Obrazowanie mikro-CT i analiza morfometryczna mózgów noworodków myszy

W neurobiologii eksperymentalnej, szczególnie w przypadku badań zajmujących się kwestiami rozwoju, istotne jest liczenie na ilościową charakterystykę mózgów próbek embrionalnych i okołoporodowych. Mikrotomografia komputerowa w połączeniu ze zwykłym środkiem kontrastowym jest w stanie uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości, nadające się do dalszej analizy morfometrycznej. Mikrotomografia komputerowa została zastosowana do niedojrzałych tkanek serca, takich jak kości, z powodu absorpcji promieniowania rentgenowskiego w tkankach zmineralizowanych.

Jednak w ostatnich dziesięcioleciach zastosowanie roztworu lugol jako środka kontrastowego ulepszyło zastosowanie tej nowej techniki w przypadku tkanek miękkich. Protokół ten łączy procedury i narzędzia stosowane w tej dziedzinie, aby zademonstrować ogromny potencjał mikrotomografii komputerowej do badania prenatalnych mózgów małych zwierząt. Mocną stroną naszej propozycji jest precyzyjne zobrazowanie procesu od przygotowania próbki do przetwarzania danych morfometrycznych.

Obrazy pochodzące z tomografii mikrokomputerowej zachowują specjalne informacje, co jest trudne przy standardowych technikach histologicznych. Dodatkowo tomografia mikrokomputerowa z użyciem środka kontrastowego ma dwie zalety w porównaniu z rezonansem magnetycznym. Skanery są tańsze i łatwiejsze w obsłudze oraz pozwalają na uzyskanie wyższej rozdzielczości przestrzennej.

Przedstawiony tutaj protokół może być stosowany z subtelnymi modyfikacjami do utrwalania próbek różnych narządów pochodzących od różnych gatunków. Wtedy można by podejść do różnych pytań naukowych. Ponieważ środek kontrastowy jest podawany przez zanurzenie, główne ograniczenia powinny być związane z wielkością próbki, ale potencjalne zastosowania są ogromne.

Na początek napełnij stożkową rurkę o pojemności 50 mililitrów, ale 40 mililitrami 4% paraformaldehydu i zanurz w niej świeżo odcięte głowy noworodków za pomocą pałki lub łyżki. Przechowuj probówki w temperaturze minus czterech stopni Celsjusza przez 48 godzin. Następnie przenieś głowice do 40 mililitrów PBS zawierającego 0,1% azydku sodu i kontynuuj utrzymywanie głowic w lodówce.

W celu barwienia zanurz każdą głowę w 50-mililitrowej stożkowej probówce zawierającej 40 mililitrów roztworu lugol i mieszaj przez 15 do 20 godzin na wytrząsarce orbitalnej przy ciągłym mieszaniu. Przed skanowaniem umieść wybarwioną próbkę w 15-mililitrowej probówce zawierającej 10 mililitrów 1% agarozy na 30 minut. Aby rozpocząć, uruchom oprogramowanie do przetwarzania obrazu, wybierz plik, a następnie otwórz dane i wybierz wcześniej wygenerowane obrazy zeskanowane mikro CT w formacie BMP.

Gdy otworzy się okno parametrów odczytu obrazu, potwierdź parametry i zaakceptuj, jeśli są poprawne. W panelu głównym kliknij na widok projektu, aby zlokalizować nowy obiekt utworzony z nazwą pliku BMP. Kliknij prawym przyciskiem myszy utworzony obiekt i wybierz opcję przekrój orto.

Następnie kliknij przycisk Utwórz. W obszarze właściwości wybierz płaszczyznę orientacji i numer wycinka, które mają być wyświetlane. Aby uzyskać objętości 3D całej głowicy w panelu głównym, przejdź do widoku projektu, kliknij prawym przyciskiem myszy obiekt obrazu, wybierz opcję interaktywnego progowania i kliknij utwórz.

W obszarze właściwości zmieniaj wartości minimalnego progu RGB i maksymalnego progu RGB, aż zostanie zaznaczona część obrazu odpowiadająca głowie zwierzęcia. Następnie wybierz pozycję Zastosuj. Kliknij prawym przyciskiem myszy na obiekcie progowym utworzonym w widoku projektu.

W obszarze Właściwości wybierz powierzchnię ISO. Wybierz próg, aby zobrazować powierzchnię. Następnie kliknij przycisk Zastosuj.

Aby zdigitalizować punkty orientacyjne, kliknij prawym przyciskiem myszy widok projektu. Wybierz opcję Utwórz obiekt. Następnie wybierz punkty i linie, a następnie punkty orientacyjne.

Następnie kliknij Utwórz. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy nowe punkty orientacyjne obiektu, wybierz widok punktu orientacyjnego i kliknij utwórz. W polu Rozmiar zmodyfikuj rozmiar w punktach.

Aby dodać punkty orientacyjne we właściwościach w trybie edycji, wybierz opcję dodaj. Zdigitalizuj pięć równomiernie rozmieszczonych punktów wokół krzywych, aż do następnego punktu orientacyjnego na przecięciu kory śródmózgowia. Następnie zdigitalizuj osiem półpunktów orientacyjnych wokół kory mózgowej.

Aby zapisać zdigitalizowane punkty, kliknij prawym przyciskiem myszy na punkty orientacyjne obiektu i wybierz Zapisz dane. Aby podzielić mózg na segmenty, kliknij prawym przyciskiem myszy widok projektu, a następnie utwórz obiekt. Wybierz obrazy i pola, a następnie oznacz pole.

Kliknij Utwórz. Wybierz obiekt pola etykiety i naciśnij opcję edytora segmentacji we właściwościach. W obszarze materiały dodaj nowy materiał i zmień jego nazwę na mózg.

W obszarze zaznaczenie wybierz bieżący wycinek, aby podzielić tkankę odpowiadającą mózgowi w każdym wycinku. W narzędziach użyj magicznej różdżki i pędzla, aby wybrać tkankę mózgową w każdym plasterku. Następnie w obszarze wyboru naciśnij przycisk dodaj.

Teraz wróć do widoku projektu, kliknij prawym przyciskiem myszy pole etykiety i wybierz generuj powierzchnię. Następnie kliknij przycisk Zastosuj. Po uzyskaniu powierzchni zastosuj powierzchnię wyodrębnienia, aby ją wyeksportować.

Dzięki mikrotomografii komputerowej, pomimo niewielkich rozmiarów mózgów noworodków myszy, można wyróżnić struktury anatomiczne, takie jak opuszki węchowe, kora, śródmózgowie, móżdżek i tyłomózgowie. Manualna segmentacja całego mózgu zaowocowała rekonstrukcją mózgu noworodka za pomocą modelu 3D.