Wytwarzanie pulsacyjnych mikrocząstek polimerowych zamykających antygen wścieklizny

Znaczenie tego podejścia polega na tym, że może ono być stosowane do podawania wielu dawek szczepionek w jednym wstrzyknięciu, potencjalnie ratując miliony istnień ludzkich, szczególnie w krajach o niskich i średnich dochodach, gdzie noworodki nie są szczepione z powodu trudności w dostępie. Ta metoda wytwarzania pozwala szczepionce przeciwko wściekliźnie zachować swoją natywną formę nadającą odporność, gdy jest zamknięta w mikrocząsteczkach, których uwalnianie naśladuje obecne harmonogramy szczepień przy użyciu tylko jednego wstrzyknięcia. Wścieklizna jest chorobą śmiertelną, w niektórych przypadkach wymagającą do pięciu powtarzających się zastrzyków szczepionki, aby zapobiec śmierci.

Jednak podanie pełnego schematu szczepienia podczas jednej wizyty może poprawić przestrzeganie zaleceń lekarskich i uratować życie. Technika ta stanowi technologię platformową zdolną do dostarczania różnorodnych terapii lub profilaktyki różnych chorób. Na początek potraktuj wydrukowaną w 3D powierzchnię formy wzorcowej, umieszczając ją w komorze próżniowej zawierającej szklane szkiełko z 40 mikrolitrami trichlorosilanu na powierzchni.

Uruchom odkurzacz na godzinę. Wymieszaj bazę prepolimerową PDMS i utwardzacz w stosunku masowym 9:1 do plastikowego kubka. Następnie przenieś roztwór do 50-mililitrowej probówki i odwiruj 300 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu upewnij się, że roztwór jest klarowny. Po zakończeniu obróbki powierzchni umieść formę wzorcową w naczyniu z folii aluminiowej i wlej nieutwardzony PDMS na formę, upewniając się, że elementy są całkowicie zanurzone. Umieść naczynie z folii aluminiowej w komorze próżniowej i ciągnij próżnię przez godzinę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

Po wyjęciu naczynia z folii aluminiowej umieść przekładki o długości 800 mikrometrów na każdym końcu formy głównej i nałóż czysty szkiełko na formę główną, unikając pęcherzyków. Użyj spinaczy do segregatorów, aby zacisnąć formę na przekładkach o grubości 800 mikronów. Utwardź prepolimer w piekarniku w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez cztery godziny.

Po utwardzeniu ostrożnie zwolnij spinki do segregatora. Użyj żyletki, aby oddzielić formę wzorcową od utwardzonej formy PDMS. Aby przygotować folię PLGA, umieść 450 miligramów PLGA na nieprzywierającym arkuszu polimerowym w podkładce pierścieniowej.

Następnie nałóż drugi nieprzywierający arkusz polimeru na PLGA i użyj zacisku C o średnicy 101,6 milimetra, aby ścisnąć stos między dwoma aluminiowymi blokami, aż do dokręcenia palcami. Umieść zespół C-clamped w piecu próżniowym. Po 30 minutach w piekarniku dokręć zacisk i włóż go z powrotem na kolejne 30 minut.

Następnie przenieś zestaw do eksykatora na cztery godziny do ostygnięcia. Po schłodzeniu poluzuj zacisk, usuń folię PLGA z nieprzywierających arkuszy polimerowych i umieść ją na oznakowanej szalce Petriego. Przechowywać szalkę Petriego w eksykatorze do późniejszego wykorzystania.

Aby wygenerować cząstki PLGA, należy potraktować powierzchnię formy PDMS, jak pokazano wcześniej. Za pomocą pęsety lub skalpela przytnij folię PLGA o grubości 250 mikronów tak, aby była mniej więcej wielkości układu cząstek i umieść ją na poddanej obróbce formie PDMS. Nałóż czysty szklany szkiełko mikroskopowe na folię PLGA na wierzch formy PDMS i zabezpiecz je razem, umieszczając zacisk sprężynowy na matrycy i folii PLGA.

Trzymaj zaciśnięty zespół formy w piekarniku próżniowym przez godzinę, a następnie schładzaj go w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po schłodzeniu delikatnie przyłóż ciśnienie za pomocą żyletki, aby oddzielić formę PDMS od układu cząstek PLGA i przechowywać cząstki PLGA w eksykatorze do dalszego użycia. Aby wypełnić cząstki skoncentrowanym antygenem szczepionki przeciwko wściekliźnie, należy przygotować dozownik piezoelektryczny i umieścić szkiełko zawierające cząstki PLGA w obszarze dozowania.

Załaduj skoncentrowany antygen na płytkę, a następnie wprowadź docelowe parametry konfiguracji i kliknij Uruchom. Robot piezoelektryczny wypełni następnie cząstki. Po zakończeniu użyj stereoskopu, aby sprawdzić, czy cząstki zostały wypełnione.

Aby uszczelnić napełnioną cząstkę, umieść blok ze stali nierdzewnej na płycie grzejnej i dwa równoległe szkiełka mikroskopowe na bloku ze stali nierdzewnej. Po wypoziomowaniu bloku ze stali nierdzewnej włącz płytę grzejną i ustaw temperaturę na 205 stopni Celsjusza. Po osiągnięciu żądanej temperatury powierzchni stali nierdzewnej zawieś napełnione cząstki PLGA na dwóch szklanych szkiełkach i natychmiast uruchom timer na 18 sekund.

Po wyjęciu szczelnie zamkniętego zestawu cząstek z płyty grzejnej, zawieś go na dwóch szklanych szkiełkach na stole laboratoryjnym i schładzaj przez minutę. Aby zebrać uszczelnione cząstki, przytrzymaj ostrze skalpela pod kątem 45 stopni do szkiełka i dociśnij podstawę cząstek, aby oddzielić je od szkiełka. Za pomocą skalpela przenieś zebrane cząstki do 0,5-mililitrowej probówki o niskiej zawartości wiązania białka.

Dodać 250 mikrolitrów PBS zawierającego albuminę surowicy bydlęcej i glukozę, aby utrzymać stabilność szczepionki przeciwko wściekliźnie Umieść próbkę pod stereoskopem i zmiażdż cząstki za pomocą jednego bolca na pęsetę z cienką końcówką. Podczas napełniania cząstkami wymagany jest wystarczający czas schnięcia, aby całkowicie odparować rozpuszczalnik lub wodę. Po wysuszeniu na dnie rdzenia cząstki pozostaje magazyn substancji rozpuszczonej.

Idealną morfologię cząstek zaobserwowano między czasami pułapu wynoszącymi od 18 do 24 sekund dla tego PLGA, ponieważ cząstki zawierające ładunek były w tym czasie całkowicie uszczelnione bez utraty struktury cząstek. Cząstki były na tyle małe, że łatwo zmieściły się w igle o rozmiarze 19, gdy były odpowiednio zapakowane i uszczelnione. Co więcej, 10 cząstek przepływało konsekwentnie przez igłę o rozmiarze 19 podczas wstrzykiwania ich do lepkiego roztworu, takiego jak 2% karboksymetyloceluloza.

Transmisyjny mikrograf elektronowy wykazał nienaruszone warianty wścieklizny w skoncentrowanej próbce antygenu, które były około 4,4 razy bardziej skoncentrowane niż wyjściowy roztwór podstawowy. Po uszczelnieniu około 69% antygenu pozostaje zamknięte w swojej bioaktywnej formie, co sugeruje, że stres cieplny powoduje znaczne straty podczas uszczelniania, ale większość antygenu wirusowego pozostaje nienaruszona. Napełnianie mikrocząsteczkami jest jednym z najbardziej krytycznych etapów.

Jeśli cząstki nie są prawidłowo wypełnione, jest mało prawdopodobne, że cząstki prawidłowo się uszczelnią. Aby zrozumieć stabilność, konieczne byłoby opracowanie dodatkowej formuły, w tym substancji pomocniczych i innych biologicznie istotnych materiałów w rdzeniu cząstek.