Ultraszybkie sekwencjonowanie nowej generacji oparte na amplikonie w niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym raku płuca
8 września 2023
Wzrost liczby biomarkerów molekularnych do testowania w leczeniu leczenia niepłaskonabłonkowym niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NS-NSCLC) skłonił do opracowania szybkich i niezawodnych metod wykrywania molekularnego. Opisujemy przebieg pracy do oceny zmian genomowych u pacjentów z NS-NSCLC przy użyciu podejścia ultraszybkiego sekwencjonowania nowej generacji (NGS).
Obecnie terapie celowane niedrobnokomórkowego raka płuca wymagają szybkiego wykrywania wielu zmian genomowych, dlatego ma to kluczowe znaczenie dla optymalnej opieki, ponieważ biopsja klatki piersiowej jest często mała i zawiera niewiele komórek nowotworowych. W związku z tym przedstawiamy ultraszybki proces sekwencjonowania nowej generacji, który jest wdrażany do rutynowej diagnostyki niedrobnokomórkowego raka płuca w laboratorium patomorfologii. Obecnie ukierunkowany NGS przy użyciu różnych rozmiarów paneli oraz testowanie sekwencjonowania jednego genu za pomocą RT-PCR, digital PCR, fluorescencyjna hybrydyzacja in situ i immunohistochemia to różne metody stosowane do wykrywania zmian molekularnych.
Jednak większość z tych metod może być czasochłonna i pochłaniać materiał tkankowy, co prowadzi do opóźnionej diagnozy i ryzyka wysiłku tkankowego. Wyzwanie polega na skutecznym wykrywaniu wielu zmian molekularnych przy jednoczesnej oszczędności materiałów i zapewnieniu szybkiej diagnozy. Przepływ pracy zapewnia onkologowi klatki piersiowej kompleksowe informacje o guzie, w tym diagnozę histologiczną, status PD-L1 i możliwe do ukierunkowania aberracje genomowe.
Umożliwia szybkie podejmowanie decyzji dotyczących leczenia w celu optymalnego wyboru terapii. Nasz protokół identyfikuje wszystkie kluczowe cele molekularne w onkologii klatki piersiowej w oparciu o zalecenia ESMO, NCCN i ASCO, zapewnia terminowe wyniki nawet w przypadku małych rozmiarów próbek i ograniczonego DNA/RNA. I tak zautomatyzowane.
System zmniejszył obciążenie techników po zaledwie trzech godzinach manipulacji w laboratorium mokrym. Naszym celem jest skupienie się na szybkiej i kompleksowej charakterystyce profilowania genomowego nowotworów poprzez opracowanie w przyszłości dużego panelu NGS dla próbek tkanek i osocza. Pilnie potrzebne jest jednak zwiększenie strategii wykrywania licznych zmian molekularnych w małych próbkach i próbkach cytologicznych przy użyciu dużych paneli.
Aby rozpocząć, przetnij formalne i utrwalone próbki zatopionej parafiny lub FFPEDNA i RNA. Włącz narzędzie do automatycznego oczyszczania lub interfejsu API i zaloguj się przy użyciu nazwy użytkownika i hasła. Następnie w oprogramowaniu Integrated Genomic Viewer Software w obszarze samples (Samples) (Próbki) kliknij pozycję Create Samples (Utwórz próbki).
Wprowadź nazwę próbki i wybierz kategorię aplikacji. Po wprowadzeniu przykładowych szczegółów kliknij Zapisz. Następnie wybierz pozycję Uruchamianie.
Kliknij pozycję Próbkuj do wyniku i wprowadź nazwę przebiegu przed kliknięciem przycisku Dalej. Wybierz test, a następnie próbkę, która Cię interesuje, i kliknij przycisk Dalej. Po wybraniu każdej próbki kliknij przycisk Przypisz, a następnie sprawdź parametry Ellucian i zapisz przebieg.
Umieść próbki tkanek FFPE w probówkach do przetwarzania próbek. Odwirować probówkę o stężeniu 2000 G przez jedną minutę. Do probówki dodać Protease Digest Master Mix przygotowany z zestawu do oczyszczania kwasów nukleinowych.
Próbkę należy inkubować w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie inkubować w temperaturze 90 stopni Celsjusza przez godzinę. Po schłodzeniu próbek podnieś rurkę wewnętrzną rurki do przetwarzania próbek i zablokuj ją, skręcając w lewo. Odwiruj probówkę wewnętrzną o sile 2000 G przez 10 minut, a następnie odblokuj probówkę, obracając ją w prawo i oddzielając ją od drugiej probówki.
Wyrzuć dętkę i umieść dętkę zewnętrzną na lodzie do momentu załadowania do API. Przygotuj główną mieszankę mineralizacji DNazy i załaduj ją na wstępnie napełnioną płytkę FFPEDNA i do oczyszczania RNA. Załaduj przygotowane próbki do FFPEDNA i pierwszej płytki do oczyszczania RNA.
Na ekranie API kliknij przycisk Uruchom. Następnie wybierz plan uruchamiania i kliknij przycisk Dalej. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby załadować materiały eksploatacyjne i odczynniki wymagane do przebiegu oczyszczania.
Po załadowaniu wszystkich odczynników kliknij przycisk Dalej. Zamknij okno interfejsu API i kliknij przycisk Start. Pod koniec przebiegu kliknij przycisk Rozładuj i natychmiast wyjmij 48-dołkową płytkę archiwum kwasu nukleinowego zawierającą oczyszczone DNA i RNA.
Po zakończeniu oczyszczania próbki należy zamknąć płytkę i przechowywać ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby rozpocząć, rozmrozić wszystkie odczynniki do sekwencjonowania w temperaturze pokojowej przez 30 minut, włączyć sekwenator i zalogować się do systemu. Zapieczętować 96-dołkową płytkę zawierającą oczyszczone próbki FFPEDNA i RNA arkuszem samoprzylepnej folii płytkowej PCR i załadować ją do sekwencera.
Zgodnie z instrukcjami sekwencera zainstaluj wszystkie materiały eksploatacyjne w odpowiedniej talii. Sprawdź trzecią rurę paska 2-HD pod kątem jakichkolwiek opadów. Jeśli probówka zawiera jakieś osady, usuń je, przesuwając rurkę lub delikatnie obracając pasek.
Obróć paski jeden i trzeci do góry nogami i z powrotem trzy do czterech razy, aby usunąć koraliki. Przytrzymaj paski na jednym końcu z uszczelką paska skierowaną do góry, a następnie przesuń pasek w dół, wykonując szybki ruch ramienia odśrodkowego i zakończ, wykonując ostry ruch nadgarstka. Odwirować paski o stężeniu 300 G przez 15 sekund.
Po zamknięciu systemu zamontuj drzwiczki wnęki odczynników sekwencjonujących i zamknij drzwiczki. Aby rozpocząć, otwórz oprogramowanie Integrated Genomic Viewer. W menu Wyniki kliknij polecenie Przykładowe wyniki.
Następnie kliknij nazwę interesującej Cię próbki w kolumnie nazwy próbki, aby wyświetlić wyniki sekwencjonowania. Aby przejrzeć wyniki wtyczki analizy pokrycia molekularnego, w prawym górnym rogu kliknij Pobierz pliki. Następnie w podsumowaniu przebiegu kliknij kartę Uruchom raport, aby wyświetlić metryki testu i uruchomić raport.
Aby wyświetlić wynik SNV i INDEL, kliknij kartę Warianty, a następnie kliknij opcję SNV i INDELs. Kliknij przycisk Edytuj filtry i wybierz opcję Brak filtru. Następnie kliknij kartę Warianty, a następnie Fuzje, aby wyświetlić wyniki fuzji i warianty eksonów RNA.
W prawym górnym rogu kliknij wizualizację i wariant eksonu RNA. Następnie przejrzyj wykres wariantów eksonu RNA. Kliknij kartę Warianty, a następnie wybierz opcję Fuzje, aby wyświetlić nierównowagę fuzji kafelków eksonów RNA.
W prawym górnym rogu kliknij pozycję Wizualizacja, a następnie pozycję Nierównowaga fuzji kafelków eksonów RNA i przejrzyj wykresy nierównowagi fuzji kafelków eksonów RNA. Na karcie Warianty kliknij pozycję CNV, aby wyświetlić wyniki CNV. Na koniec wygeneruj raport wariantów, klikając łącze, aby pobrać plik PDF.
Badanie to przedstawia analizę molekularną przeprowadzoną u 259 pacjentów z NS-NSCLC, w tym różnych typów biopsji i próbek chirurgicznych. W analizie DNA/RNA zaobserwowano również zmutowane geny napędowe i fuzje genów. Czułość metody wykrywania wariantów pojedynczych nukleotydów, insercji i delecji, wariantów liczby kopii i fuzji była wysoka i wahała się od 91,67% do 100%
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca odpowiada na pilną potrzebę szybkiego wykrywania zmian genomowych w niedrałowym niedrobnokomórkowym raku płuca (NS-NSCLC) w celu doboru odpowiednich terapii celowanych. Przedstawiono ultra-szybki schemat sekwencjonowania nowej generacji (NGS) jako rozwiązanie umożliwiające efektywną analizę małych próbek biopsyjnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Onkologia
- Diagnostyka molekularna
- Sekwencjonowanie następnej generacji
Wstęp
- Terapie celowane w przypadku NS-NSCLC zależą od terminowego wykrycia zmian genomicznych.
- Tradycyjne metody biopsji często dostarczają niewielkie próbki, co utrudnia analizę.
- Konieczne jest zastosowanie kompleksowego podejścia do szybkiego testowania w celu poprawy opieki nad pacjentem.
Zastosowane metody
- Ultraszybkie sekwencjonowanie następnej generacji (NGS)
- Analiza próbek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE)
- Zautomatyzowane procesy oczyszczania i sekwencjonowania
Główne wyniki
- Przepływ pracy pozwala na efektywne czasowo zidentyfikowanie kluczowych mutacji genetycznych i fuzji.
- Osiągnięto wysoką czułość w wykrywaniu różnych zmian genomicznych.
- Przeprowadzono kompleksowe profilowanie molekularne u 259 pacjentów z NS-NSCLC.
Wnioski
- Niniejsze badanie ustanawia nowy standard szybkiego profilowania genomowego w NS-NSCLC.
- Dostarcza ono kluczowych informacji dla spersonalizowanych strategii leczenia w onkologii.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ultraszybkie sekwencjonowanie następnej generacji (NGS) oparte na amplikonach umożliwia szybkie i kompleksowe profilowanie molekularne niedrobnokomórkowego raka płuca typu niepłaskiego (NS-NSCLC) z niewielkich i różnorodnych próbek biopsyjnych. Możliwość ta odpowiada na rosnące zapotrzebowanie na szybkie wykrywanie istotnych klinicznie zmian genomowych, co wspiera dobór terapii precyzyjnej i skraca czas oczekiwania na diagnozę. Integracja takich procedur w kluczowym momencie diagnostycznym zwiększa pewność prognostyczną oraz usprawnia podejmowanie decyzji terapeutycznych w onkologii klatki piersiowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne Etapy Odkrywania i Walidacja Celu
- Umożliwia wiarygodną identyfikację klinicznie istotnych zmian genomicznych w NS-NSCLC.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez wykrywanie mutacji sterujących i fuzji genów.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki kompleksowej charakterystyce molekularnej.
- Zwiększa pewność prognostyczną dla późniejszego testowania hipotez terapeutycznych.
Przesiewy i rozwój testów
- Zapewnia zestandaryzowane, powtarzalne profilowanie molekularne odpowiednie dla wysokoprzepustowych procesów diagnostycznych.
- Dostarcza ilościowych wyników dla SNVs, INDELs, CNVs i fuzji, wspierając gotowość analizy.
- Ogranicza zużycie tkanki i skraca czas oczekiwania na wynik, umożliwiając efektywną segregację próbek.
- Przygotowuje zwalidowane dane molekularne do integracji z platformami przesiewowymi i biomarkerowymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje profilowanie molekularne do strategii translacyjnych w zakresie biomarkerów w onkologii klatki piersiowej.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć diagnostycznych po wybór i walidację modeli przedklinicznych.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka poprzez dostarczanie kompleksowych danych genomowych.
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka podczas opracowywania nowych terapii w przypadku NS-NSCLC.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten ultraszybki schemat NGS łączy odkrycia diagnostyczne z badaniami translacyjnymi, wspierając szybką identyfikację potencjalnych kandydatów oraz walidację przedkliniczną w portfolio NS-NSCLC.
- Biologia odkrywcza: Przyspiesza weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie multipleksowej analizy genomowej.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki molekularne do rozwoju testów i oceny związków.
- Analityka: Generuje szczegółowe dane o wariantach, fuzjach i liczbie kopii do porównywania różnych warunków i wsparcia decyzji.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów i wybór modeli przedklinicznych w oparciu o rzeczywistą genomikę nowotworów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, zautomatyzowaną platformę do ciągłego profilowania molekularnego różnych typów próbek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w wyborze celu terapeutycznego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i przyspiesza diagnostykę molekularną przy minimalnych wymaganiach dotyczących ilości tkanki.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz optymalizuje alokację zasobów w projektach onkologicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów do terapii celowanej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie patologii molekularnej i interpretacji danych NGS.
- Zależy od zautomatyzowanej aparatury i zintegrowanego oprogramowania do analizy genomowej.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przetwarzania próbek i raportowania danych.
- Protokoły muszą być dostosowane do różnych rozmiarów próbek i typów tkanek, w tym do preparatów cytologicznych.
- Czas oczekiwania na wynik oraz czułość są zależne od jakości próbki i ograniczeń materiału wejściowego.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:11
Preparation of FFPE DNA and RNA Samples for Sequencing Using Automated Purification Instrument (API)
4:42
Amplicon‐Based Next‐Generation Sequencing of Non‐Squamous Non‐Small Cell Lung Cancer
5:50
Sequencing Analysis of Non‐Squamous Non‐Small Cell Lung Cancer Using Integrated Genomic Viewer Software
