Izolacja, charakterystyka i całkowita ekstrakcja DNA w celu identyfikacji grzybów endofitycznych w roślinach mykoheterotroficznych

Przedstawione tutaj techniki są przydatne do badania społeczności grzybów endofitycznych związanych z różnymi organami roślinnymi. Izolacja grzybów endofitycznych pozwala na ich identyfikację i jest cenna w innych technikach, takich jak kiełkowanie symbiotyczne. Na początek przygotuj pożywkę PDA o grubości od ośmiu do 10 centymetrów, uzupełnioną trzema mililitrami na litr antybiotyku.

Sprawdź, czy nie ma zanieczyszczeń, inkubując pożywkę Petriego w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 24 godziny przed użyciem. Następnego dnia należy powierzchownie zdezynfekować zdrowe fragmenty roślin mychoheterotroficznych przy użyciu standardowej procedury i umieścić je na sterylnej szalce Petriego. Aby ocenić skuteczność powierzchownej dezynsekcji próbek, należy zaszczepić kilka kropli wody destylowanej użytej podczas ostatniego mycia próbek na PDA.

Następnie za pomocą skalpela i kleszczy pokrój próbki na kawałki o grubości 0,2 centymetra. Podziel próbki na sekcje, aby wzmocnić powierzchnię, która ma mieć kontakt z podłożem. Umieść pięć fragmentów podziemnych organów na płytce PDA z dodatkiem antybiotyku tak daleko od siebie, jak to możliwe, nie dotykając krawędzi naczynia.

Uszczelnij szalki Petriego folią spożywczą i przechowuj je w ciemności w temperaturze od 25 do 27 stopni Celsjusza przez pięć dni. Dzień przed subkulturą przygotuj pięciocentymetrowe szalki Petriego, używając od pięciu do siedmiu gramów na litr pożywki AA i inkubuj płytki w temperaturze 36 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Aby oczyścić izolaty grzybów, rozróżnij kolonie płytek PDA według koloru, wzoru wzrostu, tekstury i formatu marginesów.

Następnie wyznacz brzegi kolonii na dolnej stronie naczynia. Zidentyfikuj również kolonie za pomocą kodu. Używając końcówki autoklawowanej drewnianej wykałaczki, odzyskaj niewielką ilość grzybni z brzegów zidentyfikowanej kolonii grzybów i prążkuj płytkę AA, tworząc trzy prążki w odległości jednego centymetra od siebie i krawędzi naczynia.

Oznacz tabliczkę AA odpowiednim kodem za pomocą papieru z naklejkami i ołówka. Uszczelnij płytki przed inkubacją w ciemności w temperaturze od 25 do 27 stopni Celsjusza przez trzy dni. Po inkubacji skrupulatnie obserwuj płytki, aby zidentyfikować drobne strzępki tworzące poszczególne kolonie.

Ogranicz obszar poszczególnych kolonii za pomocą trwałego markera. Odetnij część pożywki zawierającą kolonię za pomocą autoklawowanej wykałaczki i przenieś naciętą objętość na środek nowej płytki Petriego PDA bez antybiotyków. Po oznaczeniu szalek Petriego kodami izolatów, zamknij je folią spożywczą i trzymaj w ciemności w temperaturze od 25 do 27 stopni Celsjusza przez siedem do 14 dni.

Aby rozpocząć konserwację izolatów grzybów metodą Castellaniego, dodaj 0,5 mililitra wody destylowanej do autoklawowanej dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej. Za pomocą autoklawowanej wykałaczki odetnij prostopadłościenne podłoże o wymiarach 0,5 na 0,5 centymetra z brzegów grzybni już wyrosłych oczyszczonych izolatów. Umieść od czterech do sześciu prostopadłościanów w probówkach mikrowirówek z wodą destylowaną.

Przechowuj probówki w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza tak długo, jak to konieczne. W razie potrzeby odzyskaj prostopadłościan i umieść go na środku nowego naczynia PDA, aby wyhodować przechowywany izolat. Rozpocznij metodę dokuczania, umieszczając kroplę barwnika błękitu toluidynowego-O na czystym szkiełku podstawowym.

W takiej technice można stosować różne plamy. Za pomocą autoklawowanej wykałaczki ostrożnie usuń strzępki z wyhodowanego izolatu i umieść je w kropli plamy. Umieść szkiełko nakrywkowe i przeanalizuj je pod mikroskopem świetlnym.

W przypadku metody montażu za pomocą taśmy klejącej umieść kroplę niebieskiej plamy z laktofenolu na czystym szkiełku. Wytnij pasek przezroczystej taśmy klejącej w rozmiarze, który dobrze pasuje do szkiełka i centralnej plamy. Skieruj lepką powierzchnię paska samoprzylepnego na powierzchnię grzybni i spróbuj zebrać kilka strzępek bez naciskania lub zbierania ich zbyt wielu.

Następnie przyklej taśmę do szkiełka, upewniając się, że plama styka się z zebranymi strzępkami. Umieść kroplę wody nad taśmą i umieść szkiełko nakrywkowe przed analizą szkiełka pod mikroskopem świetlnym. Wzrost małych grup grzybni grzybów strzępkowych wyłaniających się z wnętrza fragmentów zaobserwowano po pięciu dniach inokulacji fragmentu mychoheterotroficznego organu roślinnego na pożywce PDA.

W ciągu siedmiu do 14 dni od inokulacji oczyszczonego izolatu zaobserwowano odśrodkowy wzrost kolonii czystego izolatu grzybów na PDA, tworząc jedyną okrągłą grzybnię. Możliwe zanieczyszczenia były łatwe do zidentyfikowania, co zagrażało jednorodności kolonii pod względem jej formy wzrostu, aspektu, koloru i produkcji pigmentu w pożywce. Kolonia wyizolowana z wrzecionowatych korzeni mychoheterotroficznej orchidei, Wullschlaegelia aphylla, była nieprzezroczysta, bez dyfuzyjnych pigmentów lub wysięków w pożywce.

Kolonia była biaława do szarej na górnej stronie i brązowawa na dolnej. Grzybnia była powietrzna i obfita, a brzegi nieregularne i powietrzne. Kolonia miała aksamitną teksturę i pomarszczoną topografię bez struktur makroskopowych.

Struktury, które nie były łatwo widoczne w niebarwionej grzybni, zostały ujawnione po zabarwieniu grzybni błękitem laktofenolowym i błękitem toluidyny-O, co ułatwiło ich identyfikację. Przedstawione tutaj metody izolacji grzybów mogą być również stosowane do roślin zielonych w celu identyfikacji endofitów grzybów. Wyizolowane grzyby mogą być wykorzystywane w próbach kiełkowania symbiotycznego