Name: Eksplantaty ślimakowe całego noworodka jako model in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj metodę hodowli eksplantatów ślimakowych szczura do badania biologii komórek ucha wewnętrznego. Technika umożliwia analizę interakcji między komórkami rzęsowymi a neuronami spiralnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Animal Facility Wydziału Biomedycyny Uniwersytetu w Bazylei za wsparcie w opiece nad zwierzętami, Microscopy Core Facilities, a także Information Technology Service of the Department of Biomedicine za pomoc techniczną, oraz Swiss National Science Foundation (SNSF) za wsparcie finansowe (stypendium MD-PhD dla M.C., Numer grantu 323530_191222).

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami w Kantonie Bazylea, Szwajcaria. Do eksperymentów wykorzystano postnatalne myszy C57BL/6JR, szczury Wistar i myszy z niedoborem STAT1 (mieszane C57BL/6-129/SvEv)7 w wieku 3-5 dni i dowolnej płci.
1. Powlekanie komór wielostudzienkowych
<ol>
	<li>Przygotuj kompletną pożywkę hodowlaną.
	<ol>
		<li>W przypadku eksplantatów organów Cortiego przygotuj pożywkę zawierającą zmodyfikowaną pożywkę orła Dulbecco (DMEM), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 25 mM HEPES i 30 U/ml penicyliny.</li>
		<li>W przypadku eksplantatów Cortiego i eksplantatów ślimaka przygotuj pożywkę zawierającą DMEM/F12, 1x suplement N2, 1x B27 minus przeciwutleniacze i 30 U/ml penicyliny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy poli-D-lizyny, dodając 10 ml wody z hodowli komórkowej do 5 mg poli-D-lizyny w okapie laminarnym. Końcowe stężenie poli-D-lizyny wynosi 0,5 mg/mL. 
	UWAGA: Podwielokrotnić pozostałą zawartość roztworu podstawowego i przechowywać w temperaturze -20 °C.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory robocze poli-D-lizyny, rozcieńczając roztwór podstawowy w stosunku 1:10 w sterylnej wodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pokryj 8-dołkową komorę 150 μl/studzienkę roztworu roboczego poli-D-lizyny i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Jeśli używana jest komora 4-dołkowa, pokryj 300 μl/studzienkę roztworu roboczego poli-D-lizyny.</li>
	<li>Zassać roztwór za pomocą próżni lub pipetowania.</li>
	<li>Przemyć 2x 200 μl sterylnej wody i raz 200 μl kompletnej pożywki hodowlanej lub DMEM.</li>
	<li>Do każdego dołka dodać 150 μl kompletnej pożywki hodowlanej. 
	UWAGA: Jeśli używana jest komora 4-dołkowa, dodać 250 μl/studzienkę kompletnej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Umieścić komorę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na co najmniej 30 minut przed umieszczeniem eksplantatu.</li>
</ol>
2. Sekcja kości skroniowej
<ol>
	<li>Zdezynfekuj stół operacyjny 70% etanolem i wysterylizuj wszystkie narzędzia w szklanym sterylizatorze mikrosferycznym.</li>
	<li>Umieść sterylną szalkę Petriego o średnicy 60 mm na wiadrze z lodem.</li>
	<li>Wlej kilka mililitrów 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i trzymaj na lodzie. 
	UWAGA: Użyj 30 U/ml penicyliny w 1x PBS, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego.</li>
	<li>Umieść sterylną podkładkę na sterylnej tacy i szybko odetnij głowę szczeniakowi nożyczkami operacyjnymi. Zanurz głowę w 70% etanolu na 5 sekund, jeśli zanieczyszczenie jest częstym zjawiskiem. 
	UWAGA: Ten protokół został przetestowany na myszach i szczurach w wieku P3-P5. Tkanki ślimaka są trudniejsze do wypreparowania od starszych myszy i szczurów, a przeżywalność eksplantatów w hodowli jest ograniczona.</li>
	<li>Umieść głowę zwierzęcia na sterylnej podkładce. Usuń żuchwę. Podnieś skórę i oderwij ją od czaszki. </li>
	<li>Przytrzymaj czaszkę, umieszczając kleszcze w jamach oczodołu.</li>
	<li>Ostrożnie przeciąć czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego, a następnie przeciąć w obszarze szwu koronalnego ostrym ostrzem skalpela, nie uszkadzając ślimaka. 
	UWAGA: Unikaj wywierania zbyt dużego nacisku i unikaj ruchów skalpelem do przodu i do tyłu, ponieważ może to uszkodzić kość ślimakową, a tym samym przewód ślimakowy.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij mózg z dwóch połówek czaszki.</li>
	<li>Przenieść połówki czaszki na szalkę Petriego o średnicy 60 mm za pomocą lodowatego PBS przygotowanego w kroku 2.3.</li>
</ol>
3. Izolacja ślimaka
<ol>
	<li>Zlokalizuj ślimak w kości skroniowej pod mikroskopem. Umieść kleszcze w górnym kanale półkolistym.</li>
	<li>Poluzuj otaczającą tkankę między ślimakiem a kością skroniową za pomocą strzykawki insulinowej (myszy) lub kleszczy (szczury).</li>
	<li>Ostrożnie odciągnij kość skroniową od ślimaka, trzymając ślimak przymocowany do przedsionka z kością skroniową. Upewnij się, że ślimak jest wolny od otaczających tkanek przed odsunięciem kości skroniowej na bok. 
	UWAGA: Przyłożenie zbyt dużej siły spowoduje uszkodzenie przewodu ślimakowego.</li>
	<li>Trzymaj ślimak w ustalonej pozycji, a drugą ręką ostrożnie wyjmij chrzęstną torebkę ślimakową. Ostrożnie włóż końcówki kleszczyków w okolicę wierzchołka lub między zwojami (widocznymi jako biała linia) i wyjmij kapsułkę kawałek po kawałku. Odsłoń przewód ślimakowy.</li>
	<li>Ostrożnie umieść kleszcze pod ślimakiem i odłącz go od narządu przedsionkowego i kości skroniowej.</li>
	<li>Przenieść ślimak do nowego naczynia o średnicy 60 mm zawierającego lodowaty PBS.</li>
	<li>Dostosuj powiększenie mikroskopu, aby lepiej uwidocznić eksplantaty.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z kolejnymi krokami dla narządu eksplantatów Cortiego:
	<ol>
		<li>Przytrzymaj narząd u podstawy za pomocą kleszczy. Delikatnie usuń przewód ślimakowy, chwytając go kleszczami w okolicy haka podstawy.</li>
		<li>Odwiń przewód ślimakowy od modiolus, nie rozrywając go.</li>
		<li>Ostrożnie usuń więzadło spiralne z prążkiem naczyniowym, przytrzymując narząd u podstawy i odciągając je. 
		UWAGA: Separację tkanek można również osiągnąć, przytrzymując obszar wierzchołkowy zamiast obszaru podstawowego. Może to być pomocne podczas preparowania narządów szczurów lub starszych szczeniąt myszy (>P5).</li>
		<li>Ostrożnie usuń membranę Reissnera, trzymając narząd u podstawy i ściągając go kawałek po kawałku. 
		UWAGA: Jest to krok opcjonalny, ponieważ membrana Reissnera nie przeszkadza w pozyskiwaniu obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Postępuj zgodnie z kolejnymi krokami dla eksplantatów ślimaka:
	<ol>
		<li>Odłącz spiralny ganglion od kostnej blaszki spiralnej za pomocą strzykawki insulinowej (myszy) lub kleszczy (szczury).</li>
		<li>Delikatnie rozwiń modiolus podczas odłączania. 
		UWAGA: Eksplantaty można podzielić na dwie części dla lepszej obsługi.</li>
		<li>Chwyć obszar haka kleszczami.</li>
		<li>Ostrożnie usuń więzadło spiralne z naczyniami rozstępu, ściągając je.</li>
		<li>Ostrożnie usuń membranę Reissnera, trzymając narząd u podstawy i ściągając go kawałek po kawałku. 
		UWAGA: Ten krok jest zalecany, ponieważ błona Reissnera zwykle fałduje się i zakrywa włókna neuronów, a zatem może wpływać na eksperymenty.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Hodowla eksplantatów ślimaka
<ol>
	<li>Przenieść eksplantaty z płytki Petriego do komór wielodołkowych. Podnieś eksplantaty komórkami rzęsatymi skierowanymi do góry za pomocą szpatułki laboratoryjnej. Dołącz kilka mikrolitrów 1x PBS, aby zapobiec przywieraniu próbek do szpatułki. 
	UWAGA: Poważnie uszkodzone eksplantaty przykleją się do szpatułki.</li>
	<li>Pozwól eksplantatom wsunąć się z szpatułki do komory, delikatnie machając szpatułką w podłożu. Umieść jeden eksplant w studzience szkiełka z 8-dołkową komorą. 
	UWAGA: Jeśli eksplant przyklei się do szpatułki, przytrzymaj szpatułkę w podłożu i użyj kleszczy, aby odłączyć eksplantaty. Zawsze umieszczaj kleszcze na wewnętrznej granicy eksplantatu (z dala od komórek rzęsatych).</li>
	<li>Sprawdź pod mikroskopem, czy eksplantaty zostały przeniesione we właściwej orientacji i umieszczone w środku studzienek. 
	UWAGA: Nieprawidłowo zorientowane eksplantaty z komórkami rzęsatymi skierowanymi w dół mają tendencję do pokazywania kształtu litery U skierowanym w górę wzdłuż ich szerokości. Popraw ich orientację, przesuwając eksplantaty do rogów komór (dostępnych jest więcej podłoża) i skieruj je tak, aby się obracały.</li>
	<li>Usunąć 80 μl pożywki za pomocą pipety o pojemności 100 μl i wyrzucić ją.</li>
	<li>Sprawdź pod mikroskopem, czy widoczne są komórki rzęsate i komórki neuronów spiralnego zwoju. W razie potrzeby użyj kleszczy, aby delikatnie rozsunąć niektóre zachodzące na siebie tkanki.</li>
	<li>Usuń resztę podłoża i odczekaj ~10 s.</li>
	<li>Odpipetować podłoże z powrotem. Dodaj jedną lub dwie krople pożywki obok eksplantatu i resztę pożywki w pewnej odległości od eksplanta, aby zapobiec oderwaniu się eksplantatu. 
	UWAGA: Nawet jeśli eksplantaty są przymocowane do komór, pożywkę należy zawsze dodać jako pierwszą, pipetując jedną lub dwie krople obok eksplantatów. W ten sposób eksplantaty nie zostaną podniesione po dodaniu pozostałych kompletnych pożywek.</li>
	<li>Umieść komorę z powrotem w inkubatorze i inkubuj przez 2 godziny, aby narządy mogły mocno przymocować się do dna komory.</li>
	<li>Usuń pożywkę i ostrożnie dodaj 300 μl świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki za pomocą pipety o pojemności 100 μl lub 200 μl. Nie używać pipety o pojemności 1 ml. 
	UWAGA: Jeśli pożądana jest obróbka wstępna, po 2 godzinach od utrwalenia należy dodać 300 μl kompletnego podłoża zawierającego substancję będącą przedmiotem zainteresowania. Jeśli używana jest komora 4-dołkowa, należy użyć do 500 μl/studzienkę.</li>
	<li>Umieść komory z powrotem w inkubatorze.</li>
</ol>
5. Test czynników ototoksycznych
<ol>
	<li>Pozostaw eksplantaty na noc, aby przystosować się do warunków hodowli i zregenerować się.</li>
	<li>Przygotuj różne stężenia środków ototoksycznych, aby znaleźć odpowiednie stężenie, aby ustalić model ototoksyczny z około 50% utratą komórek włosa. Stosować od 50 μM do 250 μM dla gentamycyny i od 40 μM do 320 μM dla cisplatyny. Roztwory cisplatyny należy przygotować na świeżo i chronić je przed światłem.</li>
	<li>Usuń pożywkę i ostrożnie dodaj 300 μl pożywki zawierającej pożądany lek ototoksyczny.</li>
	<li>Inkubować eksplantatyny z gentamycyną i cisplatyną w temperaturze 37 °C przez 24 godziny do 48 godzin w celu określenia przeżywalności komórek rzęsatych. 
	UWAGA: Stężenia leku i czas ekspozycji dobierane są w zależności od celu badania. Konserwacja eksplantatów była tu testowana do 72 godzin. Nie należy stosować surowicy, jeśli planuje się przeprowadzenie długotrwałego posiewu.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z następną sekcją, aby wybarwić komórki ślimaka.</li>
</ol>
6. Utrwalenie i immunofluorescencja
<ol>
	<li>Wyrzuć pożywkę pod koniec eksperymentu i natychmiast umyj eksplantaty 200 μl podgrzanego 1x PBS.</li>
	<li>Utrwal eksplantaty za pomocą 200 μl 4% paraformaldehydu (PFA) przez 15 minut pod wyciągiem chemicznym. 
	UWAGA: PFA jest niebezpieczną substancją chemiczną; zapoznaj się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed pierwszą pracą z PFA.</li>
	<li>Umyj eksplantaty dwukrotnie 200 μl 1x PBS. Przechowywać eksplantaty w 1x PBS w temperaturze 4 °C na wypadek konieczności odroczenia procedur barwienia.</li>
	<li>Przygotować roztwór przepuszczalny składający się z 1x PBS i 1%-5% Triton-X100.</li>
	<li>Wyrzuć 1x PBS, dodaj 200 μl roztworu przepuszczalnego i inkubuj eksplantaty przez 15 minut.</li>
	<li>Przygotuj roztwór blokujący.
	<ol>
		<li>W przypadku eksplantatów narządów Cortiego przygotuj roztwór blokujący składający się z 1x PBS, 10% normalnej surowicy koziej (NGS, dla przeciwciał drugorzędowych kóz lub innej surowicy tego samego gatunku co przeciwciała drugorzędowe). Alternatywnie, użyj 1%-5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), jeśli komórki są barwione tylko falloidyną.</li>
		<li>W przypadku eksplantatów ślimakowych przygotuj roztwór blokujący składający się z 1x PBS, 10% NGS i fragmentu Fab (Fab fragment kozio-anty mysi IgG H + L, rozcieńczenie 1:200), jeśli używasz mysich przeciwciał pierwszorzędowych (np. mysiego anty-TuJ1) do barwienia komórek spiralnych zwojów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu blokującego i inkubować eksplantaty przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wyrzuć roztwór blokujący. Do eksplantatów inkubowanych z fragmentem Fab dodaj 200 μl 4% PFA i inkubuj przez 5 minut.</li>
	<li>Myj eksplantaty 1x PBS przez 5 min.</li>
	<li>Przygotuj roztwór przeciwciała składający się z 1x PBS, 5% NGS i 0,1%-0,25% Triton-X100.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze przeciwciała - MYO7A (ab3481 w rozcieńczeniu 1:500 lub MYO7A 138-1 w 1:100) - aby oznaczyć komórki rzęsate i TuJ1 (1:400) w celu oznaczenia neuronów spiralnego zwoju. 
	UWAGA: Jeśli komórki rzęsate są znakowane tylko falloidyną, rozcieńczyć falloidynę w stosunku 1:150 w 1x PBS, inkubować przez 40 minut do 1 godziny w temperaturze pokojowej i przejść do kroku 6.22.</li>
	<li>Należy uwzględnić kontrolę niespecyficznego wiązania przeciwciała drugorzędowego poprzez pominięcie przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
	<li>Dodać 170 μl roztworu przeciwciała z przeciwciałem pierwszorzędowym do odpowiedniego dołka i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając (40-60 obr./min).</li>
	<li>Myj eksplantaty 4x przez 5 minut każdy za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w roztworze przeciwciała (np. kozie anty-królicze Alexa Fluor 488 lub kozie anty-mysie Alexa Fluor 568 IgG w rozcieńczeniu 1:500).</li>
	<li>Dodać 170 μl roztworu przeciwciała z przeciwciałem drugorzędowym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Od tego kroku chroń eksplantaty przed długotrwałym nasłonecznieniem.</li>
	<li>Myj eksplantaty 2x przez 5 minut każdy za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Przejdź do następnego kroku sekwencyjnego podwójnego etykietowania eksplantatów. Inkubować z drugim przeciwciałem pierwszorzędowym będącym przedmiotem zainteresowania (np. MYO7A dla komórek rzęsatych) przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając (40–60 obr./min). Alternatywnie, inkubować z falloidyną (1:150) przez 40 minut do 1 godziny w temperaturze pokojowej i przejść do kroku 6.22. 
	UWAGA: Wykonaj sekwencyjne znakowanie, jeśli przeciwciała pierwszorzędowe pochodzą od tego samego gatunku gospodarza. Wykonaj znakowanie falloidyny na końcu, aby uzyskać immunofluorescencję multipleksową.</li>
	<li>Myj eksplantaty 4x przez 5 minut każdy za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w roztworze przeciwciała (np. kozie anty-królicze Alexa Fluor 488 lub kozie anty-mysie Alexa Fluor 568 IgG w rozcieńczeniu 1:500).</li>
	<li>Dodać 170 μl przeciwciała drugorzędowego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myj eksplantaty 2x przez 5 minut każdy za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy DAPI o stężeniu 1 mg/ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozcieńczyć roztwór podstawowy DAPI w stosunku 1:10 w celu przygotowania roztworów roboczych o stężeniu 0,1 mg/ml i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Pomiń krok 23 i przejdź do kroku 26, jeśli używany jest nośnik montażowy zawierający DAPI.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór roboczy DAPI w stosunku 1:100 w 1x PBS i inkubować eksplantaty z 200 μl roztworu DAPI przez 5 minut.</li>
	<li>Myj eksplantaty 2x przez 5 minut każdy za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Wyjmij 1x PBS tak bardzo, jak to możliwe, aby dno komory wyschło. Nie pozwól, aby eksplant wyschł.</li>
	<li>Odczekaj 2-5 s i dodaj jedną kroplę podłoża montażowego bezpośrednio na eksplant. 
	UWAGA: Medium mocujące na eksplantacie pozostanie na swoim miejscu ze względu na napięcie powierzchniowe. Można użyć utwardzającego medium montażowego.</li>
	<li>Przechowywać komory w temperaturze 4°C do czasu wykonania obrazowania.</li>
</ol>
7. Immunofluorescencja żywych komórek z eksplantatów
<ol>
	<li>Użyć wyizolowanych eksplantatów po całonocnej inkubacji.</li>
	<li>Usunąć pożywkę i ostrożnie dodać 300 μl pożywki zawierającej 125 μM cisplatyny.</li>
	<li>Inkubuj eksplantaty przez 18 godzin, aby zmierzyć ponadtlenek mitochondriów w żywych eksplantatach.</li>
	<li>Wyrzucić pożywkę pod koniec ekspozycji na lek.</li>
	<li>Dodać 300 μl przepuszczalnej sondy w celu wykrycia komórkowego ROS (np. 250 nM mitohydroetydyny) i/lub kaspazy-3 (np. 2 μM peptydu DEVD sprzężonego z barwnikiem wiążącym kwas nukleinowy).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Delikatnie umyj eksplantaty dwukrotnie 200 μl ciepłego zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) lub odpowiedniego buforu.</li>
	<li>Zobrazuj komórki w ciągu 2 godzin ze wzbudzeniem fluorescencyjnym przy 400 nm i detekcją emisji przy 590 nm.</li>
	<li>Wyrzuć pożywkę pod koniec eksperymentu i natychmiast umyj eksplantaty 200 μl podgrzanego 1x PBS.</li>
	<li>Napraw eksplantaty i wybarwij komórki ślimaka zgodnie z powyższym opisem.</li>
</ol>
8. Wizualizacja za pomocą obrazowania konfokalnego
<ol>
	<li>Zobrazuj eksplantaty za pomocą mikroskopu wyposażonego w jednostkę konfokalną z wirującym dyskiem lub mikroskopu konfokalnego wyposażonego w jednostkę konfokalną ze skaningiem punktowym.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy za pomocą obracającego się dysku z obiektywem powietrznym o powiększeniu 20x (apertura numeryczna: 0,75) do zliczania komórek. Alternatywnie, uzyskaj obrazy za pomocą punktowego skaningowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem powietrznym 40x (apertura numeryczna: 0,95) lub obiektywem olejowym 100x (apertura numeryczna: 1,45), aby uwidocznić i policzyć synapsy lub zobrazować stereocilia. 
	UWAGA: Dostosuj intensywność lasera i czas ekspozycji dla każdego kanału, aby uniknąć nadmiernego i niepełnego nasycenia obrazów. Zastosuj te same ustawienia do wszystkich eksplantatów w tym samym eksperymencie.</li>
	<li>Skonfiguruj mikroskop, aby uchwycić obraz 3D całego eksplantatu ślimakowego za pomocą obiektywu pneumatycznego 20x, stosu z i narzędzi do automatycznego szycia. Użyj 3 x 3 sąsiednich pól z 15% zachodzeniem na siebie dla eksplantatów myszy i 4 x 4 sąsiednie pola do zszycia eksplantatów szczurów.</li>
	<li>Dostosuj obrazy za pomocą oprogramowania mikroskopu lub bezpłatnego oprogramowania FIJI o otwartym kodzie źródłowym8. 
	UWAGA: Dekonwolucja, technika przetwarzania obrazu, może być stosowana do obrazów konfokalnych w celu wyostrzenia ich kontrastu i rozdzielczości9-11.</li>
</ol>

<ol><li>Mukherjea, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+screening+of+drugs+to+prevent+acquired+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The design and screening of drugs to prevent acquired sensorineural hearing loss.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (5), 491-505 (2011).</li>
<li>Takeda, H., Dondzillo, A., Randall, J. A., Gubbels, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+cell-based+therapies+for+the+treatment+of+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Challenges in cell-based therapies for the treatment of hearing loss.</a> Trends in Neurosciences. 41 (11), 823-837 (2018).</li>
<li>Schacht, J., Talaska, A. E., Rybak, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+and+aminoglycoside+antibiotics%3A+Hearing+loss+and+its+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Cisplatin and aminoglycoside antibiotics: Hearing loss and its prevention.</a> The Anatomical Record. 295 (11), 1837-1850 (2012).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), e1685(2010).</li>
<li>Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+murine+cochlear+explant+technique+as+an+in+vitro+screening+tool+in+hearing+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55704(2017).</li>
<li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+culture+of+neonatal+murine+inner+ear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).</li>
<li>Durbin, J. E., Hackenmiller, R., Simon, M. C., Levy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+mouse+Stat1+gene+results+in+compromised+innate+immunity+to+viral+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the mouse Stat1 gene results in compromised innate immunity to viral disease.</a> Cell. 84 (3), 443-450 (1996).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Etournay, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+outer+hair+cells+undergo+an+apical+circumference+remodeling+constrained+by+the+hair+bundle+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cochlear outer hair cells undergo an apical circumference remodeling constrained by the hair bundle shape.</a> Development. 137 (8), 1373-1383 (2010).</li>
<li>MacDonald, G. H., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+the+intact+mouse+cochlea+by+fluorescent+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of the intact mouse cochlea by fluorescent laser scanning confocal microscopy.</a> Hearing Research. 243 (1-2), 1-10 (2008).</li>
<li>Sibarita, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Biochemical+Engineering%2FBiotechnology%22%5BJournal%5D)">Deconvolution microscopy.</a> Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).</li>
<li>Cortada, M., Sauteur, L., Lanz, M., Levano, S., Bodmer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deep+learning+approach+to+quantify+auditory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">A deep learning approach to quantify auditory hair cells.</a> Hearing Research. 409, 108317(2021).</li>
<li>Meijering, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+tool+for+neurite+tracing+and+analysis+in+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images.</a> Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).</li>
<li>Ershov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate+7%3A+Integrating+state-of-the-art+segmentation+algorithms+into+tracking+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate 7: Integrating state-of-the-art segmentation algorithms into tracking pipelines.</a> Nature Methods. 19 (7), 829-832 (2022).</li>
<li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose%3A+A+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).</li>
<li>Zhang, L. W., Cang, X. H., Chen, Y., Guan, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+of+mammalian+inner+ear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University+of+Science+B%22%5BJournal%5D)">In vitro culture of mammalian inner ear hair cells.</a> Journal of Zhejiang University of Science B. 20 (2), 170-179 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Celem aktualizacji tego protokołu było usprawnienie etapów od izolacji eksplantatów do obrazowania żywych i utrwalonych komórek ślimaka. Ulepszyliśmy niektóre kroki podczas izolacji i wprowadziliśmy kilka innowacyjnych narzędzi w celu ustanowienia wydajnego i płynnie działającego protokołu uzyskiwania wysokiej jakości eksplantatów. Opisana metoda jest zoptymalizowanym protokołem z poprzednich raportów 4,5. Ponadto w niektórych obecnych badaniach brakuje stopniowej aktualizacji protokołu. Dzięki uproszczonym etapom hodowli eksplantatów, protokół ten zapewnia łatwą obsługę dobrze zachowanych eksplantatów, co jest niezbędne do uzyskania powtarzalnych danych. Wprowadzenie komór wielodołkowych z polimerowym szkiełkiem nakrywkowym do eksplantatów ucha wewnętrznego poprawia przyczepianie narządów i zachowanie nienaruszonych eksplantatów. W tym miejscu przedstawiamy kilka przykładów eksperymentów w warunkach stresowych, aby wykazać, że narządy w hodowli utrzymują swoją organizację komórkową pomimo utraty komórek rzęsatych i uszkodzenia neurytów.
Jednym z wyzwań związanych z hodowlą narządów ucha wewnętrznego jest unikanie odrywania się i unoszenia narządów, ponieważ wpływa to na integralność eksplantatów, odpowiedź na leczenie i późniejsze badania. Wcześniej eksplantaty hodowano na szklanych szkiełkach nakrywkowych 4,5. Chociaż hodowla na powierzchniach szklanych wydaje się być dobrą alternatywą, powlekanie szkła jest czasochłonne, a same szkiełka nakrywkowe są kruche i delikatne. Alternatywny protokół wykorzystujący hodowlę komórek Millicell próbuje rozwiązać ten problem6. Jednak przecięcie i przeniesienie membrany z eksplantatami wydaje się być delikatnym krokiem w tym protokole. Ponadto eksplantaty mogą ulec uszkodzeniu podczas montażu i uszczelniania szkiełka nakrywkowego. W proponowanym przez nas podejściu, po przeniesieniu eksplantatów do komór pokrytych poli-D-lizyną i umieszczeniu we właściwej pozycji, nie jest wymagane dalsze przenoszenie ani pokrywanie szkiełkami nakrywkowymi. Kolejną zaletą tego protokołu jest zastosowanie komór z cienkim, przepuszczalnym dla gazów polimerowym szkiełkiem nakrywkowym, które zapewnia optymalne warunki hodowli eksplantatów narządowych. Polimer ten ma właściwości optyczne podobne do szkła, dzięki czemu nadaje się do obrazowania komórek w mikroskopii o wysokiej rozdzielczości.
Dodanie surowicy do pożywki jest stosowane w większości protokołów hodowli komórek i tkanek, w tym w hodowli eksplantatów ucha wewnętrznego z 1%-10% FBS 4,5,6,16. Obecność surowicy wpływa na warunki hodowli w eksperymentach; Dlatego w niektórych sytuacjach preferowana jest hodowla bez surowicy. Brak surowicy w hodowli eksplantatów ślimaka zastąpiono albo przez dodanie N2 do DMEM, albo przez dodanie N2 do pożywki Neurobaseal-A 5,6. W związku z tym przetestowaliśmy warunki hodowli eksplantatów z surowicą i bez. W obu przypadkach komórki ucha wewnętrznego były niezbędne i reagowały na warunki ototoksyczne. Testowaliśmy te warunki przez 72 godziny, ale eksplantaty mogą być utrzymywane w kulturze jeszcze dłużej, zwłaszcza gdy są inkubowane z pożywką bez surowicy wraz z N2, B27 i czynnikami wzrostu, jak sugerowano w innych badaniach 5,16.
Oprócz ogólnych krytycznych etapów izolacji eksplantatów ucha wewnętrznego, takich jak czas trwania izolacji narządu i zastosowany antybiotyk, w tym protokole znajdują się również pewne krytyczne kroki, które są jednak możliwe do opanowania. Jednym z krytycznych etapów tej metody jest objętość pożywki, która pozostaje w komorze po wprowadzeniu narządu. Zostało to zoptymalizowane, aby utrzymać eksplantaty przy życiu i przytwierdzone do dolnej powierzchni. Kolejny krytyczny krok jest związany z czasem inkubacji wymaganym do przymocowania eksplantatów do dna komory. Czas inkubacji dłuższy niż 2 godziny z kilkoma mikrolitrami pożywki może wpłynąć na zdrowie eksplantatów. Można również stosować krótsze czasy inkubacji, takie jak 1 godzina, o ile zachowa się ostrożność, aby nie odłączyć eksplantatów. Kolejnym ważnym aspektem są pozostałości poli-D-lizyny. Należy ściśle przestrzegać etapów płukania poli-D-lizyny, ponieważ pozostałości soli bromkowej poli-D-lizyny mogą być toksyczne dla komórek. Po dokładnym wykonaniu etapów mycia, powłoka poli-D-lizyną ułatwia płynne przyleganie eksplantatów do komór, dzięki czemu można skorygować położenie, zanim zostaną one mocno przymocowane do dna komory.
Jednym z ograniczeń tej metody jest obrazowanie komórek za pomocą mikroskopii pionowej. Może to być ważna kwestia dla laboratoriów z odwróconymi mikroskopami. Szkiełka podstawowe z wyjmowanymi komorami silikonowymi mogą być używane do mikroskopii pionowej i odwróconej; jednak najpierw należy przetestować nasze warunki powlekania poli-D-lizyną. Kolejnym ograniczeniem jest przechowywanie komór, ponieważ wkładki nie są wyjmowane, a łączna wysokość jednej komory z pokrywą wynosi blisko 11 mm w porównaniu do 1 mm wysokości standardowego szkiełka mikroskopowego. Jednak komora 8-dołkowa zajmuje mniej miejsca niż płytki 4-dołkowe sugerowane przed16.
Prezentujemy tutaj obrazy uzyskane za pomocą dwóch mikroskopów. Podczas gdy punktowy skaningowy mikroskop konfokalny zapewnia obrazy tkanek o wysokiej rozdzielczości dzięki cienkiemu przekrojowi optycznemu, mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem zapewnia szybszy czas obrazowania z dobrą rozdzielczością. Stereocilia wewnętrznych komórek rzęsatych (IHC) i zewnętrznych komórek rzęsatych (OHC) są wizualizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ponieważ stereorzęski IHC są większe niż u OHC, zostały one wielokrotnie i dobrze uwidocznione w tej pracy. W przypadku stereocilii OHC inne alternatywne mikroskopy mogą poprawić wizualizację, takie jak mikroskopia superrozdzielcza (SRM). Obrazy eksplantatów uzyskane za pomocą mikroskopu z wirującym dyskiem są wystarczające do łatwej integracji automatycznego zliczania komórek rzęsatych przy użyciu podejścia opartego na głębokim uczeniu12. Co więcej, krótki czas akwizycji jest ważny dla eksperymentów z żywymi komórkami i tkankami. Ponadto protokół ten nie ogranicza się do eksplantatów ślimaka u noworodków. Dzięki pewnym optymalizacjom można również hodować inne eksplantaty, takie jak narządy przedsionkowe lub tkanki embrionalne.
Kwantyfikacja komórek ślimaka, takich jak komórki rzęsate i neurony, in vitro jest ważna dla oceny żywotności komórek, a tym samym odsetka uszkodzonych lub utraconych komórek. Badania szlaków sygnałowych i funkcji komórek pomagają odkryć mechanizmy śmierci i przeżycia. Badania embrionalnych i noworodkowych tkanek ślimaka są przydatne do badania etapów rozwojowych ślimaka. W związku z tym protokół ten pomoże zoptymalizować badania in vitro eksplantatów ucha wewnętrznego, na przykład w celu ustanowienia modeli ototoksycznych, zbadania etapów rozwojowych, oceny szlaków sygnałowych i przeprowadzenia badań przesiewowych leków.

Większość przypadków odbiorczego ubytku słuchu jest spowodowana degeneracją czuciowych komórek rzęsatych, słuchowych komórek nerwowych i/lub synaps słuchowych1. Ten proces zwyrodnieniowy w komórkach czuciowych jest postępujący i zwykle nieodwracalny, co prowadzi do utraty słuchu2. Dlatego informacje o żywotności komórek czuciowych i zmianach w szlakach sygnałowych w warunkach stresu mają kluczowe znaczenie dla ochrony komórek przed uszkodzeniem, a tym samym utratą. Badanie eksplantatów ślimaka w hodowli pozwala na rekapitulację kompleksu tkankowego i utrzymanie prawidłowej sieci komórka-komórka, co umożliwia lepszy opis procesów sygnalizacyjnych. Aby ustalić eksperymentalne modele ototoksyczności, często stosuje się antybiotyk gentamycynę i chemioterapeutyk cisplatynę, ponieważ wiadomo, że mają one ototoksyczne skutki uboczne3.
Systemy hodowli in vitro eksplantatów ślimakowych były rozwijane i modyfikowane z biegiem czasu; jednak opis protokołu krokowego dla hodowli całych eksplantatów ślimakowych często nie jest dostępny w kilku publikacjach. Jeden z pierwszych protokołów wideo dla pierwotnej hodowli mysiego narządu Cortiego został opublikowany przez Parkera i wsp., w którym autorzy opisali etapy izolacji nabłonka czuciowego, hodowli na szklanych szkiełkach nakrywkowych oraz elektroporacji eksplantatów do eksperymentów transfekcji4. Wcześniej opublikowano również inny protokół z wykorzystaniem szkiełek nakrywkowych, w którym rozważano organizację struktury komórkowej w uchu wewnętrznym5. Alternatywny protokół wykorzystujący błonę Millicell do hodowli eksplantatów myszy w narządzie Cortiego i narządzie przedsionkowym został zgłoszony6. Te raporty wideo przyczyniły się do ulepszenia metody, ale nadal istnieją wyzwania, które należy rozwiązać. Aby rozwiązać szereg problemów wynikających ze stosowania szklanych szkiełek nakrywkowych i wkładek, niniejszy protokół ma na celu usprawnienie etapów hodowli narządów i hodowli narządów wysokiej jakości w celu uzyskania wiarygodnych danych. Osiąga się to poprzez zminimalizowanie bezpośredniego obchodzenia się z narządem podczas procedur eksperymentalnych i unikanie transferu narządu przed uzyskaniem obrazów o wysokiej rozdzielczości żywych i nieruchomych komórek.
Obecny protokół aktualizuje wcześniej opublikowane systemy hodowli in vitro i wprowadza kilka optymalizacji w izolacji narządu Cortiego i transferze do komór hodowlanych, a także integrację nowej komory szkiełkowej w celu poprawy warunków hodowli i dalszej analizy. Ten zoptymalizowany protokół zmniejsza ryzyko uszkodzenia narządu, które może wystąpić w przypadku stosowania szklanych szkiełek nakrywkowych podczas zmiany podłoża lub podczas przenoszenia narządu z szkiełek nakrywkowych lub błon do dalszej analizy4,5,6. Szkiełka nakrywkowe mają lepszy współczynnik odbicia niż plastikowe; Są jednak delikatne i mogą łatwiej pękać. Zastosowane tutaj komory wielodołkowe są przymocowane do szkiełka mikroskopowego, które doskonale nadaje się do hodowli narządów i obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Przenoszenie wyizolowanych narządów odbywa się za pomocą szpatułki, która pozwala na doprowadzenie narządu we właściwej orientacji i wsunięcie go do komory, zamiast przykładania siły pipetą, jak wcześniej zalecano4,5,6.
Komory wielodołkowe pokryte poli-D-lizyną, które powinny zawierać wystarczającą ilość podłoża, ułatwiają przenoszenie organów i prawidłowe rozmieszczenie eksplantatów bez stosowania nacisku adhezyjnego i unikając nakładania się narządów, jak wspomniano wcześniej6. Ponadto przypadkowe nakładanie się narządów i nierówne struktury są rozwiązywane za pomocą konfokalnego stosu Z. Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem różnych zastosowań, takich jak eksplantaty myszy i szczurów, eksplantaty narządu Cortiego i ślimaka, hodowla w pożywce zawierającej surowicę i bezsurowicy, oceny ototoksyczne i ogólne eksperymenty z odpowiedzią na leki. Eksplantaty ślimaka są montowane i inkubowane w komorach z dnem szkiełka nakrywkowego, co ułatwia przyleganie eksplantatów ślimaka do komór w celu optymalnego obchodzenia się z nimi podczas eksperymentów in vitro, obróbki końcowej eksplantatów oraz obrazowania żywych i utrwalonych eksplantatów ślimakowych. Wizualizacja całej długości narządu Cortiego i kwantyfikacja komórek rzęsatych są usprawnione. Ponadto oceny komórek podporowych, komórek neuronów spiralnych zwojów i neurytów są dokładne. Dlatego protokół ten może być wykorzystany do kompleksowej analizy komórek ślimakowych ssaków.

<table><tbody><tr><td>15 ml polipropylenowa rurka stożkowa o wysokiej czystości 17 x 120 mm styl</td><td>FALCON</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>45&deg; Kleszcze kątowe&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polipropylenowa rurka stożkowa 30 x 115 mm</td><td>styl FALCON</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe zapobiegające blaknięciu</td><td>VECTASHIELD</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 falloidyna</td><td>Thermofisher</td><td>2151755</td><td></td></tr><tr><td>Anti-beta III Przeciwciało tubulinowe [TUJ-1]</td> <td>Abcam</td><td>ab14545</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPI</td><td>VECTASHIELD</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Anty-miozyna VII królik poliklonalny</td><td>Abcam</td><td>ab3481</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement (50x), bez przeciwutleniaczy</td><td>Thermofisher</td><td>10889038</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza chirurgiczne ze stali węglowej 23</td><td>Swann Moiton</td><td>210</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent&trade; Kaspaza-3/7 Zielony odczynnik detekcyjne</td><td>Thermofisher</td><td>C10723</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12/(1:1)(1x) + GlutaMAX</td><td>Thermofisher</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Podwójne szpatułki, jedna zakrzywiona końcówka</td><td>VWR</td><td>RSGA038.150</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 70% V/V 1,000 ml</td><td>bichsel</td><td>160 0 106 00</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca, certyfikowana</td><td>Thermofisher</td><td>16000036</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór utrwalający 4% paraformaldehydu przygotowany w PBS</td><td>Thermofisher</td><td>201255309/201255305</td><td></td></tr><tr><td>Źródło zimnego halogenowego światła o wysokiej intensywności&nbsp;</td><td>Intralux&reg; &nbsp;</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Professional wersja 21.10</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ibidi &micro;-Slide 8 well</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr> mikroskop <tr><td></td><td>LEICA</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>LEICA</td><td>MS5</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX&trade; Czerwony mitochondrialny wskaźnik ponadtlenkowy do obrazowania żywych komórek</td><td>Suplement Thermofisher</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>N2 (100x)</td><td>Termofisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop Nikon Eclipse Ti z jednostką konfokalną Yokogawa CSU-W1 z wirującym dyskiem i kamerą Photometrics Prime 95B.</td><td>Mikroskop NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti z punktową jednostką konfokalną A1</td> Nożyczki operacyjne <td>NIKON</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narzędzia do nauki o nauce</td><td>14005-16</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta operacyjna</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-15</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,2 (1x), 500mL</td><td>Thermofisher</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>BROMOWODOREK POLI-D-LIZYNY MOL WT GT 30</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7405</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Steri 250 Drugi sterylizator</td><td>Simon Keller AG&</td><td>nbsp; 031100</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator, granulki środka osuszającego</td><td>Simon Keller AG</td><td>31120</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 60 x 15 mm</td><td>FALCON</td><td>353802</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 60 x 15 mm</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Trito&nbsp; X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Niekonwencjonalne badania rozwojowe miozyny-VIIa</td><td>Bank hybrydoma</td><td>138-1s</td><td></td></tr><tr><td>WFI do hodowli komórkowych [-] Przeciwbakteryjny, 500 ml</td><td>Thermofisher</td><td>A12873-01</td><td></td></tr></tbody></table>

eksplantaty ślimakowe całego noworodka jako model in vitro

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Nieleczony ubytek słuchu powoduje znaczne koszty dla globalnego systemu opieki zdrowotnej i pogarsza jakość życia poszczególnych osób. Odbiorczy ubytek słuchu charakteryzuje się skumulowaną i nieodwracalną utratą czuciowych komórek rzęsatych i nerwów słuchowych w ślimaku. Całe i niezbędne eksplantaty ślimaka są jednym z podstawowych narzędzi w badaniach słuchu do wykrywania utraty komórek rzęsatych i charakteryzowania mechanizmów molekularnych komórek ucha wewnętrznego. Wiele lat temu opracowano protokół izolacji ślimaka noworodków i chociaż z czasem został zmodyfikowany, nadal ma potencjał do poprawy. 
Ten artykuł przedstawia zoptymalizowany protokół izolacji i hodowli całych eksplantatów ślimaka noworodków w wielodołkowych komorach hodowlanych, który umożliwia badanie komórek rzęsatych i komórek neuronów spiralnych na całej długości ślimaka. Protokół został przetestowany przy użyciu eksplantatów ślimakowych od myszy i szczurów. Zdrowe eksplantaty ślimaka uzyskano w celu zbadania interakcji między komórkami rzęsatymi, komórkami neuronów spiralnych zwojów i otaczającymi komórkami podporowymi. 
Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że upraszcza ona etapy hodowli organów bez uszczerbku dla jakości eksplantatów. Wszystkie trzy zwoje narządu Cortiego są przymocowane do dna komory, co ułatwia eksperymenty in vitro i kompleksową analizę eksplantatów. Podajemy kilka przykładów obrazów ślimakowych z różnych eksperymentów z żywymi i utrwalonymi eksplantatami, pokazując, że eksplantaty zachowują swoją strukturę pomimo narażenia na leki ototoksyczne. Ten zoptymalizowany protokół może być szeroko stosowany do integracyjnej analizy ślimaka ssaków.

Niniejszy protokół został przetestowany na ślimakach noworodków myszy i szczurów. W niniejszej pracy przedstawiono obrazy eksplantów z różnych eksperymentów. Eksplanty narządu Cortiego zostały poddane działaniu gentamyciny lub cisplatyny, w wyniku czego widoczna była utrata komórek rzęsistych. Eksplanty narządu Cortiego zachowały swoją strukturę oraz całkowitą długość zarówno w warunkach prawidłowych, jak i stresowych (Rysunek 1 oraz Rysunek 2). Przeżyjące komórki rzęsiste na całej długości eksplantów szczura, wcześniej poddanych działaniu cisplatyny, były wykrywalne indywidualnie (Rysunek 1). Oprócz wykrywania przeżywających komórek rzęsistych, zidentyfikowano również komórki rzęsiste w fazie apoptozy (Rysunek 2). Podejście to ułatwia wizualizację i zliczanie przeżywających komórek, co może być realizowane za pomocą metody uczenia głębokiego, zgodnie z wcześniejszym opisem12. Możliwe było również wykrywanie procesów biologicznych w żywych komórkach ślimaka przy użyciu odpowiednich sond przenikających przez błony komórkowe (Rysunek 3).
W przypadku eksplantów ślimaka zawierających neurony zwoju spiralnego, eksplanty można przeciąć na dwie części lub wyciąć obszar wierzchołkowy, aby zapewnić lepsze warunki hodowli. W niniejszym protokole zdecydowano się na oddzielenie obszaru wierzchołkowego, ponieważ jest on mniej podatny na wpływ warunków stresowych. Rycina 4 przedstawia obszary podstawowy i środkowy eksplantów ślimaka. Wykryto komórki rzęsiste znakowane markerem komórek rzęsistych MYO7A. Podobnie zidentyfikowano zdrowe i uszkodzone ciała komórek oraz neuryty zwoju spiralnego znakowane markerem neuronalnym TuJ1. Analiza obszarów zwoju spiralnego może być przeprowadzona ręcznie lub przy użyciu oprogramowania open-source, takiego jak FIJI z wtyczką NeuronJ do śledzenia neurytów13 lub rozszerzeniami takimi jak TrackMate i Cellpose do segmentacji morfologicznej14,15. Szczegółowe badanie eksplantów mysich ujawniło wysoką rozdzielczość komórek ślimaka i stereocilii komórek rzęsistych (Rycina 5).
<img alt="Struktury spiralnej ślimaka w eksperymencie z mikroskopii porównawczej, przedstawiające anatomię ucha wewnętrznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Eksplanty narządu Cortiego szczurów poddanych działaniu gentamycyny. Reprezentatywne obrazy (maksymalna projekcja intensywności) eksplantów (A) kontrolnych oraz (B) poddanych działaniu gentamycyny (200 µM przez 24 h). Komórki rzęsate są znakowane falloidyną i można je wizualizować wzdłuż całej długości ślimaka. Dla lepszej ilustracji obraz przedstawiono w odcieniach szarości. Obrazy uzyskano za pomocą konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym z obiektywem 20x (apertura numeryczna: 0,75). Pasek skali = 500 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna; barwienie falloidyną, fluoresceiną i DAPI; analiza struktury komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Eksplanty narządu Cortiego z myszy poddanych działaniu cisplatyny. Reprezentatywne obrazy (maksymalna projekcja intensywności) eksplantów (A) kontrolnych oraz (B) poddanych działaniu cisplatyny (160 µM przez 48 h). Komórki rzęsate zostały znakowane falloidyną (czerwony), a apoptotyczne komórki rzęsate znakowano fluoresceiną. Obrazy wykonano przy użyciu punktowego skanującego mikroskopu konfokalnego i obiektywu 20x (apertura numeryczna: 0,75). Pasek skali = 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, analiza Mitosox i kaspazy-3, efekt kontrolny vs cisplatyna, obraz złożony." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Eksplanty narządu Cortiego z eksperymentów obrazowania na żywo. Reprezentatywne obrazy (maksymalna projekcja intensywności) eksplantów od myszy typu dzikiego, przedstawiające (A>) eksplanty kontrolne oraz (B>) eksplanty poddane działaniu 125 µM cisplatyny przez 18 h. Komórki rzęsate zostały oznakowane mito-hydroetydyną i kaspazą-3. Obrazy wykonano przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym i obiektywem 20x (apertura numeryczna: 0,75). Pasek skali = 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia konfokalna przekrojów ślimaka wykazująca barwienie TuJ1, MYO7A, DAPI; szczegóły neuronów i komórek rzęsecznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Eksplanty ślimaka z myszy z nokautem genu STAT1 poddane działaniu cisplatyny. Reprezentatywne obrazy (maksymalna projekcja intensywności) eksplantów kontrolnych (A) oraz eksplantów poddanych działaniu 40 µM cisplatyny przez 48 h (D). Ciała komórek rzęsecznych są znakowane przeciwciałem MYO7A (zielony), a komórki zwoju spiralnego przeciwciałem TuJ1 (czerwony) i barwieniem jąder DAPI (niebieski). Obrazy zostały wykonane przy użyciu skaningowego mikroskopu konfokalnego i obiektywu 20x (apertura numeryczna: 0,75) z dodatkowym powiększeniem 2,15x (B,C,E,F). Pasek skali = (B,C,E,F) 50 µm oraz (A,D) 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna ślimaka z barwieniem MYO7A, faloidyną i DAPI; schemat anatomii komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65160/65160fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Eksplanty narządu Cortiego myszy. (A-D) Reprezentatywne obrazy (projekcja maksymalnej intensywności) pełnowymiarowych eksplantów od myszy typu dzikiego. (A,B) Eksplanty znakowano przeciwciałem MYO7A, faloidyną oraz barwnikiem jądrowym DAPI. (B) W powiększonym widoku wyraźnie widoczne są ciała komórek komórek rzęsistych znakowanych przeciwciałem MYO7A (kolor zielony). (C,D) Faloidyna znakuje stereocylia i płytkę kutykularną komórek rzęsistych. Eksplanty znakowano faloidyną. (D) W powiększonym widoku dobrze zidentyfikowano zdekonwolucyjne obrazy poszczególnych stereocylii wewnętrznych komórek rzęsistych (dolny rząd), podczas gdy poszczególne stereocylia zewnętrznych komórek rzęsistych są trudniejsze do rozróżnienia (górny rząd). Obrazy na panelach A i C uzyskano za pomocą konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym z obiektywem 20x (apertura numeryczna: 0,75). Obraz na panelu B uzyskano za pomocą tego samego mikroskopu, ale z obiektywem powietrznym 40x (apertura numeryczna: 0,95). Obraz na panelu D uzyskano za pomocą konfokalnego mikroskopu punktowego i obiektywu olejowego 100x (apertura numeryczna: 1,45) z dodatkowym powiększeniem 3,46. Skanowanie uśredniano czterokrotnie na sekcję XY, a rozmiar piksela wynosił 0,02 µm. Paski skali = (D) 3 µm, (B) 100 µm oraz (A,C) 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65160/65160fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Obecny protokół aktualizuje poprzednie protokoły i zawiera stosunkowo proste podejścia do hodowli wysokiej jakości eksplantatów ślimakowych. Zapewnia to niezawodne pozyskiwanie danych i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w żywych i stałych komórkach. Protokół ten wspiera trwający trend badania komórek ucha wewnętrznego.

Eksplantaty ślimakowe całego noworodka jako model in vitro

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

Protokół ten obejmuje proste podejście do usprawnienia etapów hodowli, uzyskania wysokiej jakości eksplantatów i przyczyni się do zbadania i odkrycia mechanizmów molekularnych komórek ślimaka. Główną zaletą tej techniki jest minimalna bezpośrednia obsługa narządów poprzez koordynację etapów preparacji, odpowiednia powłoka powierzchniowa polimeru, zoptymalizowana objętość podłoża i czas mocowania eksplantatów. Technika ta reprezentuje popularne podejście in vitro do badania odbiorczego ubytku słuchu.Można to wykorzystać do ustanowienia modeli ototoksycznych, przeprowadzenia analizy strukturalnej, oceny szlaków sygnałowych i przeprowadzenia badań przesiewowych leków. Zasadniczo metoda ta może mieć zastosowanie do różnych eksplantatów tkanek. Może być również stosowany w badaniach nad uchem wewnętrznym w celu uzyskania wglądu w etapy rozwoju embrionalnego.Na początek połóż głowę odciętej głowy szczura na sterylnej podkładce. Użyj nożyczek i kleszczy, aby usunąć żuchwę, a następnie podnieś skórę i oderwij ją od czaszki. Umieść kleszcze w jamach oczodołu, aby przytrzymać czaszkę.Za pomocą ostrego ostrza skalpela ostrożnie przeciąć czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego, a następnie obszaru szwu koronalnego, nie uszkadzając ślimaka. Teraz usuń mózg z dwóch połówek czaszki. Pod mikroskopem zlokalizuj ślimak w kości skroniowej i poluzuj otaczającą tkankę między ślimakiem a kością skroniową.Następnie umieść kleszcze w górnym kanale półkolistym. Delikatnie odciągnij kość skroniową od ślimaka i przytrzymaj ślimak przymocowany do przedsionka kością skroniową. Włóż końcówki kleszczyków w obszar wierzchołka, który jest widoczny jako biała linia, i wyjmij chrzęstną kapsułkę ślimakową kawałek po kawałku, aby odsłonić przewód ślimakowy.Umieść kleszcze pod ślimakiem i odłącz je od narządu przedsionkowego i kości skroniowej. Przenieś ślimak do nowego 60-milimetrowego naczynia zawierającego lodowaty PBS. Aby wyizolować narządy eksplantatywne Cortiego, przytrzymaj narząd u podstawy, a przewód ślimakowy w okolicy haka podstawnego i delikatnie odwiń przewód ślimakowy od modiolus, nie rozrywając go.Następnie przytrzymaj przewód ślimakowy u podstawy i odciągnij więzadło spiralne i prążki naczyniowe. Aby wyizolować eksplantaty ślimaka, użyj kleszczy, aby odłączyć spiralny zwój od kostnej blaszki spiralnej i rozwinąć modiolus podczas odklejania. Za pomocą kleszczy chwyć obszar haczyka i usuń więzadło spiralne z prążkiem naczyniowym.Co więcej, zdejmij membranę Reissnera kawałek po kawałku. Aby przenieść eksplantaty ślimaka, zanurz szpatułkę laboratoryjną w naczyniu zawierającym eksplantat. Podnieś eksplant komórkami rzęsatymi skierowanymi do góry wraz z kilkoma mikrolitrami PBS, machając szpatułką.Umieść eksplant w ośmiodołkowym szkiełku komorowym, delikatnie machając szpatułką w podłożu. Pozwól, aby eksplant wsunął się do komory. Za pomocą pipety o pojemności 100 mikrolitrów usuń 80 mikrolitrów podłoża i wyrzuć je.Sprawdź widoczność komórek rzęsatych i komórek neuronów spiralnych pod mikroskopem. W razie potrzeby użyj kleszczy, aby rozsunąć nakładającą się tkankę. Usuń pozostałe podłoże ze studzienki.Eksplant będzie teraz leżał bardziej płasko na powierzchni komory. Po 10 sekundach odpipetuj jedną lub dwie krople pożywki tuż obok eksplantatu, a pozostałą pożywkę w pewnej odległości, aby uniknąć oderwania eksplantatu. Upewnij się, że eksplantaty nie poruszają się podczas dodawania pożywki.Inkubuj komorę przez dwie godziny, aby mocno przymocować narządy do dna komory. Po inkubacji odessać pożywkę. Za pomocą pipety o pojemności 100 lub 200 mikrolitrów ostrożnie dodaj 300 mikrolitrów świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki.Mikroskopijne obrazy konfokalne z wirującym dyskiem wykazały, że szczurzy narząd eksplantatów Cortiego zachował swoją strukturę i całkowitą długość zarówno w warunkach normalnych, jak i stresowych. Ponadto skaningowy mikroskop konfokalny wykazał ocalałe komórki rzęsate eksplantatów z narządów myszy wraz z komórkami rzęsatymi ulegającymi apoptozie. Protokół umożliwił monitorowanie procesorów biologicznych w żywych komórkach ślimaka za pomocą odpowiednich sond przepuszczalnych dla komórek i mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem.Posiew tych eksplantatów ślimakowych usprawnia analizę interakcji między komórkami rzęsatymi a komórkami spiralnymi zwojowymi. Komórki rzęsate implantów ślimakowych wykryto za pomocą markera komórek rzęsatych MYO7A. Podobnie, zdrowe i uszkodzone spiralne ciała komórek zwojowych i neuryty zostały zidentyfikowane za pomocą markera neuronalnego, Tuj 1.W powiększonym przeglądzie widoczne były ciała komórkowe komórek rzęsatych znakowanych przeciwciałem MYO7A. Zidentyfikowano zewnętrzną stereocilię komórek rzęsatych i zdekonwolucyjne obrazy pojedynczych wewnętrznych stereocilii komórek rzęsatych oznaczonych falloidyną. Należy zachować ostrożność podczas zabiegów pod mikroskopem, zwłaszcza podczas oddzielania zwoju spiralnego od blaszki spirali kostnej.Nienaruszone eksplantaty należy ostrożnie przenieść i wyrównać. Protokół ten zoptymalizował badania in vitro nad eksplantatami ucha wewnętrznego. Wyniki tych badań, takie jak szlaki sygnałowe i toksyczność leków, mogą pomóc w projektowaniu dalszych badań in vivo.

whole-neonatal-cochlear-explants-as-an-in-vitro-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejsza procedura opisuje metodę izolacji i hodowli mysiego narządu Cortiego z lub bez listka spiralnego i neuronów zwoju spiralnego. Prezentujemy również metodę ekspresji egzogennego genu reporterowego w eksplantacie narządu Cortiego za pomocą elektroporacji.

Kultura pierwotna i elektroporacja plazmidowa mysiego narządu Cortiego.

Ten film demonstruje proces izolowania eksplantatów spiralnych zwojów z ucha wewnętrznego i ich wspólnej hodowli z organem Cortiego na matrycy wieloelektrodowej. Spiralne zwoje są ostrożnie ekstrahowane i dzielone na mniejsze skrawki tkanek lub eksplantaty. Te eksplantaty są hodowane w obszarze aktywnym matrycy wieloelektrodowej, aby promować wzrost procesów neuronalnych.

Hodowla eksplantatów neuronów spiralnych myszy na matrycach wieloelektrodowych

Ten protokół opisuje ulepszoną procedurę eksplantacji, która obejmuje elektroporację ex utero, sekcję i hodowlę całych półkul mózgowych od embrionalnej myszy. Preparat ułatwia badania farmakologiczne i testy funkcji genów we wczesnym okresie rozwoju kory mózgowej.

Ex utero Elektroporacja i eksplantaty całej półkuli: prosta metoda eksperymentalna do badań nad wczesnym rozwojem kory mózgowej

Obrazowanie na żywo ślimaka embrionalnego ssaka jest wyzwaniem, ponieważ procesy rozwojowe przebiegają w tempie czasowym przez dziesięć dni. W tym miejscu przedstawiamy metodę hodowli, a następnie obrazowania embrionalnej tkanki eksplantatu ślimaka pobranej od fluorescencyjnej myszy reporterowej w ciągu pięciu dni.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe eksplantatów ślimaka myszy

Prezentujemy metodę, która opisuje izolację i hodowlę eksplantatów ślimaka z embrionalnego ucha wewnętrznego myszy.  Demonstrujemy również metodę transferu genów do eksplantatów ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Hodowla eksplantatów in vitro w połączeniu z techniką transferu genów umożliwia naukowcom badanie skutków zmiany ekspresji genów podczas rozwoju.

Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie przygotowania, hodowli, leczenia i barwienia immunologicznego eksplantatów ślimakowych u noworodków myszy. Technika ta może być wykorzystana jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu.

Technika eksplantatu ślimakowego u noworodków jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Miniaturowe świnie (mini-świnki) są idealnym dużym modelem zwierzęcym do badań nad implantami ślimakowymi. Operacja wszczepienia implantu ślimakowego u miniaturowych świń może być wykorzystana do dostarczenia wstępnych dowodów na bezpieczeństwo i potencjalną wydajność nowatorskich układów elektrod i metod chirurgicznych w żywym systemie podobnym do ludzkiego.

Miniaturowa świnia: duży model zwierzęcy do badań nad implantami ślimakowymi

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od myszy. Początkowo narząd Cortiego został wypreparowany z noworodków (w wieku 3-5 dni) mysich ślimaków pod mikroskopem. Następnie komórki trawiono enzymatycznie do zawiesiny jednokomórkowej i identyfikowano za pomocą immunofluorescencji po kilku dniach w hodowli.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od nowonarodzonych myszy

Poznaj metodę hodowli eksplantatów ślimakowych szczura do badania biologii komórek ucha wewnętrznego. Technika umożliwia analizę interakcji między komórkami rzęsowymi a neuronami spiralnymi.

Eksplantaty ślimakowe całego noworodka jako model in vitro

Przeglądaj więcej filmów