Name: Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Poznaj metodę wzbogacania natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Mycobacterium smegmatis. Technika ta umożliwia analizę zawartości mEVs oraz projektowanie kandydatów na szczepionki z wykorzystaniem białka EsxA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy serdecznie dziękują prof. Sarah M. Fortune za uprzejme podzielenie się zapasem M. smegmatis mc2155. Są również wdzięczni firmie Servier Medical Art (smart.servier.com) za dostarczenie kilku podstawowych elementów do rysunku 1. Z pełnym szczerością dziękują pozostałym członkom laboratorium za wsparcie dla ich pacjentów podczas długiego użytkowania wytrząsarek inkubatora, wirówek i ultrawirówek do wzbogacania mEV. Dziękują również panu Surjeetowi Yadavowi, asystentowi laboratoryjnemu, za to, że zawsze upewniał się, że niezbędne szkło i materiały eksploatacyjne są zawsze dostępne i pod ręką. Na koniec dziękują zespołom administracyjnym, zakupowym i finansowym THSTI za ich ciągłe wsparcie i pomoc w bezproblemowej realizacji projektu.

Wszyscy autorzy oświadczają, że niniejsza praca badawcza została przeprowadzona przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Ponieważ opracowanie nowej szczepionki przeciw gruźlicy, która jest lepsza i może zastąpić BCG, pozostaje ogromnym wyzwaniem, jako alternatywa, kilka grup dąży do odkrycia różnych podjednostkowych szczepionek przeciwgruźlicowych, które mogą zwiększyć siłę działania BCG i wydłużyć jej czas ochrony48,49. Biorąc pod uwagę rosnące zainteresowanie bakteryjnymi EV (bEV) jako potencjalnymi podjednostkami i naturalnymi adiuwantami50,51<...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated from:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University
to:
Praapti Jayaswal1 
Mohd Ilyas1 
Kuljit Singh1,2 
Saurabh Kumar1,3 
Lovely Sisodiya1 
Sapna Jain1 
Rahul Mahlawat1 
Nishant Sharma1,4 
Vishal Gupta1 
Krishnamohan Atmakuri1 
1Bacterial Pathogenesis Laboratory, Infectious Diseases and Immunology Group, Translational Health Science and Technology Institute, NCR Biotech Science Cluster 
2Clinical Microbiology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine 
3ICAR-Research Complex for Eastern Region 
4Public Health Research Institute, Rutgers University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65138">Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Pomimo rozwoju i podawania szerokiej gamy szczepionek przeciwko chorobom zakaźnym, nawet do dnia dzisiejszego, ~30% wszystkich zgonów ludzi nadal występuje z powodu chorób zakaźnych1. Przed pojawieniem się szczepionki przeciw gruźlicy (TB) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - gruźlica była zabójcą numer jeden (populacja ~10 000 do 15 000/100 000)2. Dzięki podawaniu BCG i łatwemu dostępowi do leków przeciwgruźliczych pierwszego i drugiego rzutu, do 2022 r. liczba zgonów związanych z gruźlicą dramatycznie spadła do ~1 miliona/rok do 2022 r. (tj. ~15-20/100 000 populacji1). Jednak w populacjach endemicznych gruźlicy na świecie liczba zgonów związanych z gruźlicą nadal wynosi ~100-550/100 000 populacji1. Podczas gdy eksperci dostrzegają kilka przyczyn prowadzących do tych zniekształconych liczb, ochrona za pośrednictwem BCG, która nie trwa nawet przez pierwszą dekadę życia, wydaje się być głównym powodem3,4,5,6,7. W rezultacie, biorąc pod uwagę odnowione "Cele Zrównoważonego Rozwoju" ONZ i "Strategię Walki z Gruźlicą" WHO, podejmowane są wspólne globalne wysiłki na rzecz opracowania znacznie lepszej alternatywy dla szczepionki przeciwko BCG, która być może zapewni ochronę przed gruźlicą przez całe życie.

W tym celu, kilka grup obecnie ocenia zmodyfikowane/rekombinowane szczepy BCG, niepatogenne i atenuowane gatunki prątków inne niż BCG oraz kandydatów na podjednostki8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18. Zazwyczaj szczepionki podjednostkowe to liposomy selektywnie załadowane kilkoma oczyszczonymi (~ 1-6) pełnowymiarowymi lub skróconymi białkami immunogennymi patogenu. Jednak ze względu na ich fałszywe fałdowanie w nienatywne konformacje i/lub losowe niefunkcjonalne interakcje między załadowanymi białkami, podjednostki często nie mają natywnych i germanowych epitopów, a zatem nie są wystarczająco przygotowane do układu odpornościowego14,19,20.

W związku z tym, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) bakterii stały się obiecującą alternatywą21,22,23,24,25,26. Zazwyczaj bakteryjne EV (bEV) zawierają podzbiór swoich składników komórkowych, w tym pewne porcje kwasów nukleinowych, lipidów oraz setki metabolitów i białek27,28. W przeciwieństwie do liposomów, w których kilka oczyszczonych białek jest sztucznie ładowanych, bEV zawierają setki naturalnie obciążonych, natywnie pofałdowanych białek o lepszej skłonności do pobudzania układu odpornościowego, zwłaszcza bez wzmocnienia/pomocy adiuwantów i agonistów receptora Toll-podobnego (TLR)27,28,29. To właśnie w tej linii badawczej my i inni zbadaliśmy użyteczność mykobakteryjnych EV jako potencjalnych wzmacniaczy podjednostek do BCG30. Pomimo obaw, że bEV nie mają jednorodnych ładunków antygenowych, EV z atenuowanym Neisseria meningitidis skutecznie chroniły ludzi przed meningokokami serogrupy B31,32.
Przynajmniej teoretycznie, najlepszymi EV, które mogłyby dobrze wzmocnić BCG, są EV wzbogacone o bakterie chorobotwórcze. Jednak wzbogacanie pojazdów elektrycznych generowanych przez chorobotwórcze prątki jest kosztowne, czasochłonne i ryzykowne. Ponadto pojazdy elektryczne generowane przez patogeny mogą być bardziej zjadliwe niż ochronne. Biorąc pod uwagę potencjalne ryzyko, przedstawiamy tutaj dobrze przetestowany protokół wzbogacania pojazdów elektrycznych generowanych przez osiowo hodowany Msm, awirulentny prątek.
Jednakże, pomimo kodowania kilku ortologów białek patogennych, prątki awirulentne nie mają kilku antygenów szczepionkowych/epitopów białek patogennych niezbędnych do wystarczającego przygotowania układu odpornościowego do ochrony33. W związku z tym badaliśmy również konstruowanie i wzbogacanie rekombinowanych EV Msm za pomocą inżynierii molekularnej, tak aby znaczna część każdego patogennego białka będącego przedmiotem zainteresowania ulegającego ekspresji i translacji w Msm musiała dotrzeć do swoich EV. Postawiliśmy hipotezę, że jedno lub więcej z 10 najliczniejszych białek Msm EV po połączeniu z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania pomoże w takiej translokacji.
Podczas gdy zaczynaliśmy standaryzować wzbogacanie mykobakteryjnych EVs (mEVs) w naszym laboratorium, w 2011 roku, Prados-Rosales et al. po raz pierwszy poinformowali o wizualizacji i wzbogacaniu mEVs in vitro30. Później, w 2014 roku, ta sama grupa opublikowała zmodyfikowaną wersję swojej metody z 2011 roku34. W 2015 roku Lee i in. opisali również niezależnie ustandaryzowaną metodę ponownego wzbogacania mEV z aksenicznych kultur prątków35. Łącząc oba protokoły34,35 i wprowadzając kilka naszych modyfikacji po dokładnej standaryzacji, opisujemy tutaj protokół, który pomaga rutynowo wzbogacać mEV z aksenicznych kultur prątków36.
Tutaj szczególnie szczegółowo opisujemy wzbogacanie EV specyficznych dla Msm, które jest rozszerzeniem opublikowanego protokołu36 dla wzbogacania EV mykobakteryjnych w ogóle. Szczegółowo opisujemy również, jak konstruować rekombinowane mEV (R-mEVs), które zawierają białko mCherry (jako czerwony reporter fluorescencyjny) i EsxA (Esat-6)37,38,39 dominujący immunogen i potencjalny podjednostkę wakcynogenu Mycobacterium tuberculosis. Protokół wzbogacania R-mEV pozostaje identyczny z tym, który opisaliśmy dla wzbogacania natywnych EV od Msm.

<table><tbody><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego typu A2</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td> Wirówka stołowa serii <td>1300</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf, USA</td><td></td><td>5810 R</td></tr><tr><td>BstB1, HindIII, HpaI</td><td>NEB, USA</td><td></td> Densytometr <td>komórkowy NEB</td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare, USA</td><td></td><td>Ultraspec 10</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>Dwuzasadowy fosforan potasu</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>Podwójnie destylowana woda</td><td>Merck, USA</td><td></td><td>~18.2 MW/cm @ 25 oC</td></tr><tr><td>Kuwety do elektroporacji</td><td>Bio-Rad, USA</td><td></td> 2 <td>mm</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Bio-Rad, USA</td><td></td><td>Elektroporator</td></tr><tr><td>EsxA-specific Ab</td><td>Abcam, Wielka Brytania</td><td></td><td>Królik poliklonalny</td></tr><tr><td>cytrynian żelazowo-amonowy</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>Wirówka podłogowa</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>Sorvall RC6 plus</td></tr><tr><td>Szkło</td><td>Borosil, INDIE</td><td></td><td>1 L Kolby Erlenmeyera</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>HEPES i chlorek</td> <td>soduSigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>Wytrząsarki inkubatorowe</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>MaxQ 6000 & 8000</td></tr><tr><td>L-asparagine</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>Luria Bertani Bulion i Agar, Miller</td><td>Hi Media, INDIA</td><td></td><td>Hi Media</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Tarsons, INDIE</td><td></td><td>Tarsons</td></tr><tr><td>specyficzne dla wiśni Abcam</td><td>, Wielka Brytania</td><td></td><td>Monoklonalna</td></tr><tr><td>kuchenka mikrofalowa</td> królika <td>LG, INDIE</td><td></td><td>MC3286BLT</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Bulion</td><td>BD, USA</td><td></td><td>Difco Middlebrook 7H9 Bulion</td></tr><tr><td>Middlebrook Wzbogacanie ADC</td><td>BD, USA</td><td></td><td>BBL Wzbogacanie ADC Middlebrook</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Spectronic 200 UV-Vis</td></tr><tr><td>NEB5a NEB</td><td>, USA</td><td></td><td>pochodna DH5a</td></tr><tr><td>Optiprep (Iodixanol)</td><td>Merck, USA</td><td></td><td>Dostępny jako 60% roztwór podstawowy (w wodzie)</td></tr> <tr><td>Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Hi Media, INDIA</td><td></td><td>Hi Media</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Mettler Toledo, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Mettler Toledo</td></tr><tr><td>Mini zestaw plazmidowego DNA</td><td>Hi Media, INDIE</td><td></td><td>Hi Media</td></tr><tr><td>Inkubator płytkowy</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>Nowa seria</td></tr><tr><td>Plazmid pMV261</td><td>Addgene, USA * *&nbsp; &nbsp; plazmid&nbsp; &nbsp; jest&nbsp; &nbsp; Nie&nbsp; &nbsp; więcej dostępne w tym banku</td><td></td><td>plazmidów Wahadłowiec wektor</td></tr><tr><td>Korekta Polimeraza DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>Phusion DNA Plus Polimeraza</td></tr><tr><td>Q5 Korekta Polimeraza DNA</td><td>NEB, USA</td><td></td><td>NEB</td></tr><tr><td>Chłodzona kąpiel wodna obiegowa</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>R20</td></tr><tr><td>Middlebrock 7H11 Baza agarowa</td><td>BD, USA</td><td></td><td>BBL Siedem H11 Bulion SOC na bazie agaru</td></tr><tr><td></td><td>Hi Media, INDIA</td><td></td><td>Hi Media</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>NEB, USA</td><td></td><td>NEB</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td></td><td>Optima L100K</td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek - 14 ml</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td></td><td>Typ poliallomerowy &ndash; typ ultra przezroczysty w wirniku SW40Ti</td></tr><tr><td>Probówki do ultrawirówek - 38 ml</td><td>Beckman Coulter, USA</td><td></td><td>Typ polipropylenowy&ndash; typ mętny do wirnika SW28</td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy sonikator do czyszczenia kąpieli wodnej</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>Sonicator - model stołowy</td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m Filtry jednorazowe</td><td>Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Nunc-Nalgene</td></tr><tr><td>30-kDa Koncentratory Centricon</td><td>Merck, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra - Millipore</td></tr><tr><td>3X FLAG przeciwciało</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Stany Zjednoczone</td><td></td><td>Sigma Aldrich</td></tr><tr><td>400 mL Butelki wirówkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td></td><td>Nunc-Nalgene</td></tr><tr><td>50 mL Probówki</td> <td>wirówkoweCorning, USA</td><td></td><td>Sterylne, wstępnie zapakowane</td></tr><tr><td>Bacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczep</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>NEB, USA</td><td></td><td>NEB 5-alfa (pochodna DH5&alpha;).</td></tr><tr><td>Msm wyrażający cfp29::mCherry</td><td>To badanie</td><td></td><td>MC2&nbsp; 155</td></tr><tr><td>Msm wyrażający cfp29::esxA</td><td>To badanie</td><td></td><td>MC2&nbsp; 155</td></tr><tr><td>Msm wyrażający cfp29::esxA::3X FLAG</td><td>To badanie</td><td></td><td>MC2&nbsp; 155</td></tr><tr><td>Mycobacterium smegmatis (Msm)</td><td>Prof. Sarah M. Fortune, Uniwersytet Harvarda, USA&</td><td></td><td>nbsp; MC2&nbsp; Rozdział 155</td></tr></tbody></table>

wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Enrichment of Native and Recombinant Extracellular Vesicles of Mycobacteria

Większość bakterii, w tym prątki, wytwarza pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV). Ponieważ bakteryjne EV (bEV) zawierają podzbiór składników komórkowych, w tym metabolity, lipidy, białka i kwasy nukleinowe, kilka grup oceniło natywne lub rekombinowane wersje bEV pod kątem ich siły ochronnej jako kandydatów na szczepionki podjednostkowe. W przeciwieństwie do natywnych EV, rekombinowane EV są modyfikowane molekularnie tak, aby zawierały jeden lub więcej interesujących immunogenów. W ciągu ostatniej dekady różne grupy badały różne podejścia do generowania rekombinowanych pojazdów elektrycznych. Jednak tutaj przedstawiamy projektowanie, budowę i wzbogacanie rekombinowanych prątków EV (mEVs) w prątkach. W tym celu jako system modelowy wykorzystujemy Mycobacterium smegmatis (Msm), awirulentny prątek glebowy. Najpierw opiszemy generację i wzbogacanie natywnych pojazdów elektrycznych MSM. Następnie opisujemy projekt i budowę rekombinowanych mEV, które zawierają mCherry, czerwone fluorescencyjne białko reporterowe, lub EsxA (Esat-6), ważny immunogen Mycobacterium tuberculosis. Osiągamy to poprzez oddzielne łączenie N-końców mCherry i EsxA z C-końcem małego białka Msm Cfp-29. Cfp-29 jest jednym z niewielu obficie występujących białek MsmEVs. Protokół generowania i wzbogacania rekombinowanych mEV z Msm pozostaje identyczny z generowaniem i wzbogacaniem natywnych EV Msm.

Jako model prątka wykorzystujemy M. smegmatis (Msm), aby zademonstrować wzbogacanie zarówno natywnych, jak i rekombinowanych mEV (R-mEV). Przedstawiony schematycznie protokół wzbogacania mEV (Rycina 1) sprawdza się również w przypadku wzbogacania R-mEV z Msm oraz natywnych EV z Mtb (z niewielkimi modyfikacjami opisanymi w uwagach do protokołu w sekcji 1.2). Wizualizacja wzbogaconych mEV wymaga ich barwienia negatywowego z wykorzystaniem transmisyjnego mikroskopu elektronowego<sup cl...

Ten protokół szczegółowo opisuje wzbogacanie natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków (mEV) z aksonicznych kultur Mycobacterium smegmatis (Msm) oraz jak można projektować i wzbogacać rekombinowane MsmEV zawierające mCherry (czerwony fluorescencyjny reporter). Na koniec zweryfikowano nowatorskie podejście polegające na wzbogaceniu MsmEV zawierających białko EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Most bacteria, including mycobacteria, generate extracellular vesicles (EVs). Since bacterial EVs (bEVs) contain a subset of cellular components, ...

Wzbogacanie mykobakteryjnych EV pomaga określić ich zawartość, rozszyfrować ich frakcje i daty, projektując sposoby konstruowania i generowania rekombinowanych EV, które wykorzystują głównie kandydatów na szczepionki. Sześć serii generuje się z różnych miejsc powierzchni bakteryjnej. Nie mają zachowanych znaczników.W związku z tym wszelkie podejścia oparte na powinowactwie mogą wzbogacić tylko podzbiór pojazdów elektrycznych. W przeciwieństwie do tego, nasza metoda wychwytuje wszystkie wygenerowane EV prątków. Procedurę zademonstruje Mohd Ilyas, doktorant z mojego laboratorium.Na początek dodaj jeden mililitr glicerolu Mycobacterium smegmatis typu dzikiego lub rekombinowanego do 50-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 10 mililitrów wstępnie podgrzanego bulionu 7H9. Zamknij pokrywkę i zakręć probówką przed inkubacją kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w zakresie od 200 do 220 obr./min. Następnego dnia, gdy gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie około jednego, odwirować kulturę o sile 3,200 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant do płynnego pojemnika na odpady.Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego podłoża Sautons i delikatnie zawieś ponownie, aby uzyskać jednolitą zawiesinę. Uzupełnić objętość do 10 mililitrów za pomocą pożywki Sauton. Ponownie odwirować i wyrzucić supernatant.Po umyciu ponownie zawieś komórki bakteryjne w 20 mililitrach wstępnie podgrzanego podłoża Sautons i zmierz gęstość optyczną na 600 nanometrach. Zaszczepić wymaganą objętość zawiesiny bakteryjnej w jedno- lub dwulitrowej kolbie Erlenmeyera zawierającej 330 mililitrów pożywki Sauton i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 200 obr./min, aż gęstość optyczna osiągnie 0,3.Następnego dnia umyj komórki raz, jak wykazano wcześniej, i ponownie zawieś osad w 330 mililitrach Saautonów zawierających 1/10 Tween 80. Rozprowadź 50 mililitrów zawiesiny komórek do sześciu jednolitrowych kolb, z których każda zawiera 280 mililitrów wstępnie podgrzanych Sautonów zawierających 1/10 Tween 80. Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 200 obr./min, aż gęstość optyczna osiągnie od dwóch do 2,5.Dodaj dwa litry kultur w średnim etapie wykładniczym do sześciu 400-mililitrowych butelek i odwiruj przy 8 000 G przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza. Zebrać supernatant i wstępnie schłodzone autoklawizowane kolby lub zlewki i przechowywać podwielokrotność osadu do celów procedur analitycznych. Osad jest kolorowy, jeśli EV są rekombinowane dla mCherry i brązowy, jeśli są typu dzikiego lub rekombinowane dla białek niefluorescencyjnych.Przefiltrować supernatant hodowli przez filtr utylizacji 0,45 mikrona, a następnie przefiltrować przez filtr 0,22 mikrona, aby usunąć wszelkie ślady bakterii. Następnie umyj wstępnie 30-kilodaltonowe koncentratory membranowe 15 mililitrami podwójnie destylowanej wody o sile 4 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj 15 mililitrami wstępnie przefiltrowanych zimnych pożywek Sautons w tych samych warunkach, aby usunąć wszelkie ślady chemikaliów.Po umyciu dodać 15 mililitrów przefiltrowanego supernatantu z kultur fermentowanych do koncentratora i zagęszczać w 4 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś koncentrat do zimnej 40-mililitrowej probówki wirówkowej Oak Ridge lub 50-mililitrowej świeżej probówki wirówkowej Falcon. Po zagęszczeniu całych dwóch litrów filtratu hodowlanego przenieś koncentrat do podwójnie destylowanej, umytej i wstępnie schłodzonej 50-mililitrowej probówki wirówkowej z polipropylenu i poddaj dwuetapowemu wirowaniu.Najpierw w 4 000 G, a następnie w 15 000 G. Przenieś odwirowany koncentrat do wstępnie schłodzonej 38,5-mililitrowej probówki ultrawirówki i wiruj z prędkością 100 000 G przez cztery godziny w czterech stopniach Celsjusza. Zebrać supernatant we wstępnie schłodzonej 50-mililitrowej świeżej probówce wirówkowej Falcon. odwrócić probówkę ultrawirówki na świeżym, niestrzępiącym się bibułze chłonnym, aby usunąć ślady supernatantu i ponownie zawiesić osad w 600 mikrolitrach buforu HEPES.Ułóż zawieszony osad na dnie 13-mililitrowej, wstępnie schłodzonej probówki ultrawirówki z polipropylenu UltraClear i delikatnie wymieszaj z czterema mililitrami obojętnego roztworu jodiodksanolu o gradiencie gęstości 60%. Następnie nałóż po jednym mililitrze 40%30%20% i 10%jodiksanolu. Napełnij tubkę, dodając cztery mililitry 6% jodiksanolu na górze.Po dokładnym zważeniu probówki w szklanej zlewce lub stojaku, delikatnie przenieś ją do wahadłowych wiader, a następnie do wahadłowego wirnika kubełkowego w celu ultrawirowania w temperaturze 141 000 G przez 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po ultraodwirowaniu ostrożnie wyjmij probówkę i zbierz frakcję jednego mililitra do autoklawowanych probówek mikrowirówek. Analiza TEM wykazała, że mykobakteryjne pojazdy elektryczne są okrągłe, a analiza nanośledzenia potwierdziła różne rozmiary pojazdów elektrycznych o średnicach od 20 do 250 nanometrów.Kiedy N-końcowy koniec mCherry został translacyjnie połączony z C-końcowym końcem CFP-29, część wzbogaconych mEV Msm zmieniła kolor na różowy, co wskazuje na zdolność cf-29 do przenoszenia obcego białka będącego przedmiotem zainteresowania. CFP-29 został następnie wykorzystany do oceny dostarczania EsxA do pojazdów elektrycznych Msm. EsxA Mtb zaobserwowano w pojazdach elektrycznych Msm w małych ilościach.CFP-29 EsxA 3X FLAG był bardziej stabilny i akumulował się na wyższych poziomach w mEV. Wzbogacenie EV z prątków hodowanych w różnych warunkach fizjologicznych zapewnia wgląd w ich zmienioną zawartość i zmodyfikowane funkcje, które dyktują trwałą zakaźność, patogenezę i rozprzestrzenianie się patogenów.

enrichment-native-recombinant-extracellular-vesicles

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki z ograniczoną ilością żelaza. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje stopniową izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Mycobacterium tuberculosis hodowanych w warunkach ograniczających żelazo, które naśladują środowisko gospodarza. Przedstawiono w nim zastosowanie ultrafiltracji, wirowania różnicowego i separacji gradientu gęstości w celu wzbogacenia i...

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zawierających syderofory z Mycobacterium tuberculosis

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Ten film demonstruje izolację i koncentrację białek filtratu kultur bakteryjnych, w tym pęcherzyków zewnątrzkomórkowych bakterii, przy użyciu ultrafiltracji. Skoncentrowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe służą jako markery diagnostyczne do wykrywania choroby.

Zagęszczenie białka filtratu kultur bakteryjnych za pomocą urządzenia do ultrafiltracji

Ten film demonstruje technikę chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) do oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu hodowlanego Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Technika ta wykorzystuje porowatą kolumnę wypełnioną żywicą w celu uzyskania oczyszczonych frakcji EV. Porowate cząsteczki selektywnie pozwalają mniejszym białkom wnikać do porów, co skutkuje wolniejszą elucją. Jednocześnie pojazdy elektryczne są wykluczone z wnikania do porów ze względu na ich większy...

Technika chromatografii wykluczającej wielkość do oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Prezentowana jest nowatorska technika szybkiego wyświetlania antygenu na powierzchni bakteryjnej, która polega na powierzchniowej biotynylacji, a następnie ekspozycji na interesujące białka podczas fuzji z monomeryczną awidyną. Ładowanie BCG wybranymi antygenami skutecznie poprawia jego immunogenność, co sugeruje, że dekoracja powierzchni może zastąpić tradycyjne podejścia genetyczne.

Ekspresja antygenów egzogennych w szczepionce BCG przeciwko Mycobacterium bovis poprzez niegenetyczne zdobienie powierzchni za pomocą systemu Avidin-biotyna

Mycobacterium tuberculosis wykazuje zwiększoną produkcję i uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w odpowiedzi na warunki niskiego poziomu żelaza. Praca ta szczegółowo opisuje protokół generowania warunków o niskiej zawartości żelaza oraz metody oczyszczania i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków uwalnianych w odpowiedzi na niedobór żelaza.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez prątki o ograniczonej zawartości żelaza

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Ten protokół opisuje chromatografię wykluczania rozmiaru, łatwą i powtarzalną technikę wzbogacania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Mycobacterium tuberculosis z supernatantów hodowli.

Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości

Obecny protokół opisuje szczegółową metodę produkcji przez bakterie białek rekombinowanych, w tym zazwyczaj nierozpuszczalnych lub zawierających wiązania dwusiarczkowe, upakowanych wewnątrz pęcherzyków związanych z błoną zewnątrzkomórkową. Ma to potencjał do zastosowania w różnych obszarach badań naukowych, w tym w biotechnologii stosowanej i medycynie.

Zoptymalizowana produkcja i analiza rekombinowanych pęcherzyków wypełnionych białkiem E. coli

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

Poznaj metodę wzbogacania natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Mycobacterium smegmatis. Technika ta umożliwia analizę zawartości mEVs oraz projektowanie kandydatów na szczepionki z wykorzystaniem białka EsxA.

Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Przeglądaj więcej filmów