Szeregowy zestaw anestezjologiczny do wysokoprzepustowego badania czynników lotnych z użyciem Drosophila melanogaster

SAA umożliwia przetwarzanie o wysokiej przepustowości w celu zbadania farmakologii czynników lotnych w modelowych organizmach bezkręgowców, które są wyposażone w wyrafinowany mózg i szeroki repertuar zachowań. W połączeniu z zestawem narzędzi genetycznych dostępnych w Drosophila melanogaster, technika ta pozwala na szybkie i niedrogie badanie farmakogenetyki czynników lotnych. Wiele osób jest narażonych na działanie czynników lotnych jako zanieczyszczeń lub środków terapeutycznych.

Oprócz znieczulenia, lotne środki znieczulające mają liczne toksyczne i korzystne działanie uboczne. Stopień efektu jest częściowo zdeterminowany przez genetykę, która pozostała w dużej mierze niezbadana. Po wykonaniu drewnianej ramy zmodyfikuj 50-mililitrowe nasadki rurki kronikowej, wiercąc dwa otwory w każdej nasadce wiertłem 9/32 cala.

Przeszlifuj otwory, aby oczyścić postrzępiony plastik. Przeszlifuj również górną część nasadki, aby zmatowić powierzchnię. Następnie przytnij pięć mililitrowych pipet serologicznych na wymiar, nacinając plastik i rozbijając go do czysta na linii nacięcia.

Przeszlifuj końce przeciętych lub złamanych pipet. Następnie przyklej siatkę do tub i przytnij siatkę do rozmiaru tubki po wyschnięciu kleju. Włóż rurki do otworów stożkowych nasadek tak, aby obie rurki wystawały ponad nasadkę.

Upewnij się, że rura dopływowa sięga dłużej w głąb rurki niż odpływ. Nałóż klej na górne części nakrętek wokół rurek, aby zabezpieczyć części razem i pozostawić je do wyschnięcia. Przymocuj samoprzylepne opaski kablowe do ramy.

Przymocuj zaślepki do ramy za pomocą opasek zaciskowych i odetnij końcówki zawieszki na suwak. Przetnij i połącz rurkę tygon z rurkami dopływowymi i odpływowymi na każdej zmodyfikowanej nasadce. Zaczynając od górnego końca, przymocuj rurkę najpierw do dopływu, a następnie od odpływu do dopływu kolejnej pozycji.

Następnie dodaj wskaźnik przepływu do najbardziej znajdującego się za dopływem. Umieść stożkową rurkę o pojemności 50 mililitrów w pierwszej pozycji i zaznacz znak napełnienia wodą. Wyjmij rurkę.

Napełnij go wodą poniżej rurki dopływowej i umieść z powrotem na miejscu. Przygotuj interfejs dla waporyzatora. Wyjmij tłoki, wytnij nacięcia w dwóch 10-mililitrowych strzykawkach dozujących i włóż je do wlotu i odpływu waporyzatora tak, aby nacięcia były skierowane bezpośrednio w stronę przodu waporyzatora, aby wyrównać się z otworami.

Podłącz cały system. Użyj rurki tygonowej, aby przymocować zbiornik gazu nośnego z reduktorem, przepływomierzem specyficznym dla gazu, parownikiem i SAA. Wypełnij puste miejsca na tablicy pustymi 50-mililitrowymi probówkami kronikarskimi.

Teraz włącz zbiornik paliwa. Otwórz przepływomierz do dwóch litrów na minutę i włącz parownik na 0%Potwierdź przepływ gazu przez system, sprawdzając przepływomierz przed parownikiem i wskaźnik przepływu za ostatnią komorą SAA pod kątem przepływu. Alternatywnie włóż dolną końcówkę rurki do wody i poszukaj pęcherzyków.

Na 24 godziny lub więcej przed ekspozycją na środek znieczulający, należy posortować kohorty much zgodnie z potrzebami do eksperymentu, stosując preferowaną metodę. Przenieś muchy z fiolek z jedzeniem do pustych 50-mililitrowych stożkowych probówek. Policz i zapisz wszelkie martwe muchy przed ekspozycją.

Odkręć i przykręć 50-mililitrowe stożkowe rurki z muchami do SAA. Włącz gaz nośny i ustaw go na żądane natężenie przepływu. Ustaw waporyzator znieczulający na żądane stężenie i wystaw muchy na żądany czas.

Pod koniec ekspozycji należy przepłukać system strumieniem świeżego gazu z prędkością 1,5 litra na minutę przez pięć minut, co odpowiada około 10-krotności objętości całkowitej objętości SAA. Całkowicie otwórz reduktor wysokiego ciśnienia, a następnie zamknij go o pół obrotu, aby zapewnić przepływ gazu nośnego. Postępuj zgodnie z rurkami dla każdej linii do przepływomierzy i parownika i sprawdź poziom środka znieczulającego w parownikach.

Upewnij się, że gdy gaz przepływa, wskazuje przepływ na przepływomierzu i na wskaźniku przepływu za przepływem. Pod koniec eksperymentu odczekaj od czterech do pięciu minut przepływu powietrza, aby wypłukać środek znieczulający. Siedem linii wyizolowanych z jednej populacji poprzez spotkania pojedynczej pary wykazało zmienność śmiertelności wywołanej toksycznością izofluoru z powodu presji ewolucyjnej u much ND23 60114.

Wstępne kondycjonowanie much za pomocą 15 minut 2% fluoru ISO przed urazowym uszkodzeniem mózgu zmniejszyło wskaźnik śmiertelności po 24 godzinach w białych szczepach 1118 i żółto-białych. Wskaźnik śmiertelności po 24 godzinach nie był znacząco niższy w wstępnie przygotowanych liniach Oregon R i Canton S. Podczas montażu nacięcia w zmodyfikowanych strzykawkach muszą pokrywać się z otworami w portach parownika.

Podczas ekspozycji należy okresowo sprawdzać, czy przez system przepływa. Procedura ta może być stosowana w przypadku szerokiej gamy badań behawioralnych, przeżycia i molekularnych, które mogą prowadzić do wglądu w farmakologię czynników lotnych.