Name: Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Poznaj metody niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków w warunkach hipoksji. Protokoły te wykorzystują spektrometrię masową i izotopowe znakowanie do badania adaptacji metabolicznej komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Figury wykonane w tym manuskrypcie zostały stworzone za pomocą BioRender.com. Jesteśmy wdzięczni Amy Walker za przekazanie opinii na temat tego artykułu. Projekt J.B.S. był wspierany przez Worcester Foundation for Biomedical Research Grant.

Stable Isotope Tracing & LC-MS Analysis to Measure DHODH and SDH Activities

<ol><li>Spinelli, J. B., Haigis, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+contributions+of+mitochondria+to+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The multifaceted contributions of mitochondria to cellular metabolism.</a> Nature Cell Biology. 20 (7), 745-754 (2018).</li>
<li>Gorman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial diseases.</a> Nature Reviews Disease Primers. 2, 16080(2016).</li>
<li>Chandel, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+generated+at+mitochondrial+complex+III+stabilize+hypoxia-inducible+factor-1alpha+during+hypoxia%3A+A+mechanism+of+O2+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species generated at mitochondrial complex III stabilize hypoxia-inducible factor-1alpha during hypoxia: A mechanism of O2 sensing.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (33), 25130-25138 (2000).</li>
<li>Cadenas, E., Boveris, A., Ragan, C. I., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+superoxide+radicals+and+hydrogen+peroxide+by+NADH-ubiquinone+reductase+and+ubiquinol-cytochrome+C+reductase+from+beef-heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Production of superoxide radicals and hydrogen peroxide by NADH-ubiquinone reductase and ubiquinol-cytochrome C reductase from beef-heart mitochondria.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 180 (2), 248-257 (1977).</li>
<li>Murphy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+mitochondria+produce+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">How mitochondria produce reactive oxygen species.</a> Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li>
<li>Spinelli, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fumarate+is+a+terminal+electron+acceptor+in+the+mammalian+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain.</a> Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+redox+cycle+with+complex+II+prioritizes+sulfide+quinone+oxidoreductase-dependent+H%282%29S+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A redox cycle with complex II prioritizes sulfide quinone oxidoreductase-dependent H(2)S oxidation.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (1), 101435(2022).</li>
<li>Warburg, O., Geissler, A. W., Lorenz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+growth+of+cancer+cells+in+media+in+which+glucose+is+replaced+by+galactose%5BTitle%5D)+AND+%22Hoppe-Seyler%27s+Zeitschrift+f%C3%BCr+Physiologische+Chemie%22%5BJournal%5D)">On growth of cancer cells in media in which glucose is replaced by galactose.</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 348 (12), 1686-1687 (1967).</li>
<li>Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+the+Crabtree+effect%3A+replacing+media+glucose+with+galactose+increases+susceptibility+of+HepG2+cells+to+mitochondrial+toxicants%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants.</a> Toxicological Sciences. 97 (2), 539-547 (2007).</li>
<li>Attardi, G., King, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cells+lacking+mtDNA%3A+Repopulation+with+exogenous+mitochondria+by+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human cells lacking mtDNA: Repopulation with exogenous mitochondria by complementation.</a> Science. 246 (4929), 500-503 (1989).</li>
<li>Bodnar, A. G., Cooper, M., Leonard, J. V., Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory-deficient+human+fibroblasts+exhibiting+defective+mitochondrial+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Respiratory-deficient human fibroblasts exhibiting defective mitochondrial DNA replication.</a> Biochemical Journal. 305, 817-822 (1995).</li>
<li>Gregoire, M., Morais, R., Quilliam, M. A., Gravel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+auxotrophy+for+pyrimidines+of+respiration-deficient+chick+embryo+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">On auxotrophy for pyrimidines of respiration-deficient chick embryo cells.</a> European Journal of Biochemistry. 142 (1), 49-55 (1984).</li>
<li>Mackay, G. M., Zheng, L., vanden Broek, N. J., Gottlieb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+metabolism+using+LC-MS+and+isotope+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell metabolism using LC-MS and isotope tracers.</a> Methods in Enzymology. 561, 171-196 (2015).</li>
<li>Heinrich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+for+natural+isotope+abundance+and+tracer+impurity+in+MS-%2C+MS%2FMS-+and+high-resolution-multiple-tracer-data+from+stable+isotope+labeling+experiments+with+IsoCorrectoR%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Correcting for natural isotope abundance and tracer impurity in MS-, MS/MS- and high-resolution-multiple-tracer-data from stable isotope labeling experiments with IsoCorrectoR.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17910(2018).</li>
<li>Lee, P., Chandel, N. S., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adaptation+to+hypoxia+through+hypoxia+inducible+factors+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular adaptation to hypoxia through hypoxia inducible factors and beyond.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (5), 268-283 (2020).</li>
<li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+can+shuttle+reducing+power+from+the+hypoxic+retina+to+the+O%282%29-rich+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate can shuttle reducing power from the hypoxic retina to the O(2)-rich pigment epithelium.</a> Cell Reports. 31 (2), 107606(2020).</li>
<li>Angebault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idebenone+increases+mitochondrial+complex+I+activity+in+fibroblasts+from+LHON+patients+while+producing+contradictory+effects+on+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Idebenone increases mitochondrial complex I activity in fibroblasts from LHON patients while producing contradictory effects on respiration.</a> BMC Research Notes. 4, 557(2011).</li>
<li>Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Methods in Cell Biology. 155, 3-31 (2020).</li>
<li>Iwai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+accumulation+during+ischemia+induces+mitochondrial+damage+in+perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Sodium accumulation during ischemia induces mitochondrial damage in perfused rat hearts.</a> Cardiovascular Research. 55 (1), 141-149 (2002).</li>
<li>Murphy, E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+and+mitochondrial+sodium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular and mitochondrial sodium in health and disease.</a> Circulation Research. 104 (3), 292-303 (2009).</li>
<li>Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+mitochondria+from+cultured+cells+and+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52076(2015).</li>
<li>Murphy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+measuring+reactive+oxygen+species+and+oxidative+damage+in+cells+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo.</a> Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).</li>
<li>Xiao, Y., Meierhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Are+hydroethidine-based+probes+reliable+for+reactive+oxygen+species+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Are hydroethidine-based probes reliable for reactive oxygen species detection.</a> Antioxidants and Redox Signaling. 31 (4), 359-367 (2019).</li>
<li>DeBerardinis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+aerobic+glycolysis%3A+Transformed+cells+can+engage+in+glutamine+metabolism+that+exceeds+the+requirement+for+protein+and+nucleotide+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Beyond aerobic glycolysis: Transformed cells can engage in glutamine metabolism that exceeds the requirement for protein and nucleotide synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19345-19350 (2007).</li>
<li>Keeley, T. P., Mann, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+physiological+normoxia+for+improved+translation+of+cell+physiology+to+animal+models+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Defining physiological normoxia for improved translation of cell physiology to animal models and humans.</a> Physiological Reviews. 99 (1), 161-234 (2019).</li>
<li>Ast, T., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+mammalian+cell+culture%3A+Are+we+repeating+the+experiment+of+Dr.+Ox%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxygen and mammalian cell culture: Are we repeating the experiment of Dr. Ox.</a> Nature Metabolism. 1 (9), 858-860 (2019).</li>
<li>Gu, C., Jun, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+hypoxia+decrease+the+metabolic+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Does hypoxia decrease the metabolic rate.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 668(2018).</li>
<li>Voorde, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+metabolic+fidelity+of+cancer+models+with+a+physiological+cell+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Advances%22%5BJournal%5D)">Improving the metabolic fidelity of cancer models with a physiological cell culture medium.</a> Scientific Advances. 5 (1), 7314(2019).</li>
<li>Cantor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiologic+medium+rewires+cellular+metabolism+and+reveals+uric+acid+as+an+endogenous+inhibitor+of+UMP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Physiologic medium rewires cellular metabolism and reveals uric acid as an endogenous inhibitor of UMP synthase.</a> Cell. 169 (2), 258-272 (2017).</li>
<li>MacPherson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+relevant+T+cell+expansion+media+activate+distinct+metabolic+programs+uncoupled+from+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Clinically relevant T cell expansion media activate distinct metabolic programs uncoupled from cellular function.</a> Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 24, 380-393 (2022).</li>
<li>Torres-Quesada, O., Doerrier, C., Strich, S., Gnaiger, E., Stefan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+cell+culture+media+tune+mitochondrial+bioenergetics+and+drug+sensitivity+in+cancer+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Physiological cell culture media tune mitochondrial bioenergetics and drug sensitivity in cancer cell models.</a> Cancers. 14 (16), 3917(2022).</li>
<li>Chan, S. W., Chen, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mtDNA+damage+using+a+supercoiling-sensitive+qPCR+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring mtDNA damage using a supercoiling-sensitive qPCR approach.</a> Methods in Molecular Biology. 554, 183-197 (2009).</li>
<li>Doherty, E., Perl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+mass+by+flow+cytometry+during+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Reactive+Oxygen+Species%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial mass by flow cytometry during oxidative stress.</a> Reactive Oxygen Species. 4 (10), 275-283 (2017).</li>
<li>Birsoy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain+in+cell+proliferation+is+to+enable+aspartate+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An essential role of the mitochondrial electron transport chain in cell proliferation is to enable aspartate synthesis.</a> Cell. 162 (3), 540-551 (2015).</li>
<li>Beigneux, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-citrate+lyase+deficiency+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">ATP-citrate lyase deficiency in the mouse.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (10), 9557-9564 (2004).</li>
<li>Gameiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+HIF-mediated+reductive+carboxylation+is+regulated+by+citrate+levels+and+sensitizes+VHL-deficient+cells+to+glutamine+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo HIF-mediated reductive carboxylation is regulated by citrate levels and sensitizes VHL-deficient cells to glutamine deprivation.</a> Cell Metabolism. 17 (3), 372-385 (2013).</li>
<li>Fendt, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+glutamine+metabolism+is+a+function+of+the+alpha-ketoglutarate+to+citrate+ratio+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Reductive glutamine metabolism is a function of the alpha-ketoglutarate to citrate ratio in cells.</a> Nature Communications. 4, 2236(2013).</li>
<li>Lee, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+studies+of+isolated+mitochondria+from+normal+and+diseased+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Biochemical studies of isolated mitochondria from normal and diseased tissues.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1271 (1), 21-28 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zgłaszania konfliktu interesów.

Ponieważ nowe badania pokazują, że mitochondria ssaków mogą funkcjonować bez zużywania tlenu cząsteczkowego, niezwykle ważne jest, aby naukowcy zastosowali testy ortogonalne, wykraczające poza pomiary OCR, w celu dokładnego ilościowego określenia funkcji mitochondriów. Tutaj opracowaliśmy serię testów, które można wykorzystać do bezpośredniej oceny aktywności kompleksu I, kompleksu II, kompleksu V i DHODH poprzez pomiar równowagi mitochondrialnej NAD + / NADH, wykorzystanie adaptacyjnych końcowych akceptorów elektronów, produkcję ATP, biosyntezę pirymidyny de novo i ROS pochodzącą z mitochondriów. Warto zauważyć, że testy te bardziej bezpośrednio mierzą funkcję mitochondriów niż pomiary OCR. Co więcej, testy te zapewniają naukowcom wykonalne sposoby ilościowego określania funkcji mitochondriów podczas niedotlenienia, dla których pomiary OCR są w dużej mierze nieistotne ze względu na użycie fumaranu jako preferowanego końcowego akceptora elektronów. Wreszcie, opisane tutaj metody oparte na proliferacji są bardziej opłacalne niż klasyczne eksperymenty respirometryczne, zapewniając w ten sposób szeroko dostępny sposób badania funkcji mitochondriów w systemach ssaków.
Istnieją kluczowe kwestie związane z wykorzystaniem tych testów do pomiaru funkcji mitochondriów w hodowanych komórkach. Jeśli chodzi o testy proliferacji, ważne jest, aby dostosować liczbę wysiewanych komórek do szybkości podwajania każdej linii komórkowej. Komórki powinny być wysiane do co najmniej 10% zbiegu i z wystarczającą ilością miejsca, aby umożliwić trzy do czterech podwojeń, aby można było określić ilościowo różnice w proliferacji. Innym czynnikiem branym pod uwagę przy każdym teście jest stężenie małych cząsteczek stosowanych jako kontrola aktywności każdego kompleksu ETC. Ponieważ różne linie komórkowe mogą wykazywać różną wrażliwość na te inhibitory, bardzo ważne jest przetestowanie dawki tych małych cząsteczek w celu określenia optymalnego stężenia.
Uniwersalnym ograniczeniem testów badających funkcję mitochondriów in vitro, w tym pomiarów OCR i wszystkich opisanych tutaj testów, jest skład metaboliczny pożywki. Standardowa pożywka do hodowli komórkowych ma tendencję do skłaniania systemów do powierzchownie wysokich poziomów funkcji mitochondriów. Na przykład suprafizjologiczny poziom glutaminy zwiększa jej anaplerozę cyklu TCA25, co napędza mitochondrialną syntezę NADH, a w konsekwencji zwiększa fosforylację oksydacyjną. Podobnie ciśnienie parcjalne tlenu waha się od 3 mmHg do 100 mmHg (około 0,1%-13%O2) w tkankach ssaków, ale jest atmosferyczne (140 mmHg, około 21%) in vitro26,27. Ten nadmiarO2 maksymalizuje wydolność oddechową mitochondriów i produkcję ponadtlenków28. Ostatnio podjęto wysiłki w celu zaprojektowania pożywek hodowlanych tak, aby były bardziej fizjologiczne29,30. Warto zauważyć, że hodowla komórek w pożywkach podobnych do ludzkiego osocza zmniejsza oddychanie mitochondrialne w niektórych liniach komórek rakowych30, mitochondrialne ROS w limfocytach T31 i adaptacje mitochondriów do terapii przeciwnowotworowych32. Dlatego tak ważne jest, aby zwracać uwagę na skład używanych pożywek hodowlanych i zrozumieć, w jaki sposób może to wpływać na funkcję mitochondriów.
Kolejnym ważnym i uniwersalnym ograniczeniem w interpretacji funkcji mitochondriów jest możliwość wystąpienia różnic w liczbie mitochondriów. Dlatego tak ważne jest zmierzenie zawartości mitochondriów poprzez kwantyfikację mtDNA33, pomiar masy mitochondriów za pomocą barwników niewrażliwych na potencjał błonowy34 lub western blot markerów mitochondrialnych. Jest to krytyczna kontrola, aby zmniejszenie liczby mitochondriów nie było mylone ze spadkiem funkcji mitochondriów.
Istnieją również określone ograniczenia i rozwiązywanie problemów, które mają zastosowanie do opisanych tutaj testów. Po pierwsze, biorąc pod uwagę, że zróżnicowane komórki nie proliferują, testy oparte na proliferacji nie będą przydatne do oceny funkcji mitochondriów w tym kontekście. Kluczowym ograniczeniem protokołu śledzenia 13C 4-asparaginianu w celu pomiaru aktywności DHODH jest to, że wychwyt asparaginianu w komórkach może być bardzo nieefektywny35. Aby przezwyciężyć to potencjalne ograniczenie, naukowcy mogą nadekspresję transportera asparaginianu, SLC1A3, aby ułatwić wychwyt 13C 4-asparaginianu35.
Ograniczeniem protokołu wykorzystującego śledzenie 13C 5-glutaminy do pomiaru aktywności SDH jest to, że test ten wymaga od komórek wykorzystania szlaku redukcyjnej karboksylacji w celu wzbogacenia izotopologów M + 3 w celu pomiaru aktywności odwrotnej. Niektóre linie komórkowe nie są zdolne do redukcyjnego strumienia karboksylacji z powodu niskiej ekspresji liazy cytrynianu ATP36, niewystarczającej stabilizacji HIF37 lub zbyt niskiego stosunku α-KG:cytrynian38. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, można wykorzystać śledzenie 13C 4-asparaginianu do pomiaru aktywności SDH do przodu i do tyłu7. W tym teście aktywność do przodu SDH można zmierzyć za pomocą stosunku fumaranu M + 2: bursztynianu M + 2 i reakcji odwrotnej przez bursztynian M + 4: fumaran M + 4. Warto zauważyć, że to śledzenie omija większość enzymów w szlaku redukcyjnej karboksylacji.
Ograniczeniem testu aktywności kompleksu I wykorzystującego redukcję DCPIP jako odczyt jest to, że mitochondria nie są strukturalnie nienaruszone. Proces zamrażania i rozmrażania mitochondriów, aby umożliwić ich wychwyt NADH do testu, może z pewnością nadszarpnąć integralność strukturalną błony mitochondrialnej39. Test ten powinien być wykonywany równolegle z testami, takimi jak test proliferacji kompleksu I, aby upewnić się, że obserwowane zmiany w aktywności kompleksu I są również prawdziwe w przypadku nienaruszonych komórek.
W przyszłych badaniach niektóre z tych technik mogą zostać zaadaptowane do pomiaru funkcji mitochondriów in vivo przy użyciu organizmów modelowych, takich jak myszy i Caenorhabditis elegans. Obecne metody stosowane do pomiaru funkcji mitochondriów in vivo koncentrują się na OCR na poziomie organizmu, a konkretnie na szybkości wymiany oddechowej w przypadku korzystania z modeli mysich. Wyraźnym ograniczeniem tej metody jest to, że tlen pełni wiele funkcji biochemicznych i sygnalizacyjnych poza swoją rolą jako wszechobecny końcowy akceptor elektronów w mitochondrialnym ETC. Na przykład tlen jest "zużywany" przez aktywność katalityczną enzymów z rodziny dioksygenaz. Chociaż enzymy te przyczyniają się do wskaźnika zużycia tlenu przez komórki, nie uczestniczą, nie regulują ani nie odzwierciedlają funkcji mitochondriów. Klasyczne eksperymenty respirometryczne in vitro zazwyczaj kontrolują "niemitochondrialny OCR", podczas gdy eksperymenty ze współczynnikiem wymiany oddechowej organizmu (RER) nie mogą tego kontrolować, co ogranicza interpretację RER jako wskaźnika funkcji mitochondriów in vivo. Możliwe jest jednak dostosowanie protokołów do pomiaru aktywności DHODH poprzez śledzenie 13C 4-asparaginianu, aktywności kompleksu II za pomocą śledzenia 13C5-glutaminy, aktywności kompleksu I na mitochondriach oczyszczonych z tkanek i mitochondrialnych ROS przy użyciu związków przyjaznych dla LC-MS, takich jak MitoB, w celu pomiaru funkcji mitochondriów in vivo. Te bezpośrednie testy mające na celu zbadanie funkcji mitochondriów, w połączeniu z klasycznymi eksperymentami respirometrycznymi, zapewniają naukowcom bardziej wszechstronną i dokładną ocenę funkcji mitochondriów w komórkach i tkankach ssaków.

Funkcja mitochondriów jest kluczowym wskaźnikiem zdrowia komórek, ponieważ podtrzymuje kluczowe funkcje biosyntetyczne, bioenergetyczne i sygnalizacyjne w komórkach ssaków1. Zdecydowana większość funkcji mitochondrialnych wymaga przepływu elektronów przez łańcuch transportu elektronów (ETC), a zakłócenia w przepływie elektronów w ETC powodują ciężką chorobę mitochondriów2. ETC składa się z serii reakcji redukcji i utleniania (redoks), które są osadzone w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, a te reakcje przenoszenia elektronów uwalniają darmową energię, którą można wykorzystać do wspierania syntezy ATP, procesów fizjologicznych, takich jak termogeneza, szlaków biosyntezy, takich jak biosynteza pirymidyny de novo i równowagi statusu redoks kofaktorów, takich jak NADH. Kompleksy ETC I i III wytwarzają reaktywne formy tlenu (ROS)3,4,5, które z kolei regulują kluczowe szlaki sygnałowe, takie jak HIF, PI3K, NRF2, NFκB i MAPK6. W związku z tym metryki przepływu elektronów w ETC są klasycznie używane jako wskaźnik zastępczy funkcji mitochondriów w komórkach ssaków.
Eksperymenty respirometryczne są często wykorzystywane do pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków. Ponieważ O2 jest najbardziej wszechobecnym końcowym akceptorem elektronów dla ETC ssaków, jego redukcja jest wykorzystywana jako wskaźnik zastępczy dla funkcji mitochondriów. Jednak pojawiające się dowody wskazują, że mitochondria ssaków mogą wykorzystywać fumaran jako akceptor elektronów do podtrzymywania funkcji mitochondrialnych, które zależą od ETC, w tym biosyntezy pirymidyny de novo7, utleniania NADH7 oraz detoksykacji siarkowodoru8. W związku z tym w niektórych kontekstach, zwłaszcza w środowiskach niedotlenionych, pomiary wskaźnika zużyciaO2 (OCR) nie zapewniają precyzyjnego ani dokładnego wskazania funkcji mitochondriów.
Tutaj przedstawiamy serię testów, które mogą być wykorzystane do pomiaru funkcji mitochondriów niezależnie od OCR. Zapewniamy testy do bezpośredniego pomiaru utleniania NADH za pośrednictwem kompleksu I, biosyntezy de novo pirymidyny za pośrednictwem dehydrogenazy dihydroorotanu, syntezy ATP zależnej od złożonej litery V, kierunkowości netto kompleksu dehydrogenazy bursztynianowej (SDH) oraz ROS pochodzącego z mitochondriów. Testy te są przeznaczone do wykonywania na hodowanych komórkach ssaków, chociaż wiele z nich można przystosować do badania funkcji mitochondriów in vivo. Warto zauważyć, że testy opisane w tym protokole są bardziej bezpośrednimi pomiarami funkcji mitochondriów niż OCR. Co więcej, umożliwiają pomiar funkcji mitochondriów w hipoksji, czyli w kontekście, w którym OCR nie jest pomiarem orientacyjnym. Podsumowując, testy te, w połączeniu z klasycznymi eksperymentami respirometrycznymi, zapewnią naukowcom bardziej kompleksową ocenę funkcji mitochondriów w komórkach ssaków.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Probówka 1,5 ml</td><td>Cell Treat</td><td>667443</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 2,0 ml</td><td>Cell Treat</td><td>229446</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>Cell Treat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka</td><td>Cell Treat</td><td>229112</td><td></td></tr><tr><td>13C4-asparaginian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>604852</td><td></td></tr><tr><td>13C5-Glutamina</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>285978-14-5</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka wirówkowa</td><td>Cell Treat</td><td>667411</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówka wirówkowa</td><td>Cell Treat</td><td>667421</td><td></td></tr><tr><td>150 mm naczynie do hodowli tkankowej</td><td>Cell Treat</td><td>229651</td><td></td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2,6- dichlorofenolindofenol</td><td>Honeywell</td><td>33125</td><td></td></tr><tr><td>Węglan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37999</td><td></td></tr><tr><td>Antymycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ascentis Express C18</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53825-U</td><td></td></tr><tr><td>Filtr butelkowy 500 mL, 0,22 i mikro; m, PES 9 Średnica błony 9 mm</td><td>Leczenie komórek</td><td>229717</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Brequinar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0113</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter, dwustronny płaski i wąski nóż</td><td>Cell Treat</td><td>229305</td><td></td></tr><tr><td>CentriVap -105 Zimna pułapka</td><td>Labconco</td><td>7385020</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny inhibitor proteazy Tabletki</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>4693116001</tr><tr><td>Kubki z licznikiem redlic</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-694</td><td></td></tr><tr><td>Decylubichinon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7911</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf 5425R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000908</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf 5910 Ri</td><td>Eppendorf</td><td>5943000343</td><td></td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Bez glukozy DMEM</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>Bez glutaminy DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>11960044</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>35% wodorotlenek</td> <td>amonu klasy HPLCThermo Scientific</td><td>460801000</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl klasy HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>900667</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform klasy HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy klasy HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol klasy HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563935</td><td></td></tr><tr><td>MeOH klasy HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>900688</tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka linia komórkowa osteosarcome 143B</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bufor izotonowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MitoSox Red</td><td>Invitrogen</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>ołówek Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Młynek do tkanek Potter-Elvehjem, rozmiar 21</td><td>Kimble</td><td>885502-0021</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Wolne od pirogronianu media DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965175</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Spektrometr masowy</td><td>Thermo Scientific</td><td>726030</td><td></td></tr><tr><td>ReCO2ver</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chłodzony koncentrator próżniowy Centrivap</td><td>Labconco</td><td>7310020</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Buffer Millipore Sigma</td><td>20188</td><td></td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 5&mu; m 150 x 2,1 mm kolumna analityczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.50460.0001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw osłon SeQuant ZIC-pHILIC</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.50438.0001</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, granulki</td><td>Millipore Sigma</td><td>567530-250GM</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW, TRACEFINDER 5.1 SP3</td><td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-31001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodoronadtlenku tert-butylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25-200-114</td><td></td></tr><tr><td>Urydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>VANQUISH HORIZON / FLEX HPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>VF-S01-A-02</td><td></td></tr><tr><td>Z2 Redlica Liczba i wielkość cząstek analizator</td><td>Beckman Coulter</td><td>BZ10131270</td><td></td></tr></tbody></table>

testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

Przepływ elektronów w mitochondrialnym łańcuchu transportu elektronów (ETC) wspiera wieloaspektowe funkcje biosyntetyczne, bioenergetyczne i sygnalizacyjne w komórkach ssaków. Ponieważ tlen (O2) jest najbardziej wszechobecnym końcowym akceptorem elektronów dla ETC ssaków, wskaźnik zużyciaO2 jest często używany jako wskaźnik zastępczy funkcji mitochondriów. Jednak pojawiające się badania pokazują, że ten parametr nie zawsze wskazuje na funkcję mitochondriów, ponieważ fumaran może być stosowany jako alternatywny akceptor elektronów do podtrzymywania funkcji mitochondriów w niedotlenieniu. W tym artykule zestawiono szereg protokołów, które pozwalają naukowcom mierzyć funkcję mitochondriów niezależnie od wskaźnika zużyciaO2. Testy te są szczególnie przydatne podczas badania funkcji mitochondriów w środowiskach niedotlenionych. W szczególności opisujemy metody pomiaru mitochondrialnej produkcji ATP, biosyntezy pirymidyny de novo, utleniania NADH przez kompleks I i produkcji ponadtlenków. W połączeniu z klasycznymi eksperymentami respirometrycznymi, te ortogonalne i ekonomiczne testy zapewnią naukowcom bardziej kompleksową ocenę funkcji mitochondriów w ich systemie.

Aktywność DHODH, kompleksu I oraz kompleksu V można ocenić za pomocą testów proliferacji. Po usunięciu urydyny z pożywki hodowlanej komórki stają się bardziej zależne od szlaku de novo biosyntezy pirymidyn. W związku z tym, gdy komórki zmuszano do proliferacji w pożywce bezurydynowej, wykazywały one większą wrażliwość na hamowanie aktywności DHODH przez brekwinar niż komórki hodowane w pożywce zawierającej urydynę (Rysunek 6A). Podobnie, brak pirogronianu w pożywce hodowlanej sprawia, że komórki stają się bardziej zależne od aktywności kompleksu I w procesie proliferacji. Zatem w przypadku proliferacji komórek w pożywce bespirogronianowej, były one bardziej wrażliwe na hamowanie aktywności kompleksu I przez rotenon niż komórki hodowane w pożywce zawierającej pirogronian (Rysunek 6B). Aktywność kompleksu V można ocenić, zmuszając komórki do proliferacji w pożywce zawierającej galaktozę zamiast glukozy. Ponieważ galaktoza daje zerowy wypadkowy zysk ATP w glikolizie, komórki rosnące na tym substracie są bardziej zależne od mitochondrialnej syntezy ATP poprzez aktywność kompleksu V. W rezultacie komórki proliferujące w pożywce z galaktozą były bardziej wrażliwe na hamowanie kompleksu V przez oligomycynę niż komórki proliferujące w pożywce z glukozą (Rysunek 6C).
Aktywność SDH można zmierzyć, wykorzystując śledzenie 13C5-glutaminy i monitorując jej wbudowywanie w izotopologi fumaranu i bursztynianu. W warunkach traktowania nośnikiem kompleks SDH wykazywał preferencję dla aktywności w kierunku prawym, a wbudowywanie 13C4-bursztynianu w 13C4-fumaran było wyższe niż wbudowywanie 13C3-fumaranu w 13C3-bursztynian (Rysunek 7). W warunkach traktowania antymycyną kompleks SDH wykazywał preferencję dla aktywności w kierunku odwrotnym, a wbudowywanie 13C3-fumaranu w 13C3-bursztynian było większe niż wbudowywanie 13C4-bursztynianu w 13C4-fumaran (Rysunek 7).
Produkcję anionorodnika ponadtlenkowego wewnątrz mitochondriów można zmierzyć przy użyciu fluorescencyjnego raportera MitoSox, który w reakcji z anionorodnikiem ponadtlenkowym generuje 2-hydroksy-mitoetydium. W niniejszym badaniu komórki traktowane MitoSox w obecności nadtlenku tert-butylu wykazały wyższe poziomy 2-hydroksy-mitoetydium, co było hamowane przez dodatek NAC, przeciwutleniacza wygaszającego komórkowe ROS (Rysunek 8).
<img alt="Schemat szlaków metabolicznych; przedstawia glikolizę i metabolizm galaktozy wraz z enzymami i cyklami ATP/ADP." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Podstawa mechanistyczna testu proliferacji kompleksu V. Utlenianie glukozy i galaktozy poprzez glikolizę. Glikoliza glukozy daje wypadkowy zysk dwóch cząsteczek ATP, podczas gdy glikoliza galaktozy daje wypadkowy zysk zero ATP, ponieważ synteza UTP jest niezbędna do powstania UDP-galaktozy. W związku z tym komórki hodowane na galaktozie są bardziej zależne od mitochondrialnej syntezy ATP ze względu na brak ATP produkowanego w glikolizie. Skróty: GALK = galaktokinaza; GALT = galaktozo-1-fosforan urydylylotransferaza; PGM1 = fosfoglukomutaza 1; GPI = glukozo-6-fosforan izomeraza, UGP = UDP-glukoza pirofosforylaza; GALE = UDP-galaktozo-4-epimeraza; NDK = nukleotydodifosforan kinaza; UMPK = urydynomonofosforan kinaza; HK = heksokinaza; PFK = fosfofruktokinaza; ALDO = aldolaza; TPI = triozofosforan izomeraza; GAPDH = gliceraldehyd-3-fosforan dehydrogenaza; PGK = fosfoglicerynian kinaza; PGM = fosfoglukomutaza; ENO = enolaza; PK = piruwiankinaza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Hamowanie transportu elektronów w mitochondriach przez rotenon w pośrodku z pirogronianem; schemat cyklu TCA.
" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Podstawa mechanistyczna testu proliferacji kompleksu I. Schemat szlaków metabolicznych, które ulegają zmianie po zahamowaniu aktywności kompleksu I. W pośrodku z wysoką zawartością pirogronianu hamowanie kompleksu I jest omijane poprzez utlenianie NADH zapośredniczone przez LDH. W pośrodku z niską zawartością pirogronianu taka adaptacja jest mniej możliwa, co sprawia, że komórki są bardziej zależne od aktywności kompleksu I w celu reoksydacji NADH. Skróty: LDH = dehydrogenaza mleczanowa; cykl TCA = cykl kwasu trójkarboksylowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat enzymu DHODH z procesem metabolicznym obejmującym transfer orotan i asparaginianu znakowanego ^13C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Schemat reakcji DHODH podczas śledzenia 13C4-asparaginianu. Brequinar hamuje utlenianie dihydroorotan do orotan, zapobiegając tym samym dalszej syntezie UMP. 13C4-asparaginian jest włączany do 13C3-UMP poprzez aktywność DHODH. Skróty: OMM = zewnętrzna błona mitochondrialna; IMM = wewnętrzna błona mitochondrialna; DHODH = dehydrogenaza dihydroorotanowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu utleniania bursztynianu w kierunku prawym i redukcji fumaranu w kierunku odwrotnym przez SDH; funkcja mitochondrialna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Pomiar aktywności kompleksu II w kierunku prawym i odwrotnym za pomocą śledzenia 13C5-glutaminy. W celu pomiaru aktywności kompleksu II w kierunku prawym (po lewej) monitoruje się wbudowanie 13C5-glutaminy do 13C4-bursztynianu i 13C4-fumaranu. W celu pomiaru aktywności kompleksu II w kierunku odwrotnym (po prawej) monitoruje się wbudowanie 13C5-glutaminy do 13C3-bursztynianu i 13C3-fumaranu. Skróty: SDH = dehydrogenaza bursztynianowa; CytC = cytochrom C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Utlenianie MitoSox przez anion ponadtlenkowy, schemat reakcji chemicznej, wzór cząsteczkowy, [M+H] 316.6600 m/z." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reakcja MitoSox Red z anionem ponadtlenkowym. Reakcja MitoSox z mitochondrialnymi anionami ponadtlenkowymi prowadząca do powstania 2-OH-MitoE2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe proliferacji komórek; aktywności DHODH, kompleksu I i V; analiza względnej liczby komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Testy oparte na proliferacji do pomiaru funkcji mitochondriów (A) Proliferacja komórek osteosarcoma 143B traktowanych 5 uM brequinarem, inhibitorem DHODH, w pożywce z ±100 ug/mL urydyny. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM; N = 3 na warunek. (B) Proliferacja komórek osteosarcoma 143B traktowanych 2 uM rotenonem, inhibitorem kompleksu I, w pożywce z ±5 mM pirogronianu. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM; N = 3 na warunek. (C) Proliferacja komórek osteosarcoma 143B traktowanych 5 uM oligomycyną, inhibitorem kompleksu V, w pożywce z 10 mM glukozą lub 10 mM galaktozą jako jedynym centralnym źródłem węgla. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM; N = 3 na warunek. * oznacza p &lt; 0.05 przy użyciu jednoczynnikowego testu ANOVA w programie Graphpad Prism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres aktywności SDH; utlenianie bursztynianu, redukcja fumaranu; wykres słupkowy, wpływ antymycyny na linie Caki 1, DLD1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Śledzenie 13C5-glutaminy w celu pomiaru aktywności kompleksu II. Utlenianie bursztynianu i redukcja fumaranu (odwrócona reakcja SDH) w komórkach Caki1 i DLD1 traktowanych DMSO oraz 500 nM antymycyny A. Dane przedstawiają średnią ± SEM; N = 3 na warunek. *** oznacza p &lt; 0.05 w nieparzystym teście t przeprowadzonym w programie GraphPad Prism. Skróty: SDH = utlenianie bursztynianu; SDH reverse = redukcja fumaranu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres chromatografii jonowej dla 2-OH-Mito E2+; traktowania DMSO, tBuOOH, tBuOOH+NAC; analiza powierzchni piku." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65184/65184fig08v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Analiza MitoSox oparta na LCMS w celu wykrycia anionorodnika ponadtlenkowego. Ekstrahowany chromatogram jonowy 2-OH-Mito E2+ wyizolowanego z komórek Caki1 traktowanych MitoSox przez 30 min w obecności tBuOOH ± NAC. Skróty: LCMS = chromatografia cieczowa sprzężona z spektrometrią mas; NAC = N-acetylocysteina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Tabela 1: Skład odczynników, buforów i pożywek wykorzystanych w tym protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65184/65184_Table%201%20Reaction%20Compositions_Revision%20(2).xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...

Nasze badania koncentrują się na tym, jak mitochondria wyczuwają i dostosowują się do stresorów metabolicznych. Jednym z kluczowych stresorów metabolicznych jest niedotlenienie, które występuje, gdy komórki są pozbawione tlenu. Opracowujemy lepsze testy do badania funkcji mitochondriów w środowiskach o niskiej zawartości tlenu.Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości została wykorzystana do zbadania poziomów metabolitów w komórkach i tkankach. Korzystamy z badań nad stabilnymi izotopami, aby śledzić losy określonych metabolitów i odkrywać nowe szlaki metaboliczne istotne dla fizjologii zdrowych i chorych ssaków. Grupa odkryła, że mitochondria ssaków mogą podtrzymywać krytyczne funkcje w środowiskach o niskiej zawartości tlenu.Mechanistycznie wykorzystują fumaran jako alternatywne elektroniczne berło dla łańcucha transportu elektronów. Protokół ten kompiluje kilka testów, które naukowcy mogą wykorzystać do lepszej oceny funkcji mitochondriów w komórkach ssaków. Co ważne, protokoły te mogą być wykorzystywane do badania funkcji mitochondriów w niedotlenieniu, ponieważ klasyczne eksperymenty respirometryczne nie wystarczą.Na początek zobacz 143B ludzkie komórki kostniakomięsaka w sześciodołkowej płytce. Gdy komórki staną się w 75% zlewne, zastąp pożywkę w każdej studzience pożywką zawierającą 10 milimolowców, asparaginian 13C4 i inkubuj przez osiem godzin, aby osiągnąć stan stabilny do znakowania komórek. W celu wyizolowania metabolitów przygotowany bufor należy schłodzić przez noc w temperaturze 80 stopni Celsjusza lub umieścić go na suchym lodzie.W międzyczasie wyjmij płytkę z inkubatora i odessaj pożywkę z każdej studzienki za pomocą pipety. Umyj go dwukrotnie PBS, a następnie usuń resztki PBS przed kontynuowaniem. Teraz umieść talerz na suchym lodzie i dodaj 800 mikrolitrów przygotowanego buforu do każdej studzienki.Aby ułatwić lizę komórek, inkubuj płytkę przez 15 minut w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Po inkubacji zeskrob każdą studzienkę na suchym lodzie za pomocą podnośnika do komórek i przenieś lizat do 15-mililitrowej mikroprobówki wirówkowej umieszczonej na suchym lodzie. Wirować lizat przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza i odwirowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza i 17 000 G przez 10 minut.Następnie przenieś supernatant do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej i wysusz go w koncentratorze próżniowym o temperaturze 4 stopni Celsjusza z zimną wymrażarką pod wysoką próżnią przez około sześć godzin. Wysuszone granulki metabolitu należy przechowywać w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. W celu analizy próbki za pomocą chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas lub LCMS, dodaj 100 mikrolitrów wody klasy HPLC do wysuszonego osadu i wiruj, jak pokazano.Odwirować próbki w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 10 minut z maksymalną prędkością. Następnie przenieść 25 mikrolitrów supernatantu do fiolki LCMS i wstrzyknąć dwa mikrolitry do systemu LCMS. Aby przeprowadzić chromatografię cieczową, należy użyć stałego natężenia przepływu 0,15 mililitra na minutę w trybie gradientu fazy ruchomej B od 80% do 20% przez 20 minut, od 20% do 80% przez 0,5 minuty i zatrzymać na poziomie 80% przez 7,5 minuty w stosunku do fazy ruchomej A. Następnie wykonaj spektroskopię mas, wybierając pełny skan między MZ 70 do 1000 daltonów i rozdzielczością 70, 000. Ustaw wartość docelową AGC od 1 x 10 do 6 i maksymalny czas wtrysku wynoszący 20 milisekund. Następnie ustaw czas działania na 16,5 minuty. Polaryzacja ustawiona na dodatnią.Cel AGC ustawiony na 1 do potęgi 5. Maksymalny czas reakcji IT to 20 milisekund, a zakres skanowania ustawiony na stosunek masy do naładowania od 70 do 1000. Następnie ustaw napięcie natrysku na 3,0 kilowoltów, a podgrzaną kapilarnę na 275 stopni Celsjusza.Wybierz przepływ gazu w osłonie przy 40 jednostkach, przepływ gazu pomocniczego przy 15 jednostkach i przepływ gazu przemiatającego przy 1 jednostce. W przypadku śledzenia izotopu glutaminy 13C5, gdy komórki osiągną 75% konflufluacji, zmień pożywkę na 2-milimolową pożywkę zawierającą glutaminę 13C5 i inkubuj, aby osiągnąć stały stan znakowania interesujących komórek. Wyizolować i przeanalizować metabolity, jak wykazano wcześniej.Po wyizolowaniu i przeanalizowaniu metabolitów przeanalizuj dehydrogenazę bursztynianową lub aktywność SDH, obliczając procentowe znakowanie fumaranu 13C3, fumaranu 13C4, bursztynianu 13C3 i bursztynianu 13C4. Następnie oceń utlenianie bursztynianu i redukcję fumaranów za pomocą wzoru. W warunkach traktowanych podłożem kompleks SDH faworyzował aktywność naprzód, a włączenie bursztynianu 13C4 do fumaranu 13C4 było wyższe niż fumaranu 13C3 do bursztynianu 13C3.W komórkach kostniakomięsaka leczonych antymycyną kompleks SDH faworyzował odwrotną aktywność, a włączenie fumaranu 13C3 do bursztynianu 13C3 było bardziej znaczące niż bursztynian 13C4 do fumaranu 13C4.

oxygen-independent-assays-to-measure-mitochondrial-function-in-mammals

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj prezentujemy modyfikację wcześniej opisanej metody, która pozwala na izolację wysokiej jakości i oczyszczonych mitochondriów z mniejszych ilości mięśni szkieletowych myszy. Procedura ta powoduje powstanie wysoce sprzężonych mitochondriów, które oddychają z wysoką funkcją podczas testów respirometycznych opartych na mikropłytkach.

Izolacja mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy w celu wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

W tym artykule opisana jest metoda pomiaru zużycia tlenu za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości w permeabilizowanych piersiach Drosophila. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki w porównaniu z klasyczną techniką izolacji mitochondriów, a uzyskane wyniki są bardziej istotne fizjologicznie.

Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

Oddychanie mitochondrialne jest kluczowe dla przetrwania organizmu; dlatego wskaźnik zużycia tlenu jest doskonałym wskaźnikiem zdrowia mitochondriów. W tym protokole opisujemy zastosowanie dostępnego na rynku respirometru do pomiaru podstawowych i maksymalnych wskaźników zużycia tlenu u żywych, nienaruszonych i swobodnie ruchliwych Caenorhabditis elegans.

Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans

Opracowaliśmy praktyczny protokół i analityczne podejście do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej i zdolności przenoszenia elektronów w świeżych homogenatach guza. Protokół ten można łatwo dostosować do badania różnych funkcji mitochondriów, które przyczyniają się do inicjacji, progresji i odpowiedzi na leczenie.

Analityczne oznaczanie funkcji mitochondrialnej wyciętych homogenatów guzów litych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę izolacji mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy i późniejszą analizę oddychania za pomocą wskaźnika zużycia tlenu (OCR) za pomocą testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach. Rurociąg ten można zastosować do badania wpływu wielu interwencji środowiskowych lub genetycznych na metabolizm mitochondriów.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych myszy do testów respirometrycznych

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

A przedstawiono protokół produkcji tRNA(UUU) i analizy tRNA(UUU) w kompleksie z enzymem TcdA za pomocą testów opóźniających działanie żelu agarozowego.

Testy opóźnienia w żelu agarozowym białko-tRNA do analizy funkcji TcdA N 6-treonylokarbamoiloloadenozyny

Poznaj metody niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków w warunkach hipoksji. Protokoły te wykorzystują spektrometrię masową i izotopowe znakowanie do badania adaptacji metabolicznej komórek.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Przeglądaj więcej filmów