Szeregowy zestaw anestezjologiczny do wysokoprzepustowego badania czynników lotnych z użyciem Drosophila melanogaster
February 24th, 2023
Muszka owocowa (Drosophila melanogaster) jest szeroko stosowana do badań biologicznych i toksykologicznych. Aby zwiększyć użyteczność much, opracowaliśmy instrument, seryjną matrycę anestezjologiczną, która jednocześnie wystawia wiele próbek much na działanie lotnych środków znieczulających ogólnie (VGA), umożliwiając zbadanie skutków ubocznych (toksycznych i ochronnych) VGA.
SAA umożliwia przetwarzanie o wysokiej przepustowości w celu zbadania farmakologii czynników lotnych w modelowych organizmach bezkręgowców, które są wyposażone w wyrafinowany mózg i szeroki repertuar zachowań. W połączeniu z zestawem narzędzi genetycznych dostępnych w Drosophila melanogaster, technika ta pozwala na szybkie i niedrogie badanie farmakogenetyki czynników lotnych. Wiele osób jest narażonych na działanie czynników lotnych jako zanieczyszczeń lub środków terapeutycznych.
Oprócz znieczulenia, lotne środki znieczulające mają liczne toksyczne i korzystne działanie uboczne. Stopień efektu jest częściowo zdeterminowany przez genetykę, która pozostała w dużej mierze niezbadana. Po wykonaniu drewnianej ramy zmodyfikuj 50-mililitrowe nasadki rurki kronikowej, wiercąc dwa otwory w każdej nasadce wiertłem 9/32 cala.
Przeszlifuj otwory, aby oczyścić postrzępiony plastik. Przeszlifuj również górną część nasadki, aby zmatowić powierzchnię. Następnie przytnij pięć mililitrowych pipet serologicznych na wymiar, nacinając plastik i rozbijając go do czysta na linii nacięcia.
Przeszlifuj końce przeciętych lub złamanych pipet. Następnie przyklej siatkę do tub i przytnij siatkę do rozmiaru tubki po wyschnięciu kleju. Włóż rurki do otworów stożkowych nasadek tak, aby obie rurki wystawały ponad nasadkę.
Upewnij się, że rura dopływowa sięga dłużej w głąb rurki niż odpływ. Nałóż klej na górne części nakrętek wokół rurek, aby zabezpieczyć części razem i pozostawić je do wyschnięcia. Przymocuj samoprzylepne opaski kablowe do ramy.
Przymocuj zaślepki do ramy za pomocą opasek zaciskowych i odetnij końcówki zawieszki na suwak. Przetnij i połącz rurkę tygon z rurkami dopływowymi i odpływowymi na każdej zmodyfikowanej nasadce. Zaczynając od górnego końca, przymocuj rurkę najpierw do dopływu, a następnie od odpływu do dopływu kolejnej pozycji.
Następnie dodaj wskaźnik przepływu do najbardziej znajdującego się za dopływem. Umieść stożkową rurkę o pojemności 50 mililitrów w pierwszej pozycji i zaznacz znak napełnienia wodą. Wyjmij rurkę.
Napełnij go wodą poniżej rurki dopływowej i umieść z powrotem na miejscu. Przygotuj interfejs dla waporyzatora. Wyjmij tłoki, wytnij nacięcia w dwóch 10-mililitrowych strzykawkach dozujących i włóż je do wlotu i odpływu waporyzatora tak, aby nacięcia były skierowane bezpośrednio w stronę przodu waporyzatora, aby wyrównać się z otworami.
Podłącz cały system. Użyj rurki tygonowej, aby przymocować zbiornik gazu nośnego z reduktorem, przepływomierzem specyficznym dla gazu, parownikiem i SAA. Wypełnij puste miejsca na tablicy pustymi 50-mililitrowymi probówkami kronikarskimi.
Teraz włącz zbiornik paliwa. Otwórz przepływomierz do dwóch litrów na minutę i włącz parownik na 0%Potwierdź przepływ gazu przez system, sprawdzając przepływomierz przed parownikiem i wskaźnik przepływu za ostatnią komorą SAA pod kątem przepływu. Alternatywnie włóż dolną końcówkę rurki do wody i poszukaj pęcherzyków.
Na 24 godziny lub więcej przed ekspozycją na środek znieczulający, należy posortować kohorty much zgodnie z potrzebami do eksperymentu, stosując preferowaną metodę. Przenieś muchy z fiolek z jedzeniem do pustych 50-mililitrowych stożkowych probówek. Policz i zapisz wszelkie martwe muchy przed ekspozycją.
Odkręć i przykręć 50-mililitrowe stożkowe rurki z muchami do SAA. Włącz gaz nośny i ustaw go na żądane natężenie przepływu. Ustaw waporyzator znieczulający na żądane stężenie i wystaw muchy na żądany czas.
Pod koniec ekspozycji należy przepłukać system strumieniem świeżego gazu z prędkością 1,5 litra na minutę przez pięć minut, co odpowiada około 10-krotności objętości całkowitej objętości SAA. Całkowicie otwórz reduktor wysokiego ciśnienia, a następnie zamknij go o pół obrotu, aby zapewnić przepływ gazu nośnego. Postępuj zgodnie z rurkami dla każdej linii do przepływomierzy i parownika i sprawdź poziom środka znieczulającego w parownikach.
Upewnij się, że gdy gaz przepływa, wskazuje przepływ na przepływomierzu i na wskaźniku przepływu za przepływem. Pod koniec eksperymentu odczekaj od czterech do pięciu minut przepływu powietrza, aby wypłukać środek znieczulający. Siedem linii wyizolowanych z jednej populacji poprzez spotkania pojedynczej pary wykazało zmienność śmiertelności wywołanej toksycznością izofluoru z powodu presji ewolucyjnej u much ND23 60114.
Wstępne kondycjonowanie much za pomocą 15 minut 2% fluoru ISO przed urazowym uszkodzeniem mózgu zmniejszyło wskaźnik śmiertelności po 24 godzinach w białych szczepach 1118 i żółto-białych. Wskaźnik śmiertelności po 24 godzinach nie był znacząco niższy w wstępnie przygotowanych liniach Oregon R i Canton S. Podczas montażu nacięcia w zmodyfikowanych strzykawkach muszą pokrywać się z otworami w portach parownika.
Podczas ekspozycji należy okresowo sprawdzać, czy przez system przepływa. Procedura ta może być stosowana w przypadku szerokiej gamy badań behawioralnych, przeżycia i molekularnych, które mogą prowadzić do wglądu w farmakologię czynników lotnych.
Przegląd
Serowa macierz anestetyczna (SAA) to nowatorskie urządzenie zaprojektowane do wysokoprzepustowego przetwarzania *Drosophila melanogaster* w celu badania farmakologii lotnych anestetyków ogólnych (LZO). Ta metoda pozwala badaczom badać zarówno toksyczne, jak i ochronne efekty LZO na muchach owocowych, wykorzystując ich różnorodność genetyczną.
Kluczowe elementy badania
Dział obszaru nauki
- Neurobiologia
- Farmakologia
- Toksykologia
Wprowadzenie
- *Drosophila melanogaster* jest szeroko stosowanym organizmem modelowym w badaniach biologicznych.
- LZO mają różne efekty uboczne, na które wpływają geny.
- SAA ułatwia jednoczesną ekspozycję wielu próbek na LZO.
- Zrozumienie efektów LZO może pomóc w określeniu ich implikacji terapeutycznych i toksykologicznych.
Cel badania
- Opracowanie metody badania LZO u much owocowych w skali wysokoprzepustowej.
- Zbadanie podstaw genetycznych odpowiedzi na LZO.
- Ocena zarówno toksycznych, jak i ochronnych efektów LZO na *Drosophila*.
Wykorzystane metody
- Konstrukcja SAA z wykorzystaniem zmodyfikowanych zakrętek pojemników o pojemności 50 mililitrów typu chronicle i pipet serologicznych.
- Konfiguracja systemu przepływu gazów w celu dostarczania LZO do próbek much.
- Ekspozycja *Drosophila* na LZO w kontrolowanych warunkach.
- Monitorowanie śmiertelności much i reakcji behawioralnych po ekspozycji.
Główne wyniki
- Zaobserwowano zmienność w śmiertelności wywołanej toksycznością izofluranu między różnymi liniami much.
- Wstępne warunkowanie izofluranem zmniejszało śmiertelność w niektórych szczepach.
- Metoda SAA umożliwia wydajne i powtarzalne testowanie LZO.
- Uzyskane spostrzeżenia mogą prowadzić do lepszego zrozumienia farmakologii lotnych substancji.
Wnioski
- SAA jest skutecznym narzędziem do badania efektów LZO u *Drosophila*.
- Czynniki genetyczne odgrywają znaczącą rolę w odpowiedzi na LZO.
- Badania te mogą mieć implikacje dla zrozumienia efektów LZO w szerszych kontekstach biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The Serial Anesthesia Array (SAA) enables high-throughput, quantitative investigation of volatile general anesthetics (VGAs) in Drosophila, supporting rapid pharmacogenetic and mechanistic de-risking in early discovery. By allowing simultaneous, controlled exposure of multiple genotypes or biological variables, the SAA advances predictive confidence in target validation and portfolio triage for neuropharmacology and toxicology pipelines. This platform addresses the need for scalable, reproducible systems to interrogate genetic and environmental determinants of drug response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of genetic determinants influencing VGA response in a controlled in vivo system.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying pharmacodynamic and pharmacogenetic interactions across diverse fly models.
- Facilitates functional target validation through reproducible, parallelized exposure and outcome measurement.
- Improves predictive confidence for advancing neuroactive compound programs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, scalable biological systems for downstream compound screening and mechanistic studies.
- Standardizes exposure conditions and quantitative outputs across multiple cohorts and genotypes.
- Enables reproducible, high-throughput assessment of behavioral, survival, and molecular endpoints.
- Supports assay readiness for evaluating compound efficacy and toxicity in genetically tractable models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical model systems with disease-relevant genetic and environmental variables.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation of neuropharmacological hypotheses.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust, comparative data across genotypes and conditions.
- Supports translational biomarker exploration in neuroinflammation and injury models.
Pipeline & Workflow Integration
The SAA integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing and target validation through lead identification and preclinical model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of VGA effects and genetic modifiers in a scalable in vivo system.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs for cross-cohort comparison and compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical analysis of mortality, behavioral, and molecular endpoints to inform decision-making.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by modeling disease-relevant genetic and injury variables.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, modular platform adaptable to diverse pharmacological and genetic studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuroactive compound development.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput for pharmacogenetic and toxicological studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, comparative data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neuropharmacology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, behavioral assays, and pharmacology.
- Needs access to vaporizer instrumentation, gas flow control, and analytical infrastructure for quantitative readouts.
- Demands cross-team standardization of exposure protocols and data analysis workflows.
- Adaptable to various genotypes, biological variables, and experimental endpoints.
- Practical limitations include scalability to other model organisms and translation to mammalian systems.
