Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Wzbogacanie mykobakteryjnych EV pomaga określić ich zawartość, rozszyfrować ich frakcje i daty, projektując sposoby konstruowania i generowania rekombinowanych EV, które wykorzystują głównie kandydatów na szczepionki. Sześć serii generuje się z różnych miejsc powierzchni bakteryjnej. Nie mają zachowanych znaczników.

W związku z tym wszelkie podejścia oparte na powinowactwie mogą wzbogacić tylko podzbiór pojazdów elektrycznych. W przeciwieństwie do tego, nasza metoda wychwytuje wszystkie wygenerowane EV prątków. Procedurę zademonstruje Mohd Ilyas, doktorant z mojego laboratorium.

Na początek dodaj jeden mililitr glicerolu Mycobacterium smegmatis typu dzikiego lub rekombinowanego do 50-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 10 mililitrów wstępnie podgrzanego bulionu 7H9. Zamknij pokrywkę i zakręć probówką przed inkubacją kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w zakresie od 200 do 220 obr./min. Następnego dnia, gdy gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie około jednego, odwirować kulturę o sile 3,200 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant do płynnego pojemnika na odpady.

Dodaj jeden mililitr wstępnie podgrzanego podłoża Sautons i delikatnie zawieś ponownie, aby uzyskać jednolitą zawiesinę. Uzupełnić objętość do 10 mililitrów za pomocą pożywki Sauton. Ponownie odwirować i wyrzucić supernatant.

Po umyciu ponownie zawieś komórki bakteryjne w 20 mililitrach wstępnie podgrzanego podłoża Sautons i zmierz gęstość optyczną na 600 nanometrach. Zaszczepić wymaganą objętość zawiesiny bakteryjnej w jedno- lub dwulitrowej kolbie Erlenmeyera zawierającej 330 mililitrów pożywki Sauton i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 200 obr./min, aż gęstość optyczna osiągnie 0,3.

Następnego dnia umyj komórki raz, jak wykazano wcześniej, i ponownie zawieś osad w 330 mililitrach Saautonów zawierających 1/10 Tween 80. Rozprowadź 50 mililitrów zawiesiny komórek do sześciu jednolitrowych kolb, z których każda zawiera 280 mililitrów wstępnie podgrzanych Sautonów zawierających 1/10 Tween 80. Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 200 obr./min, aż gęstość optyczna osiągnie od dwóch do 2,5.

Dodaj dwa litry kultur w średnim etapie wykładniczym do sześciu 400-mililitrowych butelek i odwiruj przy 8 000 G przez 20 minut w czterech stopniach Celsjusza. Zebrać supernatant i wstępnie schłodzone autoklawizowane kolby lub zlewki i przechowywać podwielokrotność osadu do celów procedur analitycznych. Osad jest kolorowy, jeśli EV są rekombinowane dla mCherry i brązowy, jeśli są typu dzikiego lub rekombinowane dla białek niefluorescencyjnych.

Przefiltrować supernatant hodowli przez filtr utylizacji 0,45 mikrona, a następnie przefiltrować przez filtr 0,22 mikrona, aby usunąć wszelkie ślady bakterii. Następnie umyj wstępnie 30-kilodaltonowe koncentratory membranowe 15 mililitrami podwójnie destylowanej wody o sile 4 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie umyj 15 mililitrami wstępnie przefiltrowanych zimnych pożywek Sautons w tych samych warunkach, aby usunąć wszelkie ślady chemikaliów.

Po umyciu dodać 15 mililitrów przefiltrowanego supernatantu z kultur fermentowanych do koncentratora i zagęszczać w 4 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś koncentrat do zimnej 40-mililitrowej probówki wirówkowej Oak Ridge lub 50-mililitrowej świeżej probówki wirówkowej Falcon. Po zagęszczeniu całych dwóch litrów filtratu hodowlanego przenieś koncentrat do podwójnie destylowanej, umytej i wstępnie schłodzonej 50-mililitrowej probówki wirówkowej z polipropylenu i poddaj dwuetapowemu wirowaniu.

Najpierw w 4 000 G, a następnie w 15 000 G. Przenieś odwirowany koncentrat do wstępnie schłodzonej 38,5-mililitrowej probówki ultrawirówki i wiruj z prędkością 100 000 G przez cztery godziny w czterech stopniach Celsjusza. Zebrać supernatant we wstępnie schłodzonej 50-mililitrowej świeżej probówce wirówkowej Falcon. odwrócić probówkę ultrawirówki na świeżym, niestrzępiącym się bibułze chłonnym, aby usunąć ślady supernatantu i ponownie zawiesić osad w 600 mikrolitrach buforu HEPES.

Ułóż zawieszony osad na dnie 13-mililitrowej, wstępnie schłodzonej probówki ultrawirówki z polipropylenu UltraClear i delikatnie wymieszaj z czterema mililitrami obojętnego roztworu jodiodksanolu o gradiencie gęstości 60%. Następnie nałóż po jednym mililitrze 40%30%20% i 10%jodiksanolu. Napełnij tubkę, dodając cztery mililitry 6% jodiksanolu na górze.

Po dokładnym zważeniu probówki w szklanej zlewce lub stojaku, delikatnie przenieś ją do wahadłowych wiader, a następnie do wahadłowego wirnika kubełkowego w celu ultrawirowania w temperaturze 141 000 G przez 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po ultraodwirowaniu ostrożnie wyjmij probówkę i zbierz frakcję jednego mililitra do autoklawowanych probówek mikrowirówek. Analiza TEM wykazała, że mykobakteryjne pojazdy elektryczne są okrągłe, a analiza nanośledzenia potwierdziła różne rozmiary pojazdów elektrycznych o średnicach od 20 do 250 nanometrów.

Kiedy N-końcowy koniec mCherry został translacyjnie połączony z C-końcowym końcem CFP-29, część wzbogaconych mEV Msm zmieniła kolor na różowy, co wskazuje na zdolność cf-29 do przenoszenia obcego białka będącego przedmiotem zainteresowania. CFP-29 został następnie wykorzystany do oceny dostarczania EsxA do pojazdów elektrycznych Msm. EsxA Mtb zaobserwowano w pojazdach elektrycznych Msm w małych ilościach.

CFP-29 EsxA 3X FLAG był bardziej stabilny i akumulował się na wyższych poziomach w mEV. Wzbogacenie EV z prątków hodowanych w różnych warunkach fizjologicznych zapewnia wgląd w ich zmienioną zawartość i zmodyfikowane funkcje, które dyktują trwałą zakaźność, patogenezę i rozprzestrzenianie się patogenów.