Eksplantaty ślimakowe całego noworodka jako model in vitro
28 lipca 2023
Obecny protokół aktualizuje poprzednie protokoły i zawiera stosunkowo proste podejścia do hodowli wysokiej jakości eksplantatów ślimakowych. Zapewnia to niezawodne pozyskiwanie danych i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w żywych i stałych komórkach. Protokół ten wspiera trwający trend badania komórek ucha wewnętrznego.
Protokół ten obejmuje proste podejście do usprawnienia etapów hodowli, uzyskania wysokiej jakości eksplantatów i przyczyni się do zbadania i odkrycia mechanizmów molekularnych komórek ślimaka. Główną zaletą tej techniki jest minimalna bezpośrednia obsługa narządów poprzez koordynację etapów preparacji, odpowiednia powłoka powierzchniowa polimeru, zoptymalizowana objętość podłoża i czas mocowania eksplantatów. Technika ta reprezentuje popularne podejście in vitro do badania odbiorczego ubytku słuchu.
Można to wykorzystać do ustanowienia modeli ototoksycznych, przeprowadzenia analizy strukturalnej, oceny szlaków sygnałowych i przeprowadzenia badań przesiewowych leków. Zasadniczo metoda ta może mieć zastosowanie do różnych eksplantatów tkanek. Może być również stosowany w badaniach nad uchem wewnętrznym w celu uzyskania wglądu w etapy rozwoju embrionalnego.
Na początek połóż głowę odciętej głowy szczura na sterylnej podkładce. Użyj nożyczek i kleszczy, aby usunąć żuchwę, a następnie podnieś skórę i oderwij ją od czaszki. Umieść kleszcze w jamach oczodołu, aby przytrzymać czaszkę.
Za pomocą ostrego ostrza skalpela ostrożnie przeciąć czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego, a następnie obszaru szwu koronalnego, nie uszkadzając ślimaka. Teraz usuń mózg z dwóch połówek czaszki. Pod mikroskopem zlokalizuj ślimak w kości skroniowej i poluzuj otaczającą tkankę między ślimakiem a kością skroniową.
Następnie umieść kleszcze w górnym kanale półkolistym. Delikatnie odciągnij kość skroniową od ślimaka i przytrzymaj ślimak przymocowany do przedsionka kością skroniową. Włóż końcówki kleszczyków w obszar wierzchołka, który jest widoczny jako biała linia, i wyjmij chrzęstną kapsułkę ślimakową kawałek po kawałku, aby odsłonić przewód ślimakowy.
Umieść kleszcze pod ślimakiem i odłącz je od narządu przedsionkowego i kości skroniowej. Przenieś ślimak do nowego 60-milimetrowego naczynia zawierającego lodowaty PBS. Aby wyizolować narządy eksplantatywne Cortiego, przytrzymaj narząd u podstawy, a przewód ślimakowy w okolicy haka podstawnego i delikatnie odwiń przewód ślimakowy od modiolus, nie rozrywając go.
Następnie przytrzymaj przewód ślimakowy u podstawy i odciągnij więzadło spiralne i prążki naczyniowe. Aby wyizolować eksplantaty ślimaka, użyj kleszczy, aby odłączyć spiralny zwój od kostnej blaszki spiralnej i rozwinąć modiolus podczas odklejania. Za pomocą kleszczy chwyć obszar haczyka i usuń więzadło spiralne z prążkiem naczyniowym.
Co więcej, zdejmij membranę Reissnera kawałek po kawałku. Aby przenieść eksplantaty ślimaka, zanurz szpatułkę laboratoryjną w naczyniu zawierającym eksplantat. Podnieś eksplant komórkami rzęsatymi skierowanymi do góry wraz z kilkoma mikrolitrami PBS, machając szpatułką.
Umieść eksplant w ośmiodołkowym szkiełku komorowym, delikatnie machając szpatułką w podłożu. Pozwól, aby eksplant wsunął się do komory. Za pomocą pipety o pojemności 100 mikrolitrów usuń 80 mikrolitrów podłoża i wyrzuć je.
Sprawdź widoczność komórek rzęsatych i komórek neuronów spiralnych pod mikroskopem. W razie potrzeby użyj kleszczy, aby rozsunąć nakładającą się tkankę. Usuń pozostałe podłoże ze studzienki.
Eksplant będzie teraz leżał bardziej płasko na powierzchni komory. Po 10 sekundach odpipetuj jedną lub dwie krople pożywki tuż obok eksplantatu, a pozostałą pożywkę w pewnej odległości, aby uniknąć oderwania eksplantatu. Upewnij się, że eksplantaty nie poruszają się podczas dodawania pożywki.
Inkubuj komorę przez dwie godziny, aby mocno przymocować narządy do dna komory. Po inkubacji odessać pożywkę. Za pomocą pipety o pojemności 100 lub 200 mikrolitrów ostrożnie dodaj 300 mikrolitrów świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki.
Mikroskopijne obrazy konfokalne z wirującym dyskiem wykazały, że szczurzy narząd eksplantatów Cortiego zachował swoją strukturę i całkowitą długość zarówno w warunkach normalnych, jak i stresowych. Ponadto skaningowy mikroskop konfokalny wykazał ocalałe komórki rzęsate eksplantatów z narządów myszy wraz z komórkami rzęsatymi ulegającymi apoptozie. Protokół umożliwił monitorowanie procesorów biologicznych w żywych komórkach ślimaka za pomocą odpowiednich sond przepuszczalnych dla komórek i mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem.
Posiew tych eksplantatów ślimakowych usprawnia analizę interakcji między komórkami rzęsatymi a komórkami spiralnymi zwojowymi. Komórki rzęsate implantów ślimakowych wykryto za pomocą markera komórek rzęsatych MYO7A. Podobnie, zdrowe i uszkodzone spiralne ciała komórek zwojowych i neuryty zostały zidentyfikowane za pomocą markera neuronalnego, Tuj 1.
W powiększonym przeglądzie widoczne były ciała komórkowe komórek rzęsatych znakowanych przeciwciałem MYO7A. Zidentyfikowano zewnętrzną stereocilię komórek rzęsatych i zdekonwolucyjne obrazy pojedynczych wewnętrznych stereocilii komórek rzęsatych oznaczonych falloidyną. Należy zachować ostrożność podczas zabiegów pod mikroskopem, zwłaszcza podczas oddzielania zwoju spiralnego od blaszki spirali kostnej.
Nienaruszone eksplantaty należy ostrożnie przenieść i wyrównać. Protokół ten zoptymalizował badania in vitro nad eksplantatami ucha wewnętrznego. Wyniki tych badań, takie jak szlaki sygnałowe i toksyczność leków, mogą pomóc w projektowaniu dalszych badań in vivo.
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia udoskonaloną metodę hodowli eksplantów ślimaka, mającą na celu badanie komórek ucha wewnętrznego. Zastosowana metodologia poprawia jakość eksplantów, co przyczynia się do lepszego zrozumienia mechanizmów funkcjonowania komórek ślimaka oraz potencjalnych reakcji ototoksycznych. Techniki obrazowania żywych komórek pozwalają na uzyskanie informacji na temat interakcji i żywotności komórek ślimaka.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia komórki ślimaka
- badania nad utratą słuchu
Wstęp
- Niniejszy protokół aktualizuje wcześniejsze metody hodowli eksplantów ślimaka
- Komórki ucha wewnętrznego odgrywają kluczową rolę w badaniu sensoroneuralnego niedosłuchu
- Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości jest niezbędne do oceny stanu zdrowia komórek i przekaźnictwa sygnałowego
- Postępy w technikach hodowli ograniczają uszkodzenia podczas sekcji
Cel badania
- Optymalizacja hodowli eksplantów ślimaka w celu wiarygodnego pozyskiwania danych.
- Ułatwienie badania mechanizmów molekularnych w komórkach ślimaka.
- Wsparcie analizy strukturalnej oraz przesiewu leków w modelach utraty słuchu.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano zestandaryzowaną platformę do hodowli organów.
- Wyizolowano z należytą starannością i hodowano w kontrolowanym środowisku eksplanty ślimaka człowieka szczura.
- Procedura obejmuje sekcję, przeniesienie do naczyń hodowlanych oraz przytwierdzanie w warunkach niskiego i średniego stężenia pożywki.
- Czasy inkubacji są kluczowe dla żywotności i stabilności eksplantów podczas obserwacji.
- Wykorzystano techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak konfokalna mikroskopia dysku wirującego.
Główne wyniki
- Eksplantaty zachowały swoją strukturę zarówno w warunkach normalnych, jak i stresowych.
- Zidentyfikowano przeżyłe komórki rzęsiste oraz te podlegające apoptozie.
- Zaobserwowano istotne interakcje między komórkami rzęsistymi a komórkami zwoju spiralnego.
- Do oceny żywotności i różnicowania komórek wykorzystano markery takie jak MYO7A oraz Tuj 1.
Wnioski
- Ten udoskonalony protokół umożliwia pogłębioną analizę oddziaływań i mechanizmów komórkowych wewnątrz ślimaka.
- Zastosowane metodologie podkreślają znaczenie starannej dysekcji oraz odpowiednich warunków hodowli.
- Wnioski płynące z tych badań mogą stanowić podstawę dla przyszłych badań in-vivo nad utratą słuchu i mechanizmami regeneracyjnymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Całe eksplanty ślimaka noworodkowego stanowią solidny model in vitro do badania mechanizmów molekularnych i komórkowych leżących u podstaw sensoroneuralnego niedosłuchu. Platforma ta umożliwia wysokoprzepustową analizę żywotności komórek rzęsistych i neuronów, co zwiększa pewność predykcyjną w ramach wczesnej walidacji celów terapeutycznych oraz redukcji ryzyka mechanistycznego. Uproszczony przebieg procedury oraz powtarzalność tej metody sprawiają, że jest ona cennym narzędziem w selekcji projektów badawczych oraz w badaniach translacyjnych nad terapiami niedosłuchu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę interakcji między komórkami rzęskowymi a neuronami zwoju spiralnego w kontrolowanym systemie.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez umożliwienie prowadzenia badań nad szlakami sygnałowymi i toksycznością w kontekście utraty słuchu.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów terapeutycznych dzięki ilościowemu obrazowaniu i analizie markerów molekularnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną platformę do hodowli eksplantów, umożliwiając powtarzalne badania ototoksyczności oraz przesiewowe badania leków.
- Dostarcza wyników ilościowych dzięki obrazowaniu konfokalnemu i zastosowaniu markerów specyficznych dla komórek (np. MYO7A, Tuj 1).
- Umożliwia skalowalność analizy oraz ponowne wykorzystanie platformy w wielu różnych warunkach eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z modelami istotnymi dla chorób w zakresie niedosłuchu sensoryczno-nerwowego oraz oceny ototoksyczności.
- Wspiera ciągłość procesu od mechanistycznych badań in vitro do walidacji hipotez terapeutycznych in vivo.
- Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, dostarczając danych predykcyjnych dotyczących odpowiedzi komórkowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten model eksplantu łączy wczesną fazę odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając testowanie hipotez, analizę szlaków sygnałowych oraz ocenę związków w ramach ujednoliconego schematu pracy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania nad przeżywalnością komórek ślimaka oraz mechanizmami sygnalizacyjnymi oparte na hipotezach.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki w badaniach przesiewowych związków chemicznych i toksyczności.
- Analityka: Umożliwia obrazowanie o wysokiej rozdzielczości oraz ilościowe oznaczanie żywotności komórek i apoptozy z wykorzystaniem markerów.
- Badania translacyjne: Oferuje system istotny z punktu widzenia patogenez chorób, zapewniając ciągłość przedkliniczną w badaniach nad utratą słuchu.
- Zastosowania rozszerzone: Możliwość adaptacji do różnych planów eksperymentalnych i typów tkanek w badaniach nad słuchem.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje przygotowanie eksplantatów, standaryzuje warunki hodowli i zwiększa powtarzalność.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową we wczesnych fazach programów dotyczących utraty słuchu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów terapeutycznych celujących w patologię ślimaka z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie mikrodysekcji i obrazowania konfokalnego w celu optymalnego przygotowania i analizy eksplantów.
- Wymagany jest dostęp do wielodołkowych systemów hodowli oraz zwalidowanych markerów molekularnych do identyfikacji komórek.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów dysekcji, hodowli i obrazowania pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych modeli gryzoni oraz potencjalnie dla innych eksplantów tkankowych po wprowadzeniu modyfikacji protokołu.
- Staranne obchodzenie się z materiałem jest niezbędne dla zachowania integralności eksplantu i zapewnienia wiarygodnych wyników ilościowych.
