Name: Wytwarzanie pulsacyjnych mikrocząstek polimerowych zamykających antygen wścieklizny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania pulsacyjnych mikrocząstek polimerowych zamykających antygen wścieklizny. Technika ta umożliwia podanie szczepionki wielodawkowej w jednej iniekcji, poprawiając przystępność szczepień w krajach o niskich dochodach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Chiron Behring i Bharat Biotech International za dostarczenie Cząstkom dla Ludzkości antygenu RABB. Chcielibyśmy również podziękować Charlesowi Rupprechtowi, VMD, MS, PhD., za jego nieocenione wskazówki i wkład techniczny. Autorzy pragną podziękować za hojność dr Rebecci Richards-Kortum za umożliwienie korzystania z jej pikolitrowego aparatu dozującego SciFLEXARRAYER S3 oraz instrukcję dr Chelsey Smith dotyczącą korzystania z urządzenia. Dziękujemy również Szkole Medycznej Uniwersytetu Massachusetts Chan za wygenerowanie obrazów mikroskopowych antygenu wścieklizny. Na koniec dziękujemy Donowi Chickeringowi i Erin Euliano za zapoznanie się z dokumentem przed jego złożeniem. Praca ta została wsparta grantem (INV-004360) z Fundacji Billa i Melindy Gatesów.

<ol><li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+the+health+impact+of+vaccination+against+ten+pathogens+in+98+low-income+and+middle-income+countries+from+2000+to+2030%3A+a+modelling+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Estimating the health impact of vaccination against ten pathogens in 98 low-income and middle-income countries from 2000 to 2030: a modelling study.</a> The Lancet. 397, 398-408 (2021).</li>
<li>Euliano, E. M., Sklavounos, A. A., Wheeler, A. R., McHugh, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+diagnostics+and+drug+delivery+technologies+to+low-resource+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translating diagnostics and drug delivery technologies to low-resource settings.</a> Science Translational Medicine. 14 (666), eabm1732(2022).</li>
<li>Haider, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies%3A+old+disease%2C+new+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Medical+Association+Journal%22%5BJournal%5D)">Rabies: old disease, new challenges.</a> Canadian Medical Association Journal. 178 (5), 562-563 (2008).</li>
<li>Fisher, C. R., Streicker, D. G., Schnell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spread+and+evolution+of+rabies+virus%3A+conquering+new+frontiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The spread and evolution of rabies virus: conquering new frontiers.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (4), 241-255 (2018).</li>
<li>Nagarajan, T., Rupprecht, C. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagarajan%2C+T+%22Rabies+and+Rabies+Vaccines%22">Rabies and Rabies Vaccines</a>. , Springer International Publishing. (2020).</li>
<li>Shi, T., Dunham, E. F., Nyland, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+vaccination+compliance+and+reasons+for+incompletion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Western+Journal+of+Emergency+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rabies vaccination compliance and reasons for incompletion.</a> The Western Journal of Emergency Medicine. 21 (4), 918-923 (2020).</li>
<li>Shankaraiah, R. H., Rajashekar, R. A., Veena, V., Hanumanthaiah, A. N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compliance+to+anti-rabies+vaccination+in+post-exposure+prophylaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Compliance to anti-rabies vaccination in post-exposure prophylaxis.</a> Indian Journal of Public Health. 59 (1), 58-60 (2015).</li>
<li>Cleland, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-administration+vaccines%3A+controlled-release+technology+to+mimic+repeated+immunizations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-administration vaccines: controlled-release technology to mimic repeated immunizations.</a> Trends in Biotechnology. 17 (1), 25-29 (1999).</li>
<li>Yeh, M. K., Coombes, A. G. A., Jenkins, P. G., Davis, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+emulsification-solvent+extraction+technique+for+production+of+protein+loaded+biodegradable+microparticles+for+vaccine+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">A novel emulsification-solvent extraction technique for production of protein loaded biodegradable microparticles for vaccine and drug delivery.</a> Journal of Controlled Release. 33 (3), 437-445 (1995).</li>
<li>Peyre, M., Sesardic, D., Merkle, H. P., Gander, B., Johansen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+divalent+vaccine+based+on+biodegradable+microspheres+induces+protective+immunity+against+tetanus+and+diphtheria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">An experimental divalent vaccine based on biodegradable microspheres induces protective immunity against tetanus and diphtheria.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 92 (5), 957-966 (2003).</li>
<li>Mvan de Weert, M., Hennink, W. E., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+instability+in+poly%28lactic-co-glycolic+acid%29+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Protein instability in poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles.</a> Pharmaceutical Research. 17 (10), 1159-1167 (2000).</li>
<li>Graf, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+platform+for+fabricating+biodegradable+microparticles+with+pulsatile+drug+release%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A scalable platform for fabricating biodegradable microparticles with pulsatile drug release.</a> Advanced Materials. , https://doi.org/10.1002/adma.202300228 e2300228 (2023).</li>
<li>Wang, Y., Qin, B., Xia, G., Choi, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FDA%27s+poly+%28lactic-co-glycolic+acid%29+research+program+and+regulatory+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Association+of+Pharmaceutical+Scientists+Journal%22%5BJournal%5D)">FDA's poly (lactic-co-glycolic acid) research program and regulatory outcomes.</a> The American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 23 (4), 92(2021).</li>
<li>Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+stabilizing+formulations+of+a+trivalent+inactivated+poliovirus+vaccine+in+a+dried+state+for+delivery+in+the+NanopatchTM+microprojection+array%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of stabilizing formulations of a trivalent inactivated poliovirus vaccine in a dried state for delivery in the NanopatchTM microprojection array.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 107 (6), 1540-1551 (2018).</li>
<li>Smith, T. G., Siirin, M., Wu, X., Hanlon, C. A., Bronshtein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+vaccine+preserved+by+vaporization+is+thermostable+and+immunogenic%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Rabies vaccine preserved by vaporization is thermostable and immunogenic.</a> Vaccine. 33 (19), 2203-2206 (2015).</li>
<li>McHugh, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+fillable+microparticles+and+other+complex+3D+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fabrication of fillable microparticles and other complex 3D microstructures.</a> Science. 357 (6356), 1138-1142 (2017).</li>
<li>Sanchez, M. E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+vaccine+characterization+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rabies vaccine characterization by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 8149(2020).</li>
<li>Fu, K., Pack, D. W., Klibanov, A. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+evidence+of+acidic+environment+within+degrading+poly%28lactic-co-glycolic+acid%29+%28PLGA%29+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Visual evidence of acidic environment within degrading poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres.</a> Pharmaceutical Research. 17 (1), 100-106 (2000).</li>
</ol>

Dr McHugh posiada patent złożony w oparciu o zawarte w nim prace, a obecnie jest konsultantem w Particles for Humanity. Pan Graf posiada patent złożony na podstawie opisanej pracy. Dr Kadasia, pan Yang i pani Brady są częścią Particles for Humanity, korporacji pożytku publicznego, która podczas tej pracy uzyskała licencję na podobną technologię dostarczania szczepionek mikrocząsteczkowych od MIT.

Możliwa jest zmiana geometrii cząstek w zależności od potrzeb; Jednak w przypadku konstrukcji cylindrycznych autorzy zalecają zachowanie stosunku 5:4:1 wysokości do średnicy:grubości ścianki opisanego w protokole. Ten współczynnik kształtu zapewnia, że obecna jest wystarczająca ilość materiału PLGA, aby uszczelnić cząstki i pozostać wystarczająco wytrzymałym mechanicznie do przenoszenia. Wymiary i kształty cząstek można łatwo zmieniać podczas procesu CAD, co umożliwia generowanie niezliczonych geometrii. Połączenie elastyczności CAD z drukiem 3D umożliwia szybką iterację projektów mikrocząstek. Chociaż protokół ten wykorzystuje wielofotonową drukarkę 3D, każda drukarka 3D o specyfikacji umożliwiającej wydrukowanie wymiarów mikrostruktury w odpowiednim materiale może być użyta do wygenerowania początkowej formy wzorcowej. Co więcej, fotolitografia była wcześniej wykorzystywana do tworzenia podobnych struktur w układach znacznie większych niż te wytworzone w tym protokole; Jednak nakład pracy, opóźnienia w zamawianiu niestandardowych fotomasek i dostępność sprzętu spowolniłyby iteracyjny proces projektowania16. Wreszcie, wytwarzanie form wzorcowych można zlecić firmom pobierającym opłaty za usługi, jeśli nie jest możliwe wyprodukowanie formy wzorcowej we własnym zakresie. Niezależnie od drukarki 3D lub metody użytej do wygenerowania form wzorcowych, przyczepność wydruku do podłoża ma kluczowe znaczenie dla dalszych etapów. W szczególności, jeśli przyczepność jest niewystarczająca podczas generowania formy PDMS, wydrukowane cząstki pozostaną w formie PDMS, co będzie wymagało ręcznego usunięcia wydrukowanych cząstek i zniszczenia formy wzorcowej.
Kolejnym krytycznym aspektem, który należy wziąć pod uwagę, jest wypełnianie cząstkami. Mikrocząstki mają ograniczoną zdolność napełniania, dlatego filtracja jest stosowana nie tylko w celu zagęszczenia antygenu RABB, ale także w celu usunięcia podstawowych substancji pomocniczych, które w przeciwnym razie zajęłyby dużą część objętości rdzenia mikrocząsteczki. Biorąc jednak pod uwagę duży rozmiar antygenu RABV (około 60 nm × 180 nm)17, możliwe jest częściowe osadzenie antygenu na etapach wirowania. Z tego powodu ważne jest, aby po odwirowaniu ponownie zawiesić antygen przez pipetowanie lub wirowanie, aby osiągnąć wysoki odzysk antygenu RABB. Wysoce skoncentrowany roztwór jest idealny do dozowania, ponieważ skraca cykle dozowania, a tym samym ogranicza degradację antygenu podczas napełniania. Jednak lepkość jest głównym ograniczeniem piezoelektrycznych robotów dozujących tworzących stabilną kroplę, więc dozowanie roztworu o bardzo wysokim stężeniu może nie być możliwe lub wskazane. Rozcieńczanie roztworu wypełniającego jest najłatwiejszym sposobem na osiągnięcie stabilnego tworzenia kropli, ale należy wziąć pod uwagę stabilność antygenu w dodatkowych cyklach napełniania potrzebnych do osiągnięcia pożądanego obciążenia i dłuższy czas potrzebny do napełnienia cząstek.
Ograniczenia Metoda ta wymaga wysoce specjalistycznego sprzętu do produkcji początkowych form oraz specjalistycznego przyrządu do napełniania do produkcji mikrocząstek. Chociaż zapotrzebowanie na drukarkę 3D o rozdzielczości drukowania zdolnej do generowania początkowych form wzorcowych może zostać zniwelowane przez podejście oparte na opłatach za usługę, dostęp do piezoelektrycznego robota dozującego jest ograniczony. Zakup piezoelektrycznego robota dozującego wymaga znacznej inwestycji początkowej, często w wysokości od 80 000 do 200 000 USD, w zależności od marki, przepustowości i możliwości. Chociaż kilka innych metod napełniania jest potencjalną alternatywą, metody te nie zostały zwalidowane przy użyciu antygenuRABV 12.
Przyszłe zastosowania Znaczna część kapsułkowanego antygenu RABV pozostała stabilna w procesie uszczelniania. W teorii, poprzez włączenie tego antygenu do cząstek złożonych z różnych typów PLGA, które naśladują czas podawania profilaktyki poekspozycyjnej, wszystkie dawki można podać w jednym wstrzyknięciu. Wyeliminowanie konieczności powtórnych wizyt w szpitalu w celu podania dodatkowych dawek poprawi przestrzeganie zaleceń przez pacjentów, co przełoży się na lepsze wyniki leczenia. Ponadto, po wykazaniu zdolności do zachowania reaktywności ELISA wysoce złożonego inaktywowanego wirusa wścieklizny, prawdopodobne jest, że inne antygeny, w tym szczepionki podjednostkowe, byłyby zgodne z tą metodą enkapsulacji. Stosowanie innych profilaktycznych antygenów z mikrocząstkami PULSED może uratować miliony istnień ludzkich w krajach o niskich i średnich dochodach poprzez zwiększenie wskaźników szczepień w populacjach niedostatecznie zaszczepionych. Aby to osiągnąć, szczepionki muszą jednak pozostać stabilne nie tylko poprzez kapsułkowanie, ale także uwalnianie, co może być trudne, ponieważ ładunek będzie poddawany podwyższonym temperaturom i potencjalnie kwaśnemu mikrośrodowisku ze względu na ciepło ciała i produkty degradacji PLGA18. Przyszłe prace będą koncentrować się na stabilizowaniu strategii antygenu poprzez uwalnianie, co otworzy potencjał dla platformy szczepień jednoiniekcyjnych, która ma szerokie zastosowanie w zapobieganiu wielu chorobom zakaźnym.

Szczepienie jest niezwykle skutecznym narzędziem opieki zdrowotnej, które zapobiegło ponad 37 milionom zgonów w latach 2000-20191. Pomimo tej skuteczności, choroby, którym można zapobiegać poprzez szczepienia, nadal stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia na świecie, zwłaszcza w krajach o niskich i średnich dochodach (LMIC), gdzie wysokie wskaźniki nieszczepień i niedostatecznych szczepień przyczyniają się do 1,5 miliona zgonów rocznie, którym można zapobiec dzięki szczepieniom2. Wścieklizna nie jest wyjątkiem od tych dysproporcji. Pomimo swojego statusu najbardziej śmiertelnej choroby znanej ludzkości, prawie zawsze śmiertelnej, wścieklizna jest w pełni uleczalna i jest klasyfikowana jako zwalczona w wielu krajach o wysokich dochodach. Zamiast tego ciężar wścieklizny jest nieproporcjonalnie duży dla ludzi żyjących w częściach Azji i Afryki, gdzie choroba ma niszczące skutki dla ludzi i zwierząt gospodarskich3,4.
Szczepienie ma kluczowe znaczenie dla zarządzania globalnym wpływem wścieklizny5. Koszt szczepień uniemożliwia powszechne stosowanie profilaktyki przedekspozycyjnej (PrEP), biorąc pod uwagę ogólnie niską częstość występowania choroby. Ponadto w krajach o niskich i średnich dochodach użyteczność profilaktyki poekspozycyjnej (PEP) jest ograniczona przez presję społeczno-ekonomiczną wywieraną na pacjentów poszukujących opieki zdrowotnej. Czynniki logistyczne, takie jak odległość do punktów dostępu do opieki zdrowotnej, utracone zarobki podczas leczenia, koszt leczenia, wizyty zakłócające codzienne czynności i zapominanie, powodują, że wskaźniki przestrzegania PEP wynoszą zaledwie 60%6,7. Ten wysoki wskaźnik odejść pacjentów stanowi okazję do udoskonalenia podejść w celu wyeliminowania luk w szczepieniach przeciwko wściekliźnie w celu zwalczania choroby.
Systemy szczepień pojedynczym wstrzyknięciem (SI), które kontrolują uwalnianie antygenów, zostały zbadane jako sposoby na uzyskanie pełnej immunizacji w jednym wstrzyknięciu. Wyeliminowanie konieczności wielokrotnych wizyt u lekarza zmniejsza obciążenia, które uniemożliwiają pacjentom poszukiwanie odpowiedniej opieki. Aby osiągnąć szczepienie SI, antygen jest zwykle zamknięty w biodegradowalnej matrycy polimerowej, która często przybiera postać mikrocząstek do wstrzykiwań. Po wstrzyknięciu polimer ulega degradacji i uwalnia sekwestrowany antygen. Do tej pory prowadzono dwie podstawowe strategie uwalniania w celu osiągnięcia szczepienia przeciwko SI. W jednym podejściu antygen jest uwalniany w sposób ciągły przez dłuższy czas. Chociaż miało to na celu zwiększenie immunogenności pojedynczego wstrzyknięcia, nie jest jasne, czy takie podejście jest wystarczające do wywołania ochronnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko wirusowi wścieklizny (RABV) u ludzi8. W drugim antygen jest uwalniany po z góry określonym opóźnieniu, aby naśladować konwencjonalny i sprawdzony schemat szczepienia typu prime-boost. Suszenie rozpyłowe i metody wytwarzania mikrocząstek oparte na emulsji/rozpuszczalniku wykazują tę pierwszą strategię i zostały wykorzystane do skutecznego enkapsulacji zarówno szczepionek modelowych9, jak i wysoce stabilnych antygenów, takich jak tetanus toxoid10. Jednak te metody enkapsulacji obejmują stresory, w tym ciepło, oddziaływanie rozpuszczalnika i siły fizyczne, które mogą denaturować antygeny11.
Cząsteczki Równomiernie Upłynnione i Zamknięte w Celu Encapulate Drugs (PULSED) to niedawno opracowana metoda wytwarzania, która może być wykorzystana do kapsułkowania leków biologicznych w biodegradowalne mikrocząsteczki. Mikroformowanie służy do generowania cząstek, które są wypełniane płynnym ładunkiem i podgrzewane, aby umożliwić polimerowi ponowne rozpłynięcie się i pełne zamknięcie centralnego magazynu ładunku w ciągłej warstwie biodegradowalnego polimeru. Ta mikrostruktura powoduje pulsacyjne uwalnianie ładunku po czasie zależnym od szybkości degradacji powłoki polimerowej12. Ten manuskrypt demonstruje enkapsulację inaktywowanego RABV w mikrocząstkach składających się z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA), biodegradowalnego polimeru stosowanego w wielu zatwierdzonych przez FDA preparatach 13, przy użyciu metody wytwarzania PULSED do enkapsulacji stabilnego antygenu RABV ocenianego za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Łącząc cząstki PLGA o różnej masie cząsteczkowej i/lub grupach końcowych, podejście to może naśladować obecny przebieg szczepienia przeciwko wściekliźnie po pojedynczym wstrzyknięciu.

<table><tbody><tr><td>0,22 &mikro; m Filtr PES</td><td>Cole-Parmer+B4B2:B63</td><td>04396-26</td><td></td></tr><tr><td>0,25 mm Podkładki</td><td>regulacyjne McMaster Carr</td><td>98090A935</td><td></td></tr><tr><td>0,75 cala Spiner Clips</td><td>Zszywki</td><td>480114</td><td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>10 mL&nbsp; Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu z paskiem lupy</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>101.6 mm C-Clamp</td><td>Amazon</td><td>PT-SD-CP01A</td><td>uchwyt w końcu odpadnie. Użyj szczypiec, aby wyregulować, gdy tak się stanie.</td></tr><tr><td>Igła 19 G</td><td>EXCELINT</td><td>26438</td><td></td></tr><tr><td>25 mL&nbsp; Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu z paskiem lupy</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimetoksysilil) metakrylan propylu&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>M6514-25ML</td><td></td></tr><tr><td>5 ml&nbsp; Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu z paskiem powiększającym</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Probówki wirówkowe</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>50 ml&nbsp; Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu z paskiem lupy</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher</td><td>AC268310010</td><td></td></tr><tr><td>Blok aluminiowy</td><td>McMaster Carr</td><td>9057K175</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>VWR</td><td>89079-069</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra 0,5 ml, 100 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>C82301</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko wirusowi wścieklizny, przeciwciało wolne od surowicy, klon 1112-1, 100</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne przeciw wirusowi wścieklizny, klon D1-25, biotynylowane</td><td>Fisherbrand</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>Karboksymetyloceluloza</td><td>Tokyo Chemical Industries</td><td>C0045</td><td></td></tr><tr><td>ClipTip 300, filtr, stojak</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Costar 0,65 ml probówka do mikrowirówki z zatrzaskiem o niskim poziomie wiązania</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3206</td><td></td></tr><tr><td>Costar 1,7 mL Probówka do mikrowirówek z zatrzaskiem o niskim poziomie wiązania</td><td>&nbsp;</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Opis</td><td>Nanoscribe</td><td></td><td>Oprogramowanie służące do definiowania parametrów drukowania dla drukarki 3D Nanoscribe to krok 1.2. Oprogramowanie dostarczone z drukarką.</td></tr><tr><td>Eksykator</td><td>Fisher Scientific</td><td>10529901</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Zszywki</td><td>dwustronne</td><td>649280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x), bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>F1-ClipTip Pipety wielokanałowe, 30 do 300 i mikro; L</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne Końcówki do pipet z barierą aerozolową, 0,1 &ndash; 10 i mikro; L</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne Końcówki do pipet z barierą aerozolową, 100 &ndash; 1000 &micro; L</td><td>Fisherbrand</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne Końcówki do pipet z barierą aerozolową, 2 &ndash; 20 &micro; L</td><td>Fisherbrand</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand SureOne Końcówki do pipet z barierą aerozolową, 20 &ndash; 200 &micro; L</td><td>Fisherbrand</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Elitarny zestaw pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Kontroler pipet&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego, 90 mm</td><td>VWR</td><td>470313-346</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Globe Scientific</td><td>1380-10</td><td></td></tr><tr><td>Helicon Focus 8</td><td>HeliconSoft</td><td></td><td>Oprogramowanie służące do ustawiania ostrości obrazów stosu</td></tr><tr><td>IP-Q Resin</td><td>Nanoscribe</td><td></td><td>Żywica drukarki jest kompatybilna z soczewką 10x i służy do drukowania dużych mikrostruktur na termoparze Nanoscribe Photonic Professional GT2</td></tr><tr><td>Lascar EL-USB-TC-LCD</td><td>Amazon</td><td>5053485896236</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>Pudełko na szkiełka mikroskopowe</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z374385-1EA</td><td>Lub odpowiednik</td></tr><tr><td>Nanoscribe Photonic Professional GT2 z 10-krotnym obiektywem</td><td>Nanoscribe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NanoWrite</td><td>Nanoscribe</td><td></td><td>używane do interfejsu z drukarką 3D nanoscrive. Oprogramowanie dostarczane z drukarką.</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp 96-dołkowa płytka z płaskim dnem</td><td>Invitrogen</td><td>44-2404-21</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z substratem OPD (dichlorowodorek o-fenylenodiaminy)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>Folia do owijania Parafilm M, 4 w.</td><td>Fisherbrand</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>PDC 60 z powłoką typu 3</td><td>Sicion</td><td>P-2020</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Formy cząsteczkowe</td><td>Rice University</td><td>n/a</td><td>Nie dotyczy- Cząstki wynoszą 400 &mu; m średnicy o grubości ścianki 100 &mu; m i wysokości 500 &mu; m, co daje średnicę wewnętrzną 200 &mu;m. Tablice to 14 x 22 cząstki rozmieszczone w odstępach 600 &mu; m od siebie. Gwiazdy 4- i 5-ramienne są używane jako fiducialia, pozycjonowane 600 &mu; m po prawej i lewej stronie prawego górnego i lewego górnego rogu tablicy.</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Przebija stabilny bufor podłoża nadtlenkowego (10x)</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-430</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe kubki</td><td>Fisher Scientific</td><td>S04170</td><td></td></tr><tr><td>Folia PLGA, 502H</td><td>Sigma</td><td>502H: 719897-1G</td><td></td></tr> Octan <tr><td>eteru monometylowego glikolu propylenowego</td><td>Millipore Sigma 484431</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibries Antigen</td><td>Chiron Behring i Bharat Biotech International</td><td></td><td>Material zostały nabyte poprzez zawarcie z firmą umowy o transferze materiałów.</td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>VWR</td><td>21899-530 i 76457-512</td><td></td></tr><tr><td>SciFLEXARRAYER S3 z PCD 60</td><td>Sicion</td><td></td><td>lub równoważny</td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca do płytek 96-dołkowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Silicon Wafer</td><td>University Wafer</td><td>1025</td><td></td></tr><tr><td>Zaciski sprężynowe</td><td>IRWIN</td><td></td><td></td>VGP58100</tr><tr><td>Blok ze stali nierdzewnej</td><td>McMaster Carr</td><td>9083K12</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna&minus; Polimer peroksydazy, ultraczuły</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>DOW</td><td>2646340</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz teflonowy</td><td>McMaster Carr</td><td>9266K12</td><td>Służy do produkcji folii PLGA. Musi być pokrojony na kawałki o odpowiedniej wielkości.</td></tr><tr><td>Arkusz teflonowy o grubości 0,8 mm</td><td>McMaster Carr</td><td>9266K81</td><td></td></tr><tr><td>Trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooktyl) Pęseta silanowa</td><td>Sigma</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Pixnor</td><td>ESD-16</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Woda destylowana</td><td>Fisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Piec UV, CL-1000S UV Crosslinker</td><td>UVP</td><td>95-0174-01</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>eksykator próżniowy</td><td>Bel-Art</td><td>F420100000</td><td>Pamiętaj, że będziesz potrzebować dwóch z nich. Jeden będzie używany wyłącznie do wstępnej obróbki próbek trichloro(1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylo) silanu, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</td></tr><tr><td>Piec próżniowy o temperaturze 120 stopni Celsjusza; C</td><td>VWR</td><td>97027-664</td><td>Lub równoważny</td></tr><tr><td>odkurzacz, CRVpro4&nbsp;</td><td>Welch</td><td>3041-01</td><td>Lub równoważne</td></tr><tr><td>Drewniane depresory języka</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72320</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie pulsacyjnych mikrocząstek polimerowych zamykających antygen wścieklizny

Fabrication of Pulsatile Polymeric Microparticles Encapsulating Rabies Antigen

Obecne wytyczne dotyczące profilaktyki poekspozycyjnej wścieklizny wymagają wielokrotnych zastrzyków podawanych przez kilka tygodni. Może to być nieproporcjonalnie uciążliwe dla osób mieszkających w krajach o niskich i średnich dochodach, gdzie występuje większość śmiertelnych przypadków narażenia na wściekliznę. Zbadano różne strategie dostarczania leków w celu skondensowania schematów szczepień do jednego wstrzyknięcia poprzez enkapsulację antygenów w cząsteczkach polimerowych. Jednak silne czynniki stresogenne podczas procesu enkapsulacji mogą powodować denaturację kapsułkowanego antygenu. W artykule opisano metodę kapsułkowania antygenu wirusa wścieklizny (RABV) w mikrocząstkach polimerowych, które wykazują regulowane uwalnianie pulsacyjne. Ta metoda, określana jako Cząstki Równomiernie Upłynnione i Uszczelnione w celu Encapulate Drugs (PULSED), generuje mikrocząstki za pomocą miękkiej litografii do tworzenia odwróconych form polidimetylosiloksanu (PDMS) z wielofotonowej, wydrukowanej w 3D formy wzorcowej. Folie z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA) są następnie formowane tłocznie w formach PDMS w celu wytworzenia cylindrów o otwartej powierzchni, które są napełniane skoncentrowanym RABV za pomocą piezoelektrycznego robota dozującego. Te mikrostruktury są następnie uszczelniane poprzez podgrzanie górnej części cząstek, co pozwala materiałowi płynąć i tworzyć ciągłą, nieporowatą barierę polimerową. Po wytworzeniu stosuje się test immunoenzymatyczny (ELISA) specyficzny do wykrywania nienaruszonej glikoproteiny wirusa wścieklizny trimerycznej w celu potwierdzenia wysokiego odzysku antygenu immunogennego z mikrocząstek.

Uszczelnianie i napełnianie cząstek to dwa z najbardziej krytycznych etapów w tym protokole. Cząstki napełniono solą sodową fluoresceiny, aby zademonstrować idealne napełnienie oraz niektóre częste błędy. Sól sodowa fluoresceiny została użyta zamiast antygenu RABV w celu ułatwienia wizualizacji. Podczas napełniania ważne jest, aby dozować roztwór na dno rdzeni cząstek, a następnie odczekać odpowiedni czas, aż rozpuszczalnik/woda odparują. Po zakończeniu tego procesu na dnie rdzenia cząstki pozostaje depozyt substancji rozpuszczonej (Rysunek 1A). Po napełnieniu kluczowe jest prawidłowe uszczelnienie cząstek. Rysunek 1B przedstawia kilka wyników (pomyślnych i niepomyślnych) procesu uszczelniania. Po 12 s czasu uszczelniania od centrum cząstki do jej zewnętrznej strony pozostaje wyraźna ścieżka, co wskazuje na cząstkę, która nie została całkowicie uszczelniona. Z kolei, jeśli czas uszczelniania wynosi 36 s, PLGA niemal całkowicie się topi, co skutkuje mikrostrukturą o płytkim profilu. Idealna morfologia jest widoczna, gdy cząstki są uszczelniane przez 18 i 24 s, ponieważ zawierają one ładunek całkowicie zamknięty w polimerze przy jednoczesnym zachowaniu struktury cząstki. Rysunek 1C przedstawia kilka potencjalnych wyników po napełnieniu i uszczelnieniu. Podczas dozowania, jeśli rozpuszczalnik nie dotrze do dna cząstki, substancja rozpuszczona wysycha w środku rdzenia cząstki (nieprawidłowe napełnienie); mimo że takie cząstki mogą zostać uszczelnione, słabe załadowanie ładunku może ograniczyć wydajność ładowania. Jeśli cząstki są napełnione zbyt dużą ilością ładunku (przepełnione), proces uszczelniania zostaje zahamowany, ponieważ ładunek uniemożliwia przepływ PLGA nad otworem. Po prawidłowym napełnieniu i uszczelnieniu cząstki o takiej geometrii są wystarczająco małe, aby łatwo zmieścić się w igle 19 G. Ponadto 10 cząstek konsekwentnie przepłynęło przez igłę 19 G (100% ± 0%) podczas wstrzykiwania lepkim roztworem, takim jak 2% karboksymetyloceluloza (Rysunek uzupełniający 7).
<img alt="Sekwencja czasu suszenia i uszczelniania podczas napełniania urządzenia mikrofluidycznego; obrazy mikroskopowe poziomów cieczy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65147/65147fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Typowe problemy w procesie napełniania i uszczelniania. (A) Obrazy przedstawiają odparowywanie rozpuszczalnika po jednym cyklu napełniania, w którym cząstki zostały załadowane z 6 nL 100 mg/mL soli sodowej fluoresceiny rozpuszczonej w wodzie. (B) Reprezentatywne obrazy cząstek 502H PLGA usuniętych z procesu uszczelniania w czasie 0, 12, 18, 24 i 36 s. (C) Różne wyniki procesu uszczelniania w przypadku prawidłowego napełnienia cząstek, nieprawidłowego napełnienia lub przepełnienia. Obrazy zostały wygenerowane poprzez nakładanie ostrości wielu zdjęć i ich łączenie za pomocą oprogramowania do focus stackingu. Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/65147fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Przepuszczenie antygenu przez filtr wirowy przed jego załadowaniem do cząsteczek jest ważne z dwóch powodów. Po pierwsze, wirowanie służy do usunięcia substancji pomocniczych z roztworu szczepionki, które mogą ograniczać pojemność załadunku cząsteczek, przy jednoczesnym zatrzymaniu antygenu RABV. Niniejszy protokół oczyszcza antygen około 50-krotnie. Po drugie, w trakcie tego procesu następuje również zagęszczenie antygenu. Rycina 2A przedstawia mikrofotografię nienaruszonych wirionów RABV w stężonej próbce antygenu. Antygen ten jest około 4,4-krotnie bardziej stężony niż wyjściowy roztwór zapasowy (Rycina 2B). Ilość antygenu początkowo naniesioną na wirówki filtracyjne może być zmieniana w celu modulacji końcowego stopnia zagęszczenia. Na przykład naniesienie 40 µL antygenu treściwego skutkuje przybliżonym 1,75-krotnym stężeniem. Rycina uzupełniająca 8 wykazuje znaczenie mieszania w wirówce typu vortex (krok 5.15) w procesie zagęszczania. Pominięcie mieszania lub niewłaściwe wymieszanie próbek ogranicza efektywność procesu zagęszczania.
<img alt="Mikroskopia elektronowa nanocząsteczek; wykres słupkowy porównujący wzrosty stężeń: obraz mikroskopowy, wykres." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65147/65147fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Stężenie antygenu. Stężenie antygenu po filtracji odśrodkowej przedstawione za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (A) i potwierdzone testem ELISA (B). Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. Analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu testu wielokrotnych porównań Tukeya z jednoczynnikową analizą wariancji ANOVA. **p &lt; 0.01, ****p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/65147fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina 3A przedstawia stężony antygen wypełniony w cząstkach nieszczelnych i uszczelnionych. Mimo że do cząstek wprowadzono znaczną ilość antygenu (0,0469 ± 0,0086 IU), materiał ten stanowi &lt;90% pojemności cząstki, co pozostawia wystarczającą przestrzeń do załadowania dodatkowego antygenu. Co ciekawe, cząstki nieszczelne zawierają jedynie 0,0396 ± 0,0077 IU, co stanowi tylko 85% ± 16% całkowitej załadowanej ilości. Choć strata ta jest statystycznie nieistotna, część antygenu RABV mogła ulec denaturacji podczas wielokrotnego rehydratowania i suszenia w procesie napełniania. Po uszczelnieniu 69% ± 5% antygenu pozostaje zamknięte w formie bioaktywnej. Sugeruje to, że podczas procesu uszczelniania, ze względu na stres termiczny, dochodzi do znacznych strat, jednak większość inaktywowanego antygenu wirusowego pozostaje nienaruszona (Rycina 3B). Współinkapsulacja substancji pomocniczych stabilizujących wraz z antygenem jest jedną z możliwych strategii dalszego zwiększenia stabilności antygenu w całym procesie wytwarzania i odnosiła ona wcześniej sukcesy w przypadku innych inaktywowanych antygenów wirusowych14,15.
<img alt="Analiza antygenu bioaktywnego: struktura mikrokapsułek, wykres słupkowy porównawczy, skuteczność zamykania antygenu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65147/65147fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Bioaktywny antygen RABV po wytworzeniu cząstek. (A) Zdjęcia przedstawiają cząstki zawierające antygen RABV przed i po zamykaniu. (B) Stabilność antygenu w procesie wytwarzania cząstek (n = 4). Kontrolę załadunku uzyskano poprzez bezpośrednie dodanie antygenu do roztworu. Słupki błędu oznaczają odchylenie standardowe. Pasek skali = 200 µm. Analiza statystyczna została przeprowadzona z użyciem testów wielokrotnych porównań Tukeya z jednoczynnikową analizą wariancji ANOVA. *p &lt; 0.05. Zdjęcia zostały utworzone poprzez stosowanie techniki focus stackingu wielu obrazów i ich scalanie za pomocą oprogramowania do stosowania ostrości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/65147fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Wymiary cząsteczek, markerów i macierzy. Rysunek przedstawia właściwości geometryczne czteroramiennego markera w kształcie gwiazdy (A), cylindrycznej mikrocząsteczki (B), pięcioramiennego markera w kształcie gwiazdy (C) oraz macierzy cząsteczek z markerami (D) wyświetlonych w oprogramowaniu CAD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S1.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 2: Na tym rysunku przedstawiono przekrój poprzeczny konstrukcji umieszczonej w piecu w celu utwardzenia form z PDMS. Strzałki wskazują miejsca zastosowania zacisków wiążących. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S2.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 3: Prawidłowa technika efektywnego odzyskiwania zagęszczonego antygenu. Po zakończeniu pierwszego wirowania zagęszczona próbka zaznaczona czerwonym okręgiem (A) pozostaje w filtrze, natomiast filtrat zbiera się w dolnej części probówki zbiorczej (większa zewnętrzna probówka). Aby resuspender osad antygenu, jednostkę filtra odśrodkowego zamyka się probówką zbiorczą (B) w celu przygotowania do mieszania w wstrząsarku typu vortex. Podczas mieszania końcówka probówki styka się z podkładką wstrząsarki, a górna część jest obracana przy zachowaniu kąta 45° względem podkładki (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S3.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 4: Programowanie dozownika piezoelektrycznego przed uruchomieniem. (A) Skonfiguruj funkcję „Find Target Reference Points”, przechodząc z „Main tab” do Robot Setup &gt; Miscellaneous &gt;Div. Function &gt; Find Target Reference Points. Użyj przycisków zaznaczonych na niebiesko, aby ustawić znaczniki fiducyjne. Najpierw wybierz Learn Template i obrysuj ramką interesujący Cię znacznik fiducyjny, następnie zweryfikuj dokładność szablonu, klikając Search Template, i zapisz szablon. Powtórz tę czynność dla gwiazd czteroramiennych i pięcioramiennych, zapisując nazwy plików zgodnie z instrukcjami w sekcji Use Two Different Template Images. Następnie upewnij się, że wszystkie parametry w czarnych polach są zgodne. Wczytaj znacznik gwiazdy czteroramiennej za pomocą funkcji Load Template (zielone pole). Zapisz program „Find Target Reference Points”, wybierając Task List (pomarańczowe pole). (B) Skonfiguruj Run, przechodząc do Robot Setup &gt; Tasks tab, a następnie wczytaj sekwencję zadań pokazaną w niebieskim polu, dodając zadania z Task List (czarne pole) za pomocą opcji Task in Run (zielone pole). Na koniec zapisz zadanie (pomarańczowe pole). (C) Skonfiguruj „Target Substrate”, przechodząc do Robot Setup &gt; Target Substrate, a następnie dodaj cel (niebieskie pole). (D) Wprowadź parametry pokazane tutaj i wybierz Save (niebieskie pole). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S4.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 5: Nabieranie antygenu i kalibracja wyrównania dozownika. (A) Przejdź do zakładki Nozzle Setup &gt; Do Task i aspiruj 10 µL antygenu do końcówki dozującej, wybierając TakeProbe10 uL (czarna ramka) i klikając DO (czarna ramka). (B) Spowoduje to otwarcie osobnego okna. Wybierz studzienkę, do której wprowadzono stężony antygen, a następnie wybierz OK (niebieska ramka). (C) Po aspiracji antygenu przemyj końcówkę, wybierając niebieską ramkę, i powtórz to płukanie jeszcze dwa razy. Wybierz kamerę (czarna ramka) i określ objętość kropli, wybierając drop volume (zielona ramka). Upewnij się, że tworzy się stabilna kropla z odchyleniem standardowym objętości (%) &lt;2 (pomarańczowa ramka). (D) Wykonanie tych kroków otworzy Snap Drop Cam; wybierz Image (niebieska ramka) z menu rozwijanego, a następnie wybierz Nozzle Head Camera Wizard. Otworzy to nowe okno. Wykonaj następującą sekwencję kroków szybko. (E) Upewnij się, że załadowano cel przygotowany na Rysunku uzupełniającym 4, a następnie wybierz Move To Target (niebieska ramka). Ustaw liczbę kropli na 15 i wybierz Spot (czarna ramka). Po naniesieniu kropli natychmiast wybierz Move (zielona ramka). Upewnij się, że zaznaczono Auto Find i usuń wartość particle size = 12, a następnie kliknij Start (pomarańczowe ramki). Jeśli autowykrywanie nie powiedzie się, powtórz ten proces po przesunięciu się do innego obszaru na szkiełku (fioletowa ramka). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S5.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 6: Programowanie macierzy punktowej i rozpoczęcie procesu. (A) Przejdź do sekcji Target Setup &gt; Target, a następnie wypełnij parametry wskazane w niebieskiej ramce. (B) Następnie przejdź do karty „Field Setup” i wprowadź wartość 20 w polu liczby kropli (niebieska ramka), wybierz dołek (czarna ramka), a następnie wybierz cele/cząstki do dozowania (zielona ramka). Wybierając inny dołek i ponownie zaznaczając cele/cząstki, można przeprowadzić dodatkowe cykle napełniania podczas jednego przebiegu. (C) Na ekranie głównym upewnij się, że wybrano proces i cel utworzone na Rycini uzupełniającej 5. (D) Przejdź do karty „Run” i wybierz Start Run (niebieska ramka). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S6.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 7: Możliwość wstrzyknięcia mikrocząstek. (A-C) Obrazy stereoskopowe z zastosowaniem techniki focus stacking przedstawiające mikrocząsteczki wypełnione solem sodową fluoresceiny i zamknięte w igle 19 G. (D) Łącznie 10 cząsteczek wstrzyknięto za pomocą igły 19 G, wykorzystując 2% roztwór karboksymetylocelulozy (n = 8). Pasek skali = 1 mm. Słupki błędu oznaczają odchylenie standardowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S7.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek uzupełniający 8: Potencjalne problemy z koncentracją antygenu. Czerwona linia wskazuje oczekiwany wzrost koncentracji w krotnościach. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe. Analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu testów wielokrotnych porównań Tukeya z jednoczynnikową analizą wariancji ANOVA. *** p &lt; 0.001, ****p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Figure%20S8_Revised.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 1: Przygotowanie buforów i roztworów do testu ELISA dla RABV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Uzupełniający plik kodowania 1: plik STL zawierający macierz cząsteczek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Supplemental%20File%201.STL" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dodatkowy plik kodowania 2: plik STL zawierający geometrię niestandardowego uchwytu do szkiełek przedmiotowych używanego do uszczelniania cząstek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65147/Supplemental%20File%202.STL" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ta metoda opisuje enkapsulację antygenu wścieklizny w biodegradowalne mikrocząstki polimerowe o właściwościach strukturalnych i materiałowych, które umożliwiają pulsacyjne uwalnianie po określonym opóźnieniu. Test immunoenzymatyczny (ELISA) oceny antygenu pobranego z rdzenia cząstki potwierdza obecność nienaruszonej glikoproteiny wirusa wścieklizny trimerycznej w wyniku wytwarzania cząstek.

Wytwarzanie pulsacyjnych mikrocząstek polimerowych zamykających antygen wścieklizny

The current guidelines for rabies post-exposure prophylaxis require multiple injections administered over several weeks. This can be disproportionately ...

Znaczenie tego podejścia polega na tym, że może ono być stosowane do podawania wielu dawek szczepionek w jednym wstrzyknięciu, potencjalnie ratując miliony istnień ludzkich, szczególnie w krajach o niskich i średnich dochodach, gdzie noworodki nie są szczepione z powodu trudności w dostępie. Ta metoda wytwarzania pozwala szczepionce przeciwko wściekliźnie zachować swoją natywną formę nadającą odporność, gdy jest zamknięta w mikrocząsteczkach, których uwalnianie naśladuje obecne harmonogramy szczepień przy użyciu tylko jednego wstrzyknięcia. Wścieklizna jest chorobą śmiertelną, w niektórych przypadkach wymagającą do pięciu powtarzających się zastrzyków szczepionki, aby zapobiec śmierci.Jednak podanie pełnego schematu szczepienia podczas jednej wizyty może poprawić przestrzeganie zaleceń lekarskich i uratować życie. Technika ta stanowi technologię platformową zdolną do dostarczania różnorodnych terapii lub profilaktyki różnych chorób. Na początek potraktuj wydrukowaną w 3D powierzchnię formy wzorcowej, umieszczając ją w komorze próżniowej zawierającej szklane szkiełko z 40 mikrolitrami trichlorosilanu na powierzchni.Uruchom odkurzacz na godzinę. Wymieszaj bazę prepolimerową PDMS i utwardzacz w stosunku masowym 9:1 do plastikowego kubka. Następnie przenieś roztwór do 50-mililitrowej probówki i odwiruj 300 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Po odwirowaniu upewnij się, że roztwór jest klarowny. Po zakończeniu obróbki powierzchni umieść formę wzorcową w naczyniu z folii aluminiowej i wlej nieutwardzony PDMS na formę, upewniając się, że elementy są całkowicie zanurzone. Umieść naczynie z folii aluminiowej w komorze próżniowej i ciągnij próżnię przez godzinę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.Po wyjęciu naczynia z folii aluminiowej umieść przekładki o długości 800 mikrometrów na każdym końcu formy głównej i nałóż czysty szkiełko na formę główną, unikając pęcherzyków. Użyj spinaczy do segregatorów, aby zacisnąć formę na przekładkach o grubości 800 mikronów. Utwardź prepolimer w piekarniku w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez cztery godziny.Po utwardzeniu ostrożnie zwolnij spinki do segregatora. Użyj żyletki, aby oddzielić formę wzorcową od utwardzonej formy PDMS. Aby przygotować folię PLGA, umieść 450 miligramów PLGA na nieprzywierającym arkuszu polimerowym w podkładce pierścieniowej.Następnie nałóż drugi nieprzywierający arkusz polimeru na PLGA i użyj zacisku C o średnicy 101,6 milimetra, aby ścisnąć stos między dwoma aluminiowymi blokami, aż do dokręcenia palcami. Umieść zespół C-clamped w piecu próżniowym. Po 30 minutach w piekarniku dokręć zacisk i włóż go z powrotem na kolejne 30 minut.Następnie przenieś zestaw do eksykatora na cztery godziny do ostygnięcia. Po schłodzeniu poluzuj zacisk, usuń folię PLGA z nieprzywierających arkuszy polimerowych i umieść ją na oznakowanej szalce Petriego. Przechowywać szalkę Petriego w eksykatorze do późniejszego wykorzystania.Aby wygenerować cząstki PLGA, należy potraktować powierzchnię formy PDMS, jak pokazano wcześniej. Za pomocą pęsety lub skalpela przytnij folię PLGA o grubości 250 mikronów tak, aby była mniej więcej wielkości układu cząstek i umieść ją na poddanej obróbce formie PDMS. Nałóż czysty szklany szkiełko mikroskopowe na folię PLGA na wierzch formy PDMS i zabezpiecz je razem, umieszczając zacisk sprężynowy na matrycy i folii PLGA.Trzymaj zaciśnięty zespół formy w piekarniku próżniowym przez godzinę, a następnie schładzaj go w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Po schłodzeniu delikatnie przyłóż ciśnienie za pomocą żyletki, aby oddzielić formę PDMS od układu cząstek PLGA i przechowywać cząstki PLGA w eksykatorze do dalszego użycia. Aby wypełnić cząstki skoncentrowanym antygenem szczepionki przeciwko wściekliźnie, należy przygotować dozownik piezoelektryczny i umieścić szkiełko zawierające cząstki PLGA w obszarze dozowania.Załaduj skoncentrowany antygen na płytkę, a następnie wprowadź docelowe parametry konfiguracji i kliknij Uruchom. Robot piezoelektryczny wypełni następnie cząstki. Po zakończeniu użyj stereoskopu, aby sprawdzić, czy cząstki zostały wypełnione.Aby uszczelnić napełnioną cząstkę, umieść blok ze stali nierdzewnej na płycie grzejnej i dwa równoległe szkiełka mikroskopowe na bloku ze stali nierdzewnej. Po wypoziomowaniu bloku ze stali nierdzewnej włącz płytę grzejną i ustaw temperaturę na 205 stopni Celsjusza. Po osiągnięciu żądanej temperatury powierzchni stali nierdzewnej zawieś napełnione cząstki PLGA na dwóch szklanych szkiełkach i natychmiast uruchom timer na 18 sekund.Po wyjęciu szczelnie zamkniętego zestawu cząstek z płyty grzejnej, zawieś go na dwóch szklanych szkiełkach na stole laboratoryjnym i schładzaj przez minutę. Aby zebrać uszczelnione cząstki, przytrzymaj ostrze skalpela pod kątem 45 stopni do szkiełka i dociśnij podstawę cząstek, aby oddzielić je od szkiełka. Za pomocą skalpela przenieś zebrane cząstki do 0,5-mililitrowej probówki o niskiej zawartości wiązania białka.Dodać 250 mikrolitrów PBS zawierającego albuminę surowicy bydlęcej i glukozę, aby utrzymać stabilność szczepionki przeciwko wściekliźnie Umieść próbkę pod stereoskopem i zmiażdż cząstki za pomocą jednego bolca na pęsetę z cienką końcówką. Podczas napełniania cząstkami wymagany jest wystarczający czas schnięcia, aby całkowicie odparować rozpuszczalnik lub wodę. Po wysuszeniu na dnie rdzenia cząstki pozostaje magazyn substancji rozpuszczonej.Idealną morfologię cząstek zaobserwowano między czasami pułapu wynoszącymi od 18 do 24 sekund dla tego PLGA, ponieważ cząstki zawierające ładunek były w tym czasie całkowicie uszczelnione bez utraty struktury cząstek. Cząstki były na tyle małe, że łatwo zmieściły się w igle o rozmiarze 19, gdy były odpowiednio zapakowane i uszczelnione. Co więcej, 10 cząstek przepływało konsekwentnie przez igłę o rozmiarze 19 podczas wstrzykiwania ich do lepkiego roztworu, takiego jak 2% karboksymetyloceluloza.Transmisyjny mikrograf elektronowy wykazał nienaruszone warianty wścieklizny w skoncentrowanej próbce antygenu, które były około 4,4 razy bardziej skoncentrowane niż wyjściowy roztwór podstawowy. Po uszczelnieniu około 69% antygenu pozostaje zamknięte w swojej bioaktywnej formie, co sugeruje, że stres cieplny powoduje znaczne straty podczas uszczelniania, ale większość antygenu wirusowego pozostaje nienaruszona. Napełnianie mikrocząsteczkami jest jednym z najbardziej krytycznych etapów.Jeśli cząstki nie są prawidłowo wypełnione, jest mało prawdopodobne, że cząstki prawidłowo się uszczelnią. Aby zrozumieć stabilność, konieczne byłoby opracowanie dodatkowej formuły, w tym substancji pomocniczych i innych biologicznie istotnych materiałów w rdzeniu cząstek.

fabrication-pulsatile-polymeric-microparticles-encapsulating-rabies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film demonstruje barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny w zakażonej tkance mózgowej myszy. Proces ten obejmuje deparatynizację i leczenie alkoholem, a następnie leczenie proteolityczne w celu zwiększenia dostępności antygenu. Barwienie immunohistochemiczne ujawnia czerwone osady, potwierdzające obecność antygenów wścieklizny w skrawku tkankowym.

Barwienie immunohistochemiczne do wykrywania antygenów wirusa wścieklizny

Ten film prezentuje pośredni test immunoenzymatyczny lub test immunoenzymatyczny ELISA, przeznaczony do oceny poziomów immunogennej glikoproteiny w szczepionkach. Płytka testowa, zawierająca przeciwciała specyficzne dla glikoproteiny, jest inkubowana z seryjnie rozcieńczanymi próbkami szczepionki, w tym szczepionkami referencyjnymi i testowymi, a następnie przeprowadza się test immunologiczny w celu ilościowego określenia zawartości glikoproteiny w badanej szczepionce.

Za pomocą testu ELISA typu kanapkowego w celu określenia zawartości glikoproteiny immunogennej w szczepionce

Ten film demonstruje metodę generowania kandydata na szczepionkę mRNA przy użyciu nanocząsteczek polimerowych. Polimer kationowy oddziałuje z ujemnie naładowanym mRNA, tworząc polipleksy. Tworzenie polipleksów stabilizuje mRNA, co czyni je potencjalnym kandydatem na przyszłe szczepionki mRNA w zastosowaniach immunoterapeutycznych.

Formułowanie nanocząstek obciążonych mRNA do celów szczepień

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego i powtarzalnego generowania biologicznie inspirowanych, biodegradowalnych komórek prezentujących antygen sztuczny (aAPC) o regulowanym rozmiarze, kształcie i prezentacji białka powierzchniowego do ekspansji limfocytów T ex vivo lub in vivo.

Wytwarzanie anizotropowych polimerowych sztucznych komórek prezentujących antygen do aktywacji limfocytów T CD8 +

Zaoferowaliśmy mangustom placebo doustne przynęty przeciwko wściekliźnie z kwasem etylowym lub metylowym jofenoksynowym jako biomarkerem i zweryfikowaliśmy wykorzystanie przynęty za pomocą nowatorskiej metody chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Analiza analogów kwasu jofenoksynowego w małych surowicach mangusty indyjskiej (Herpestes auropunctatus) do stosowania jako doustny marker biologiczny szczepienia przeciwko wściekliźnie

Nowatorskie, kompatybilne z barwieniem immunologicznym techniki oczyszczania tkanek, takie jak ostateczne obrazowanie 3D organów oczyszczonych rozpuszczalnikiem, pozwalają na wizualizację 3D infekcji mózgu wirusem wścieklizny i jego złożonego środowiska komórkowego. Grube, znakowane przeciwciałami wycinki tkanki mózgowej są optycznie przezroczyste, aby zwiększyć głębokość obrazowania i umożliwić analizę 3D za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości zakażenia wirusem wścieklizny w tkance mózgowej oczyszczonej rozpuszczalnikiem

Tutaj opisujemy pośrednie wychwytywanie immunologiczne metodą ELISA w celu określenia zawartości immunogennej glikoproteiny w szczepionkach przeciwko wściekliźnie. Ten test wykorzystuje neutralizujące przeciwciało monoklonalne (mAb-D1) rozpoznające trimery glikoproteiny. Jest to alternatywa dla testu NIH in vivo w celu śledzenia spójności siły działania szczepionki podczas produkcji.

Test ELISA in vitro do oceny siły działania szczepionki przeciwko wściekliźnie

Tutaj prezentujemy protokół testu immunohistochemicznego do wykrywania antygenu wirusa wścieklizny jako alternatywny test diagnostyczny dla tkanek utrwalonych w formalinie.

Test immunohistochemiczny do wykrywania antygenu wirusa Lyssa z tkanek utrwalonych formaliną

Tutaj przedstawiono prosty protokół produkcji nanocząsteczek mRNA opartych na polimerach poli(beta aminoestrowych), który można łatwo dostosować poprzez zmianę kapsułkowanego mRNA. Opisano również przebieg syntezy polimerów, nanocząstek oraz ich niezbędną charakterystykę in vitro. Dodano również dowód słuszności koncepcji dotyczący szczepień.

Synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do celów szczepień

Tutaj prezentujemy szybki i ekonomiczny proces charakteryzowania genomów wirusa wścieklizny (RABV) za pomocą technologii nanoporowej. Przepływ pracy ma na celu wsparcie nadzoru opartego na genomice na poziomie lokalnym, dostarczając informacji na temat krążących linii RABV i ich umiejscowienia w regionalnych filogenezach w celu ukierunkowania środków kontroli wścieklizny.

Sekwencjonowanie całego genomu w celu szybkiej charakterystyki wirusa wścieklizny przy użyciu technologii nanoporowej

Protokół ten demonstruje test reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (RT-PCR) pan-lizawirusa LN34 w czasie rzeczywistym od pobierania tkanek do interpretacji wyników, w tym aktualizacje sekwencji primerów i formuł poprawiających wydajność testu dla niektórych lizawirusów i zalegowców niezwiązanych z wścieklizną. Demonstrujemy także konfigurację testu dla multipleksowanego formatu LN34 z pojedynczym dołkiem (LN34M).

Diagnostyka pośmiertna wścieklizny u zwierząt za pomocą zaktualizowanego, multipleksowanego testu LN34 w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy

Poznaj metodę wytwarzania pulsacyjnych mikrocząstek polimerowych zamykających antygen wścieklizny. Technika ta umożliwia podanie szczepionki wielodawkowej w jednej iniekcji, poprawiając przystępność szczepień w krajach o niskich dochodach.

Wytwarzanie pulsacyjnych mikrocząstek polimerowych zamykających antygen wścieklizny

Przeglądaj więcej filmów