Name: Wytwarzanie cybridów transmiscyjnych przy użyciu linii komórek rakowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania cybridów transmiscyjnych z komórek nowotworowych w zawiesinie. Technika ta pozwala badać rolę mitochondriów w procesie nowotworzenia i progresji raka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane z grantu numer PID2019-105128RB-I00 dla RSA, JMB i AA oraz PGC2018-095795-B-I00 dla PFS i RML, oba finansowane przez MCIN/AEI/10.13039/501100011033 i granty o numerach B31_20R (RSA, JMA i AA) oraz E35_17R (PFS i RML) i finansowane przez Gobierno de Aragón. Prace RSA były wspierane przez grant z Asociación Española Contra el Cáncer (AECC) PRDAR21487SOLE. Autorzy pragną potwierdzić wykorzystanie Servicio General de Apoyo a la Investigación-SAI, Universidad de Zaragoza.

UWAGA: Wszystkie podłoża hodowlane i kompozycje buforowe są określone w Tabeli 1. Przed generacją cybridów należy typować zarówno mitochondrialne, jak i jądrowe profile DNA z komórek dawcy i biorcy, aby potwierdzić obecność różnic genetycznych w obu genomach między liniami komórkowymi. W tym badaniu wykorzystano dostępną na rynku linię komórkową L929 i jej pochodną linię komórkową, L929dt, która została spontanicznie wygenerowana w naszym laboratorium (więcej informacji można znaleźć w 13). Te linie komórkowe wykazują dwie różnice w sekwencji ich genu mt-Nd2, które mogą być wykorzystane do potwierdzenia czystości mtDNA po zakończeniu procesu cybrydyzacji13. W tym przypadku czystość tła jądrowego została potwierdzona wrażliwością na antybiotyki, ponieważ w przeciwieństwie do komórek L929dt, L929 były oporne na genetycynę.
1. Zubożenie mitochondriów przez leczenie rodaminą 6G (komórki biorcze)
UWAGA: Pierwszym krokiem do udanego generowania cybridów jest całkowite i nieodwracalne zniesienie funkcji mitochondriów w komórkach biorcy. W tym celu konieczne jest wcześniejsze określenie, dla każdej linii komórkowej, odpowiedniego stężenia i czasu trwania leczenia rodaminą 6G. To odpowiednie stężenie powinno być tuż poniżej śmierci komórek wywołanej lekiem (najwyższej, która nie zabija komórek podczas leczenia). Po zdefiniowaniu optymalnych warunków wykonaj następujące czynności.
<ol>
	<li>Wysiew 106 komórek na 6-dołkowej płytce przy użyciu kompletnej pożywki hodowlanej (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli 1) i traktuj je codziennie optymalnym stężeniem rodaminy 6G przez 3-10 dni, w zależności od linii komórkowej. Tradycyjne stężenia wahają się od 2 do 5 μg/ml przez 3-10 dni20,21. W tym badaniu, dla komórek pochodzących z L929, 2,5 μg/ml rodaminy 6G przez 7 dni było wybranym leczeniem13,22.</li>
	<li>Aby utrzymać komórki przy życiu, należy uzupełnić pożywkę do hodowli komórkowych o 50 μg/ml urydyny i 100 μg/ml pirogronianu i odnawiać co 24 godziny.</li>
	<li>Po poddaniu działaniu substancji, a przed fuzją, należy zmienić pożywkę komórek poddanych działaniu rodaminy 6G na kompletną pożywkę do hodowli komórkowych bez rodaminy 6G i pozostawić je w tym podłożu na 3-4 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Toksyczny efekt rodaminy 6G jest nieodwracalny, a komórki z niefunkcjonalnymi mitochondriami nie powinny się zregenerować20. Tak więc po leczeniu komórki, które nie otrzymują funkcjonalnych mitochondriów, powinny umrzeć nawet w pożywce hodowlanej uzupełnionej urydyną. W związku z tym nie powinna być konieczna żadna selekcja jądrowa. Zaleca się jednak kontrolną fuzję komórek traktowanych rodaminą 6G bez mitochondriów.</li>
</ol>
2. Ekspansja i izolacja mitochondriów (komórki dawcy)
<ol>
	<li>Rozszerz komórki dawcy mitochondriów w czasie upływu czasu leczenia rodaminą 6G, aby uzyskać około 25 x 106 komórek.</li>
	<li>W dniu 7 zbierz wykładniczo rosnące komórki w probówce o pojemności 50 ml i zbierz je przez wirowanie przy 520 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Przemyć komórki 3x zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) i osadzać je przez odwirowanie przy 520 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Od tej pory wykonuj wszystkie etapy ekstrakcji mitochondrialnej w temperaturze 4 °C, używając zimnych odczynników i trzymając probówki z komórkami lub mitochondriami na lodzie.</li>
	<li>Po trzecim odwirowaniu odrzucić supernatant przez aspirację za pomocą szklanej pipety sprzężonej z pompą próżniową i ponownie zawiesić wypełnione komórki w objętości hipotonicznego buforu równej 7-krotności objętości osadu komórkowego. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki homogenizatora i pozwól komórkom pęcznieć, inkubując je na lodzie przez 2 minuty.</li>
	<li>Przerwij błony komórkowe, wykonując od 8 do 10 uderzeń w homogenizatorze sprzężonym z napędzanym silnikiem tłuczkiem obracającym się z prędkością 600 obr./min. 
	UWAGA: Etap przerwania błony komórkowej może się różnić w zależności od typu komórki; W związku z tym należy go zoptymalizować dla każdego typu ogniwa.</li>
	<li>Dodaj tę samą objętość buforu hipertonicznego do zawiesiny komórki (7x objętość osadu komórkowego), aby wytworzyć środowisko izotoniczne.</li>
	<li>Przenieść homogenat do probówki o pojemności 15 ml i odwirować w stałym wirniku o sile 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Następnie należy zebrać tylko 3/4 supernatantu, pozostawiając duży margines od osadu, aby uniknąć zanieczyszczenia jądrami lub nienaruszonymi komórkami, i przenieść go do innej probówki. Powtórz ten sam proces dwa razy. Należy pamiętać, że supernatant musi być przechowywany, a osad odrzucony.</li>
	<li>Zachowaj frakcję mitochondrialną (supernatant). Przenieść go do probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować z maksymalną prędkością (18 000 x g) przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i przemyć osad wzbogacony w mitochondria buforem A, łącząc zawartość dwóch probówek w jedną i odwirować w tych samych warunkach, jak opisano w kroku 2.7. Powtarzaj ten sam proces, aż cały materiał znajdzie się tylko w jednej tubie.</li>
	<li>Wykonaj dodatkowe płukanie 300 μl buforu A i określ ilościowo stężenie białka mitochondrialnego za pomocą testu Bradforda23. Dla każdego testu cybrydyzacyjnego należy określić optymalną ilość mitochondriów do procedury transferu (w naszym przypadku stężenie między 10-40 μg białka mitochondrialnego na10-6 komórek).</li>
	<li>Jednocześnie przygotuj komórki wstępnie poddane działaniu rodaminy 6G do fuzji, zbierając je do probówki o pojemności 15 ml i odwirowując przy 520 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że granulka nabiera neonowo-różowego koloru dzięki traktowaniu rodaminą 6G.</li>
	<li>Aby upewnić się, że zarówno zniesienie funkcji mitochondriów w komórkach receptorowych, jak i oczyszczanie organelli od dawców zostały prawidłowo przeprowadzone, wysiewaj niewielką liczbę komórek traktowanych rodaminą 6G i izolowane mitochondria przy użyciu kompletnej pożywki hodowlanej na 6-dołkowej płytce i hoduj je przez miesiąc, aby sprawdzić, czy w żadnym z dołków nie pozostały żadne komórki, które przeżyły (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2).</li>
	<li>Równolegle oceniaj brak zanieczyszczeń jąder we frakcji mitochondrialnej poprzez immunodetekcję białek jądrowych (tj. laminy beta, histonu H3 itp.) lub przez ilościową amplifikację genu jądrowego (qPCR) w reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) (tj. SDH, 18S rRNA itp.). 
	UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczeń, zaleca się wykonywanie wszystkich czynności w warunkach aseptycznych podczas pracy pod okapem z przepływem laminarnym.</li>
</ol>
3. Fuzja i generacja cybrydów
<ol>
	<li>Aby kontynuować fuzję, ostrożnie dodaj 106 komórek traktowanych rodaminą 6G do izolowanego osadu mitochondriów (10-40 μg białka mitochondrialnego) i wiruj przy 520 x g przez 5 minut, aby komórki mogły wymieszać się z mitochondriami.</li>
	<li>Dodać 100 μl glikolu polietylenowego (PEG, 50%) i delikatnie zawiesić granulkę na 30 s. Następnie pozostaw nietknięte na kolejne 30 sekund.</li>
	<li>Na koniec przenieść mieszaninę na 6-dołkową płytkę ze świeżą, kompletną pożywką do hodowli komórkowych i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Po kilku dniach (zwykle 1 tygodniu) cybrydy transmishondrialne powinny zacząć rosnąć (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), dając początek klonom, które mogą być indywidualnie selekcjonowane lub mieszane w puli przed ich analizą.</li>
</ol>
4. Weryfikacja zarówno tła mitochondrialnego, jak i jądrowego
UWAGA: Gdy nowa linia komórkowa zostanie ustanowiona, a komórki zaczną rosnąć wykładniczo, czystość ich mitochondrialnych i jądrowych DNA musi zostać zweryfikowana. W związku z tym oryginalne linie komórkowe powinny zawierać różne mutacje lub polimorfizmy w swoich genomach, aby były rozpoznawalne.
<ol>
	<li>Całkowita izolacja DNA
	<ol>
		<li>Wyizoluj genomowe DNA wszystkich linii komórkowych używanych do generowania cybridów, stosując komercyjny zestaw do ekstrakcji genomowego DNA (patrz Tabela Materiałów) lub wykonując standardowy protokół z użyciem ekstrakcji alkoholem fenolowo-chloroformowo-izoamylowym i wytrącania alkoholu24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena mtDNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 3) 
	UWAGA: W celu analizy czystości mtDNA można przeprowadzić kilka technik, takich jak sekwencjonowanie, analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) lub qPCR specyficzny dla alleli. Aby potwierdzić obecność wariacji sekwencji mtDNA przez RFLP, postępuj zgodnie z kolejnymi krokami protokołu.
	<ol>
		<li>Amplifikuj fragment mtDNA zawierający zmianę nukleotydu metodą PCR.
		<ol>
			<li>W tym przypadku komórki L929dt prezentują mutację mtDNA w pozycji 4206, w genie mt-Nd2 (m.4206C>T), którego nie ma w komórkach L929. Aby potwierdzić obecność tej substytucji w transmisjąsterkwialnych cybrydach, amplifikuj fragment o długości 397 pz metodą PCR przy użyciu standardowego protokołu i następujących starterów: 1) 5'-AAGCTATCGGG 
			CCCATACCCCG-3' (pozycje 3862-3884) i 2) 5'-TAATCAGAAGTGGAATGGGGGG -3' (pozycje 4236-4258).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeanalizuj obecność pożądanej substytucji nukleotydów przez RFLP, używając specyficznej endonukleazy, która rozpoznaje zmianę sekwencji i generuje inny wzór cięcia dla obu linii komórkowych. 
		UWAGA: Gdy obecny jest wariant mtDNA L929dt (4206T), amplikon uzyskany w kroku 4.2.1 zawiera dwa miejsca restrykcyjne dla SspI (patrz tabela materiałów), które wytwarzają trzy fragmenty DNA o długości 306 pz, 52 pz i 39 pz. Miejsce ograniczenia, które generuje pasma 52 i 39, jest zakłócane, gdy obecna jest wersja C4206 typu dzikiego (WT) i pojawia się nowe pasmo 91 pz. W związku z tym analiza obejmuje kontrolę wewnętrzną w celu pełnego roztrawienia SspI. Reakcję trawienia przeprowadza się w temperaturze 37 °C, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Oddziel fragmenty restrykcyjne za pomocą elektroforezy i porównaj wzór pasma.
		<ol>
			<li>Po przeprowadzeniu trawienia należy przeanalizować otrzymane fragmenty restrykcyjne za pomocą elektroforezy w 10% żelach poliakrylamidowo-tris-boranowych-EDTA (TBE) (patrz Tabela 1 dla składu 1x TBE). Uruchomić elektroforezę przy napięciu 80 V przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Uwidocznić fragmenty DNA po barwieniu żelem w roztworze bromku etydyny w 1x TBE przez 15 minut w temperaturze pokojowej (patrz Tabela 1 dla składu roztworu do barwienia żelu).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Genotypowanie jądrowego DNA 
	UWAGA: Genotypowanie jądrowego DNA musi być przeprowadzone przy użyciu poprzedniej próbki ekstrakcji DNA użytej do analizy RFLP.
	<ol>
		<li>Amplifikuj 16 loci (D21S11, CSF1PO, vWA, D8S1179, TH01, D18S51, D5S818, D16S539, D3S1358, D2S1338, TPOX, FGA, D7S820, D13S317, D19S433 i AMEL) przy użyciu puli oligonukleotydów specyficznych dla handlu (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Wykonać elektroforezę za pomocą analizatora genetycznego w celu oddzielenia wcześniej uzyskanych fragmentów. 
		UWAGA: Po amplifikacji różne loci są analizowane za pomocą elektroforezy przy użyciu systemu kapilarnego (patrz Tabela materiałów). Fragmenty są rozdzielane w kapilarze o długości 50 cm wypełnionym dostępnym w handlu polimerem. katodowe i anodowe są również dostępne w handlu, jak pokazano w tabeli materiałów. Elektroforezę wykonuje się przy napięciu 19,5 kV przez 20 min w temperaturze 60 °C.</li>
		<li>Użyj narzędzi bioinformatycznych, aby określić allele odpowiadające każdemu amplifikowanemu locus (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Porównaj dane uzyskane w kroku 4.3.3 z bazą danych profilu jądrowego DNA (Tabela 1), aby sprawdzić, czy profil jądrowego DNA pasuje do profilu linii komórkowej receptora mitochondriów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Transmitochondrial Cybrid Generation From Suspension-Growing Cancer Cells

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Odkąd Otto Warburg poinformował, że komórki rakowe zmieniają swój metabolizm i nasilają "glikolizę tlenową"3,4, jednocześnie zmniejszając oddychanie mitochondrialne, zainteresowanie rolą mitochondriów w transformacji i progresji raka wzrosło wykładniczo. W ostatnich latach mutacje w mtDNA i dysfunkcja mitochondriów zostały postulowane jako cechy charakterystyczne wielu typów nowotworów25. Do tej pory w licznych badaniach analizowano zmienn...

Przeprogramowanie metabolizmu energetycznego jest cechą charakterystyczną raka1, który został zaobserwowany po raz pierwszy przez Otto Warburga w latach 30. XX wieku2. W warunkach tlenowych normalne komórki przekształcają glukozę w pirogronian, który następnie wytwarza acetylo-coA, napędzając maszynerię mitochondrialną i promując oddychanie komórkowe. Niemniej jednak Warburg wykazał, że nawet w warunkach normoksyjnych większość komórek nowotworowych przekształca pirogronian uzyskany w procesie glikolizy w mleczan, przestawiając się w celu uzyskania energii. Ta zmiana metaboliczna jest znana jako "efekt Warburga" i umożliwia niektórym komórkom nowotworowym zaspokojenie ich zapotrzebowania energetycznego na szybki wzrost i podział, pomimo generowania ATP mniej wydajnie niż proces tlenowy3,4,5. W ostatnich dziesięcioleciach liczne prace potwierdziły implikacje przeprogramowania metabolizmu w progresji raka. W związku z tym energetyka nowotworów jest uważana za interesujący cel przeciwko rakowi1. Jako centralny ośrodek metabolizmu energetycznego i dostarczania niezbędnych prekursorów, mitochondria odgrywają kluczową rolę w tych adaptacjach komórkowych, które do tej pory rozumiemy tylko częściowo.
Zgodnie z powyższym, mutacje mitochondrialnego DNA (mtDNA) zostały zaproponowane jako jedna z możliwych przyczyn tego przeprogramowania metabolicznego, co może prowadzić do pogorszenia wydajności łańcucha transportu elektronów (ETC)6 i wyjaśniałoby, dlaczego niektóre komórki rakowe zwiększają swój metabolizm glikolityczny, aby przetrwać. Rzeczywiście, doniesiono, że mtDNA kumuluje mutacje w komórkach rakowych, będąc obecnym w co najmniej 50% nowotworów7. Na przykład, niedawne badanie przeprowadzone przez Yuan i wsp. wykazało obecność hipermutowanych i skróconych cząsteczek mtDNA w raku nerki, jelita grubego i tarczycy8. Ponadto wiele prac wykazało, że niektóre mutacje mtDNA są związane z bardziej agresywnym fenotypem guza i wzrostem potencjału przerzutowego komórek nowotworowych9, 10,11,12,13,14,15,16.
Pomimo oczywistego znaczenia genomu mitochondrialnego w progresji raka, badanie tych mutacji i ich udziału w chorobie było trudne ze względu na ograniczenia w obecnie dostępnych modelach eksperymentalnych i technologiach17. W związku z tym potrzebne są nowe techniki, aby zrozumieć rzeczywisty wpływ DNA mitochondriów na rozwój i progresję choroby nowotworowej. W tej pracy wprowadzamy protokół generowania cybrydów transmisyjnych z komórek nowotworowych rosnących w zawiesinie, oparty na ponownym zasiedleniu komórek wstępnie potraktowanych rodaminą 6G z izolowanymi mitochondriami, który pokonuje główne wyzwania tradycyjnych metod cybrydyzacji18,19. Metodologia ta pozwala na wykorzystanie dowolnego dawcy jąder niezależnie od dostępności odpowiadającej im linii komórkowej ρ0 oraz transfer mitochondriów z komórek, które przy użyciu tradycyjnych technik byłyby trudne do wyłuszczenia (tj. nieprzylegających linii komórkowych).

<table><tbody><tr><td>Analizator genetyczny 3500XL&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific 4406016</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa</td><td>płytka Corning</td><td>08-772-1B</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>AmpFlSTR Identifiler Plus Zestaw do amplifikacji PCR</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4427368</td><td></td></tr><tr><td>Anoda buforowa Seria 3500</td><td>Applied Biosystems</td><td>4393927</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Test PanReac</td><td>131015</td><td></td></tr><tr><td>Bradford</td><td>Biorad</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik buforowy katody Seria 3500</td><td>Stosowane biosystemy</td><td>4408256</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>DMEM o wysokiej stężeniu glukozy</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131026</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8751</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td>10131027</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Tłuczek teflonowy</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>linia komórkowa L929</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>MiniProtean Tetra4 Gel System</td><td>BioRad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Startery</td><td></td> PCR Sigma-Aldrich M1254 <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Produkty niestandardowe</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór poliakryloamidu 30%</td> <td>PanReac</td><td>A3626</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7181</td><td></td></tr><tr><td>POP-7</td><td>Applied Biosystems</td><td>4393714</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>QIAmp DNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina-6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4127</td><td></td></tr><tr><td>Surowica płodowa bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>SspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3132</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna/penicylina</td><td>PAN biotech</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>P14030b</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie cybridów transmiscyjnych przy użyciu linii komórek rakowych

Transmitochondrial Cybrid Generation Using Cancer Cell Lines

W ostatnich latach znacznie wzrosła liczba badań poświęconych ustaleniu związku między mitochondriami a rakiem. Jednak nadal potrzebne są dalsze wysiłki, aby w pełni zrozumieć związek między zmianami w mitochondriach a nowotworzeniem nowotworów, a także zidentyfikować fenotypy mitochondrialne związane z nowotworem. Na przykład, aby ocenić udział mitochondriów w procesach nowotworzenia i przerzutów, konieczne jest zrozumienie wpływu mitochondriów z komórek nowotworowych w różnych środowiskach jądrowych. W tym celu jednym z możliwych podejść jest przeniesienie mitochondriów w inne tło jądrowe w celu uzyskania tzw. komórek cybridowych. W tradycyjnych technikach cybrydyzacji linia komórkowa pozbawiona mtDNA (ρ0, komórka dawcy jądra) jest ponownie zasiedlana mitochondriami pochodzącymi z komórek wyłuszczonych lub płytek krwi. Jednak proces enukleacji wymaga dobrej adhezji komórek do płytki hodowlanej, cechy, która w wielu przypadkach jest częściowo lub całkowicie tracona w komórkach inwazyjnych. Ponadto kolejną trudnością występującą w tradycyjnych metodach jest osiągnięcie całkowitego usunięcia endogennego mtDNA z linii komórkowej mitochondrialnego biorcy w celu uzyskania czystego tła jądrowego i mitochondrialnego DNA, unikając obecności dwóch różnych gatunków mtDNA w wygenerowanym cybridzie. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół wymiany mitochondrialnej stosowany do komórek nowotworowych rosnących w zawiesinie w oparciu o ponowne zasiedlenie komórek leczonych rodaminą 6G z izolowanymi mitochondriami. Metodologia ta pozwala nam przezwyciężyć ograniczenia tradycyjnych podejść, a tym samym może być wykorzystana jako narzędzie do poszerzenia zrozumienia roli mitochondriów w progresji raka i przerzutach.

Po zastosowaniu przedstawionego powyżej protokołu powinno uzyskać się homoplastyczną linię komórek cybryd o zachowanym tle jądrowym, ale z nowym genotypem mitochondrialnym, co przedstawiono na schematach na Rysunku 1 i Rysunku 2. Czystość mitochondrialnego i jądrowego DNA obecnego w cybrydach można potwierdzić za pomocą metody RFLP, co pokazano na Rysunku 3, oraz poprzez analizę genotypowania DNA jądrowego, co przedstawiono na <stro...

Ten protokół opisuje technikę generowania cybrydów z komórek nowotworowych rosnących w zawiesinie jako narzędzie do badania roli mitochondriów w procesie nowotworowym.

Wytwarzanie cybridów transmiscyjnych przy użyciu linii komórek rakowych

In recent years, the number of studies dedicated to ascertaining the connection between mitochondria and cancer has significantly risen. However, more ...

Badania te mają na celu lepsze zrozumienie udziału mitochondriów w progresji raka i przerzutach. Pokolenie cybridów transcynordialnych może pomóc nam wyjaśnić, w jaki sposób i na jakim poziomie genotypy mitochondrialne są zaangażowane w agresywność komórki nowotworowej. Jedną z technologii pozwalających uzyskać informacje na temat roli mitochondriów w nowotworach jest wytwarzanie cybrydów.Łączymy to narzędzie z wieloma innymi metodami, które obejmują elektroforezę donacyjną, analizę oddechu i inne testy funkcjonalne mitochondriów, cytometrię przepływową, proteomikę i tak dalej. Plastyczność komórek nowotworowych, wraz z sieciami interakcji między genami jądrowymi i mitochondrialnymi, zwiększa złożoność naszych eksperymentów i interpretacji danych. Jest to jeden z powodów, dla których konieczne jest opracowanie nowych podejść eksperymentalnych.Jednym z najbardziej ekscytujących wyników naszych badań było odkrycie dwóch mutacji mitochondrialnego DNA związanych z oderwaniem komórek od naczynia do zabawy, przypominających powstawanie przerzutów i całkowicie uzależniających komórki od glikolizy tlenowej, a także czyniących je bardziej maregenicznymi i przerzutowymi w modelach in vivo. Ten protokół wymiany mitochondrialnej może być stosowany do zawiesiny rosnących komórek rakowych. Chronologia może przezwyciężyć ograniczenia tradycyjnych podejść, w których proces zarodkowania i całkowite usunięcie mitochondrialnego DNA z mitochondrialnych linii komórkowych biorców często staje się prawdziwym wyzwaniem.Aby wykonać zubożenie mitochondrialne linii komórkowej biorcy, należy wysiać 1 milion komórek na sześciodołkowej płytce, używając kompletnej pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS i penicylinę streptomycynę. Codziennie traktuj komórki optymalnym stężeniem rodaminy 6G przez trzy do siedmiu dni, w zależności od rodzaju linii komórkowej. Aby utrzymać komórki przy życiu, uzupełnij pożywkę do hodowli komórkowej 50 mikrogramami na mililitr urydyny i 100 mikrogramami na mililitr pirogronianu.Po poddaniu działaniu substancji, a przed fuzją z mitochondriami wyizolowanymi z linii komórkowej dawcy, należy usunąć pożywkę z komórek poddanych działaniu Rhodaminy 6G i dodać kompletną pożywkę do hodowli komórkowych bez Rhodaminy 6G. Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez trzy do czterech godzin. Na koniec, aby przygotować wstępnie potraktowane komórki rodaminy 6G do fuzji, zbierz je do 15-mililitrowej probówki i odwiruj probówkę w temperaturze pokojowej i 520 G przez pięć minut.Należy pamiętać, że granulka nabiera neonowo-różowego koloru dzięki obróbce rodaminą 6G. Po uzyskaniu około 25 milionów komórek dawcy mitochondriów w siódmym dniu, zbierz wykładniczo rosnące komórki w 50-mililitrowej probówce i zbierz je przez odwirowanie w temperaturze pokojowej i 520 G przez pięć minut. Przemyć komórki zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem i osadzić je przez odwirowanie w temperaturze pokojowej i 520 G przez pięć minut.Teraz przeprowadź całą ekstrakcję mitochondriów w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą zimnych odczynników i utrzymuj komórki lub mitochondria na lodzie. Po trzecim odwirowaniu odrzucić supernatant przez aspirację za pomocą szklanej pipety połączonej z pompą próżniową. I ponownie zawiesić upakowane komórki w objętości hipotonicznego bufora równej siedmiokrotności objętości osadu komórkowego.Następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki homogenizatora i pozwól komórkom pęcznieć, inkubując je na lodzie przez dwie minuty. Przerwij błony komórkowe, wykonując od ośmiu do 10 uderzeń w homogenizatorze sprzężonym z napędzanym silnikiem tłuczkiem obracającym się z prędkością 600 obrotów na minutę. Do homogenatu komórki dodaj bufor hipertoniczny równy siedmiokrotności objętości początkowego osadu, aby wytworzyć środowisko izotoniczne.Przenieść homogenat do 15-mililitrowej probówki i odwirować w stałym wirniku przy 1 000 G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie zbierz tylko trzy czwarte supernatantu, pozostawiając duży margines od osadu, aby uniknąć zanieczyszczenia jądrami lub nienaruszonymi komórkami, i przenieś go do innej probówki. Po dwukrotnym powtórzeniu procesu przenieś supernatant zawierający frakcję mitochondrialną do 1,5 mililitrowych probówek.Odwirować probówki z maksymalną prędkością 18 000 G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i przemyć osad wzbogacony w mitochondria buforem A. Połączyć zawartość dwóch probówek w jedną i odwirować, jak pokazano wcześniej. Powtarzaj proces, aż cały materiał znajdzie się tylko w jednej tubie.Przepłukać osad otrzymany z ostatniego wirowania za pomocą 300 mikrolitrów buforu A. Określić ilościowo stężenie białka mitochondrialnego za pomocą testu Bradforda. Przed fuzją z mitochondrialną linią komórkową biorcy należy ocenić brak zanieczyszczeń jąder we frakcji mitochondrialnej poprzez immunodetekcję białek jądrowych. Alternatywnie należy przeprowadzić ilościową reakcję łańcuchową polimerazy lub amplifikację QPCR genu jądrowego.Do generowania cybrydów transcyprrialnych należy użyć mitochondrialnych komórek biorczych, które zostały zubożone do mitochondriów przez leczenie rodaminą 6G i przeprowadzić fuzję z mitochondriami wyizolowanymi z komórek dawcy mitochondriów. Zapewnić prawidłowe zniesienie funkcji mitochondriów w komórkach biorcy i oczyszczanie organelli z komórek dawcy poprzez wysiewanie niewielkiej liczby komórek traktowanych rodaminą 6G i izolowanych mitochondriów w kompletnej pożywce hodowlanej na płytce sześciodołkowej. Sprawdź, czy po miesiącu hodowli w studzienkach nie pozostały żadne komórki, które przeżyły.Aby kontynuować fuzję, ostrożnie dodaj komórki poddane działaniu rodaminy 6G do izolowanego osadu mitochondriów, a następnie odwiruj przy 520 G przez pięć minut, aby komórki mogły zmieszać się z mitochondriami. Dodaj 100 mikrolitrów 50% glikolu polietylenowego i delikatnie zawieś granulat na 30 sekund. Następnie pozostaw zawiesinę nienaruszoną przez kolejne 30 sekund.Na koniec przenieś mieszaninę do sześciodołkowej płytki ze świeżą, kompletną pożywką do hodowli komórkowych i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Zwykle po około tygodniu cybrid transmiscyjny powinien zacząć rosnąć, dając początek klonom, które można indywidualnie wybierać lub mieszać w puli przed ich analizą. Fragmenty restrykcyjne uzyskane z polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego lub analizy RFLP mitochondriów typu dzikiego różniły się od zmutowanego.Analiza RFLP nowych transmitochondrialnych linii komórkowych wykazała, że fragmenty restrykcyjne były identyczne z tymi uzyskanymi u odpowiednich dawców mitochondrialnych i różniły się od tych generowanych przez linie komórkowe biorców. Co więcej, różnica w typowym profilu genotypowania jądrowego DNA dwóch linii komórkowych wykorzystywanych w procesie hybrydyzacji może być również wykorzystana do potwierdzenia czystości jądrowego DNA.

transmitochondrial-cybrid-generation-using-cancer-cell-lines

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Szybki i prosty sposób na wygenerowanie ludzkich linii komórkowych z indukowalną i odwracalną nadekspresją cDNA lub nokautem za pośrednictwem shRNA interesującego genu. Metoda ta umożliwia naukowcom wiarygodne i wysoce powtarzalne manipulowanie liniami komórkowymi, które są trudne do zmiany za pomocą przejściowych metod transfekcji lub konwencjonalnych strategii knockdown/knockout.

Generowanie stabilnych linii komórek ludzkich z ekspresją shRNA lub cDNA indukowaną tetracykliną (Tet-on)

Cytotoksyczna aktywność fenantrydyny PJ-34 w komórkach nowotworowych przechodzących mitozę została udokumentowana w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania konfokalnego na żywo. PJ-34 zlikwidował ludzkiego raka piersi Komórki MDA-MB-231 zawierające extracentrosomy w mitozie. W przeciwieństwie do normalnej dwuogniskowej mitozy, pozacentrosomy nie były skupione w dwóch biegunach wrzeciona w obecności PJ-34.

Śmierć komórki związana z nieprawidłową mitozą obserwowana przez obrazowanie konfokalne w żywych komórkach rakowych

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje metodę używaną do generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty (PDX) z krążących komórek nowotworowych (CTC). Generowanie modeli PDX z CTC zapewnia alternatywny model eksperymentalny do badania raka prostaty; Najczęściej diagnozowany nowotwór i częsta przyczyna zgonów z powodu raka u mężczyzn.

Generowanie modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem prostaty z krążących komórek nowotworowych

Tutaj przedstawiono protokół (MitoCeption) do transferu mitochondriów, wyizolowanych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), do komórek macierzystych glejaka (GSC), w celu zbadania ich biologicznego wpływu na metabolizm i funkcje GSC. Podobny protokół można dostosować do przenoszenia mitochondriów między innymi typami komórek.

MitoCeption: Przenoszenie izolowanych ludzkich mitochondriów MSC do komórek macierzystych glejaka

Tutaj prezentujemy protokół generowania klonów komórek rakowych zawierających znacznik sekwencji MS2 na pojedynczym subtelomerze. Podejście to, oparte na systemie MS2-GFP, umożliwia wizualizację endogennych transkryptów telomerowego RNA zawierającego powtórzenia (TERRA) wyrażonego z pojedynczego telomeru w żywych komórkach.

Generowanie klonów komórek rakowych w celu wizualizacji telomerowego RNA TERRA zawierającego powtórzenia wyrażonego z pojedynczego telomeru w żywych komórkach

Cybrydy transcyondryjne to hybrydowe komórki uzyskane przez fuzję komórek zubożonych w mitochondrialne DNA (mtDNA) (komórki rho0) z cytoplastami (komórkami wyłuszczonymi) pochodzącymi od pacjentów dotkniętych zaburzeniami mitochondrialnymi. Pozwalają one na określenie jądrowego lub mitochondrialnego pochodzenia choroby, ocenę aktywności biochemicznej oraz potwierdzenie patogenetycznej roli wariantów związanych z mtDNA.

Podejście in vitro do badania dysfunkcji mitochondriów: model Cybrid

Tutaj prezentujemy protokół obejmujący śledzenie mitochondriów, procedury bezpośredniej kohodowli mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) i komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (ARPE19), a także metody obserwacji i statystycznej analizy tworzenia i transferu mitochondriów przez nanorurki tunelowe (TNT) w celu scharakteryzowania wymiany mitochondrialnej za pośrednictwem TNT między MSC a komórkami ARPE19.

Transfer mitochondrialny za pomocą nanorurek tunelowych między mezenchymalnymi komórkami macierzystymi a nabłonkiem barwnikowym siatkówki in vitro

Ten protokół opisuje rozwój przedklinicznego modelu osteoklastogenezy in vitro z monocytów krwi obwodowej hodowanych z liniami komórkowymi raka piersi w celu naśladowania interakcji komórka rakowa - osteoklast. Model ten może zostać wykorzystany do pogłębienia naszej wiedzy na temat powstawania przerzutów do kości i poprawy opcji terapeutycznych.

Opracowanie ludzkiego przedklinicznego modelu osteoklastogenezy z monocytów krwi obwodowej hodowanych wspólnie z liniami komórkowymi raka piersi

Oporność na terapie przeciwnowotworowe przyczynia się do postępu choroby i śmierci. Określenie mechanistycznych podstaw oporności ma kluczowe znaczenie dla poprawy odpowiedzi terapeutycznej. Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje protokół generowania opornych na taksany modeli komórkowych raka gruczołu krokowego (PC), aby pomóc w analizie szlaków zaangażowanych w progresję do oporności na docetaksel u pacjentów z PC.

Generowanie modeli komórkowych raka gruczołu krokowego oporności na lek antymitotyczny docetaksel

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Poznaj metodę wytwarzania cybridów transmiscyjnych z komórek nowotworowych w zawiesinie. Technika ta pozwala badać rolę mitochondriów w procesie nowotworzenia i progresji raka.

Wytwarzanie cybridów transmiscyjnych przy użyciu linii komórek rakowych

Przeglądaj więcej filmów