształt wrzecionowaty i były mniejsze, a także bardziej wydłużone w porównaniu z komórkami kontrolnymi w obecności FBS.Immunofenotyp komórek wydawał się być podobny między HASC hodowanymi z dwoma suplementami. Ponad 80 do 90% HASC było dodatnich dla CD73 i CD105, a mniej niż 5% wyrażonych dla CD34 i CD45. Wreszcie, test proliferacji wykazał znaczny wzrost komórek, gdy ludzki lizat płytek krwi został dodany do pożywki w porównaniu z kontrolą FBS.Najważniejszym etapem jest mikro wypreparowanie fragmentów tkanki tłuszczowej i ich przymocowanie za pomocą nacięcia skalpelem na szalce Petriego. Gotowa do użycia populacja ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej jest uzyskiwana z uwzględnieniem kryteriów bezpieczeństwa biologicznego GMP, zachowując właściwości terapeutyczne komórek i zwiększając proliferację komórek.

isolation-culture-human-adipose-derived-stem-cells-with-an-innovative

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W 2001 roku naukowcy z UCLA opisali izolację populacji dorosłych komórek macierzystych, określanych jako komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC. W tym artykule przedstawiono izolację ASC z lipoaspiratów przy użyciu ręcznego, enzymatycznego protokołu trawienia z użyciem kolagenazy.

Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów

Niejednorodność transkrypcyjna w ludzkich komórkach zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej może być zdefiniowana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą markerów powierzchni komórki i genów osteogennych.  Opisujemy protokół wykorzystujący cytometrię przepływową do izolacji subpopulacji komórek o zwiększonym potencjale osteogennym, który może być wykorzystany do poprawy rekonstrukcji szkieletu twarzoczaszki.

Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Dojrzałe adipocyty mogą stanowić obfite źródło komórek macierzystych poprzez dedyferencjację, co prowadzi do jednorodnej populacji komórek podobnych do fibroblastów. Trawienie kolagenazą służy do izolowania dojrzałych adipocytów z ludzkiego tłuszczu. Celem naszego protokołu jest uzyskanie multipotencjalnych, odróżnicowanych komórek tłuszczowych z ludzkich dojrzałych adipocytów.

Wytwarzanie ludzkich komórek macierzystych tkanki tłuszczowej poprzez dedyferencjację dojrzałych adipocytów w hodowlach sufitowych

Odróżnienie białych i beżowych adipocytów od komórek progenitorowych naczyń tkanki tłuszczowej niesie ze sobą potencjał do metabolicznej poprawy otyłości. Opisujemy protokoły izolacji komórek śródbłonka CD34 + CD31 + z ludzkiego tłuszczu oraz późniejszej ekspansji i różnicowania in vitro do białych i beżowych adipocytów. Omówiono kilka dalszych zastosowań.

Izolacja, ekspansja i indukcja adipogenna komórek śródbłonka CD34+CD31+ z ludzkiej tkanki tłuszczowej i podskórnej

Ten protokół zapewnia bezenzymatyczną metodę izolowania mezenchymalnych komórek macierzystych z próbek abdominoplastyki i lipoaspiratu przy użyciu metody eksplantatu. Brak ostrych enzymów lub etapów wirowania zapewnia klinicznie istotne komórki macierzyste, które można wykorzystać do badań in vitro lub przenieść z powrotem do kliniki.

Bezenzymatyczna metoda izolacji i namnażania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Tutaj prezentujemy mikrofragmentację ludzkiej tkanki tłuszczowej bez enzymów przy użyciu urządzenia systemu zamkniętego. Ta nowa metoda pozwala na uzyskanie submilimetrowych skupisk tkanki tłuszczowej nadających się do przeszczepu in vivo, hodowli in vitro oraz dalszej izolacji i charakterystyki komórek.

Mikrofragmentacja ludzkiej tkanki tłuszczowej do fenotypowania komórek i charakterystyki sekretomu

Opisujemy 3D ludzki system hodowli pozakomórkowej macierzy i adipocytów in vitro, który pozwala na analizę ról matrycy i adipocytów w przyczynianiu się do fenotypu metabolicznego tkanki tłuszczowej.

Ludzki model 3D zewnątrzkomórkowej hodowli macierzy i adipocytów do badania przesłuchów metabolicznych między macierzą a komórką

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodologię izolacji ADSC, co skutkuje ogromną wydajnością komórkową z zyskiem czasu w porównaniu z literaturą. Badanie to dostarcza również prostej metody uzyskiwania stosunkowo dużej liczby żywotnych komórek po długotrwałej krioprezerwacji.

Technika otrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i charakterystyka frakcji naczyniowej zrębu w długoterminowej kriokonserwacji

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.

Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Przedstawiamy tutaj standardową metodę efektywnej izolacji komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu i adipocytów, charakteryzującą się skróceniem czasu przetwarzania o &gt;90%, wysoką żywotnością komórek oraz szeroką kompatybilnością.

Efektywna izolacja komórek macierzystych i adipocytów pochodzących z tłuszczu z tkanki tłuszczowej wieprzi

Poznaj metodę izolacji i hodowli ludzkich komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej wolnej od ksenogenu. Technika ta zapewnia bezpieczeństwo biologiczne w terapii komórkowej i jest prosta w replikacji.

Izolacja i hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej za pomocą innowacyjnej metody wolnej od ksenogenu w terapii u ludzi (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja i hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej za pomocą innowacyjnej metody wolnej od ksenogenu w terapii u ludzi

Przeglądaj więcej filmów