Somatyczne modele myszy z inżynierią genomu przy użyciu mikroiniekcji in vivo i elektroporacji
May 5th, 2023
Ten protokół opisuje mikroiniekcję i elektroporację in vivo dla regionalnie ograniczonej edycji genomu za pośrednictwem CRISPR w jajowodzie myszy.
Przedstawiony protokół jest wysoce elastyczną metodą manipulacji genomem w jajowodzie myszy. Pozwala to na tworzenie sporadycznie zmutowanych komórek otoczonych nieedytowanymi komórkami w środowisku immunokompetentnym. Jest to korzystne dla badania inicjacji raka.
Główną zaletą tej techniki jest jej wysoka zdolność adaptacji w celowaniu w narząd, obszar, region lub typ komórki będący przedmiotem zainteresowania za pomocą łatwo wymiennych zestawów kombinacji mutacji, a wszystko to bez absolutnej potrzeby posiadania linii myszy. Metodę tę można łatwo dostosować do stosowania w narządach ze światłem, a także w miąższu narządowym. Aby rozpocząć, wciągnij szklaną rurkę kapilarną w ostry punkt za pomocą ściągacza do mikropipet.
Za pomocą pary zwężających się kleszczyków z bardzo cienką końcówką odetnij spiczasty koniec ciągniętej rurki kapilarnej pod mikroskopem preparacyjnym, aby utworzyć otwór. Upewnij się, że otwór nie jest zbyt duży, ponieważ uszkodzi to jajowód i uniemożliwi powolne wstrzyknięcie. Następnie umieść sterylny sprzęt chirurgiczny, mikroskop, mikromanipulator i elektroporator na czystej, sterylnej ławce lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
Podgrzej poduszkę grzewczą na dysku i umieść ją pod czystą, w pełni wyposażoną klatką. Wlej sterylny 1X PBS na szalkę Petriego. Za pomocą czystych nożyczek pokrój chłonny papier na kwadraty o wymiarach jeden na centymetr.
Wrzuć je do PBS, aby je namoczyć. Następnie przymocuj ciągniętą igłę kapilarną do mikromanipulatora z mocowaniem zaciskowym, stabilizowanego mocowaniem magnetycznym. Pobrać pipetą dwa mikrolitry roztworu do wstrzykiwań na sterylną szalkę Petriego.
Obserwując pod mikroskopem, powoli nabierz od jednego do dwóch mikrolitrów roztworu iniekcyjnego do igły do mikroiniekcji za pomocą strzykawki pod ciśnieniem powietrza dołączonej do mikromanipulatora. Należy unikać gromadzenia się pęcherzyków w igle. Po znieczuleniu sześcio- do ośmiotygodniowej samicy myszy i podskórnym podaniu karprofenu, umieść mysz na rozgrzanym bibułie chłonnej stroną grzbietową skierowaną do góry.
Nałóż lubrykant do oczu na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu. Po potwierdzeniu zatrzymania znieczulenia poprzez uszczypnięcie palca u nogi kleszczami, usuń sierść grzbietową wokół potencjalnego miejsca nacięcia i przetrzyj gołą skórę środkiem antyseptycznym. Użyj pary prostych, kleszczy, aby uszczypnąć gołą skórę i wykonaj jednocentymetrowe nacięcie wzdłuż linii środkowej ciała za pomocą sterylnych nożyczek.
Ściśnij i przytrzymaj jedną stronę miejsca cięcia za pomocą sterylnych kleszczy Adson. Następnie, za pomocą sterylnych, zakrzywionych, ząbkowanych kleszczy, delikatnie oddziel skórę od ściany ciała, zaczynając od nacięcia w linii środkowej i przesuwając się na boki. Po zlokalizowaniu poduszeczki tłuszczowej poniżej nerki użyj pary sterylnych, prostych, kleszczy, aby uszczypnąć ścianę ciała bezpośrednio nad poduszką tłuszczową.
Wykonaj małe nacięcie w ścianie ciała za pomocą sterylnych, ostrych, spiczastych nożyczek preparacyjnych, uważając, aby uniknąć naczyń krwionośnych. Nadal ściskając ścianę ciała prostymi, kleszczami, włóż parę sterylnych,, zakrzywionych kleszczy do nacięcia i poszerz nacięcie utworzone w ścianie ciała. Chwyć widoczną poduszeczkę tłuszczową, zakrzywionymi kleszczami i wyciągnij ją z otworu, aby odsłonić jajnik, jajowód i macicę.
Utrzymuj odsłonięty ślad rozrodczy, zaciskając poduszeczkę tłuszczową za pomocą sterylnego zacisku buldoga. Ostrożnie umieść znieczuloną mysz z odsłoniętym torem rozrodczym na stoliku mikroskopu preparacyjnego. Wyregulować mikromanipulator w taki sposób, aby igła do wstrzykiwań z roztworem była obserwowana pod mikroskopem.
Następnie manipuluj mikroskopem, aby łatwo obserwować jajnik, jajowód i macicę. Używając pary sterylnych, zwężających się kleszczyków z bardzo cienką końcówką, przytrzymaj obszar jajowodu, który ma zostać wstrzyknięty. Obszar ten musi być wyrównany z kierunkiem igły do mikroiniekcji.
Wyreguluj mikromanipulator tak, aby nakłuć jajowód igłą do mikroiniekcji, jednocześnie podając jajowód na igłę za pomocą zwężających się kleszczyków z bardzo cienką końcówką. Delikatnie przesunąć igłę do mikroiniekcji, aby upewnić się, że została wprowadzona do jajowodu. Powoli wstrzyknąć jeden mikrolitr roztworu do wstrzykiwań i 5% przefiltrowanego błękitu trypanowego do jajowodu, obserwując ruch niebieskiego roztworu i rozszerzanie się światła jajowodu.
Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza do światła. Po wstrzyknięciu należy wyjąć igłę z jajowodu i przykryć obszar, który ma być docelowy, kawałkiem chłonnego papieru nasączonego wcześniej PBS. Chwyć wstępnie namoczony papier i obszar, który ma być celowany, pęsetą elektrod i odciągnij od ciała.
Naelektryzuj obszar docelowy za pomocą trzech impulsów unipolarnych o napięciu 30 woltów przez 50 milisekund w odstępach jednosekundowych. Po elektroporacji usuń papier chłonny i umieść mysz z powrotem na poduszce grzewczej. Odkręć zacisk buldoga i ostrożnie wepchnij odsłoniętą ścieżkę rozrodczą z powrotem pod ścianę ciała.
Po elektroporowaniu obu jajowodów i umieszczeniu ich z powrotem pod ścianą ciała, użyj uchwytu na igłę, aby chwycić igłę. Ściśnij i przytrzymaj jedną stronę miejsca cięcia za pomocą pary sterylnych, zakrzywionych, ząbkowanych kleszczy. Następnie użyj uchwytu na igłę, aby manipulować szwem i zamknąć ranę.
Przenieś mysz do czystej klatki umieszczonej na poduszce grzewczej i monitoruj, aż mysz będzie aktywna. Po elektroporacji przy użyciu elektrod typu pęseta o długości trzech lub jednego milimetra, obszar docelowy oznaczony TdTomato ograniczono do dystalnego nabłonka jajowodu. W przypadku trzymilimetrowych elektrod typu pęseta celowano w znacznie większy obszar bańek w porównaniu z celowaniem tylko w dystalną końcówkę, lejek, za pomocą jednomilimetrowych elektrod typu pęseta.
W regionie docelowym elektroporowane ogniwa oznaczone TdTomato zostały losowo rozmieszczone wśród ogniw nieelektroporowanych. Dodatkowo, elektroporowane komórki były ograniczone do nabłonka błony śluzowej i nie obserwowano ich w leżącej poniżej warstwie zrębu lub mięśni. Aby potwierdzić edycję genomu za pośrednictwem CRISPR, komórkę fluorescencyjną można wyizolować przez sortowanie FACS w celu izolacji i sekwencjonowania DNA.
Pozwala nam to określić ilościowo częstotliwość docelowych alleli, śledzić unikalną komunikację między próbką, aby śledzić ewolucję koronalną in vivo guza pierwotnego i przerzutów w środowisku immunokompetentnym.
Overview
Ten protokół opisuje elastyczną metodę edycji genomu za pośrednictwem CRISPR w jajowodzie myszy, umożliwiającą ukierunkowane mutacje w określonym narządzie. Ta technika ułatwia badania nad inicjacją raka poprzez tworzenie sporadycznie mutowanych komórek w środowisku immunokompetentnym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Genetyka
- Onkologia
Tło
- Technologia CRISPR umożliwia precyzyjną edycję genomu.
- Ukierunkowanie na określone narządy lub typy komórek jest kluczowe dla badań nad mechanizmami chorób.
- Jajowód myszy służy jako model do badań nad rakiem.
- Elektroporacja poprawia wydajność dostarczania genów.
Cel badania
- Rozwój metody ukierunkowanej edycji genomu w jajowodzie myszy.
- Zbadanie inicjacji raka w kontrolowanym środowisku.
- Możliwość elastycznego ukierunkowania na różne typy komórek bez konieczności stosowania specyficznych linii myszy.
Stosowane metody
- Mikroiniekcja komponentów CRISPR do jajowodu.
- Elektroporacja w celu ułatwienia edycji genów.
- Użycie fluorescencyjnych markerów do identyfikacji edytowanych komórek.
- Izolowanie komórek w celu sekwencjonowania DNA w celu potwierdzenia edycji.
Główne wyniki
- Pomyślna iniekcja i elektroporacja jajowodu.
- Stworzenie sporadycznie mutowanych komórek wśród nieedytowanych komórek.
- Elektroporowane komórki były ograniczone do nabłonka śluzówkowego.
- Sortowanie fluorescencyjne potwierdziło edycję genomu za pośrednictwem CRISPR.
Wnioski
- Ta metoda zapewnia solidne narzędzie do badania funkcji genów in vivo.
- Pozwola na badanie mechanizmów inicjacji raka.
- Elastyczność techniki może być dostosowana do różnych potrzeb badawczych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Somatic genome engineering via in vivo microinjection and electroporation enables rapid, region-specific genetic manipulation in immunocompetent mouse models, directly addressing the limitations of traditional germline models. This approach accelerates hypothesis-driven cancer initiation studies and supports flexible, cost-effective target validation in disease-relevant tissues. Its adaptability and precision provide strategic value for oncology discovery pipelines and translational research continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene function and pathway involvement in specific tissue microenvironments.
- Supports biological de-risking by modeling sporadic mutations within immunocompetent hosts.
- Facilitates functional target validation through regionally restricted genome editing.
- Improves predictive confidence for candidate gene prioritization in oncology portfolios.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, region-specific disease models for downstream phenotypic screening.
- Enables reproducible generation of mosaic tissues for quantitative readouts.
- Supports assay standardization by controlling mutation frequency and cell-type targeting.
- Allows scalable adaptation to different organs or cell populations with minimal colony management.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mouse models with human disease initiation sites, enhancing translational relevance.
- Enables tracking of tumor evolution and metastasis in immunocompetent settings.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling clinically relevant genetic events.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation in cancer research.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, bridging hypothesis testing and translational validation in oncology research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and mechanistic de-risking by enabling targeted somatic mutations in vivo.
- Screening: Provides reproducible, region-specific models for quantitative phenotypic assays.
- Analytics: Supports quantitative measurement of mutation frequency and spatial distribution via FACS and sequencing.
- Translational Research: Models human disease initiation sites, supporting biomarker alignment and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple genes, tissues, and experimental designs without new mouse lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines model generation, reduces colony costs, and enhances reproducibility.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in oncology pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of disease-relevant targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microinjection, electroporation, and surgical techniques.
- Needs access to micromanipulators, electroporators, and FACS for cell isolation and analysis.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable across organs with lumens or parenchyma, but tissue-specific optimization may be necessary.
- Mutation frequency and spatial targeting must be empirically validated for each application.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:01
Preparing Microinjection Needle, Surgery Area, Solution, and Needle for Injection
2:26
Exposing the Female Reproductive Tract
4:11
In Vivo Oviduct Injection and Electroporation
6:29
Results: Validation of Successful In Vivo Injection and Electroporation of Oviduct Epithelial Cells
7:16
Conclusion
