Standaryzacja cytometrycznego testu kulkowego opartego na przeciwciałach przeciwko żółtku jaja kurzego

Wśród technik testów immunologicznych mających na celu diagnozowanie choroby, test cytometryczny z kulkami okazał się bardzo czułym i niezawodnym podejściem, analizującym tysiące cząstek w jednym teście. Wysoka dokładność cytometrii przepływowej w połączeniu z niskim kosztem kulek lateksowych sprawia, że nasza technika ma zastosowanie do analizy narzędzi testów immunologicznych, takich jak przeciwciała i antygeny. Przeciwciała IgY mają niski koszt i etyczne zalety w ich produkcji i mogą być stosowane jako narzędzie do wykrywania rzadkich chorób.

Zacznij od zanurzenia świeżo złożonych lub czterodniowych jaj z białej linii Gallus gallus deckle w 0,2% rozcieńczonym roztworze podchlorynu sodu. Szybko opłucz je pod bieżącą wodą i delikatnie wytrzyj. Ostrożnie rozbij jajko, oddziel żółtko od białka za pomocą separatora żółtek.

I usuń nadmiar bieli bibułą filtracyjną. Przekłuj żółtko i zbierz jego wnętrze do 50-mililitrowej stożkowej tuby. Przechowuj żółtko w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny przed użyciem.

Po rozmrożeniu przechowywanego żółtka rozcieńczyć je w stosunku od 1 do 10 w jednym milimolowym PBS. Doprowadzić pH roztworu do pięciu za pomocą jednego normalnego kwasu solnego i inkubować roztwór w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez sześć do 24 godzin. Odwirować roztwór o sile 3000 G przez 40 minut i przefiltrować odzyskany supernatant za pomocą 0,7 milimetrowego filtra celulozowego, a następnie ponownie dostosować pH supernatantu do pięciu.

Dodać kwas kaprylowy do końcowego stężenia 8,7% przy ciągłym mieszaniu, przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu próbek przez 15 minut oddzielić supernatant od wytrąconego materiału. Ponownie dostosować pH roztworu do 7,4 za pomocą jednego molowego wodorotlenku sodu.

I oznacz ilościowo przeciwciała za pomocą testu Bradforda, przed przechowywaniem ich w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Dodaj 21 mikrolitrów EDC i 21 mikrolitrów NHS do 21 mikrolitrów kulek lateksowych. I dostosuj do końcowej objętości 2,1 mililitra, z przefiltrowanym 10-milimolowym PBS.

Inkubować roztwór w temperaturze 22 stopni Celsjusza, szybko wstrząsając, przez trzy godziny. Dodaj wcześniej wyekstrahowane przeciwciało wychwytujące, IgY PfHRP2, do różnych mikroprobówek zawierających 100 mikrolitrów tego roztworu. I ponownie inkubować przez 16 godzin.

Po odwirowaniu próbek i odrzuceniu supernatantów, przepłukać kulki lateksowe dwukrotnie 500 mikrolitrami przefiltrowanego 10-milimolowego PBS, stosując cykle wirowania i ponownego zawieszania. W celu zablokowania kulek należy ponownie zawiesić próbki w jednym mililitrze buforu blokującego i postępować zgodnie z tą samą procedurą, którą pokazano wcześniej, aby inkubować je przez dwie godziny. Po umyciu kulek PBS, należy je ponownie zawiesić w 10-milimolowym buforze PBS.

Dodać 100 mikrolitrów fluorescencyjnego przeciwciała przeciwko kurczakowi, rozcieńczonego do 1 do 2000 w 10-milimolowej mieszaninie PBS i BSA, do każdej mikroprobówki. Próbki należy inkubować w ciemności przez 30 minut. Po umyciu kulek ponownie zamieszaj je za pomocą 250 mikrolitrów przefiltrowanego 10-milimolowego PBS.

Określić granicę wykrywalności, rozprowadzając 100 mikrolitrów preparatu z zablokowanymi kulkami do probówek zawierających różne ilości rozcieńczonego rekombinowanego białka PfHRP2 w trzech powtórzeniach. Inkubować roztwory kulek z białkiem w temperaturze 22 stopni Celsjusza, szybko wstrząsając, przez jedną godzinę. Przemyć kulki 500 mikrolitrami przefiltrowanego 10-milimolowego PBS z odwirowaniem, jak wykazano wcześniej.

Po odrzuceniu supernatantu dodać dwa mikrogramy mysiego przeciwciała IgG przeciwko rekombinowanemu białku, rozcieńczonego w 10 milimolowych PBS i BSA do każdej próbki i postępować zgodnie z tą samą procedurą inkubacji. Następnie dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonego fluorescencyjnego przeciwciała anty-mysiego do każdej próbki. Po inkubacji ponownie zawiesić próbkę w 250 mikrolitrach przefiltrowanego 10-milimolowego PBS.

Włącz komputer i cytometr przepływowy i poczekaj kilka minut, aż sprzęt połączy się z komputerem. Kliknij oprogramowanie do cytometrii zainstalowane na komputerze i zaloguj się do niego. W obszarze roboczym oprogramowania wybierz pozycję Cytometr, a następnie Uruchamianie płynów, Tryby czyszczenia i Płukanie SIT.

Zdefiniuj strategię bramkowania w oparciu o charakterystykę morfometryczną i fluorescencyjną cząstki kontroli ujemnej. Aby określić morfometrię komórki, wybierz wykres punktowy do analizy parametrów punktu A do przodu przy użyciu rozrzutu bocznego A.Określ pojedyncze komórki według rozrzutu bocznego za pomocą wykresu punktowego do analizy rozrzutu bocznego W na osi Y i rozrzutu bocznego H na osi X. I wyznacz pojedyncze komórki za pomocą rozproszenia do przodu, używając grafiki wykresu kropkowego, do analizy rozproszenia do przodu W na osi Y i rozproszenia do przodu H na osi X.

Do analizy fluorescencji wybierz wykresy punktowe FL1 z użyciem rozrzutu do przodu A. Użyj zakorkowanej rurki polistyrenowej zawierającej nieoznakowane próbki i próbki wcześniej oznaczone jednokolorowym Alexa Fluor 488 I ostrożnie wymieszaj zawartość probówki. Podłącz rurkę do sondy cytometru przepływowego i kliknij lewym przyciskiem myszy Pobierz. Aby ustawić moc laserów, kliknij Parametry, a w poniższych opcjach dostosuj napięcie rozpraszania do przodu na 182 wolty, a napięcie rozpraszania bocznego do 236 woltów.

Aby ustawić próg na cytometrze, kliknij Próg, a w poniższych opcjach dostosuj FSC do 500 woltów. Ustaw bramkę analizy, aby scharakteryzować cząstki według wielkości i złożoności, a także przeprowadzić analizę pojedynczych komórek. Usunąć autofluorescencję, analizując bezbarwną próbkę zawierającą tylko kulki lateksu i dostosowując napięcie detektora FL1 FITC do 332 woltów.

Ustaw bramkę analizy fluorescencji w formacie czworokątnym, od punktu ujemnego pokazanego na wykresie kropkowym. Po dostosowaniu analiz morfometrycznych i fluorescencyjnych skonfiguruj urządzenie na 50 000 zdarzeń i kliknij Nagraj. Przedstawiono profile elektroforetyczne przeciwciała IgY PfHRP2, wynikające z separacji za pomocą kwasu kaprylowego.

Z tego rysunku można zauważyć, że przeciwciała przed i po oddzieleniu kwasu kaprylowego wykazywały podobne profile elektroforetyczne, z charakterystycznymi pasmami 65 kilodaltonów i 27 kilodaltonów, które odnoszą się do lekkich i ciężkich łańcuchów IgY. Oprócz tego widoczne są również inne prążki, prawdopodobnie z powodu prekursora białka żółtka jaja C końcowego witellogeniny II. Ocena stężenia nasycenia przeciwciał na kulkach lateksowych ma zasadnicze znaczenie dla opracowania testu immunologicznego z kulkami.

Pokazano tutaj krzywą procentowej fluorescencji różnych stężeń przeciwciał, sprzężoną z każdym mikrolitrem użytych komercyjnych kulek lateksowych. Wraz ze wzrostem stężenia, wartości procentowe również wzrosły i ustabilizowały się na poziomie dwóch mikrogramów stężenia przeciwciał, ustanawiając je jako optymalne stężenie sprzęgające dla docelowego testu immunologicznego antygenu. Granicę wykrywalności wyznaczono poprzez ocenę procentu fluorescencji reaktywności prędkości lateksu w stosunku do różnych stężeń białka rPfHRP2.

Z testu immunologicznego kanapkowego zaobserwowano, że fluorescencja wzrosła z 0,01 mikrograma białka PfHRP2 i ustabilizowała się na poziomie 0,1 mikrograma. Nie stwierdzono istotnej różnicy we fluorescencji przy dawkach zero mikrogramów i 0,01 mikrograma. Jednak istotną różnicę we fluorescencji zaobserwowano przy 0,01 mikrograma, 0,1 mikrograma i 10 mikrogramach.

Etap mycia tego protokołu ma kluczowe znaczenie, aby uniknąć utraty koralików. Miernik musi być dobrze zdefiniowany, aby nie było błędów w uzyskanym wyniku. Opisane tutaj kroki stanowią ważną standaryzację, która jest niezbędna do zapewnienia wiarygodności testów diagnostycznych z wykorzystaniem kulek lateksowych, które są oceniane za pomocą pełnej cytometrii.

Dlatego metodologia ta jest alternatywą dla klasycznych modeli testów kanapkowych. Metoda ta może być stosowana do różnych rodzajów testów i może być odpowiednia do radzenia sobie z kilkoma cząsteczkami na powierzchni kulek, a także do wykrywania różnych analitów.