Wytwarzanie cybridów transmiscyjnych przy użyciu linii komórek rakowych

Badania te mają na celu lepsze zrozumienie udziału mitochondriów w progresji raka i przerzutach. Pokolenie cybridów transcynordialnych może pomóc nam wyjaśnić, w jaki sposób i na jakim poziomie genotypy mitochondrialne są zaangażowane w agresywność komórki nowotworowej. Jedną z technologii pozwalających uzyskać informacje na temat roli mitochondriów w nowotworach jest wytwarzanie cybrydów.

Łączymy to narzędzie z wieloma innymi metodami, które obejmują elektroforezę donacyjną, analizę oddechu i inne testy funkcjonalne mitochondriów, cytometrię przepływową, proteomikę i tak dalej. Plastyczność komórek nowotworowych, wraz z sieciami interakcji między genami jądrowymi i mitochondrialnymi, zwiększa złożoność naszych eksperymentów i interpretacji danych. Jest to jeden z powodów, dla których konieczne jest opracowanie nowych podejść eksperymentalnych.

Jednym z najbardziej ekscytujących wyników naszych badań było odkrycie dwóch mutacji mitochondrialnego DNA związanych z oderwaniem komórek od naczynia do zabawy, przypominających powstawanie przerzutów i całkowicie uzależniających komórki od glikolizy tlenowej, a także czyniących je bardziej maregenicznymi i przerzutowymi w modelach in vivo. Ten protokół wymiany mitochondrialnej może być stosowany do zawiesiny rosnących komórek rakowych. Chronologia może przezwyciężyć ograniczenia tradycyjnych podejść, w których proces zarodkowania i całkowite usunięcie mitochondrialnego DNA z mitochondrialnych linii komórkowych biorców często staje się prawdziwym wyzwaniem.

Aby wykonać zubożenie mitochondrialne linii komórkowej biorcy, należy wysiać 1 milion komórek na sześciodołkowej płytce, używając kompletnej pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS i penicylinę streptomycynę. Codziennie traktuj komórki optymalnym stężeniem rodaminy 6G przez trzy do siedmiu dni, w zależności od rodzaju linii komórkowej. Aby utrzymać komórki przy życiu, uzupełnij pożywkę do hodowli komórkowej 50 mikrogramami na mililitr urydyny i 100 mikrogramami na mililitr pirogronianu.

Po poddaniu działaniu substancji, a przed fuzją z mitochondriami wyizolowanymi z linii komórkowej dawcy, należy usunąć pożywkę z komórek poddanych działaniu Rhodaminy 6G i dodać kompletną pożywkę do hodowli komórkowych bez Rhodaminy 6G. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy do czterech godzin. Na koniec, aby przygotować wstępnie potraktowane komórki rodaminy 6G do fuzji, zbierz je do 15-mililitrowej probówki i odwiruj probówkę w temperaturze pokojowej i 520 G przez pięć minut.

Należy pamiętać, że granulka nabiera neonowo-różowego koloru dzięki obróbce rodaminą 6G. Po uzyskaniu około 25 milionów komórek dawcy mitochondriów w siódmym dniu, zbierz wykładniczo rosnące komórki w 50-mililitrowej probówce i zbierz je przez odwirowanie w temperaturze pokojowej i 520 G przez pięć minut. Przemyć komórki zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem i osadzić je przez odwirowanie w temperaturze pokojowej i 520 G przez pięć minut.

Teraz przeprowadź całą ekstrakcję mitochondriów w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą zimnych odczynników i utrzymuj komórki lub mitochondria na lodzie. Po trzecim odwirowaniu odrzucić supernatant przez aspirację za pomocą szklanej pipety połączonej z pompą próżniową. I ponownie zawiesić upakowane komórki w objętości hipotonicznego bufora równej siedmiokrotności objętości osadu komórkowego.

Następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki homogenizatora i pozwól komórkom pęcznieć, inkubując je na lodzie przez dwie minuty. Przerwij błony komórkowe, wykonując od ośmiu do 10 uderzeń w homogenizatorze sprzężonym z napędzanym silnikiem tłuczkiem obracającym się z prędkością 600 obrotów na minutę. Do homogenatu komórki dodaj bufor hipertoniczny równy siedmiokrotności objętości początkowego osadu, aby wytworzyć środowisko izotoniczne.

Przenieść homogenat do 15-mililitrowej probówki i odwirować w stałym wirniku przy 1 000 G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie zbierz tylko trzy czwarte supernatantu, pozostawiając duży margines od osadu, aby uniknąć zanieczyszczenia jądrami lub nienaruszonymi komórkami, i przenieś go do innej probówki. Po dwukrotnym powtórzeniu procesu przenieś supernatant zawierający frakcję mitochondrialną do 1,5 mililitrowych probówek.

Odwirować probówki z maksymalną prędkością 18 000 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i przemyć osad wzbogacony w mitochondria buforem A. Połączyć zawartość dwóch probówek w jedną i odwirować, jak pokazano wcześniej. Powtarzaj proces, aż cały materiał znajdzie się tylko w jednej tubie.

Przepłukać osad otrzymany z ostatniego wirowania za pomocą 300 mikrolitrów buforu A. Określić ilościowo stężenie białka mitochondrialnego za pomocą testu Bradforda. Przed fuzją z mitochondrialną linią komórkową biorcy należy ocenić brak zanieczyszczeń jąder we frakcji mitochondrialnej poprzez immunodetekcję białek jądrowych. Alternatywnie należy przeprowadzić ilościową reakcję łańcuchową polimerazy lub amplifikację QPCR genu jądrowego.

Do generowania cybrydów transcyprrialnych należy użyć mitochondrialnych komórek biorczych, które zostały zubożone do mitochondriów przez leczenie rodaminą 6G i przeprowadzić fuzję z mitochondriami wyizolowanymi z komórek dawcy mitochondriów. Zapewnić prawidłowe zniesienie funkcji mitochondriów w komórkach biorcy i oczyszczanie organelli z komórek dawcy poprzez wysiewanie niewielkiej liczby komórek traktowanych rodaminą 6G i izolowanych mitochondriów w kompletnej pożywce hodowlanej na płytce sześciodołkowej. Sprawdź, czy po miesiącu hodowli w studzienkach nie pozostały żadne komórki, które przeżyły.

Aby kontynuować fuzję, ostrożnie dodaj komórki poddane działaniu rodaminy 6G do izolowanego osadu mitochondriów, a następnie odwiruj przy 520 G przez pięć minut, aby komórki mogły zmieszać się z mitochondriami. Dodaj 100 mikrolitrów 50% glikolu polietylenowego i delikatnie zawieś granulat na 30 sekund. Następnie pozostaw zawiesinę nienaruszoną przez kolejne 30 sekund.

Na koniec przenieś mieszaninę do sześciodołkowej płytki ze świeżą, kompletną pożywką do hodowli komórkowych i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Zwykle po około tygodniu cybrid transmiscyjny powinien zacząć rosnąć, dając początek klonom, które można indywidualnie wybierać lub mieszać w puli przed ich analizą. Fragmenty restrykcyjne uzyskane z polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego lub analizy RFLP mitochondriów typu dzikiego różniły się od zmutowanego.

Analiza RFLP nowych transmitochondrialnych linii komórkowych wykazała, że fragmenty restrykcyjne były identyczne z tymi uzyskanymi u odpowiednich dawców mitochondrialnych i różniły się od tych generowanych przez linie komórkowe biorców. Co więcej, różnica w typowym profilu genotypowania jądrowego DNA dwóch linii komórkowych wykorzystywanych w procesie hybrydyzacji może być również wykorzystana do potwierdzenia czystości jądrowego DNA.