Name: Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia w kolikulusie górnym myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej i szerokopolowej. Technika umożliwia rejestrację aktywności pojedynczych neuronów z zachowaniem integralności kory mózgowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (32271060). Y.-t.L. zaprojektował badania, przeprowadził eksperyment, przeanalizował dane i napisał manuskrypt. Z.L. i R.W. przeprowadzili doświadczenie.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt i zatwierdzone przez IACUC w Chińskim Instytucie Badań nad Mózgiem w Pekinie.
UWAGA: Harmonogram tego protokołu przedstawia się następująco: 1) wykonanie przyssawki; 2) wstrzyknięcie wirusa; 3) implantacja płytki głownej; 4) po 3 tygodniach implantacja wtyczki; 5) po około 3-dniowej rekonwalescencji i habituacji na bieżni, wykonanie obrazowania dwufotonowego/szerokopolowego.
1. Przygotowanie przyssawki (Rysunek 1A)
<ol>
	<li>Nanieś kroplę soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS, 1x) na tackę akrylową i dotknij jej płaską igłą 21 G, aby wypełnić końcówkę poprzez kapilarność.</li>
	<li>Pokryj końcówkę igły półprzezroczystym klejem silikonowym i pozostaw do utrwalenia na około ~10 min.</li>
	<li>Wytnij nożyczkami z kleju silikonowego dysk o średnicy ~2 mm.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kostek (Rycina 1B)
<ol>
	<li>Przygotuj plastikową podkładkę o grubości 0,75 mm i wytnij w jej centrum kwadrat o wymiarach 1 cm x 1 cm. Przygotuj dwa bloki akrylowe. Oczyść podkładkę oraz bloki akrylowe alkoholem i przetrzyj je papierem do soczewek.</li>
	<li>Umieść podkładkę dystansową na jednym bloku akrylowym, nanieś klej silikonowy na środek, wypełniając około 90% otworu (unikając pęcherzyków powietrza), dołóż drugi blok akrylowy i przyłóż siłę około 1 kg, a następnie odczekaj 20 min.</li>
	<li>Pod mikroskopem chirurgicznym, używając skalpela, wytnij z kleju silikonowego pryzmaty trójkątne o wysokości 1 mm i szerokości 1,5 mm, wykonując nacięcia nad arkuszem papieru z wydrukowanymi trójkątami.</li>
	<li>Usuń kurz z pryzmatów trójkątnych za pomocą plastikowej taśmy klejącej, a następnie umieść je na szkiełku nakrywkowym o średnicy 5 mm i grubości 0,15 mm.</li>
	<li>Umieść szkiełko przykrywowe z pryzmatami trójkątnymi pod urządzeniem do traktowania koronowego, włącz urządzenie i zbliż je do szkiełka, aż pojawi się wyładowanie. Utrzymaj tę pozycję przez kilka minut, aż zostaną one ze sobą połączone. 
	UWAGA: Ten krok może różnić się w zależności od urządzenia do traktowania koronowego.</li>
	<li>Umieść krążki w szalce Petriego i włóż ją do inkubatora w temperaturze 70 °C przez noc.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zwierząt i wstrzyknięcie konstruktu wirusowego
<ol>
	<li>Użyć myszy obu płci szczepów C57BL/6J (typ dziki) oraz Emx1-Cre:Pals1flox/wt (częściowa kora)20 w wieku 6 tygodni (9 tygodni w momencie obrazowania).</li>
	<li>Sterylizować wszystkie materiały i narzędzia wykorzystywane podczas procedury chirurgicznej.</li>
	<li>Zanestetyzować mysz 5% izofluranem, a następnie utrzymywać stężenie izofluranu na poziomie 1%-2% przy przepływie 1 L/min podczas operacji. Potwierdzić poziom znieczulenia brakiem odruchu na uciśnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Ustabilizować głowę myszy w aparacie stereotaktycznym za pomocą prętów usznych. Przez cały czas trwania operacji nakładać maść oftalmiczną na oczy myszy, aby zapobiec ich wysychaniu, oraz utrzymywać temperaturę ciała na poziomie 37 °C za pomocą termostatycznej podgrzewaczki.</li>
	<li>Ogolić futro i zdezynfekować powierzchnię skóry jodoforem oraz 75% etanolem. Wstrzyknąć lidokainę (5 mg/kg, iniekcja podskórna [SQ]), tylidynę (2 mg/kg, SQ) i meloksykam (2 mg/kg, SQ). 
	UWAGA: Procedura chirurgiczna dotycząca sterylizacji, analgezji i znieczulenia miejscowego może różnić się w zależności od instytucji.</li>
	<li>Usunąć skórę nad SC za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby odsłonić czaszkę. Oczyścić czaszkę patyczkiem bawełnianym.</li>
	<li>Wyregulować aparat stereotaktyczny, aż powierzchnia czaszki będzie płaska. Wywiercić otwór 0,5 mm bocznie i 0,42 mm przednio od lambda, aż do odsłonięcia opony twardej.</li>
	<li>Wstrzyknąć wirusa adeno-zależnego (AAV) wykazującego ekspresję GCaMP6m (rAAV2/9-hsyn-GCaMP6m; 1 x 1013 GC/mL rozpuszczonego w 1x PBS) na głębokość 1 mm i 1,6 mm od lambda za pomocą szklanej mikropipety o ściętym końcu (koncówka ścięta pod kątem 25° o średnicy 40-50 µm).</li>
	<li>Na każdej głębokości wstrzyknąć 100 nL z prędkością 50 nL/min i odczekać 5 min po każdej iniekcji. Po wstrzyknięciu powoli wycofać injektor.</li>
</ol>
4. Implantacja płytki głownej
<ol>
	<li>Oczyścić mięśnie i tkanki nad czaszką, a następnie delikatnie zeskrobać powierzchnię czaszki ostrzem skalpela. W przypadku wystąpienia krwawienia zatamować je za pomocą gąbki żelatynowej i usunąć krew. Przymocować płytkę głowową (Rysunek 1C>) do czaszki, używając samoutwardzalnego kompozytu dentystycznego. W szczególności wymieszać 3/4 łyżeczki polimeru, trzy krople monomeru i jedną kroplę katalizatora w ceramicznej miseczce umieszczonej w lodzie. Nanieść mieszankę na płytkę głowową oraz czaszkę. Połączyć oba elementy i odczekać 5 min do zastygnięcia spoiwa.</li>
	<li>Wstrzyknąć antybiotyk (ceftiofur sodowy, 5 mg/kg, podskórnie), aby zapobiec infekcjom. Wyjąć mysz z ramy stereotaksycznej i umieścić ją na macie grzewczej do czasu wybudzenia. Po ustąpieniu działania anestezji oddać zwierzę do klatki domowej. W celu łagodzenia bólu podawać myszy wodę pitną zawierającą ibuprofen (0,5 mL/50 mL) przez 3 dni po zabiegu.</li>
</ol>
5. Implantacja zatyczki (Rysunek 2)
<ol>
	<li>Zaimplantuj zatyczkę 3 tygodnie po wstrzyknięciu wirusa. Znieczul mysz i unieruchom ją w aparacie stereotaksycznym, zgodnie z opisem w krokach 3.2-3.5. Przygotuj gąbkę żelatynową nasączoną solą fizjologiczną w celu zatamowania ewentualnych krwawień.</li>
	<li>Za pomocą mikrotrepanu wywierć otwór owalny o wymiarach 3 mm x 2 mm, którego środek znajduje się 0,5 mm za punktem lambda. Ścień krawędzie owalu, aż do pęknięcia kostnej barierki. Ścień czaszkę przed oknem rejestracyjnym, aby szkiełko nakrywowe znajdowało się jak najbliżej SC.</li>
	<li>Usuń płaty kostne za pomocą precyzyjnej pęsety. Wykonaj nacięcie opony twardej za zatoką poprzeczną i usuń fragment opony. W razie potrzeby, aby zapobiec wysychaniu, podaj do mózgu sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF) za pomocą strzykawki 3 mL. Osusz czaszkę i okno rejestracyjne gąbką żelatynową oraz patyczkami bawełnianymi.</li>
	<li>Nanieś kroplę kleju silikonowego do okna rejestracyjnego. Użyj przyssawki, aby utrzymać zatyczkę pod wpływem podciśnienia. Za pomocą zmotoryzowanego mikromanipulatora przesuń przyssawkę i opuść zatyczkę do kleju silikonowego, aż szkiełko nakrywowe dotknie czaszki. Następnie przesuń zatyczkę do przodu o ok. 1 mm, aby odsunąć zatokę poprzeczną i odsłonić SC. Krok ten należy wykonać w ciągu 1-2 min, zanim klej silikonowy stanie się lepki.</li>
	<li>Oczyść płytkę głowy, a następnie nałóż butylcyanoakrylan i cement żywiczny wokół krawędzi zatyczki, aby przymocować ją do płytki głowy. 
	UWAGA: Zapewnij opiekę pooperacyjną zgodnie z opisem w kroku 4.2.</li>
</ol>
6. Obrazowanie dwufotonowe (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Unieruchom głowę zwierzęcia na obrotowej bieżni za pomocą płytki nagłownej. Umieść bieżnię pod mikroskopem dwufotonowym i dostosuj wysokość do odpowiedniej pozycji. Umieść czarny aluminiowy stożek między obiektywem a płytką nagłowną, aby zapobiec zanieczyszczeniu światłem z monitora służącego do stymulacji wizualnej. Pozwól myszy na aklimatyzację przez ok. 15 min.</li>
	<li>Przeprowadź obrazowanie dwufotonowe na mikroskopie z obiektywem o powiększeniu 16x, aperturze numerycznej (NA) 0,8 i odległości roboczej (WD) 3 mm. Użyj lasera Ti:szafir z techniką blokady modów, sterowanego przez dwa skanery galwanometryczne, aby wzbudzić GCaMP6m przy 920 nm. Dostosuj moc lasera w płaszczyźnie próbki do zakresu 20-80 mW.</li>
	<li>Skanuj pole widzenia 600 µm x 600 µm z częstotliwością 4,8 Hz i rozdzielczością przestrzenną 2,4 µm/pixel, obrazując aktywność neuronalną na głębokości do 350 µm. 
	UWAGA: Częstotliwość próbkowania i rozdzielczość przestrzenna dotyczą skanerów galwanometrycznych i powinny zostać dostosowane w przypadku skanerów rezonansowych.</li>
	<li>Zbierz emitowaną fluorescencję za pomocą lustra dichroicznego i wykryj ją za pomocą lampy fotopowielaczowej (PMT) po przepuszczeniu przez filtr pasmowy.</li>
	<li>Rejestruj lokomocję myszy na bieżni za pomocą enkodera obrotowego. Użyj kamery z obiektywem 50 mm do zapisu wielkości i pozycji źrenicy. Zsynchronizuj te zapisy oraz akwizycję obrazów ze stymulacją wizualną, rejestrując triggery wysyłane przez komputer sterujący stymulacją.</li>
</ol>
7. Analiza odpowiedzi wapniowych mierzonych za pomocą obrazowania dwufotonowego
<ol>
	<li>Skoryguj ruchy mózgu podczas obrazowania, korzystając z narzędzi SIMA21 lub NoRMCorre22.</li>
	<li>Ręcznie wyznacz obszar zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia Cell Magic Wand (ImageJ), a następnie dopasuj do niego elipsę w programie MATLAB. Wyekstrahuj przebiegi fluorescencji dla każdego ROI po usunięciu zanieczyszczeń neuropilem: 
	<img alt="Wzór na obliczanie rzeczywistej fluorescencji, Ftrue=Fraw−r×Fneuropil." src="/files/ftp_upload/65181/65181eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1"> 
	Ftrue oraz Fraw to odpowiednio skorygowana i surowa amplituda fluorescencji ROI, Fneuropil to amplituda fluorescencji otaczającego neuropila, a r to współczynnik zanieczyszczenia neuropilem poza ogniskiem (0,7 dla naszej konfiguracji). Wartość r szacuje się poprzez pomiar sygnałów na naczyniu krwionośnym, dla którego Ftrue = 0, zgodnie z wcześniejszymi opisami23,24.</li>
	<li>Usuń powolne fluktuacje linii bazowej poprzez odjęcie wartości ósmego percentyla z 15 s okna wyśrodkowanego na każdej klatce25.</li>
	<li>Zdefiniuj odpowiedzi wzrokowe neuronu jako względną zmianę amplitudy fluorescencji w jego ROI podczas okresu stymulacji: 
	<img alt="Wzór na stosunek \( R = (F_{peak} - F_{baseline}) / F_{baseline} \); równanie do analizy danych." src="/files/ftp_upload/65181/65181eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 2"> 
	Fpeak  to maksymalna amplituda przebiegu fluorescencji podczas stymulacji wzrokowej, a Fbaseline to średnia amplituda w okresie 0,5 s przed stymulacją.</li>
</ol>
8. Obrazowanie w szerokim polu i analiza danych (Rysunek 4)
<ol>
	<li>Budowa makroskopu szerokopolowego z soczewką tandemową4 (Rysunek 4A). Makroskop z soczewkami tandemowymi składa się z dwóch obiektywów aparatów fotograficznych (50 mm i 105 mm) połączonych ze sobą poprzez adapter, a powiększenie wynosi ok. 2x.</li>
	<li>Przygotować myszy z mutantem części kory mózgowej zgodnie z opisem w krokach 3.2-3.5. Wstrzyknąć 100 nL AAV wykazującego ekspresję GCaMP6m na głębokość 200 µm na środku każdego boku SC.</li>
	<li>Po około 3 tygodniach wszczepia się szkiełko nakrywkowe o średnicy 5 mm nad korą wzgórza górnego (SC). Wykonuje się owalną kraniotomię o wymiarach 4 mm x 3 mm z centrum w miejscu SC i ścieńcza kość wokół niej. Następnie szkiełko nakrywkowe dociska się bezpośrednio do SC i utrwala cementem żywicznym.</li>
	<li>Wzbudź GCaMP6m za pomocą niebieskiej diody emitującej światło (LED) z filtrem wzbudzenia (469 nm ± 35 nm). Nabywaj obrazy przy użyciu kamery CMOS (complementary metal oxide semiconductor) po przejściu przez filtr emisyjny (525 nm ± 39 nm) z częstotliwością 10 Hz. Kamera obejmuje obszar o wymiarach 5,36 mm x 2,85 mm przy rozdzielczości przestrzennej wynoszącej 2.63 µm/pixel.</li>
	<li>Każdy pozyskany obraz należy poddać splotowi z znormalizowanym filtrem prostokątnym i przeskalować go w dół do 1/4 oryginalnego rozmiaru. Dla każdego piksela w obrazie należy zdefiniować odpowiedź, zgodnie z opisem w kroku 7.4. 
	UWAGA: Zapewnić opiekę pooperacyjną zgodnie z opisem w kroku 4.2.</li>
</ol>

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

<ol><li>May, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+superior+colliculus%3A+laminar+structure+and+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections.</a> Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).</li>
<li>Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tandem-lens+epifluorescence+macroscope%3A+Hundred-fold+brightness+advantage+for+wide-field+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging.</a> Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).</li>
<li>de Vries, S. E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+standardized+physiological+survey+reveals+functional+organization+of+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).</li>
<li>Mrsic-Flogel, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+map+of+visual+space+in+the+superior+colliculus+of+mice+lacking+early+retinal+waves%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).</li>
<li>Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+ephrin-as+and+structured+activity+in+the+development+of+functional+maps+in+the+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).</li>
<li>Feinberg, E. H., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+columns+in+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Orientation columns in the mouse superior colliculus.</a> Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).</li>
<li>Ahmadlou, M., Heimel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preference+for+concentric+orientations+in+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus.</a> Nature Communications. 6, 6773(2015).</li>
<li>de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinotopic+separation+of+nasal+and+temporal+motion+selectivity+in+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus.</a> Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).</li>
<li>Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+motion+direction+in+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus.</a> Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).</li>
<li>Gribizis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+cortex+gains+independence+from+peripheral+drive+before+eye+opening%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening.</a> Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).</li>
<li>Inayat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+in+the+most+superficial+lamina+of+the+mouse+superior+colliculus+are+highly+selective+for+stimulus+direction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).</li>
<li>Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+encoding+of+motion+contrast+in+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus.</a> eLife. 7, 35261(2018).</li>
<li>Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+locomotion+on+visual+responses+in+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).</li>
<li>Schröder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arousal+modulates+retinal+output%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Arousal modulates retinal output.</a> Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).</li>
<li>Ge, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+waves+prime+visual+motion+detection+by+simulating+future+optic+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow.</a> Science. 373 (6553), (2021).</li>
<li>Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+evidence+for+stereotypical+direction+columns+in+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus.</a> The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).</li>
<li>Kasai, M., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+light+isoflurane+anesthesia+on+organization+of+direction+and+orientation+selectivity+in+the+superficial+layer+of+the+mouse+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus.</a> The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apical+complex+couples+cell+fate+and+cell+survival+to+cerebral+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development.</a> Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).</li>
<li>Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Python+software+for+analysis+of+dynamic+fluorescence+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data.</a> Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80(2014).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NoRMCorre%3A+An+online+algorithm+for+piecewise+rigid+motion+correction+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data.</a> Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).</li>
<li>Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+tuned+response+properties+of+diverse+inhibitory+neuron+subtypes+in+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex.</a> Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).</li>
<li>Göbel, W., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+neural+network+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of neural network function.</a> Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li>
<li>Evans, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synaptic+threshold+mechanism+for+computing+escape+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions.</a> Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytyczne kroki w protokole Najbardziej krytycznym krokiem jest kraniotomia w krokach 5.2 i 5.3. Po pierwsze, kość znajdująca się 0,5 mm za lambdą jest gruba i ma w środku naczynia krwionośne, które mogą powodować krwawienie podczas wiercenia. Należy przygotować odpowiednią piankę żelową, aby zatamować krwawienie. Po drugie, istnieje duża szansa na krwotoczność naczynioruchową podczas usuwania kości tuż nad zatoką poprzeczną. W celu rozwiązania problemu jednym z alternatywnych podejść jest rozrzedze...

Górny wzgórek (SC) jest ważnym ośrodkiem wzrokowym u wszystkich kręgowców. U ssaków otrzymuje bezpośrednie dane wejściowe z siatkówki i kory wzrokowej1. Podczas gdy zapis optyczny jest szeroko stosowany w cortex2,3,4,5, jego zastosowanie w SC jest utrudnione przez słabe dostępy optyczne6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowych informacji na temat dwóch uzupełniających się metod optycznego rejestrowania aktywności neuronalnej w SC.
SC znajduje się poniżej kory i zatoki poprzecznej, co ogranicza optyczny dostęp do neuronów obojczykowych. Jednym ze sposobów przezwyciężenia tego ograniczenia jest zassanie kory nakładającej i odsłonięcie przednio-bocznej SC7,9,10,13,14,19. Ponieważ jednak SC otrzymuje bodźce korowe, taka operacja może wpływać na to, jak neurony SC reagują na bodźce wzrokowe. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, szczegółowo opisujemy tutaj alternatywny protokół obrazowania powierzchownej warstwy tylno-przyśrodkowej SC za pomocą wtyczki krzemowej, pozostawiając korę nienaruszoną8,11. W szczególności, aby osiągnąć rozdzielczość pojedynczej komórki, zastosowaliśmy mikroskopię dwufotonową do zobrazowania odpowiedzi wapnia w tylno-przyśrodkowym SC myszy typu dzikiego. Ponadto, aby uzyskać szeroki zasięg, zastosowaliśmy mikroskopię szerokokątną, aby zobrazować cały SC zmutowanej myszy, której tylna kora nie rozwinęła się20.
Dwie metody opisane w tym protokole wzajemnie się uzupełniają. Dwufotonowe obrazowanie wapnia bez ablacji kory mózgowej jest odpowiednie do rejestrowania aktywności neuronalnej w rozdzielczości pojedynczej komórki z nienaruszonymi danymi wejściowymi kory mózgowej. Obrazowanie wapnia w szerokim polu widzenia jest odpowiednie do rejestrowania aktywności neuronalnej w całym SC przy jednoczesnym poświęceniu rozdzielczości przestrzennej.

<table><tbody><tr><td>16-krotny obiektyw</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50-mm</td><td>obiektyw Computar</td><td>M5018-MP2</td><td></td></tr><tr><td>5-mm szkiełko nakrywkowe</td><td>Warner instruments</td><td>CS-5R filtr</td><td></td></tr><tr><td>pasmowo-przepustowy</td><td>Chroma Technology</td><td>HQ575/250 m-2p</td><td></td></tr><tr><td>cyjanoakrylan butylu</td><td>Vetbond, World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kamera do monitorowania źrenicy</td><td>Kamera FLIR</td><td>BFS-U3-04S2M-CS</td><td></td></tr><tr><td>do obrazowania szerokokątnego</td><td>Basler</td><td>acA2000-165 i mikro; m</td><td></td></tr><tr><td>obróbka koronowa</td><td>Electro-Technic Products</td><td>BD-20AC</td><td></td></tr><tr><td>dichroiczny</td><td>Chroma Technology</td><td>T600/200dcrb&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>galwanometry</td><td>Cambridge Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sterylizator kulek szklanych</td><td>RWD</td><td>RS1502</td><td></td></tr><tr><td>mikrowiertło</td><td>RWD</td><td>78001</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>Lampa</td> fotopowielacza QUAD <td></td></tr> Koder rotory <tr><td></td><td>Hamamatsu</td><td>R3896</td><td></td></tr><tr><td></td><td>USdigital</td><td>MA3-A10-125-N</td><td></td></tr><tr><td>Samoutwardzalny cement z żywicy adhezyjnej do zębów&nbsp;</td><td>SuperBond C& B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japonia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>termostatyczna poduszka grzewcza&nbsp;</td><td>RWD</td><td>69020</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Szafirowy laser</td><td>Spectra-Physics</td><td>Mai Tai HP DeepSee</td><td></td></tr><tr><td>półprzezroczysty klej silikonowy&nbsp;</td><td>Kwik-Sil, bieżnia World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Xinglin Biology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szczepy wirusa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m</td><td>Vector Core w Chińskim Instytucie Badań nad Mózgiem, Pekin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J typ</td> <td>dzikiCentrum Zasobów Laboratoryjnych dla Zwierząt w Chińskim Instytucie Badań nad Mózgiem, Pekin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMX1-CRE</td><td>Laboratorium Jacksona&nbsp;</td><td>5628</td><td></td></tr><tr><td>Pals1flox/wt</td><td>Christopher A. Walsh Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH Image</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie wapnia u myszy superior colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Wzgórek górny (SC), ewolucyjnie zachowana struktura śródmózgowia u wszystkich kręgowców, jest najbardziej wyrafinowanym centrum wzrokowym przed pojawieniem się kory mózgowej. Otrzymuje bezpośrednie dane wejściowe z ~30 typów komórek zwojowych siatkówki (RGC), z których każda koduje określoną cechę wizualną. Pozostaje nieuchwytne, czy SC po prostu dziedziczy cechy siatkówki, czy też w SC dochodzi do dodatkowego i potencjalnie de novo przetwarzania. Aby ujawnić neuronalne kodowanie informacji wizualnych w SC, przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół optycznego rejestrowania reakcji wizualnych za pomocą dwóch uzupełniających się metod u obudzonych myszy. Jedna metoda wykorzystuje mikroskopię dwufotonową do obrazowania aktywności wapnia w rozdzielczości pojedynczej komórki bez ablacji kory nakładającej, podczas gdy druga wykorzystuje mikroskopię szerokokątną do zobrazowania całego SC zmutowanej myszy, której kora jest w dużej mierze nierozwinięta. Protokół ten szczegółowo opisuje te dwie metody, w tym przygotowanie zwierząt, wstrzyknięcie wirusa, implantację płytki czołowej, implantację zatyczki, pozyskiwanie danych i analizę danych. Reprezentatywne wyniki pokazują, że dwufotonowe obrazowanie wapnia ujawnia wizualnie wywołane reakcje neuronalne w rozdzielczości pojedynczej komórki, a obrazowanie wapnia w szerokim polu ujawnia aktywność neuronalną w całym SC. Łącząc te dwie metody, można ujawnić kodowanie neuronalne w SC w różnych skalach, a taka kombinacja może być również zastosowana do innych obszarów mózgu.

Rysunki 1A,B przedstawiają odpowiednio sposób wykonania przyssawki oraz korków. Rysunek 2 pokazuje, jak pomyślnie zaimplantować korek. Po implantacji korka odsłonięta zostaje tylno-przyśrodkowa część SC, co przedstawiono na Rysunku 2D. Rysunek 3 przedstawia odpowiedzi wapniowe neuronów SC u przykładowej myszy typu dzikiego, obrazowane za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Pryzmat trójkątn...

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Moje badania koncentrują się na kodowaniu neuronalnym mechanizmów przetwarzania wzrokowego. Próbujemy zrozumieć, w jaki sposób informacja wzrokowa jest kodowana w mózgu, zwłaszcza w wzgórku górnym pod podstawowymi neuromechanizmami. Aby zrozumieć przetwarzanie wzrokowe, naukowcy łączą różne podejścia, w tym morfologię neuronów, śledzenie następcze i wsteczne, sekwencjonowanie IL, modelowanie neuronowe, uczenie maszynowe i tak dalej.Wyzwaniem jest usunięcie nad cięciem SSA, a podniesienie kości w jednym dużym kawałku prawdopodobnie się nie powiedzie, ponieważ kość jest przymocowana do opony twardej. Łącząc dwa zdjęcia na szerokokątnym obrazie wapnia, nasze ostatnie prace ujawniły architekturę funkcyjną kierunku ruchu w myszy, zarówno w rozdzielczości pojedynczej komórki, jak i w skali globalnej. Odkryliśmy, że neurony mają podobną preferencję od plam do 500 mikrometrów w biopsji globalnej do w górę w ruchu nosa.W naszym protokole dostosowujemy dwa limity badań. Po pierwsze, naukowcy mogą przeprowadzić długoterminowe obrazowanie wapnia w mysim SC w rozdzielczości pojedynczej komórki bez przerywania kory mózgowej. Po drugie, naukowcy mogą rejestrować neuroaktywność w całym SC za pomocą mikroskopii szerokokątnej.Nasz protokół zapewnia laser do obrazowania tylnego przyśrodkowego SC w rozdzielczości pojedynczej komórki z nienaruszoną korą u myszy typu dzikiego. Używamy również biokompatybilnej zatyczki do odsłonięcia SC, co zmniejsza efekt w przypadku przewlekłego obrazowania. Nasze wyniki pozwalają badać neuronalne kodowanie informacji wizualnych w dużym polu widzenia.W połączeniu z optogenetyką można badać połowę danych wejściowych z różnych regionów mózgu modulujących neuroaktywność w SC. Rozpocznij proces tworzenia przyssawki, umieszczając kroplę PBS w akrylowym naczyniu. Użyj płaskiej igły o rozmiarze 21, aby wypełnić końcówkę igły PBS przez kapilarność. Przykryj końcówkę igły półprzezroczystym klejem silikonowym i ustaw na około 10 minut.Przytnij klej silikonowy nożyczkami do dysku o średnicy dwóch milimetrów. Aby przygotować zatyczki, weź plastikową podkładkę o grubości 0,75 milimetra i wytnij kwadrat jeden na jeden centymetr pośrodku. Wyczyść podkładkę podporową i dwa bloki akrylowe alkoholem i przetrzyj je papierem do soczewek.Umieść podkładkę na jednym bloku akrylowym i nałóż klej silikonowy na środku, aby wypełnić 90% otworu. Dodaj kolejny blok akrylowy. Zastosuj około jednego kilograma siły i odczekaj 20 minut.Pod mikroskopem chirurgicznym pokrój klej silikonowy skalpelem na trójkątne pryzmaty o wymiarach 1,5 milimetra. Usuń kurz z trójkątnych pryzmatów za pomocą lepkiej plastikowej taśmy i umieść je na szklanym szkiełku nakrywkowym. Umieść szkiełko nakrywkowe z trójkątnymi pryzmatami pod obróbką koronową i włącz ją.Zbliż urządzenie do obróbki koronowej do szkiełka nakrywkowego, aż pojawi się błyskawica i przytrzymaj je w tej pozycji przez kilka minut, aż pryzmaty i szkiełko nakrywkowe zostaną przymocowane. Po umieszczeniu zatyczek na szalce Petriego inkubować przez noc w temperaturze 70 stopni Celsjusza. Zacznij od zamocowania znieczulonej myszy na stereotaktycznej ramie za pomocą nauszników.Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu i utrzymać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 stopni Celsjusza za pomocą termostatycznej poduszki grzewczej. Po ogoleniu sierści i wysterylizowaniu miejsca operowanego wstrzyknij lidokainę, tylidynę i meloksykam. Po usunięciu skóry nad SC wyczyść czaszkę bawełnianym wacikiem.Dostosuj ramkę stereotaktyczną, aż powierzchnia czaszki będzie płaska. Za pomocą wiertła wykonaj otwór 0,5 milimetra z boku i 0,42 milimetra z przodu do lambdy, aż opona twarda zostanie odsłonięta. Wstrzyknąć wirusa związanego z adenowirusem lub GCaMP6m z ekspresją AAV na głębokość jednego milimetra i 1,6 milimetra od lambda za pomocą mikropipety ze ściętego szkła.Po wstrzyknięciu należy powoli wyjąć wstrzykiwacz i przystąpić do implantacji płytki głowy. Po wstrzyknięciu konstruktu wirusowego do mózgu myszy należy oczyścić mięśnie i tkanki nad czaszką i podrapać czaszkę ostrzem. Przygotuj cement z żywicy adhezyjnej dentystycznej, mieszając trzy czwarte łyżki polimeru, trzy krople monomeru i jedną kroplę katalizatora w ceramicznej misce na lodzie.Nałóż mieszaninę na płytę głowy i czaszkę. Przymocuj je i poczekaj, aż klej stwardnieje przez pięć minut. Na koniec wstrzyknij antybiotyki, aby zapobiec infekcjom.Po wyjęciu myszy z ramki stereotaktycznej umieść ją na poduszce grzewczej w celu odzyskania i wróć do klatki domowej po wyzdrowieniu ze znieczulenia. Trzy tygodnie po infekcji wirusowej znieczulij i przymocuj mysz za pomocą płytki na głowę do ramy stereotaktycznej. Namocz piankę żelową w soli fizjologicznej, aby zatrzymać potencjalne krwawienie.Użyj mikrowiertła, aby utworzyć owal o wymiarach trzy na dwa milimetry wyśrodkowany w odległości 0,5 milimetra za lambdą. Rozcieńczyć granicę owalu, aż pęknie, a następnie rozrzedzić czaszkę przed owalnym oknem nagrywania, aby zamknąć szkiełko nakrywkowe do SC. Za pomocą cienkich kleszczy zdejmij płaty kostne. Wykonaj cięcie opony twardej z tyłu zatoki poprzecznej i usuń kawałek opony twardej.Osusz czaszkę i okienko nagrywania pianką żelową i wacikami, a następnie wlej kroplę kleju silikonowego do okienka nagrywania. Użyj przyssawki, aby przytrzymać wtyczkę z podciśnieniem i użyj zmotoryzowanego mikromanipulatora, aby przesunąć przyssawkę i opuść wtyczkę do kleju silikonowego, aż szkiełko nakrywkowe dotknie czaszki. Po oczyszczeniu płyty głowicy nałóż cyjanoakrylan butylu i cement żywiczny wokół granicy korka, aby przymocować go do płyty głowicy i przystąp do obrazowania.Po wszczepieniu płyty czołowej i wtyczki zabezpiecz zwierzę na bieżni obrotowej za pomocą płyty czołowej. Umieść bieżnię pod mikroskopem dwufotonowym i ustaw wysokość w odpowiedniej pozycji. Umieść czarną aluminiową membranę między obiektywem a płytą główną, aby zapobiec zanieczyszczeniu światłem monitora w celu stymulacji wizualnej.Aby wykonać obrazowanie dwufotonowe, dostosuj moc lasera na płaszczyźnie próbki w zakresie od 20 do 80 miliwatów. Skanuj pole widzenia o wymiarach 600 na 600 mikrometrów przy częstotliwości 4,8 Hz, z rozdzielczością przestrzenną 2,4 mikrometra na piksel i aktywnością neuronalną obrazu do głębokości 350 mikrometrów. Za pomocą enkodera obrotowego rejestruj ruch myszy na bieżni.Użyj aparatu z obiektywem o ogniskowej 50 mm, aby zarejestrować rozmiar i położenie źrenicy. Na koniec zsynchronizuj te nagrania i akwizycje obrazów ze stymulacją wizualną, nagrywając wyzwalacze wysyłane przez komputer stymulacyjny. Przedstawiono odpowiedzi wapniowe neuronów SC myszy typu dzikiego oraz projekcję odchylenia standardowego fluorescencji na obrazach.Na początek wstrzyknij 100 nanolitrów GCaMP6M z ekspresją AAV na głębokości 200 mikrometrów w środku każdej strony SC zmutowanej myszy, której tylna kora nie rozwinęła się. Po około trzech tygodniach wszczepić szkiełko nakrywkowe o średnicy pięciu milimetrów na SC. Po zamocowaniu szkiełka nakrywkowego należy uzyskać obrazy za pomocą kamery CMOS po przejściu filtra emisyjnego z częstotliwością 10 Hz. Reakcje wapniowe neuronów SC od myszy z częściowym mutantem kory mózgowej zobrazowano za pomocą mikroskopii szerokokątnej.Uzyskany obraz został poddany próbkowaniu w dół do jednej czwartej oryginalnego rozmiaru i pokazano wizualnie wywołane reakcje wapnia.

calcium-imaging-in-mouse-superior-colliculus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Źródło: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Ten film pokazuje wapń obrazowanie w celu wizualizacji i analizy aktywności neuronów jelitowych i gleju w preparatach splotu mięśniowo-mięśniowego okrężnicy myszy.

Obrazowanie wapnia aktywności neuronów jelitowych i gleju w splocie mięśniowym okrężnicy myszy

Źródło: Bancroft, E. A., et al. Kwantyfikacja spontanicznych strumieni ca2+{ i ich dalsze efekty w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy. J. Vis. Exp. (2020) {{TAG_ 46}}Ten film pokazuje wizualizację w czasie rzeczywistym napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy. Wykorzystując wektor wirusowy do ekspresji wskaźnika wapnia, neurony są obrazowane pod mikroskopem konfokalnym w celu śledzenia zmian intensywności fluorescencji podczas spontanicznej i...

Wizualizacja napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy

Źródło: Lee, H. et. al., Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje obrazowanie wapnia in vivo u myszy przy użyciu gradientowego współczynnika załamania światła lub soczewki GRIN i zminiaturyzowanego mikroskopu. Konfiguracja łączy mocowanie głowy w beztarciowym mobilnym systemie klatek, stymulując neurony i wyzwalając napływ jonów wapnia. Soczewka GRIN...

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszającej się myszy

Źródło: Thapa, R., et. al., Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewki o indeksie gradientowym dla głębokiego mózgu In vivo Obrazowanie wapnia.  J. Vis. Exp. (2021)Film demonstruje obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą miniskopu u transdukowanej myszy, korelując aktywność neuronów z zachowaniem.

Obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym przyśrodkowej kory przedczołowej myszy za pomocą miniskopu

Używając wielu kątów do cięcia mózgu szczeniaka myszy, ulepszamy poprzednio opisany ostry wycinek mózgu, który rejestruje połączenia między większością głównych struktur słuchowych śródmózgowia i przodomózgowia.

Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne

Opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą podwójnych okien optycznych nad obustronnymi głównymi korami somatosensorycznymi (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P) in vivo.

Obrazowanie aktywności neuronalnej w pierwotnej korze somatosensorycznej przy użyciu transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s

Tutaj prezentujemy, jak odsłonić kolankowaty ganglion żywej, znieczulonej myszy laboratoryjnej i jak wykorzystać obrazowanie wapnia do pomiaru reakcji zespołów tych neuronów na bodźce smakowe, co pozwala na wielokrotne próby z różnymi stymulantami. Pozwala to na dogłębne porównania, które neurony reagują na które degustacje.

Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Zakręt zębaty hipokampa pełni podstawowe i odrębne funkcje w uczeniu się i pamięci. Protokół ten opisuje zestaw solidnych i skutecznych procedur obrazowania in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym u swobodnie poruszających się myszy.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

Poznaj metodę obrazowania wapnia w kolikulusie górnym myszy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej i szerokopolowej. Technika umożliwia rejestrację aktywności pojedynczych neuronów z zachowaniem integralności kory mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Przeglądaj więcej filmów