Name: Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj metody izolacji grzybów endofitycznych z roślin mykoheterotroficznych przy użyciu technik hodowli sterylnej i analizy mikroskopowej. Protokoły te umożliwiają dokładną identyfikację i badania molekularne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za dofinansowanie z FAPESP (2015/26479-6) i CNPq (447453/2014-9). JLSM dziękuje CNPq za dotacje na produktywność (303664/2020-7). MPP dziękuje Capes (stypendium magisterskie, proces 88887.600591/2021-00) i CNPq.

<ol><li>de Azevedo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Ecologia+Microbiana%22%5BJournal%5D)">Endophytic microorganisms.</a> Ecologia Microbiana. , 117-137 (1998).</li>
<li>Stone, J. K., Bacon, C. W., White, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+endophytic+microbes%3A+endophytism+defined%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Endophytes%22%5BJournal%5D)">An overview of endophytic microbes: endophytism defined.</a> Microbial Endophytes. , 17-44 (2000).</li>
<li>Schulz, B., Boyle, C. What are Endophytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchulz%2C+B+%22Microbial+Root+Endophytes%22">Microbial Root Endophytes</a>. , Springer-Verlag. Berlin. 1-13 (2006).</li>
<li>Smith, S. E., Read, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+SE+%22Mycorrhizal+Symbiosis%22">Mycorrhizal Symbiosis</a>. , Elsevier Science Academic Press. London. (2008).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Dixon, K. W., Jersáková, J., Těšitelová, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+and+seedling+establishment+in+orchids%3A+a+complex+of+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Germination and seedling establishment in orchids: a complex of requirements.</a> Annals of Botany. 116 (3), 391-402 (2015).</li>
<li>Rasmussen, H. N., Rasmussen, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchid+mycorrhiza%3A+implications+of+a+mycophagous+life+style%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">Orchid mycorrhiza: implications of a mycophagous life style.</a> Oikos. 118 (3), 334-345 (2009).</li>
<li>Ma, X., Kang, J., Nontachaiyapoom, S., Wen, T., Hyde, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-mycorrhizal+endophytic+fungi+from+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Non-mycorrhizal endophytic fungi from orchids.</a> Current Science. 109 (1), 72-87 (2015).</li>
<li>Favre-Godal, Q., Gourguillon, L., Lordel-Madeleine, S., Gindro, K., Choisy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchids+and+their+mycorrhizal+fungi%3A+an+insufficiently+explored+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Mycorrhiza%22%5BJournal%5D)">Orchids and their mycorrhizal fungi: an insufficiently explored relationship.</a> Mycorrhiza. 30 (1), 5-22 (2020).</li>
<li>Sun, X., Guo, L. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+fungal+diversity%3A+review+of+traditional+and+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Mycology%22%5BJournal%5D)">Endophytic fungal diversity: review of traditional and molecular techniques.</a> Mycology. 3 (1), 65-76 (2012).</li>
<li>Pena-Passos, M., Sisti, L. S., Mayer, J. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+techniques+for+interpreting+fungal+colonization+in+mycoheterotrophic+plants+tissues+and+symbiotic+germination+of+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microscopy techniques for interpreting fungal colonization in mycoheterotrophic plants tissues and symbiotic germination of seeds.</a> Journal of Visualized Experiments. (183), e63777(2022).</li>
<li>Araújo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAra%C3%BAjo%2C+WL+%22Endophytic+microorganisms%3A+Theoretical+and+Practical+Aspects+of+Isolation+and+Characterization.+1st+ed%22">Endophytic microorganisms: Theoretical and Practical Aspects of Isolation and Characterization. 1st ed</a>. 1, Santarém: UFOPA. 257(2014).</li>
<li>de Souza, R. S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+bacterial+and+fungal+communities+assemblages+of+sugarcane+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Unlocking the bacterial and fungal communities assemblages of sugarcane microbiome.</a> Scientific Reports. 6, 28774(2016).</li>
<li>Sisti, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+non-mycorrhizal+fungi+in+germination+of+the+mycoheterotrophic+orchid+Pogoniopsis+schenckii+Cogn%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The role of non-mycorrhizal fungi in germination of the mycoheterotrophic orchid Pogoniopsis schenckii Cogn.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1589(2019).</li>
<li>Araújo, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+interactions+between+endophytic+bacteria+and+fungi+isolated+from+leaf+tissues+of+citrus+rootstocks%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Variability and interactions between endophytic bacteria and fungi isolated from leaf tissues of citrus rootstocks.</a> Canadian Journal of Microbiology. 47 (3), 229-236 (2001).</li>
<li>Castellani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+researches+on+the+long+viability+and+growth+of+many+pathogenic+fungi+and+some+bacteria+in+sterile+distilled+water%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Further researches on the long viability and growth of many pathogenic fungi and some bacteria in sterile distilled water.</a> Mycopathologia. 20 (1-2), 1-6 (1963).</li>
<li>Currah, R. S., Zelmer, C. D., Hambleton, S., Richardson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungi+from+orchid+mycorrhizas%5BTitle%5D)+AND+%22Orchid+Biology%3A+Reviews+and+Perspectives%2C+VII%22%5BJournal%5D)">Fungi from orchid mycorrhizas.</a> Orchid Biology: Reviews and Perspectives, VII. , 117-170 (1997).</li>
<li>Freitas, E. F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+mycorrhizal+Tulasnella+associated+with+epiphytic+and+rupicolous+orchids+from+the+Brazilian+Atlantic+Forest%2C+including+four+new+species%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Diversity of mycorrhizal Tulasnella associated with epiphytic and rupicolous orchids from the Brazilian Atlantic Forest, including four new species.</a> Scientific Reports. 10 (1), 7069(2020).</li>
<li>Sato, M., Inaba, S., Noguchi, M., Nakagiri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vermiculite+as+a+culture+substrate+greatly+improves+the+viability+of+frozen+cultures+of+ectomycorrhizal+basidiomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Biology%22%5BJournal%5D)">Vermiculite as a culture substrate greatly improves the viability of frozen cultures of ectomycorrhizal basidiomycetes.</a> Fungal Biology. 124 (8), 742-751 (2020).</li>
<li>Pereira, O. L., Kasuya, M. C. M., Borges, A. C., Araújo, E. F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+characterization+of+mycorrhizal+fungi+isolated+from+neotropical+orchids+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular characterization of mycorrhizal fungi isolated from neotropical orchids in Brazil.</a> Canadian Journal of Botany. 83 (1), 54-65 (2005).</li>
<li>Riddell, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permanent+stained+mycological+preparations+obtained+by+slide+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Permanent stained mycological preparations obtained by slide culture.</a> Mycologia. 42 (2), 265-270 (1950).</li>
<li>Walsh, T. J., Hayden, R. T., Larone, D. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalsh%2C+TJ+%22Larone%27s+Medically+Important+Fungi%3A+A+Guide+to+Identification%22">Larone's Medically Important Fungi: A Guide to Identification</a>. , ASM Press. (2018).</li>
<li>Malloch, D. Moulds: Isolation, Cultivation, Identification. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://website.nbm-mnb.ca/mycologywebpages/Moulds/Moulds.html">http://website.nbm-mnb.ca/mycologywebpages/Moulds/Moulds.html</a> (1997).</li>
<li>Smith, P. Microscopy: Chemical Reagents. British Mycological Society. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents">https://www.britmycolsoc.org.uk/field_mycology/microscopy/reagents</a> (2022).</li>
<li>Senanayake, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+approaches+in+studying+fungi%3A+Collection%2C+examination%2C+isolation%2C+sporulation+and+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Mycosphere%22%5BJournal%5D)">Morphological approaches in studying fungi: Collection, examination, isolation, sporulation and preservation.</a> Mycosphere. 11 (1), 2678-2754 (2020).</li>
<li>Slifkin, M., Cumbie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congo+red+as+a+fluorochrome+for+the+rapid+detection+of+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Congo red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi.</a> Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).</li>
<li>Raeder, U., Broda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+preparation+of+DNA+from+filamentous+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid preparation of DNA from filamentous fungi.</a> Letters in Applied Microbiology. 1 (1), 17-20 (1985).</li>
<li>Martins, M. K., et al. Molecular characterization of endophytic microorganisms. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMartins%2C+MK+%22Endophytic+microorganisms%3A+theoretical+and+practical+aspects+of+isolation+and+characterization.+1st+edition%22">Endophytic microorganisms: theoretical and practical aspects of isolation and characterization. 1st edition</a>. , Santarém: UFOPA. 189-211 (2014).</li>
<li>Rayner, R. W. A Mycological Colour Chart. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRayner%2C+RW+%22Commonwealth+Mycological+Institute%22">Commonwealth Mycological Institute</a>. , (1970).</li>
<li>Kornerup, A., Wanscher, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornerup%2C+A+%22Methuen+Handbook+of+Colour.+Methuen+handbook+of+colour%22">Methuen Handbook of Colour. Methuen handbook of colour</a>. , Methuen & Co. Ltd. London. (1967).</li>
<li>Ridgway, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRidgway%2C+R+%22Color+Standards+and+Color+Nomenclature%22">Color Standards and Color Nomenclature</a>. , Washington, DC. Published by the author (1912).</li>
<li>McGinnis, M. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcGinnis%2C+MR+%22Laboratory+Handbook+of+Medical+Mycology%22">Laboratory Handbook of Medical Mycology</a>. , Elsevier Science. (2012).</li>
<li>Webster, J., Weber, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+J+%22Introduction+to+Fungi%22">Introduction to Fungi</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2007).</li>
<li>Sridharan, G., Shankar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toluidine+blue%3A+A+review+of+its+chemistry+and+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+and+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Toluidine blue: A review of its chemistry and clinical utility.</a> Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (2), 251-255 (2012).</li>
<li>Smith, D., Onions, A. H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+some+preservation+techniques+for+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+British+Mycological+Society%22%5BJournal%5D)">A comparison of some preservation techniques for fungi.</a> Transactions of the British Mycological Society. 81 (3), 535-540 (1983).</li>
<li>Ryan, M. J., Smith, D., Jeffries, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decision-based+key+to+determine+the+most+appropriate+protocol+for+the+preservation+of+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A decision-based key to determine the most appropriate protocol for the preservation of fungi.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 16 (2), 183-186 (2000).</li>
<li>Lalaymia, I., Cranenbrouck, S., Declerck, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+and+preservation+of+ectomycorrhizal+and+arbuscular+mycorrhizal+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Mycorrhiza%22%5BJournal%5D)">Maintenance and preservation of ectomycorrhizal and arbuscular mycorrhizal fungi.</a> Mycorrhiza. 24 (5), 323-337 (2014).</li>
<li>Zettler, L. W., Corey, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchid+mycorrhizal+fungi%3A+isolation+and+identification+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Orchid+Propagation%3A+From+Laboratories+to+Greenhouses-Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Orchid mycorrhizal fungi: isolation and identification techniques.</a> Orchid Propagation: From Laboratories to Greenhouses-Methods and Protocols. , 27-59 (2018).</li>
<li>Yu, S., Wang, Y., Li, X., Yu, F., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+factors+affecting+the+reproducibility+of+micro-volume+DNA+mass+quantification+in+Nanodrop+2000+spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22Optik%22%5BJournal%5D)">The factors affecting the reproducibility of micro-volume DNA mass quantification in Nanodrop 2000 spectrophotometer.</a> Optik. 145, 555-560 (2017).</li>
<li>Martos, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+recruitment+of+saprotrophic+fungi+as+mycorrhizal+partners+by+tropical+achlorophyllous+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Independent recruitment of saprotrophic fungi as mycorrhizal partners by tropical achlorophyllous orchids.</a> New Phytologist. 184 (3), 668-681 (2009).</li>
<li>Schoch, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+ribosomal+internal+transcribed+spacer+%28ITS%29+region+as+a+universal+DNA+barcode+marker+for+Fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (16), 6241-6246 (2012).</li>
<li>White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+and+direct+sequencing+of+fungal+ribosomal+RNA+genes+for+phylogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Protocols%3A+A+Guide+to+Methods+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.</a> PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. 18 (1), 315-322 (1990).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Ranjard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bacterial+and+fungal+soil+communities+by+automated+ribosomal+intergenic+spacer+analysis+fingerprints%3A+biological+and+methodological+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: biological and methodological variability.</a> Applied and Environmental Microbiology. 67 (10), 4479-4487 (2001).</li>
<li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+technologies-the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sequencing technologies-the next generation.</a> Nature Reviews Genetics. 11 (1), 31-46 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają konfliktu interesów.

Powierzchowna dezynsekcja próbek roślin jest jednym z najbardziej krytycznych etapów w przedstawionym protokole. Brak zanieczyszczeń w naczyniach PDA kroplami z ostatniego mycia jest wysoce pożądany. Bakterie są często obserwowane jako zanieczyszczenia w naczyniach izolacyjnych, zwykle bardziej niż grzyby zarodnikujące w powietrzu, biorąc pod uwagę, że bakterie endofityczne są również powszechne w tkankach roślinnych 3,11. W związku z tym niezbędne jest dodanie a...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
to:
Juliana Lischka Sampaio Mayer

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Grzyby endofityczne to, z definicji, organizmy zasiedlające wnętrze organów i tkanek roślin w sposób niepozorny (tj. bez wyrządzania szkód gospodarzowi)1,2. Grzyby te mogą wchodzić w neutralne lub korzystne interakcje z roślinami gospodarzami, mogą nadawać im odporność na patogeny i niekorzystne warunki środowiskowe, a także przyczyniać się do syntezy korzystnych dla roślin związków (np. czynników wzrostu i innych fitohormonów)1,3. Endofity mikoryzowe to grzyby tworzące z rośliną asocjacje mikoryzowe, biorące udział w transporcie składników odżywczych4. W rodzinie Orchidaceae interakcja z endofitami mikoryzowymi jest kluczowa dla kiełkowania nasion u ogromnej większości gatunków oraz dla zakorzenienia siewek u wszystkich roślin z tej rodziny5. W takim kontekście storczyki mykoheterotroficzne stanowią przykład całkowitej zależności od partnerów mikoryzowych, ponieważ przez cały cykl życiowy zależą one od transferu składników mineralnych i związków węgla realizowanego przez te grzyby6. Dlatego izolacja i identyfikacja stowarzyszonych grzybów stanowi fundamentalną podstawę badań nad strategiami życiowymi mykoheterotrofów. Co więcej, niewiele wiadomo o roli endofitów grzybowych u roślin mykoheterotroficznych, a nawet o rzeczywistej różnorodności tych grzybów7,8.
Badania nad grzybami endofitycznymi można prowadzić poprzez różne techniki, tradycyjnie opisywane jako niezależne lub zależne od hodowli, na przykład: (a) obserwacja bezpośrednia, (b) izolacja grzybów oraz identyfikacja morfologiczna i/lub molekularna, a także (c) ekstrakcja całkowitego DNA z tkanek roślinnych i identyfikacja molekularna9W obserwacji bezpośredniej (a) grzyby endofityczne można badać za pomocą mikroskopii świetlnej lub elektronowej, gdy znajdują się one jeszcze wewnątrz komórek i tkanek roślinnych.9, zgodnie ze szczegółowymi opisami różnych protokołów mikroskopowych przedstawionymi przez Pena-Passos i wsp.10Za pomocą metod izolacji (b) endofity grzybowe można scharakteryzować pod kątem morfologii ich kolonii, strzępek oraz struktur rozrodczych lub przetrwalnikowych. Ponadto, poprzez techniki izolacji, możliwe jest przeprowadzenie identyfikacji molekularnej izolatów poprzez ekstrakcję DNA, amplifikację sekwencji identyfikacji molekularnej (kodów kreskowych lub odcisków palców) oraz sekwencjonowanie11Ta druga technika (c) umożliwia molekularną identyfikację grzybów endofitycznych poprzez ekstrakcję DNA bezpośrednio z wnętrza tkanek roślinnych (metabarcoding), a następnie przygotowanie bibliotek i sekwencjonowanie.12.
Ponadto izolaty grzybów można wykorzystać w próbach kiełkowania symbiotycznego, stosując nasiona storczyków autotroficznych lub mykoheterotroficznych. Przykładem takiego zastosowania jest badanie przeprowadzone przez Sisti i wsp.13, opisujące kiełkowanie i wczesne stadia rozwoju protokormu u Pogoniopsis schenckii, storczyka mykoheterotroficznego, w powiązaniu z niektórymi jego izolatami, obejmującymi nie-mikoryzowe grzyby endofityczne. Zastosowany protokół kiełkowania symbiotycznego został szczegółowo opisany i przedstawiony w filmie autorstwa Pena-Passos i wsp.10. Izolowanie grzybów z różnych organów roślin pozwala na zróżnicowanie celów badawczych w zakresie natury interakcji roślina-grzyb (np. w celu zrozumienia aspektów ekologicznych lub fizjologicznych tej symbiozy, a także badania transferu składników odżywczych z grzybów do rośliny)9.
Metodyki przedstawione w sekcji 1 opierają się na zbiorze próbek organów podziemnych, ponieważ organy te sprawiają największe trudności podczas pobierania i budzą duże zainteresowanie ze względu na kolonizację przez endofity mikoryzowe. Niemniej jednak oba zawarte protokoły (kroki 1.1 i 1.2) można zastosować do innych organów roślin mykoheterotroficznych (np. kłączy, łodyg kwiatowych i owoców). Metodyka pobierania opisana w kroku 1.1 jest przeznaczona do izolacji grzybów endofitycznych (sekcja 2) w celu charakterystyki morfologicznej (sekcje 4 i 5) i/lub ekstrakcji całkowitego DNA do identyfikacji izolatów (sekcja 6). Z kolei metodyka pobierania opisana w kroku 1.2 jest przypisana wyłącznie do ekstrakcji całkowitego DNA z tkanek roślinnych na potrzeby technik metabarcodingu (sekcja 7). W sekcji 3 przedstawiono cztery metody przechowywania i konserwacji grzybów nitkowatych, z czego dwie służą do przechowywania krótkoterminowego (3-6 miesięcy), a dwie pozostałe są odpowiednie do przechowywania długoterminowego (&gt;1 rok). Charakterystyka morfologiczna (sekcje 4 i 5) może być powiązana z identyfikacją molekularną w celu jej wzmocnienia oraz dostarczenia istotnych informacji na temat makro- i mikromorfologii grzybów. Rysunek 1 podsumowuje opisane poniżej metodyki pobierania.
<img alt="Schemat analizy grzybów w próbkach roślinnych; obejmuje ekstrakcję DNA i kwantyfikację spektrofotometryczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65135/65135fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczne podsumowanie przedstawionych metod. Pobieranie roślin i izolacja grzybów, ich konserwacja oraz identyfikacja molekularna za pomocą metod zależnych i niezależnych od hodowli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65135/65135fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Taśma</td><td></td><td></td> klejąca <td>(dowolnej firmy, do montażu taśmy klejącej w analizach mikromorfologicznych)</td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5354</td> <td>(do montażu fragmentów roślin; można stosować inne antybiotyki - sprawdź krok 2.2.1)</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td></td><td></td> <td>(od dowolnej firmy, do sterylizacji materiałów w wielu etapach)</td></tr><tr><td>Agar bakteriologiczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td> <td>(dla wielu kroków)</td></tr> <tr><td>Roztwory C1, C2, C3, C4, C5 i C6</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td> <td>(zakupione z zestawem DNeasy PowerSoil)</td></tr><tr><td>Wirówka&nbsp; &nbsp;</td><td>Merck/Eppendorf</td><td>5810 G</td> <td>(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)</td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe</td><td>Merck</td><td>CLS430828</td><td>(do pobierania próbek)</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td> <td>(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)</td></tr> <tr><td>Czerwień kongijska</td><td>Supelco</td><td>75768</td> <td>(do barwienia strzępek)</td></tr> <tr><td>Cryotubes</td><td>Merck</td><td>BR114831</td> (<td>do wiele kroków)</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Supelco</td><td>100983</td><td>Konieczne będzie przeprowadzenie odpowiednich rozcieńczeń (dla wielu etapów)</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Merck</td><td>WHA10010155</td><td>(dla wielu etapów)</td></tr><tr><td>Szklane probówki</td><td>Merck</td><td>CLS7082516</td><td>(do kriokonserwacji w niełuskanych ziarnach ryżu)</td></tr><tr><td>Wata szklana</td><td>Supelco</td><td>20411</td> <td>(do kriokonserwacji w niełuskanych ziarnach ryżu)</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Lub dekstroza (do kriokonserwacji w wermikulicie)</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Lub gliceryna (do kriokonserwacji w wermikulicie, do przygotowania LPCB)</td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563935</td><td>(do całkowitej ekstrakcji DNA z grzybów izolaty)</td></tr><tr><td>Kwas mlekowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td>(do przygotowania LPCB - barwienie strzępek)</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu laktofenolowego (LPCB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td>(do barwienia strzępek)</td></tr><tr><td>Okap</td><td></td><td></td> z przepływem laminarnym<td>(klasa I, z dowolnej firmy, do wielu kroków)</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> świetlny(<td>z dowolnej firmy, do obserwacji strzępek)</td></tr><tr><td>MB Spin Kolumny</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td> <td>(do kupienia z zestawem DNeasy PowerSoil)</td></tr><tr><td>Błękit metylowy (niebieski bawełniany)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5528</td> <td>(do przygotowania LPCB - barwienie strzępkami)</td></tr> <tr><td>Probówka do mikrowirówek (1,5 ml)</td> <td>Merck</td><td>HS4323</td> <td>(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)</td></tr> <tr><td>Probówka do mikrowirówek (2 ml)</td> <td>BR780546</td> <td>Merck</td> <td>(do wielu etapów)</td></tr> <tr><td>Olej mineralny</td><td></td><td></td><td>(do konserwacji izolatów grzybów)</td></tr><tr><td>Worki</td><td></td><td></td> papierowe <td>Średni rozmiar 150 mm x 200 mm (do pobierania próbek)</td></tr><tr><td>Szalka Petriego (szkło, 120 mm x 20 mm)</td><td>Merck/Pyrex</td><td>SLW1480/10D</td> <td>(autoklawowalne, do hodowli grzybów, preferuj wyższe)</td></tr><tr><td>Szalka Petriego (szkło, 50 mm x 17 mm)</td><td>Merck/Aldrich</td><td>Z740618</td><td>(do oczyszczania izolatów grzybów); alternatywnie: polistyrenowe szalki Petriego (sterylne, napromieniowane promieniami gamma, nieautoklawowane)</td></tr><tr><td>Szalka Petriego (szkło, 80 mm x 15 mm)</td><td>Merck/Brand</td><td>BR455732</td>(<td>do montażu fragmentów roślin); alternatywnie: polistyrenowe szalki Petriego (sterylne, &napromieniowane promieniami gamma, nieautoklawowalne)</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1037</td> <td>(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów, do przygotowania LPCB)</td></tr><tr><td>Porcelana moździerz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247464</td><td>(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)</td></tr><tr><td>Tłuczek porcelanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247502</td><td>(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)</td></tr><tr><td>Agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA)</td><td>Milipor</td><td>P2182</td><td>(dla wielu kroków)</td></tr><tr><td>Rurki PowerBead</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td><td>(zakupione z zestawem DNeasy PowerSoil)</td></tr><tr><td>Szybki montaż podłoże (Entellan)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.0796</td> <td>(do hodowli szkiełka grzybowego)</td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy</td><td>Supelco</td><td>717185</td> <td>(do kriokonserwacji w niełuskanych ziarnach ryżu)</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td> <td>(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Sól sodowa laurylosiarczanu (do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)</td></tr><tr><td>Podchloryn sodu (z 2% aktywnym chlorem)</td><td></td><td></td> <td>(produkt handlowy, do powierzchownego usuwania</td></tr> <tr><td>zanieczyszczeń)Zestaw do ekstrakcji DNA z gleby (zestaw DNeasy PowerSoil)</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td> <td>(do całkowitej ekstrakcji DNA z organów roślinnych)</td></tr><tr><td>Spektrofotometr - Nanodrop 2000/2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td> <td>(do całkowitej ekstrakcji DNA z organów roślinnych)</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td> <td>stereoskopowy(=mikroskop preparacyjny, dowolnej firmy, do analiz makromorfologicznych)</td></tr><tr><td>Tetracyklina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td>(do instalacji fragmentów roślin)</td></tr><tr><td>Termoblok</td><td>Merck/Eppendorf</td><td>EP5362000035</td><td>(lub z innych firm)</td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy i lizer komórkowy</td><td>SPEX SamplePrep</td><td></td><td>2010 Geno / Grinder - Automatyczny homogenizator tkanek i lizer komórkowy (do całkowitej ekstrakcji DNA z organów roślinnych)</td></tr> <tr><td>Błękit toluidynowy O</td><td>Sigma-Aldrich / Harleco</td><td>364-M</td> <td>(do barwienia strzępek)</td></tr> <tr><td>Trehaloza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531</td> <td>(do kriokonserwacji w wermikulicie)</td></tr> <tr><td>Roztwór podstawowy Tris (Tris)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1699</td> <td>(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)</td></tr><tr><td>Niełuskane ziarna</td><td></td><td></td> ryżu <td>(do krioprezerwacji)</td></tr> <tr><td>Pręt</td><td></td><td></td> szklany w kształcie <td>litery U (lub adaptacja - sprawdź krok 5.4.1, do hodowli szkiełka grzybowego)</td></tr> <tr><td>Wermikulit</td><td></td><td></td><td>Drobna granulometria (do kriokonserwacji w wermikulicie)</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Sigma-Aldrich/BenchMixer</td><td>BMSBV1000</td><td>(do całkowitej ekstrakcji DNA z izolatów grzybów)</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td> <td>(do kriokonserwacji w wermikulicie)</td></tr></tbody></table>

izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja dna w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Rośliny mykoheterotroficzne prezentują jedną z najbardziej ekstremalnych form zależności mikoryzowej, całkowicie utraciwszy swoją zdolność autotroficzną. Tak samo niezbędne jak każdy inny ważny zasób, grzyby, z którymi te rośliny są ściśle powiązane, są dla nich niezbędne. W związku z tym niektóre z najbardziej odpowiednich technik w badaniu gatunków mykoheterotroficznych to te, które umożliwiają badanie powiązanych grzybów, zwłaszcza tych zasiedlających korzenie i organy podziemne. W tym kontekście powszechnie stosuje się techniki identyfikacji grzybów endofitycznych zależnych od kultury i niezależnych od kultury. Izolowanie endofitów grzybów zapewnia środki do ich morfologicznej identyfikacji, analizy ich różnorodności i utrzymania inokulum do zastosowań w symbiotycznym kiełkowaniu nasion orchidei. Wiadomo jednak, że w tkankach roślinnych występuje duża różnorodność grzybów nienadających się do hodowli. W związku z tym niezależne od kultury techniki identyfikacji molekularnej oferują szerszy zakres różnorodności i liczebności gatunków. Niniejszy artykuł ma na celu dostarczenie wsparcia metodologicznego niezbędnego do wszczęcia dwóch postępowań wyjaśniających: zależnego od kultury i niezależnego postępowania wyjaśniającego. Jeśli chodzi o protokół zależny od hodowli, szczegółowo opisano procesy pobierania i utrzymywania próbek roślin z miejsc pobierania do obiektów laboratoryjnych, wraz z izolacją grzybów strzępkowych z podziemnych i powietrznych organów roślin mykoheterotroficznych, utrzymywaniem kolekcji izolatów, morfologicznie charakteryzowaniem strzępek za pomocą metodologii hodowli szkiełkowej oraz identyfikacją molekularną grzybów przez całkowitą ekstrakcję DNA. Szczegółowe procedury, obejmujące metodologie niezależne od hodowli, obejmują pobieranie próbek roślin do analiz metagenomicznych i całkowitą ekstrakcję DNA z achlorofilnych organów roślinnych przy użyciu komercyjnego zestawu. Wreszcie, do analiz sugerowane są również protokoły ciągłości (np. reakcja łańcuchowa polimerazy [PCR], sekwencjonowanie) i przedstawiono tutaj techniki.

W protokole izolacji, w przypadku stwierdzenia kontaminacji wodą użytą do ostatniego płukania oraz wykrycia zanieczyszczenia w szalkach Petriego z zaszczepionymi fragmentami, można podjąć różne działania w zależności od rodzaju kontaminantu (Tabela 1). Procedurę tę należy powtórzyć od początku w przypadku silnie sporulujących grzybów, które wykazują również przyspieszony wzrost, oraz intensywnie namnażających się bakterii opornych na wybrane antybiotyki. Natomiast jeśli k...

Obecny artykuł ma na celu dostarczenie szczegółowych i adekwatnych protokołów do izolacji grzybów endofitycznych związanych z roślinami, długoterminowego przechowywania izolatów, charakterystyki morfologicznej i całkowitej ekstrakcji DNA w celu późniejszej identyfikacji molekularnej i analiz metagenomicznych.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...

Przedstawione tutaj techniki są przydatne do badania społeczności grzybów endofitycznych związanych z różnymi organami roślinnymi. Izolacja grzybów endofitycznych pozwala na ich identyfikację i jest cenna w innych technikach, takich jak kiełkowanie symbiotyczne. Na początek przygotuj pożywkę PDA o grubości od ośmiu do 10 centymetrów, uzupełnioną trzema mililitrami na litr antybiotyku.Sprawdź, czy nie ma zanieczyszczeń, inkubując pożywkę Petriego w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 24 godziny przed użyciem. Następnego dnia należy powierzchownie zdezynfekować zdrowe fragmenty roślin mychoheterotroficznych przy użyciu standardowej procedury i umieścić je na sterylnej szalce Petriego. Aby ocenić skuteczność powierzchownej dezynsekcji próbek, należy zaszczepić kilka kropli wody destylowanej użytej podczas ostatniego mycia próbek na PDA.Następnie za pomocą skalpela i kleszczy pokrój próbki na kawałki o grubości 0,2 centymetra. Podziel próbki na sekcje, aby wzmocnić powierzchnię, która ma mieć kontakt z podłożem. Umieść pięć fragmentów podziemnych organów na płytce PDA z dodatkiem antybiotyku tak daleko od siebie, jak to możliwe, nie dotykając krawędzi naczynia.Uszczelnij szalki Petriego folią spożywczą i przechowuj je w ciemności w temperaturze od 25 do 27 stopni Celsjusza przez pięć dni. Dzień przed subkulturą przygotuj pięciocentymetrowe szalki Petriego, używając od pięciu do siedmiu gramów na litr pożywki AA i inkubuj płytki w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby oczyścić izolaty grzybów, rozróżnij kolonie płytek PDA według koloru, wzoru wzrostu, tekstury i formatu marginesów.Następnie wyznacz brzegi kolonii na dolnej stronie naczynia. Zidentyfikuj również kolonie za pomocą kodu. Używając końcówki autoklawowanej drewnianej wykałaczki, odzyskaj niewielką ilość grzybni z brzegów zidentyfikowanej kolonii grzybów i prążkuj płytkę AA, tworząc trzy prążki w odległości jednego centymetra od siebie i krawędzi naczynia.Oznacz tabliczkę AA odpowiednim kodem za pomocą papieru z naklejkami i ołówka. Uszczelnij płytki przed inkubacją w ciemności w temperaturze od 25 do 27 stopni Celsjusza przez trzy dni. Po inkubacji skrupulatnie obserwuj płytki, aby zidentyfikować drobne strzępki tworzące poszczególne kolonie.Ogranicz obszar poszczególnych kolonii za pomocą trwałego markera. Odetnij część pożywki zawierającą kolonię za pomocą autoklawowanej wykałaczki i przenieś naciętą objętość na środek nowej płytki Petriego PDA bez antybiotyków. Po oznaczeniu szalek Petriego kodami izolatów, zamknij je folią spożywczą i trzymaj w ciemności w temperaturze od 25 do 27 stopni Celsjusza przez siedem do 14 dni.Aby rozpocząć konserwację izolatów grzybów metodą Castellaniego, dodaj 0,5 mililitra wody destylowanej do autoklawowanej dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej. Za pomocą autoklawowanej wykałaczki odetnij prostopadłościenne podłoże o wymiarach 0,5 na 0,5 centymetra z brzegów grzybni już wyrosłych oczyszczonych izolatów. Umieść od czterech do sześciu prostopadłościanów w probówkach mikrowirówek z wodą destylowaną.Przechowuj probówki w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza tak długo, jak to konieczne. W razie potrzeby odzyskaj prostopadłościan i umieść go na środku nowego naczynia PDA, aby wyhodować przechowywany izolat. Rozpocznij metodę dokuczania, umieszczając kroplę barwnika błękitu toluidynowego-O na czystym szkiełku podstawowym.W takiej technice można stosować różne plamy. Za pomocą autoklawowanej wykałaczki ostrożnie usuń strzępki z wyhodowanego izolatu i umieść je w kropli plamy. Umieść szkiełko nakrywkowe i przeanalizuj je pod mikroskopem świetlnym.W przypadku metody montażu za pomocą taśmy klejącej umieść kroplę niebieskiej plamy z laktofenolu na czystym szkiełku. Wytnij pasek przezroczystej taśmy klejącej w rozmiarze, który dobrze pasuje do szkiełka i centralnej plamy. Skieruj lepką powierzchnię paska samoprzylepnego na powierzchnię grzybni i spróbuj zebrać kilka strzępek bez naciskania lub zbierania ich zbyt wielu.Następnie przyklej taśmę do szkiełka, upewniając się, że plama styka się z zebranymi strzępkami. Umieść kroplę wody nad taśmą i umieść szkiełko nakrywkowe przed analizą szkiełka pod mikroskopem świetlnym. Wzrost małych grup grzybni grzybów strzępkowych wyłaniających się z wnętrza fragmentów zaobserwowano po pięciu dniach inokulacji fragmentu mychoheterotroficznego organu roślinnego na pożywce PDA.W ciągu siedmiu do 14 dni od inokulacji oczyszczonego izolatu zaobserwowano odśrodkowy wzrost kolonii czystego izolatu grzybów na PDA, tworząc jedyną okrągłą grzybnię. Możliwe zanieczyszczenia były łatwe do zidentyfikowania, co zagrażało jednorodności kolonii pod względem jej formy wzrostu, aspektu, koloru i produkcji pigmentu w pożywce. Kolonia wyizolowana z wrzecionowatych korzeni mychoheterotroficznej orchidei, Wullschlaegelia aphylla, była nieprzezroczysta, bez dyfuzyjnych pigmentów lub wysięków w pożywce.Kolonia była biaława do szarej na górnej stronie i brązowawa na dolnej. Grzybnia była powietrzna i obfita, a brzegi nieregularne i powietrzne. Kolonia miała aksamitną teksturę i pomarszczoną topografię bez struktur makroskopowych.Struktury, które nie były łatwo widoczne w niebarwionej grzybni, zostały ujawnione po zabarwieniu grzybni błękitem laktofenolowym i błękitem toluidyny-O, co ułatwiło ich identyfikację. Przedstawione tutaj metody izolacji grzybów mogą być również stosowane do roślin zielonych w celu identyfikacji endofitów grzybów. Wyizolowane grzyby mogą być wykorzystywane w próbach kiełkowania symbiotycznego.

isolation-characterization-total-dna-extraction-to-identify

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten protokół demonstruje dwie metody inokulacji w celu wprowadzenia entomopatogenu grzyba Beauveria bassiana jako endofitu do fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris), w ramach przygotowań do kolejnych ocen endofitycznej kontroli biologicznej.

Ustanawianie entomopatogenów grzybów jako endofitów: w kierunku endofitycznej kontroli biologicznej

Metoda wyodrębniania endospor bakteryjnych ze złożonych społeczności mikrobiologicznych została opracowana w celu przeprowadzenia dostosowanych kultur lub badań molekularnych tej grupy bakterii.

Fizyczna izolacja przetrwalników z próbek środowiskowych poprzez celowaną lizę komórek wegetatywnych

Przedstawiono porównanie i optymalizację dwóch metod wzbogacania DNA organelek roślinnych: tradycyjne wirowanie różnicowe i frakcjonowanie całkowitego gDNA w oparciu o status metylacji. Oceniamy otrzymaną ilość i jakość DNA, wykazujemy wydajność w sekwencjonowaniu nowej generacji z krótkim odczytem i omawiamy potencjał zastosowania w sekwencjonowaniu pojedynczych cząsteczek z długim odczytem.

Optymalizacja i analiza porównawcza metod wzbogacania organelek DNA roślin odpowiednich do sekwencjonowania nowej generacji

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Wydobywanie korzeni roślin z pola, jak również przetwarzanie próbek do endosfery, ryzosfery i gleby są szczegółowo opisane, łącznie z metodami ekstrakcji DNA i analizy danych. Niniejszy artykuł ma na celu umożliwienie innym laboratoriom wykorzystania tych technik do badania mikrobiomów glebowych, endosfery i ryzosfer.

Izolacja i analiza zbiorowisk mikrobiologicznych w glebie, ryzosferze i korzeniach w eksperymentach z wieloletnimi trawami

Produkty na bazie glifosatu (GBP) są najpopularniejszymi herbicydami o szerokim spektrum działania na świecie. W tym artykule przedstawiamy ogólne wytyczne dotyczące ilościowego określania wpływu GBP na mikrobiomy, od eksperymentów terenowych po analizy bioinformatyczne.

Kwantyfikacja potencjalnego wpływu produktów na bazie glifosatu na mikrobiomy

Entomopatogeniczne kolonie grzybów są izolowane z próbek gleby tropikalnej za pomocą przynęty Tenebrio, przynęty Galleria, a także selektywnego sztucznego podłoża, tj. agaru z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC).

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

Ten protokół jest skuteczną, szybką metodą hodowli drożdży i pleśni Aspergillus fumigatus z dużych zestawów próbek gleby w ciągu zaledwie 7 dni. Metody te można łatwo modyfikować w celu dostosowania do różnych pożywek inkubacyjnych i temperatur w zależności od potrzeb eksperymentów.

Izolacja drożdży i pleśni nadających się do hodowli z gleb w celu zbadania struktury populacji grzybów

Wykonalność i skuteczność wysokoprzepustowych metod sekwencyjnych scRNA zwiastuje erę jednokomórkowych w badaniach roślinnych. Przedstawiono tutaj solidną i kompletną procedurę izolowania określonych typów komórek korzenia rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana) oraz późniejszej budowy i analizy biblioteki transkryptomu.

Izolacja i analiza transkryptomu typów komórek roślinnych

Tutaj prezentujemy protokół pozyskiwania entomopatogenicznych grzybów z omacnicy leśnej oraz zastępczy sposób oceny ich entomopatogenicznej aktywności za pomocą modelowego owada Coleoptera. Ta metoda jest skuteczna i wygodna w badaniu entomopatogenicznych zasobów grzybów ze szkodników owadzich drążących drewno w lasach naturalnych.

Izolacja, identyfikacja behawioralna i ocena chorobotwórczości grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej

Technika iChip wykorzystuje niedrogie i proste urządzenie do izolacji in-situ, które zwiększa tempo odkrywania nowych mikroorganizmów z gleby. Nowe mikroorganizmy mogą być wykorzystywane m.in. do dalszych badań nad mikrobiomem glebowym lub odkrywaniem produktów naturalnych.

Izolacja mikroorganizmów glebowych z wykorzystaniem technologii iChip

Poznaj metody izolacji grzybów endofitycznych z roślin mykoheterotroficznych przy użyciu technik hodowli sterylnej i analizy mikroskopowej. Protokoły te umożliwiają dokładną identyfikację i badania molekularne.

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Przeglądaj więcej filmów