Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Moje badania koncentrują się na kodowaniu neuronalnym mechanizmów przetwarzania wzrokowego. Próbujemy zrozumieć, w jaki sposób informacja wzrokowa jest kodowana w mózgu, zwłaszcza w wzgórku górnym pod podstawowymi neuromechanizmami. Aby zrozumieć przetwarzanie wzrokowe, naukowcy łączą różne podejścia, w tym morfologię neuronów, śledzenie następcze i wsteczne, sekwencjonowanie IL, modelowanie neuronowe, uczenie maszynowe i tak dalej.

Wyzwaniem jest usunięcie nad cięciem SSA, a podniesienie kości w jednym dużym kawałku prawdopodobnie się nie powiedzie, ponieważ kość jest przymocowana do opony twardej. Łącząc dwa zdjęcia na szerokokątnym obrazie wapnia, nasze ostatnie prace ujawniły architekturę funkcyjną kierunku ruchu w myszy, zarówno w rozdzielczości pojedynczej komórki, jak i w skali globalnej. Odkryliśmy, że neurony mają podobną preferencję od plam do 500 mikrometrów w biopsji globalnej do w górę w ruchu nosa.

W naszym protokole dostosowujemy dwa limity badań. Po pierwsze, naukowcy mogą przeprowadzić długoterminowe obrazowanie wapnia w mysim SC w rozdzielczości pojedynczej komórki bez przerywania kory mózgowej. Po drugie, naukowcy mogą rejestrować neuroaktywność w całym SC za pomocą mikroskopii szerokokątnej.

Nasz protokół zapewnia laser do obrazowania tylnego przyśrodkowego SC w rozdzielczości pojedynczej komórki z nienaruszoną korą u myszy typu dzikiego. Używamy również biokompatybilnej zatyczki do odsłonięcia SC, co zmniejsza efekt w przypadku przewlekłego obrazowania. Nasze wyniki pozwalają badać neuronalne kodowanie informacji wizualnych w dużym polu widzenia.

W połączeniu z optogenetyką można badać połowę danych wejściowych z różnych regionów mózgu modulujących neuroaktywność w SC. Rozpocznij proces tworzenia przyssawki, umieszczając kroplę PBS w akrylowym naczyniu. Użyj płaskiej igły o rozmiarze 21, aby wypełnić końcówkę igły PBS przez kapilarność. Przykryj końcówkę igły półprzezroczystym klejem silikonowym i ustaw na około 10 minut.

Przytnij klej silikonowy nożyczkami do dysku o średnicy dwóch milimetrów. Aby przygotować zatyczki, weź plastikową podkładkę o grubości 0,75 milimetra i wytnij kwadrat jeden na jeden centymetr pośrodku. Wyczyść podkładkę podporową i dwa bloki akrylowe alkoholem i przetrzyj je papierem do soczewek.

Umieść podkładkę na jednym bloku akrylowym i nałóż klej silikonowy na środku, aby wypełnić 90% otworu. Dodaj kolejny blok akrylowy. Zastosuj około jednego kilograma siły i odczekaj 20 minut.

Pod mikroskopem chirurgicznym pokrój klej silikonowy skalpelem na trójkątne pryzmaty o wymiarach 1,5 milimetra. Usuń kurz z trójkątnych pryzmatów za pomocą lepkiej plastikowej taśmy i umieść je na szklanym szkiełku nakrywkowym. Umieść szkiełko nakrywkowe z trójkątnymi pryzmatami pod obróbką koronową i włącz ją.

Zbliż urządzenie do obróbki koronowej do szkiełka nakrywkowego, aż pojawi się błyskawica i przytrzymaj je w tej pozycji przez kilka minut, aż pryzmaty i szkiełko nakrywkowe zostaną przymocowane. Po umieszczeniu zatyczek na szalce Petriego inkubować przez noc w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Zacznij od zamocowania znieczulonej myszy na stereotaktycznej ramie za pomocą nauszników.

Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu i utrzymać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 stopni Celsjusza za pomocą termostatycznej poduszki grzewczej. Po ogoleniu sierści i wysterylizowaniu miejsca operowanego wstrzyknij lidokainę, tylidynę i meloksykam. Po usunięciu skóry nad SC wyczyść czaszkę bawełnianym wacikiem.

Dostosuj ramkę stereotaktyczną, aż powierzchnia czaszki będzie płaska. Za pomocą wiertła wykonaj otwór 0,5 milimetra z boku i 0,42 milimetra z przodu do lambdy, aż opona twarda zostanie odsłonięta. Wstrzyknąć wirusa związanego z adenowirusem lub GCaMP6m z ekspresją AAV na głębokość jednego milimetra i 1,6 milimetra od lambda za pomocą mikropipety ze ściętego szkła.

Po wstrzyknięciu należy powoli wyjąć wstrzykiwacz i przystąpić do implantacji płytki głowy. Po wstrzyknięciu konstruktu wirusowego do mózgu myszy należy oczyścić mięśnie i tkanki nad czaszką i podrapać czaszkę ostrzem. Przygotuj cement z żywicy adhezyjnej dentystycznej, mieszając trzy czwarte łyżki polimeru, trzy krople monomeru i jedną kroplę katalizatora w ceramicznej misce na lodzie.

Nałóż mieszaninę na płytę głowy i czaszkę. Przymocuj je i poczekaj, aż klej stwardnieje przez pięć minut. Na koniec wstrzyknij antybiotyki, aby zapobiec infekcjom.

Po wyjęciu myszy z ramki stereotaktycznej umieść ją na poduszce grzewczej w celu odzyskania i wróć do klatki domowej po wyzdrowieniu ze znieczulenia. Trzy tygodnie po infekcji wirusowej znieczulij i przymocuj mysz za pomocą płytki na głowę do ramy stereotaktycznej. Namocz piankę żelową w soli fizjologicznej, aby zatrzymać potencjalne krwawienie.

Użyj mikrowiertła, aby utworzyć owal o wymiarach trzy na dwa milimetry wyśrodkowany w odległości 0,5 milimetra za lambdą. Rozcieńczyć granicę owalu, aż pęknie, a następnie rozrzedzić czaszkę przed owalnym oknem nagrywania, aby zamknąć szkiełko nakrywkowe do SC. Za pomocą cienkich kleszczy zdejmij płaty kostne. Wykonaj cięcie opony twardej z tyłu zatoki poprzecznej i usuń kawałek opony twardej.

Osusz czaszkę i okienko nagrywania pianką żelową i wacikami, a następnie wlej kroplę kleju silikonowego do okienka nagrywania. Użyj przyssawki, aby przytrzymać wtyczkę z podciśnieniem i użyj zmotoryzowanego mikromanipulatora, aby przesunąć przyssawkę i opuść wtyczkę do kleju silikonowego, aż szkiełko nakrywkowe dotknie czaszki. Po oczyszczeniu płyty głowicy nałóż cyjanoakrylan butylu i cement żywiczny wokół granicy korka, aby przymocować go do płyty głowicy i przystąp do obrazowania.

Po wszczepieniu płyty czołowej i wtyczki zabezpiecz zwierzę na bieżni obrotowej za pomocą płyty czołowej. Umieść bieżnię pod mikroskopem dwufotonowym i ustaw wysokość w odpowiedniej pozycji. Umieść czarną aluminiową membranę między obiektywem a płytą główną, aby zapobiec zanieczyszczeniu światłem monitora w celu stymulacji wizualnej.

Aby wykonać obrazowanie dwufotonowe, dostosuj moc lasera na płaszczyźnie próbki w zakresie od 20 do 80 miliwatów. Skanuj pole widzenia o wymiarach 600 na 600 mikrometrów przy częstotliwości 4,8 Hz, z rozdzielczością przestrzenną 2,4 mikrometra na piksel i aktywnością neuronalną obrazu do głębokości 350 mikrometrów. Za pomocą enkodera obrotowego rejestruj ruch myszy na bieżni.

Użyj aparatu z obiektywem o ogniskowej 50 mm, aby zarejestrować rozmiar i położenie źrenicy. Na koniec zsynchronizuj te nagrania i akwizycje obrazów ze stymulacją wizualną, nagrywając wyzwalacze wysyłane przez komputer stymulacyjny. Przedstawiono odpowiedzi wapniowe neuronów SC myszy typu dzikiego oraz projekcję odchylenia standardowego fluorescencji na obrazach.

Na początek wstrzyknij 100 nanolitrów GCaMP6M z ekspresją AAV na głębokości 200 mikrometrów w środku każdej strony SC zmutowanej myszy, której tylna kora nie rozwinęła się. Po około trzech tygodniach wszczepić szkiełko nakrywkowe o średnicy pięciu milimetrów na SC. Po zamocowaniu szkiełka nakrywkowego należy uzyskać obrazy za pomocą kamery CMOS po przejściu filtra emisyjnego z częstotliwością 10 Hz. Reakcje wapniowe neuronów SC od myszy z częściowym mutantem kory mózgowej zobrazowano za pomocą mikroskopii szerokokątnej.

Uzyskany obraz został poddany próbkowaniu w dół do jednej czwartej oryginalnego rozmiaru i pokazano wizualnie wywołane reakcje wapnia.