Automatyzacja przetwarzania pączków cytrusów w celu wykrywania patogenów na dalszych etapach procesu za pomocą inżynierii urządzeń

Zademonstrowana technika wykorzystuje niedrogie urządzenie do szybkiego przetwarzania bogatej w łyko tkanki cytrusowej, eliminując potrzebę stosowania pracochłonnych protokołów i specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Pozwala to na szybkie wykrywanie i zarządzanie wiroidami cytrusów, wirusami i bakteriami. Metoda ta może zwiększyć przepustowość oraz poprawić jakość i jednolitość usług testowych, przynosząc korzyści przemysłowi cytrusowemu i potencjalnie pomagając w diagnozowaniu i leczeniu chorób w szkółkach i na polach.

Rośliny cytrusowe są zainfekowane patogenami, co powoduje znaczne straty ekonomiczne na całym świecie. Zaawansowane techniki wykrywania patogenów, takie jak Budwood Tissue Extractor (BTE), są niezbędne do produkcji materiałów rozmnożeniowych testowanych pod kątem patogenów do produkcji drzew na dużą skalę. Chociaż metoda została przetestowana i zwalidowana na próbkach cytrusów, może być stosowana w laboratoriach diagnostycznych i pracach polowych w przypadku wielu innych upraw.

Początkujący wykonujący tę technikę muszą zapoznać się z protokołem, dokładnie postępować zgodnie z instrukcjami i uzbroić się w cierpliwość. Aby rozpocząć, użyj aplikacji telefonicznej Test Tracker, aby wybrać drzewo i przyłóż do telefonu znacznik obroży Near-Field Communication (NFC), aby załadować informacje o drzewie do tagu. Włóż trzy do czterech próbek pączków cytrusów do ekstraktora tkanek Budwood lub BTE, kompatybilnego z plastikowym nośnikiem toreb i zamknij go klipsem.

Po upewnieniu się o jakości próbki, wykonując czynności opisane w tekście, użyj aplikacji na telefon Test Tracker, aby zeskanować znacznik obroży NFC drzewa i połączyć go z tagiem klipsa NFC na torbie na próbkę. Wewnątrz odpowiednio zdezynfekowanego dygestorium przestaw przełącznik z tyłu podstawy ekstraktora chusteczek. Upewnij się, że przełącznik po lewej stronie pudełka jest wciśnięty u góry i poczekaj, aż zielona dioda LED wskaże, że komora jest gotowa.

Aby przygotować komorę zauszną, przymocuj pustą torbę na próbkę z tyłu komory, mocując ją do tylnej dyszy za pomocą O-ringu. Sprawdź ostrze pod kątem oznak zużycia lub uszkodzeń, takich jak nacięcia na ostrzu wchodzące w plastik lub nacięcia na końcówce. Upewnij się, że strzałka na ostrzu pokrywa się z symbolem pojedynczej blokady, a odpowietrzanie na dnie komory jest obrócone w kierunku symbolu O.

Umieść przezroczystą pokrywę nad otworem komory. Korzystając z prowadnicy po prawej stronie komory, wsuń przezroczysty suwak zauszny na komorę, wciskając zamek na dnie komory tak daleko, jak to możliwe, do zamka. Upewnij się, że nasadka tłoka jest zamontowana w górnej części zamka.

Aby załadować komorę zauszną na podstawę zauszną, należy umieścić przygotowaną komorę na podstawie tak, aby dysza podstawy BTE wystająca z tyłu komory. Załaduj próbkę na podstawę zauszną, przesuwając białą naklejkę na klipsie NFC tag powolnymi ruchami okrężnymi do litery Z po prawej stronie pudełka, aż żółte światło zacznie migać. Po przymocowaniu próbki do podstawy upewnij się, że worek na próbkę nie ma w sobie otworów.

Następnie umieść pierścień uszczelniający o przekroju okrągłym nad workiem na próbkę, aby przymocować go do przedniej części dyszy zausznej. Aby załadować nieużywany zestaw strzykawek, należy najpierw rozerwać zestaw strzykawek. Następnie umieść nieużywany zestaw strzykawek na wieży wagi.

Wyjmij zestaw strzykawek, gdy czerwona lampka zacznie migać lub waga pokaże zero. Wyjąć tłok z filtrem ze strzykawki, upewniając się, że płyn pozostaje w dolnej strzykawce. Umieścić tłok na ręczniku papierowym lub wieży w miejscu, w którym nie dotyka żadnej powierzchni.

Na koniec przymocować strzykawkę do portu wyjściowego suwaka, wciskając port wyjściowy do strzykawki i obracając go o 90 stopni. Aby rozpocząć przetwarzanie próbki pączków, naciśnij górny przycisk, aby uruchomić maszynę. Chwyć jeden patyczek z pączka z torby i przełóż go przez górną część dyszy zausznej.

Drugą ręką chwyć kij z drewna pączkowego po drugiej stronie komory i powoli wbij się w ostrze. Powoli przesuwaj pączek do przodu i do tyłu, obracając go. Gdy usłyszysz lekkie brzęczenie, przesuń gałąź głębiej w maszynę, aby skupić się na łyku.

Po wykonaniu tego samego dla wszystkich gałęzi naciśnij górny przycisk, aby zatrzymać przetwarzanie i poczekaj, aż światło zacznie ponownie migać na żółto. Aby sprawdzić masę próbki, obrócić strzykawkę o 90 stopni i pociągnąć ją w dół. Umieścić tłok z powrotem na strzykawce i umieścić strzykawkę na wieży.

Gdy waga automatycznie wykryje próbkę, zielona dioda LED wskazuje, że masa próbki mieści się w odpowiednim zakresie. Jeśli czerwone światło, wskazując na zbyt niską masę próbki, powtórz przetwarzanie próbki. Jeśli waga jest zbyt wysoka, usuń kilka próbek, a żółtej diody LED stanie się wolniejsze.

W celu homogenizacji próbki należy wyjąć tłok ze strzykawki zawierającej próbkę. Wepchnąć płyn do strzykawki i włożyć tłok z powrotem. Wcisnąć tłok, aby przepuścić bufor i sok roślinny przez filtr siatkowy przez gumową rurkę do pustej strzykawki.

Wymieszaj próbkę, popychając bufor i sok roślinny tam iz powrotem trzy do czterech razy z jednej strzykawki do drugiej, aż próbka zamieni się w jednorodną zieloną ciecz. Po dokładnej homogenizacji wepchnij próbkę soku roślinnego do strzykawki bez filtra siatkowego i odłącz od niej gumową rurkę i strzykawkę z filtrem. Następnie wyrzuć próbkę soku roślinnego ze strzykawki do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności dwóch mililitrów.

Po oznaczeniu próbki numerem worka za pomocą markera permanentnego, przechowuj je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Zdezynfekuj wyjmowaną komorę zauszną po przetworzeniu 10. próbki, a zielona dioda LED nadal zamiast zmieniać kolor na niebieski. Aby zdemontować komorę i usunąć wszystkie zanieczyszczenia, zdejmij przezroczystą plastikową osłonę, przezroczystą prowadnicę komory i otwór zatkania na suwaku komory.

Następnie przekręć zawór spustowy powietrza na dnie komory do oznaczenia otwartej kłódki. Po umieszczeniu elementów komory w ustawionej myjce ultradźwiękowej, umieść komorę w wannie z pokrywką pod spodem, aby zapobiec unoszeniu się pokrywy. Uruchom myjkę ultradźwiękową na 15 minut.

Płukać elementy komory w łaźni wodnej przez co najmniej 30 sekund przed przeniesieniem elementów komory do stacji suszenia. Aby rozpocząć suszenie, ustaw pistolet pneumatyczny w jednej linii z rowkiem górnego otworu komory i naciśnij spust pistoletu, aby dozować powietrze przez około 30 sekund. Obrócić pistolet pneumatyczny w kierunku górnych dysz komory, a po naciśnięciu spustu powoli prześledzić trzy pełne koła każdego wejścia dyszy.

Ustaw pistolet pneumatyczny na środku aparatu zausznego i zaczynając od najbardziej wewnętrznego punktu, przytrzymaj spust w dół i poruszaj się, aż pistolet pneumatyczny skieruje się w stronę zamka. Szybko przeprowadź powietrze przez całą komorę z przodu iz tyłu, aby usunąć wodę powierzchniową z zewnątrz. Porównanie BTE i konwencjonalnego protokołu laboratoryjnego do przetwarzania tkanek cytrusowych wykazało, że wyekstrahowane stężenia kwasów nukleinowych określone przez pomiar absorbancji na poziomie 260 nanometrów w obu przypadkach były porównywalne.

Czystość kwasów nukleinowych ekstrahowanych przez BTE, określona jako stosunek absorbancji przy 260 i 280 nanometrach, była wysoka przy niskim zanieczyszczeniu białkami. Integralność kwasu nukleinowego analizowana za pomocą RT-qPCR ukierunkowanego na mRNA genu dehydrogenazy cytrusowej NADH była bardzo podobna zarówno dla BTE, jak i standardowego protokołu ręcznego. Konwencjonalna procedura laboratoryjna wymagała prawie siedmiu do 10 minut na ręczne siekanie próbki i więcej czasu na przetwarzanie tkanek, w tym liofilizację, mielenie i wirowanie.

Jednak BTE przetworzył każdą próbkę do ekstrakcji kwasem nukleinowym w ciągu trzech minut, w tym etapy przygotowania, ważenia i czyszczenia. Żadna z 72 zdrowych próbek z pierwszego przetwarzania próbki zausznej nie wytworzyła krzywych amplifikacji dla badanych patogenów cytrusów, potwierdzając w ten sposób przetwarzanie tkanki cytrusowej w BTE. W drugim przetwarzaniu próbki zausznej, z wprowadzonymi dwiema próbkami zakażonymi mieszanką, wyekstrahowane kwasy nukleinowe wykazały obecność różnych wirusów cytrusowych i wiroidów w partiach pierwszej i piątej.

Nie wykryto jednak zanieczyszczenia krzyżowego między głowami ani wyników fałszywie dodatnich lub ujemnych. Podczas przetwarzania pozostawienie gałęzi w jednym miejscu zbyt długo może wciąć się zbyt głęboko w gałąź, zwiększając ryzyko zatkania i zebrania bezkomórkowego materiału włóknistego. Po przetworzeniu materiał jest gotowy do większości protokołów ekstrakcji i oczyszczania DNA i RNA i może być testowany za pomocą dowolnego testu wykrywania molekularnego patogenów roślinnych.

Opracowanie ekstraktora tkanek Budwood otworzyło drzwi do obszarów o wysokiej przepustowości i badań przesiewowych w całym zagajniku. Wraz z ekstraktorem tkanek liści pozwala na przetwarzanie na dużą skalę tkanek roślinnych, które wcześniej uważano za trudne do przetworzenia, takich jak korzenie i szypułki.