Somatyczne modele myszy z inżynierią genomu przy użyciu mikroiniekcji in vivo i elektroporacji

Przedstawiony protokół jest wysoce elastyczną metodą manipulacji genomem w jajowodzie myszy. Pozwala to na tworzenie sporadycznie zmutowanych komórek otoczonych nieedytowanymi komórkami w środowisku immunokompetentnym. Jest to korzystne dla badania inicjacji raka.

Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka zdolność adaptacji w celowaniu w narząd, obszar, region lub typ komórki będący przedmiotem zainteresowania za pomocą łatwo wymiennych zestawów kombinacji mutacji, a wszystko to bez absolutnej potrzeby posiadania linii myszy. Metodę tę można łatwo dostosować do stosowania w narządach ze światłem, a także w miąższu narządowym. Aby rozpocząć, wciągnij szklaną rurkę kapilarną w ostry punkt za pomocą ściągacza do mikropipet.

Za pomocą pary zwężających się kleszczyków z bardzo cienką końcówką odetnij spiczasty koniec ciągniętej rurki kapilarnej pod mikroskopem preparacyjnym, aby utworzyć otwór. Upewnij się, że otwór nie jest zbyt duży, ponieważ uszkodzi to jajowód i uniemożliwi powolne wstrzyknięcie. Następnie umieść sterylny sprzęt chirurgiczny, mikroskop, mikromanipulator i elektroporator na czystej, sterylnej ławce lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

Podgrzej poduszkę grzewczą na dysku i umieść ją pod czystą, w pełni wyposażoną klatką. Wlej sterylny 1X PBS na szalkę Petriego. Za pomocą czystych nożyczek pokrój chłonny papier na kwadraty o wymiarach jeden na centymetr.

Wrzuć je do PBS, aby je namoczyć. Następnie przymocuj ciągniętą igłę kapilarną do mikromanipulatora z mocowaniem zaciskowym, stabilizowanego mocowaniem magnetycznym. Pobrać pipetą dwa mikrolitry roztworu do wstrzykiwań na sterylną szalkę Petriego.

Obserwując pod mikroskopem, powoli nabierz od jednego do dwóch mikrolitrów roztworu iniekcyjnego do igły do mikroiniekcji za pomocą strzykawki pod ciśnieniem powietrza dołączonej do mikromanipulatora. Należy unikać gromadzenia się pęcherzyków w igle. Po znieczuleniu sześcio- do ośmiotygodniowej samicy myszy i podskórnym podaniu karprofenu, umieść mysz na rozgrzanym bibułie chłonnej stroną grzbietową skierowaną do góry.

Nałóż lubrykant do oczu na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu. Po potwierdzeniu zatrzymania znieczulenia poprzez uszczypnięcie palca u nogi kleszczami, usuń sierść grzbietową wokół potencjalnego miejsca nacięcia i przetrzyj gołą skórę środkiem antyseptycznym. Użyj pary prostych, kleszczy, aby uszczypnąć gołą skórę i wykonaj jednocentymetrowe nacięcie wzdłuż linii środkowej ciała za pomocą sterylnych nożyczek.

Ściśnij i przytrzymaj jedną stronę miejsca cięcia za pomocą sterylnych kleszczy Adson. Następnie, za pomocą sterylnych, zakrzywionych, ząbkowanych kleszczy, delikatnie oddziel skórę od ściany ciała, zaczynając od nacięcia w linii środkowej i przesuwając się na boki. Po zlokalizowaniu poduszeczki tłuszczowej poniżej nerki użyj pary sterylnych, prostych, kleszczy, aby uszczypnąć ścianę ciała bezpośrednio nad poduszką tłuszczową.

Wykonaj małe nacięcie w ścianie ciała za pomocą sterylnych, ostrych, spiczastych nożyczek preparacyjnych, uważając, aby uniknąć naczyń krwionośnych. Nadal ściskając ścianę ciała prostymi, kleszczami, włóż parę sterylnych,, zakrzywionych kleszczy do nacięcia i poszerz nacięcie utworzone w ścianie ciała. Chwyć widoczną poduszeczkę tłuszczową, zakrzywionymi kleszczami i wyciągnij ją z otworu, aby odsłonić jajnik, jajowód i macicę.

Utrzymuj odsłonięty ślad rozrodczy, zaciskając poduszeczkę tłuszczową za pomocą sterylnego zacisku buldoga. Ostrożnie umieść znieczuloną mysz z odsłoniętym torem rozrodczym na stoliku mikroskopu preparacyjnego. Wyregulować mikromanipulator w taki sposób, aby igła do wstrzykiwań z roztworem była obserwowana pod mikroskopem.

Następnie manipuluj mikroskopem, aby łatwo obserwować jajnik, jajowód i macicę. Używając pary sterylnych, zwężających się kleszczyków z bardzo cienką końcówką, przytrzymaj obszar jajowodu, który ma zostać wstrzyknięty. Obszar ten musi być wyrównany z kierunkiem igły do mikroiniekcji.

Wyreguluj mikromanipulator tak, aby nakłuć jajowód igłą do mikroiniekcji, jednocześnie podając jajowód na igłę za pomocą zwężających się kleszczyków z bardzo cienką końcówką. Delikatnie przesunąć igłę do mikroiniekcji, aby upewnić się, że została wprowadzona do jajowodu. Powoli wstrzyknąć jeden mikrolitr roztworu do wstrzykiwań i 5% przefiltrowanego błękitu trypanowego do jajowodu, obserwując ruch niebieskiego roztworu i rozszerzanie się światła jajowodu.

Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza do światła. Po wstrzyknięciu należy wyjąć igłę z jajowodu i przykryć obszar, który ma być docelowy, kawałkiem chłonnego papieru nasączonego wcześniej PBS. Chwyć wstępnie namoczony papier i obszar, który ma być celowany, pęsetą elektrod i odciągnij od ciała.

Naelektryzuj obszar docelowy za pomocą trzech impulsów unipolarnych o napięciu 30 woltów przez 50 milisekund w odstępach jednosekundowych. Po elektroporacji usuń papier chłonny i umieść mysz z powrotem na poduszce grzewczej. Odkręć zacisk buldoga i ostrożnie wepchnij odsłoniętą ścieżkę rozrodczą z powrotem pod ścianę ciała.

Po elektroporowaniu obu jajowodów i umieszczeniu ich z powrotem pod ścianą ciała, użyj uchwytu na igłę, aby chwycić igłę. Ściśnij i przytrzymaj jedną stronę miejsca cięcia za pomocą pary sterylnych, zakrzywionych, ząbkowanych kleszczy. Następnie użyj uchwytu na igłę, aby manipulować szwem i zamknąć ranę.

Przenieś mysz do czystej klatki umieszczonej na poduszce grzewczej i monitoruj, aż mysz będzie aktywna. Po elektroporacji przy użyciu elektrod typu pęseta o długości trzech lub jednego milimetra, obszar docelowy oznaczony TdTomato ograniczono do dystalnego nabłonka jajowodu. W przypadku trzymilimetrowych elektrod typu pęseta celowano w znacznie większy obszar bańek w porównaniu z celowaniem tylko w dystalną końcówkę, lejek, za pomocą jednomilimetrowych elektrod typu pęseta.

W regionie docelowym elektroporowane ogniwa oznaczone TdTomato zostały losowo rozmieszczone wśród ogniw nieelektroporowanych. Dodatkowo, elektroporowane komórki były ograniczone do nabłonka błony śluzowej i nie obserwowano ich w leżącej poniżej warstwie zrębu lub mięśni. Aby potwierdzić edycję genomu za pośrednictwem CRISPR, komórkę fluorescencyjną można wyizolować przez sortowanie FACS w celu izolacji i sekwencjonowania DNA.

Pozwala nam to określić ilościowo częstotliwość docelowych alleli, śledzić unikalną komunikację między próbką, aby śledzić ewolucję koronalną in vivo guza pierwotnego i przerzutów w środowisku immunokompetentnym.