Metoda obrazowania oparta na smartfonach do oznaczania unikania trawników C. elegans
February 24th, 2023
Ten artykuł opisuje prostą, tanią metodę rejestrowania zachowania Caenorhabditis elegans polegającego na unikaniu trawnika, przy użyciu łatwo dostępnych przedmiotów, takich jak smartfon i kaseton świetlny z diodą elektroluminescencyjną (LED). Udostępniamy również skrypt w języku Python do przetwarzania pliku wideo do formatu bardziej podatnego na zliczanie.
Wśród wielu zachowań wykazywanych przez C.elegans, unikanie patogennego trawnika jest strategią obronną robaka mającą na celu zminimalizowanie jego narażenia na szkodliwe patogeny. W naszym laboratorium używamy tego zachowania jako narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w prawidłowe funkcjonowanie neuronów, które pośredniczą w tym zachowaniu. Zachowanie unikania trawnika jest prostym testem.
Rozwija się jednak przez wiele godzin. Dlatego wygodnie jest, jeśli test można rejestrować w celu obserwacji zachowania przez długi czas. Ponadto, jeśli można rejestrować wiele testów w tym samym czasie, jest to jeszcze lepsze.
Chociaż w literaturze opisano wiele rozwiązań do obrazowania, nawet kilka kamer w umiarkowanej cenie może być poza zasięgiem laboratoriów o ograniczonych zasobach. Ponadto niektórzy mogą chcieć wypróbować test, ale nie planują tego robić w dłuższej perspektywie. W takich przypadkach pomocne mogą być rozwiązania krótkoterminowe, takie jak ten protokół.
Nasz protokół obrazowania oferuje łatwy i tani sposób rejestrowania zachowania robaków. Używamy smartfonów do nagrywania testu, a następnie przetwarzamy wideo za pomocą skryptu Pythona, który sprawia, że nadaje się do liczenia. Aby skonfigurować aparat do obrazowania, użyj smartfona z minimalną specyfikacją 12-megapikselowego aparatu, rozdzielczością 1080 pikseli, pięciogigabajtową przestrzenią dyskową i aplikacją do filmów poklatkowych ze sklepu z aplikacjami.
Umieść kaseton świetlny LED na dolnym stojaku inkubatora ustawionego na 25 stopni Celsjusza, w miejscu, w którym odbędzie się test. Aby ukryć kropkowany wzór na powierzchni światła LED, rozłóż dwa arkusze chusteczek, aby pokryć całą powierzchnię pudełka LED. Wybrać podwyższony stopień dla próbki składający się z przezroczystego arkusza z tworzywa sztucznego wspartego na pustych prostokątnych tunelach.
Upewnij się, że ściany tuneli są nieco ciemne, aby zminimalizować rozproszenie światła. Umieść kolejny stojak nad sceną, aby umieścić telefony do nagrywania. Każdy telefon nagra od trzech do sześciu płyt, więc odpowiednio dostosuj wysokość stojaka.
Umieść listwę zasilającą wewnątrz inkubatora, aby podłączyć telefony podczas nocnego nagrywania. Aby przygotować się do nagrania, podłącz smartfon do listwy zasilającej podłączonej do gniazdka elektrycznego. Upewnij się, że wyłączyłeś ustawienie automatycznej blokady, aby zapobiec powrotowi telefonu do ekranu blokady podczas nagrywania.
Otwórz aplikację aparatu poklatkowego i ustaw jakość wideo na 1080 pikseli przy 30 klatkach na sekundę. Ustaw interwał poklatkowy na dwie sekundy. Umieść smartfon ekranem skierowanym do góry, aby nagrywać za pomocą tylnej kamery i upewnij się, że tunele papierowego pudełka mieszczą się w polu view.
Za pomocą wykałaczki z drutu platynowego przenieś 30 zsynchronizowanych ślimaków L4-stage na płytkę PA14. Umieść robaki na środku trawnika z bakteriami PA14. W tym badaniu, dla każdego schorzenia, przetestowano dwie płytki.
Umieść dwie płytki na podniesionym stoliku aparatu rejestrującego z pokrywą skierowaną w dół, tak aby strona agarowa była skierowana do góry w kierunku kamery. Na ekranie smartfona dotknij miejsca, w którym znajduje się płytka, aby aparat mógł ustawić ostrość na płytkach testowych. Rozpocznij nagrywanie, a następnie dodaj więcej płyt do stołu montażowego.
Nagrywaj przez 20 godzin od ostatniego zestawu płyt umieszczonych na scenie. W końcowym filmie poklatkowym 20 godzin nagrywania da 20-minutowy film. Robaki N2 typu dzikiego porównano z mutantami npr-1.
Robaki typu dzikiego stopniowo opuszczały bakteryjny trawnik i pozostawały na zewnątrz. Robaki na zewnątrz gęstego bakteryjnego trawnika były wyraźnie widoczne na filmie, ale robaki wewnątrz bakteryjnego trawnika były trudniejsze do odróżnienia. Zidentyfikuj wymiary płytki PA14 zawierającej robaki L4-stage, uruchamiając skrypt Pythona extract_frame.py.
Następnie otwórz plik JPEG w ImageJ. Z menu wybierz Analizuj, a następnie Ustaw pomiary. Upewnij się, że pole Wyświetl etykietę jest zaznaczone i zamknij okno.
Za pomocą narzędzia Linia prosta zmierz średnicę płyty, rysując na niej linię. Następnie wybierz z menu opcję Analizuj, a następnie Zmierz. Jeśli film ma 1080 pikseli, każda płyta będzie miała szerokość około 480 pikseli.
Wprowadź te informacje w Notatniku, aby użyć ich później, i zamknij okno Wyniki. Za pomocą narzędzia do tworzenia wielu punktów zaznacz punkty w lewym górnym rogu każdej płyty, które staną się lewym górnym rogiem przyciętych filmów. Zaznacz go w kolejności, w jakiej zostały uruchomione płyty.
Po utworzeniu punktu dla wszystkich płyt wybierz z menu opcję Analizuj, a następnie Zmierz. Pomiary, w tym współrzędne X i Y punktów, pojawią się w oknie Wyniki. Aby przetworzyć wiele filmów, powtórz ten proces w ImageJ z innymi plikami JPEG.
Wszystkie współrzędne X i Y zostaną wyświetlone w tym samym oknie wyników. Zapisz okno Wyniki w pliku CSV. Plik powinien być zapisany w tym samym katalogu, co pliki filmowe.
Aby znaleźć czas rozpoczęcia dla każdej płyty, odtwórz film na komputerze lub telefonie i zanotuj czas rozpoczęcia każdego zestawu płyt umieszczonego pod aparatem. Otwórz wyniki. csv ze współrzędnymi i dodaj kolumnę startową.
Dla każdego wiersza odpowiadającego poszczególnym blachom wprowadź odpowiedni czas rozpoczęcia w sekundach pod kolumną początkową. Zapisz plik. Aby przyciąć i przyciąć filmy, uruchom crop_n_trim.
Skrypt py. Wybierz wyniki. Plik csv.
Wprowadź podane wcześniej wymiary blachy i wartość piksela. Skrypt odczyta teraz każdy wiersz wyników. csv, aby znaleźć właściwy plik filmowy po zakończeniu działania skryptu.
Pojawi się folder o tej samej nazwie co film, po którym nastąpi godzina rozpoczęcia, w której zostaną zapisane filmy odpowiadające testowi. Aby zliczyć ręcznie, otwórz każdy plik AVI w ImageJ. Policz robaki, które są widoczne na zewnątrz trawnika, a następnie oblicz wskaźnik zajętości dla każdego punktu czasowego.
Dzikie robaki N2 stopniowo opuszczały trawnik bakteryjny i pozostawały na zewnątrz, jak zauważono we wskaźniku zajętości w czasie. Zliczenia dokonane bezpośrednio na płytkach porównano z liczeniami zobrazowanych robaków. Zliczenia wykonane na podstawie zobrazowanych robaków okazały się bardzo dokładne.
Gdy trzy próby dla każdego szczepu zostały uśrednione razem, szczepy N2 i npr-1 uzyskały odpowiednio 99,5% i 96,2% dokładności.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje prostą, niskobudżetową metodę rejestracji zachowania unikania trawnika Caenorhabditis elegans, wykorzystującą smartfon i skrzynkę świetlną z diodami LED. Metoda ta umożliwia długotrwałą obserwację tego zachowania, co jest kluczowe dla badania podstawowych funkcji neuronowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia zachowań
- Genetyka
Tło
- Unikanie trawnika przez patogeny jest strategią obronną C. elegans.
- To zachowanie minimalizuje ekspozycję na szkodliwe patogeny.
- Test można rejestrować przez dłuższy czas dla szczegółowej obserwacji.
- Rejestrowanie wielu testów jednocześnie poprawia wydajność badań.
Cel badania
- Zidentyfikować geny zaangażowane w funkcje neuronowe związane z unikaniem trawnika.
- Opracować niskobudżetową metodę analizy zachowań.
- Ułatwić długotrwałą obserwację zachowań C. elegans.
Stosowane metody
- Wykorzystanie smartfonu do rejestracji wideo.
- Zastosowanie skrzynki świetlnej LED do kontrolowanego oświetlenia.
- Zastosowanie skryptu Pythona do przetwarzania wideo.
- Obserwacja zachowań przez dłuższy czas.
Główne wyniki
- Metoda skutecznie rejestruje zachowanie unikania trawnika.
- Długotrwałe nagrania dostarczają wglądu w funkcje neuronowe.
- Wiele testów można rejestrować jednocześnie.
- Podejście jest przystępne i niskobudżetowe dla badaczy.
Wnioski
- Badanie przedstawia praktyczną metodę analizy zachowań w C. elegans.
- Poprawia zrozumienie mechanizmów neuronowych w unikaniu patogenów.
- Wyniki mogą pomóc w badaniach genetycznych związanych z funkcją neuronową.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative behavioral assays in C. elegans are critical for target validation and mechanistic de-risking in early neuroscience and neurogenetics discovery. This smartphone-based imaging method enables scalable, cost-effective, and reproducible measurement of avoidance phenotypes, supporting predictive confidence in gene-function studies. The approach facilitates high-throughput screening and cross-strain comparisons, directly impacting portfolio triage and early-stage decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal gene function through quantifiable avoidance behavior.
- Supports biological de-risking by distinguishing wild-type from mutant phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in linking genetic perturbations to observable outcomes.
- Provides a scalable platform for functional target validation in neurogenetics.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible behavioral readouts suitable for multi-sample workflows.
- Enables assay scalability by imaging multiple plates simultaneously with minimal instrumentation.
- Generates quantitative occupancy data for robust compound or genetic screening.
- Supports platform reuse for diverse behavioral assays in C. elegans.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neuronal pathway interrogation in preclinical models.
- Provides continuity from genetic discovery to functional validation in translational neuroscience.
- Enables risk-adjusted advancement of candidate targets based on behavioral phenotypes.
- Supports mechanistic de-risking for neuroactive compound evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging method integrates into the early discovery-to-lead identification continuum, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and functional screening in neurogenetics pipelines.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing by quantifying avoidance behavior in genetic models.
- Screening: Provides reproducible, quantitative occupancy measurements for assay readiness.
- Analytics: Delivers time-resolved behavioral data for statistical comparison across strains or conditions.
- Translational Research: Bridges genetic findings to functional outcomes in preclinical systems.
- Enterprise Reuse: Offers a low-cost, scalable platform adaptable to other behavioral assays in C. elegans.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neuronal target validation.
- Operational Value: Standardizes behavioral data collection and enables high-throughput, reproducible workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust early-stage screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of genetic targets and phenotypic screens.
Implementation Considerations
- Requires basic expertise in C. elegans handling and behavioral assay setup.
- Needs smartphones with sufficient camera resolution and storage, plus LED light boxes.
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and data analysis scripts.
- Adaptable to various C. elegans behavioral assays with minimal protocol changes.
- Manual counting remains a throughput limitation unless automated image analysis is developed.
