Poprawa liczenia zarodników Bacillus subtilis i analizy znaczników w cytometrii przepływowej
30 czerwca 2023
Ten protokół skupia się na wykorzystaniu cytometrii przepływowej i liczenia koralików do ilościowego oznaczania zarodników bakterii znakowanych bromkiem etydyny. Metoda ta jest również skuteczna w analizie kowalencyjnego sprzężenia białek na powierzchni nienaruszonych zarodników.
Liczenie komórek zarodników Bacillus subtilis przy użyciu tradycyjnych metod może być pracochłonnym zadaniem, ponieważ metody te mogą być całkowicie ręczne, a ich dokładność zależy od doświadczenia operatora. Protokół ten umożliwia liczenie uśpionych i kiełkujących zarodników. Ponadto technika ta umożliwia również określenie procentowego stopnia radzenia sobie białek fluorescencyjnych na jej powierzchni.
Biorąc pod uwagę etap konfiguracji obecny w tym protokole, wizja demonstruje się z udogodnieniami i zrozumieniem technicznym oraz szczegółami opieki w tym wykonaniu. Zacznij od zalogowania się do oprogramowania cytometru. W obszarze roboczym oprogramowania wybierz Cytometr, a następnie Uruchamianie fluidyczne.
Następnie wybierz Tryby czyszczenia. I na koniec zainicjuj SIT Flush. Weź 50 mikrolitrów zarodników autoklawu i inkubuj je z bromkiem etydyny o współczynniku rozcieńczenia 0,05% objętości przez 30 minut, chroniąc przed światłem.
Przemyć zarodniki trzykrotnie PBS, odwirowując przy 17 949 G przez 10 minut i ponownie zawieszając w PBS. Następnie dodaj 10 mikrolitrów kulek zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi rozcieńczania i przeanalizuj próbkę za pomocą cytometru przepływowego. Zdefiniować strategię bramkowania w oparciu o charakterystyki morfometryczne i fluorescencyjne cząstek, wykorzystując kontrolę ujemną jako punkt odniesienia.
Następnie delikatnie wymieszaj tubkę. Podłącz go do sondy cytometru przepływowego i kliknij przycisk Pobierz. Aby ustawić moc lasera należy przejść do zakładki parametry w oknie cytometru, dostosować rozproszenie do przodu na 375 i rozproszenie boczne na 275.
Następnie wybierz zakładkę próg i ustaw ją na 500. Następnie przeanalizuj bezbarwną próbkę zawierającą tylko zarodniki, aby wyeliminować autofluorescencję. W zakładce parametrów dostosuj napięcia detektora filtra trzeciego na 603 i napięcia detektora filtra piątego na 538, aby rozróżnić populacje ujemne i dodatnie za pomocą fluorescencji w kontrolach.
Następnie kliknij Kompensacja i ustaw przesunięcie ustawień detektora filtra 5 na 3 na jeden. Aby skonfigurować urządzenie do pozyskiwania, wybierz pozycję Eksperyment, wybierz układ eksperymentu i ustaw pozyskiwanie na 30 000 zdarzeń. Po dostosowaniu parametrów należy pozyskać dane dla próbek, które są oznaczone i zawierają kulki w cytometrze przepływowym.
Odwirować 50 mikrolitrów zarodników przy 17 949 G przez 10 minut. Następnie ponownie zawiesić zarodniki za pomocą 25 mikrolitrów 1-etylo-3-3-dimetyloaminopropylokarbodimidu i inkubować przez 15 minut. Następnie dodać 25 mikrolitrów N-hydroksysulfosukcynimidu o stężeniu 50 milimolów do zawiesiny zarodników.
Inkubować zawiesinę zarodników w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Umyj zarodniki trzykrotnie PBS, odwirowując, jak pokazano wcześniej. Dodać białko fluorescencyjne do próbek i inkubować przez noc w temperaturze 15 stopni Celsjusza.
Dodać 10 miligramów na mililitr bromku etydyny rozcieńczonego w stosunku 1 do 50, a następnie pozostawić próbki na lodzie na godzinę, chroniąc przed światłem. Po umyciu zarodników i zdefiniowaniu bramek, jak pokazano wcześniej, zmień parametry dla detektora filtrującego trzy na osi x i detektora filtrującego pięć na osi Y wykresu punktowego. Metoda liczenia kulek wykryła dwa razy od 10 do trzeciej zarodników na mikrolitr w próbkach zarodników w autoklawie.
Barwienie bromkiem etydyny próbek zarodników autoklawu wykazało wyższą średnią intensywność fluorescencji niż barwienie zarodników nieautoklawowanych, co wskazuje na większe zabarwienie materiału genetycznego. Powierzchnia zarodników autoklawu, w połączeniu z przeciwciałem anty-ludzkiej interleukiny 10 znakowanym APC, wykazała większą skuteczność sprzężenia w porównaniu z zarodnikami nieautoklawizowanymi. Obecność zarodników przepuszczalnych dla bromku etydyny wskazywała na możliwą obecność kiełkujących zarodników w całej populacji.
Na podstawie analiz cytometrii przepływowej zaobserwowano, że przeciwciało fluorescencyjne wykazywało wyższy procent sprzęgania z uśpionymi zarodnikami w porównaniu z przeciwciałami kiełkującymi. Ponadto wraz ze wzrostem stężenia przeciwciał fluorescencyjnych zaobserwowano wzrost odsetka sprzężonych zarodników i średniej intensywności fluorescencji. Ważne jest, aby przeprowadzić dokładną homogenizację obecnych kulek, aby zapewnić precyzyjne odczyty za pomocą cytometrii przepływowej i dokładne wyliczenie zarodników.
Standaryzacja stężenia antygenów przyłączonych do zarodników, kanadyjskie badania analizują zastosowanie zarodników jako przeciwciał szczepionkowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół koncentruje się na użyciu cytometrii przepływowej i liczenia kul do ilościowego określenia bakterii zaznaczonych bromkiem etydyny. Umożliwia wydajną analizę kowalencyjnego łączenia białek na powierzchniach nienaruszonych zarodników.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Mikrobiologia
- Cytometria przepływowa
- Techniki liczenia komórek
Tło
- Tradycyjne metody liczenia zarodników Bacillus subtilis są pracochłonne.
- Dokładność ręcznego liczenia zależy od doświadczenia operatora.
- Ten protokół pozwala na liczenie zarodników w stanie spoczynku i kiełkujących.
- Ocena procentowej zawartości fluorescencyjnych białek na powierzchniach zarodników.
Cel badania
- Aby usprawnić liczenie zarodników bakteryjnych.
- Aby poprawić dokładność liczenia zarodników.
- Aby analizować łączenie białek na zarodnikach za pomocą cytometrii przepływowej.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa do liczenia zarodników.
- Zastosowanie bromku etydyny do zaznaczania zarodników.
- Konfiguracja oprogramowania do obsługi cytometru.
- Analiza łączenia fluorescencyjnych białek na powierzchniach zarodników.
Główne wyniki
- Osiągnięto wydajne liczenie zarodników Bacillus subtilis.
- Dokładna ocena zarodników w stanie spoczynku i kiełkujących.
- Sukces w określeniu procentowej zawartości białek.
- Protokół wykazuje łatwość użycia i zrozumienie techniczne.
Konkluzje
- Ten protokół zwiększa efektywność liczenia zarodników.
- Daje niezawodną metodę analizy interakcji białek.
- Cytometria przepływowa jest cennym narzędziem w badaniach mikrobiologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate enumeration and surface labeling analysis of Bacillus subtilis spores are critical for biotechnological applications where quantification and antigen display efficiency impact downstream R&D. Flow cytometry-based workflows, leveraging DNA and surface markers, enable standardized, operator-independent spore quantification and facilitate robust assessment of protein coupling. These capabilities support translational research and platform development for spore-based delivery systems and immunological studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative assessment of antigen display on spore surfaces for target validation studies.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing dormant from germinated spores via DNA labeling.
- Facilitates predictive confidence in spore-based platform development through reproducible enumeration.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-throughput quantification of labeled spores for assay development.
- Improves reproducibility and scalability of spore-based screening assays using counting beads.
- Enables reliable evaluation of coupling efficiency for surface-displayed proteins.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spore quantification with translational biomarker strategies for vaccine and delivery platform studies.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling precise measurement of spore populations and surface modifications.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models using robust, quantitative readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry-based method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing quantitative, reproducible spore enumeration and surface marker analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antigen display and spore viability through dual labeling strategies.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized quantification for downstream compound or antigen screening.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence and bead-based readouts for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with biomarker and platform development objectives in vaccine and delivery research.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for spore-based quantification and surface analysis across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in spore-based applications.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of spore enumeration and labeling workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of spore-based platforms and translational studies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry operation and gating strategy definition.
- Needs access to cytometry instrumentation and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of labeling protocols and bead handling for reproducibility.
- May require adaptation for different spore types or surface markers based on application.
- Dependent on thorough homogenization and control setup to ensure accurate quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:44
Flow Cytometry Setting and Preparation of Autoclaved Spores for Flow Cytometry
1:47
Analysis Using Flow Cytometry
3:27
Estimation of the Protein Coupling Index on a Spore Surface Using Flow Cytometry
4:52
Results: Fluorescence Coupling Percentage Analysis of Bacillus subtilis Spores
6:08
Conclusion
