Name: Metoda obrazowania oparta na smartfonach do oznaczania unikania trawników C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Poznaj metodę obrazowania zachowań C. elegans przy użyciu smartfona i diodowej skrzynki świetlnej. To tanie rozwiązanie umożliwia długoterminową obserwację unikania trawników patogennych i analizę funkcji neuronalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Deok Joong Lee za krytyczne przeczytanie manuskryptu i przetestowanie kodu Pythona. Badania te były sponsorowane przez National Research Foundation of Korea 2017R1A5A2015369 (K.-h.Y.) i 2019R1C1C1008708 (K.-h.Y.).

1. Ustawianie aparatury do obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-E)
<ol>
	<li>Upewnij się, że dostępny jest aparat w smartfonie spełniający następujące minimalne wymagania: 
	Aparat 12 megapikseli (MP) 
	Rozdzielczość 1080p Video 
	5 GB przestrzeni dyskowej (20 minut wideo to 3-4 Gb) 
	Aplikacja do filmów poklatkowych ze sklepu z aplikacjami (dostępne bezpłatne aplikacje)</li>
	<li>Umieść kaseton oświetleniowy LED na dolnym stojaku inkubatora o temperaturze 25 °C, w którym będzie przeprowadzany test</li>.
	<li>Aby ukryć kropkowany wzór na powierzchni światła LED, rozłóż dwa arkusze chusteczek, aby pokryć całą powierzchnię pudełka LED.</li>
	<li>Wykonaj podwyższony stolik dla próbki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,D). Podniesiona scena to przezroczysta folia z tworzywa sztucznego wsparta na pustych prostokątnych tunelach. Tunele działają jak kondensor skupiający światło, zapewniając lepszy kontrast z próbką (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Upewnij się, że ściany tunelu są nieco ciemne, aby zminimalizować rozproszenie światła. W badaniu wykorzystano brązowe pudełka papierowe. Wymiary tunelu to 5,5 cm x 17 cm x 4,5 cm (szer. x dł. x wys.). Kaseton świetlny LED może pomieścić do pięciu tuneli.</li>
	<li>Umieść kolejny stojak nad sceną, aby umieścić telefony do nagrywania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B,E). Każdy telefon nagrywa od trzech do sześciu płyt (od jednego do dwóch rzędów po trzy płyty), więc odpowiednio dostosuj wysokość stojaka. Będzie to około 15 cm powyżej próbki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B).</li>
	<li>Umieść listwę zasilającą wewnątrz inkubatora, aby podłączyć telefony podczas nocnego nagrywania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i nośników
<ol>
	<li>Przygotować bufor M9, dodając 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4 i 5 g NaCl do 1 l destylowanegoH2O. Sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min. Schłodzić bufor, a następnie dodać 1 ml 1 M MgSO4.</li>
	<li>Przygotować 1 M bufor KPO4 przez dodanie 108,3 g KH2PO4 i 35,6 g K2HPO4 do 1 L H2O. Dostosować pH do 6,0 przez dodanie KOH. Sterylizuj w autoklawie.</li>
	<li>Przygotuj roztwór do wybielania robaków, mieszając 1 ml wybielacza, 0,4 ml 1 M NaOH i 2,6 ml H2O.</li>
	<li>Przygotuj płytki agarowe z pożywką do wzrostu nicieni (NGM).
	<ol>
		<li>Dodać 3 g NaCl, 2,5 g peptonu baktonowego i 17 g agaru baktonowego do kolby o pojemności 3 l. Dodaj 975 ml wody destylowanej i włóż mieszadło.</li>
		<li>Sterylizować w autoklawie, następnie schłodzić do 55 °C i dodać 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w etanolu), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 MMgSO4 i 25 ml 1 M buforu KPO4 (pH 6,0). Wymieszaj, aby dobrze wymieszać. Wlać do talerzy o średnicy 6 cm. Pozostaw talerze do wyschnięcia na co najmniej 2 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewaj płytki agarowe NGM z OP50 E. coli, pipetując około 1 ml nocnej kultury OP50 w celu utworzenia trawnika bakterii. Pozostaw w temperaturze pokojowej (RT) do momentu, gdy będzie gotowy do użycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie płytek NGM o wysokiej zawartości peptonu (dla PA14)
UWAGA: Te płytki powinny być wykonane co najmniej 5 dni przed testem.
<ol>
	<li>Wytwarzaj NGM zawierający 0,35% peptonu. Wymieszaj 0,3 g NaCl, 0,35 g peptonu baktonowego i 1,7 g agaru bakto w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Dodaj 97,5 ml wody destylowanej i włóż mieszadło.</li>
	<li>Przykryć otwór kolby folią aluminiową i przechowywać w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Schłodzić do 55 °C i dodać 0,1 ml cholesterolu (5 mg/ml w etanolu), 0,1 ml 1 M CaCl2, 0,1 ml 1 MMgSO4 i 2,5 ml 1 M buforu KPO4 (pH 6,0). Wymieszaj, aby dobrze wymieszać.</li>
	<li>Wlej wysokopeptonowy NGM do szalek Petriego o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Suszyć talerze przez co najmniej 2 dni.</li>
</ol>
4. Synchronizacja robaków przez wybielanie
UWAGA: Rozpocznij ten krok 3 dni przed testem.
<ol>
	<li>Weź płytki z gravid dorosłymi robakami i zbierz je do mikroprobówki o pojemności 1,7 ml, myjąc płytki buforem M9.</li>
	<li>Usuń jak najwięcej płynu, a następnie dodaj 400 μl roztworu wybielającego. Odczekaj około 4-5 minut z przerywanym wirowaniem, aż dorosłe ciała robaków pękną, uwalniając jaja.</li>
	<li>Dodać bufor M9, aby wypełnić resztę mikroprobówki w celu rozcieńczenia roztworu wybielającego. Wiruj z maksymalną prędkością (od 12 000 do 13 000 x g) przez 1-2 s. Usunąć supernatant i przemyć jeszcze trzy razy buforem M9.</li>
	<li>Przenieść jaja na pustą płytkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą bufor M9. Pozostaw jaja do wyklucia się na noc w temperaturze 20 °C. W przypadku braku pożywienia wyklute robaki zatrzymują się w stadium larwalnym L1, synchronizując stadium rozwojowe wszystkich robaków. 
	UWAGA: Pokrycie szalki Petriego o średnicy 35 mm roztworem żelatyny (0,05% żelatyny w autoklawie wodnym) może zapobiec przywieraniu jaj do dna i zminimalizować ich utratę.</li>
	<li>Następnego dnia przenieś robaki etapowe L1 na płytki NGM z nasionami OP50.</li>
	<li>Inkubować robaki w temperaturze 20 °C przez 53–54 godziny, aż robaki osiągną stadium larwalne L4.</li>
</ol>
5. Przygotowanie bakterii ( Pseudomonas aeruginosa, PA14)
UWAGA: Rozpocznij ten krok 4 dni przed testem.
<ol>
	<li>Rozmrożone bakterie rozmrozić w temperaturze od -80 °C na płytce agarowej Luria Bertani (LB) bez użycia antybiotyku i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Zawsze używaj świeżych bakterii. Płytki z prążkami należy przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 tydzień.</li>
	<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię w 3 ml bulionu King's i hodować przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Następnego dnia wysiać 7 μl nocnej kultury na płytki NGM o wysokiej zawartości peptonu i inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Przenieś płytki z nasionami do RT i inkubuj przez kolejne 24 godziny przed użyciem. Po przygotowaniu zużyć płytkę w ciągu najbliższych 24 godzin.</li>
</ol>
6. Przygotowanie do nagrywania
UWAGA: Zrób to tuż przed testem.
<ol>
	<li>Podłącz smartfon do listwy zasilającej podłączonej do gniazdka elektrycznego. Pamiętaj, aby wyłączyć ustawienie automatycznej blokady, aby zapobiec powrotowi telefonu do ekranu blokady podczas nagrywania.</li>
	<li>Otwórz aplikację aparatu poklatkowego i ustaw interwał poklatkowy na 2 s. Ustaw jakość wideo na 1080p przy 30 kl./s.</li>
	<li>Umieść smartfon ekranem skierowanym do góry, aby nagrywać tylnym aparatem. Sprawdź na ekranie, aby upewnić się, że tunele pudełka papierowego mieszczą się w polu view.</li>
</ol>
7. Test unikania trawników
<ol>
	<li>Za pomocą wykałaczki z drutu platynowego przenieś 30 zsynchronizowanych ślimaków etapowych L4 (53-54 h z L1) na płytkę PA14. Umieść robaki na środku trawnika bakteryjnego. Dla każdego warunku w tym badaniu przetestowano dwie płytki (tj. 60 robaków na warunek).</li>
	<li>Umieścić dwie płytki na podniesionym stoliku aparatu rejestrującego z pokrywą skierowaną w dół. Strona z agarem będzie skierowana do góry w stronę kamery.</li>
	<li>Na ekranie smartfona dotknij miejsca, w którym znajduje się płytka, aby aparat mógł ustawić ostrość na płytkach testowych. Pomocne jest posiadanie etykiety lub napisu na tabliczce, ponieważ aparat może go użyć do prawidłowego ustawiania ostrości. 
	UWAGA: Pisanie na spodzie tabliczek nie zakłóca obrazowania robaków, o ile jest skierowane w stronę krawędzi. Na szczęście robaki pozostają w pobliżu trawnika nawet po jego opuszczeniu, więc niezakłócony widok jest potrzebny tylko na bezpośrednią okolicę trawnika.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie.</li>
	<li>Po rozpoczęciu nagrywania dodaj więcej płyt do sceny. Między płytkami może wystąpić znaczne opóźnienie ze względu na czas potrzebny na przeniesienie robaków przez zbieranie. Zanotuj późniejszy czas opóźnienia, aby każdy warunek mógł być policzony w momencie jego rozpoczęcia.</li>
	<li>Nagrywaj przez 20 h od ostatniego kompletu klisz umieszczonych na scenie. W końcowym filmie poklatkowym 20 godzin nagrywania da 20-minutowy film. 
	UWAGA: Być może warto policzyć robaki bezpośrednio z płytek po teście, przynajmniej na początku przy kilku pierwszych okazjach. Można to porównać z wartościami uzyskanymi za pomocą obrazowania wideo, aby upewnić się, że dają one podobne liczby.</li>
</ol>
8. Przetwarzanie wideo za pomocą skryptu Pythona
<ol>
	<li>Prześlij plik filmowy do komputera w celu przetworzenia. Rozszerzeniem będzie plik MOV (iPhone) lub MP4 (Android).</li>
	<li>Użyj kodu Pythona, aby przetworzyć filmy. Kod można znaleźć pod adresem github.com/khyoon201/wormavoid.</li>
	<li>Aby uruchomić skrypty Pythona, upewnij się, że na komputerze są wstępnie zainstalowane: ffmpeg, narzędzie do konwersji plików wideo (wskazówki dotyczące instalacji można znaleźć na jego stronie internetowej, ffmpeg.org/download) oraz pakiety Pythona os, pandas, tkinter i ffmpeg-python.</li>
	<li>Znajdź wymiary i współrzędne każdej blachy za pomocą skryptu extract_frame.py.
	<ol>
		<li>Uruchom skrypt extract_frame.py. Pojawi się okno, w którym można wybrać plik wideo przechowywany na komputerze. Po zakończeniu uruchamiania plik jpeg o tej samej nazwie pojawi się w tym samym katalogu.</li>
		<li>Otwórz plik jpeg w programie ImageJ (imagej.org).</li>
		<li>Z menu wybierz opcję Analizuj > ustaw pomiary. Upewnij się, że pole Wyświetl etykietę jest zaznaczone (Rysunek 2A). Zamknij okno.</li>
		<li>Za pomocą narzędzia Linia prosta zmierz średnicę blachy, rysując na niej linię, a następnie wybierając z menu opcję Analizuj > Zmierz. Jeśli wideo jest w rozdzielczości 1080p, każda płyta będzie miała szerokość około 480 pikseli. Zapisz te informacje i zamknij okno Wyniki.</li>
		<li>Za pomocą narzędzia Wielopunktowe zaznacz punkty w lewym górnym rogu każdej blachy. Punkty te staną się lewym górnym rogiem przyciętych filmów (Rysunek 2B). Kolejność ma znaczenie; Zaznacz w kolejności, w jakiej tabliczki zostały rozpoczęte. Po utworzeniu punktu dla wszystkich blach wybierz z menu opcję Analizuj > Zmierz. Pomiary, w tym współrzędne X i Y punktów, pojawią się w oknie Wyniki.</li>
		<li>Aby przetworzyć wiele filmów, powtórz ten proces w ImageJ z innymi plikami jpeg. Wszystkie współrzędne X i Y zostaną wyświetlone w tym samym oknie wyników.</li>
		<li>Zapisz okno Wyniki w pliku csv. Plik powinien być zapisany w tym samym katalogu, co pliki filmowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znajdź czas rozpoczęcia dla każdej płyty.
	<ol>
		<li>Odtwórz film na komputerze lub telefonie i zanotuj czasy rozpoczęcia każdego zestawu klisz umieszczonych pod aparatem.</li>
		<li>Otwórz plik Results.csv ze współrzędnymi i dodaj kolumnę "start". Dla każdego wiersza odpowiadającego poszczególnym tabliczkom wprowadź odpowiedni czas rozpoczęcia, w sekundach, w kolumnie "start" (np. jeśli godzina rozpoczęcia to 0:00:08, wprowadź 8). Zapisz. 
		UWAGA: Nazwa kolumny musi być "start" (małymi literami, bez cudzysłowów), aby została rozpoznana przez następny skrypt do przycinania i przycinania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przycinaj i przycinaj filmy.
	<ol>
		<li>Uruchom skrypt crop_n_trim.py.</li>
		<li>Po wyświetleniu monitu wybierz plik Results.csv. 
		UWAGA: Upewnij się, że plik Results.csv i wszystkie pliki filmowe znajdują się w tym samym katalogu.</li>
		<li>Wprowadź wymiary blachy. Wprowadź zanotowaną wcześniej wartość piksela. 
		UWAGA: Skrypt odczyta teraz każdy wiersz pliku Results.csv, aby znaleźć właściwy plik filmowy, odczytując nazwę pliku w kolumnie "label" i przyciąć zgodnie ze współrzędnymi wskazanymi w kolumnach "X" i "Y". Czas rozpoczęcia każdej tabliczki zostanie określony przez czas wskazany w kolumnie "start". Po zakończeniu działania skryptu pojawi się folder o tej samej nazwie co film, po którym następuje czas rozpoczęcia (np. "Movie1_8"), w którym zostaną zapisane 10-sekundowe filmy odpowiadające każdemu godzinowemu punktowi czasowemu testu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Ręczne liczenie za pomocą ImageJ
<ol>
	<li>Otwórz każdy plik AVI w ImageJ.</li>
	<li>Policz robaki, które są widoczne na zewnątrz trawnika. Robaki, które nakładają się na siebie w jednej klatce, zwykle oddalają się od siebie w innej klatce, aby można je było poprawnie policzyć.</li>
	<li>Oblicz wskaźnik obłożenia dla każdego punktu czasowego: 
	Wskaźnik obłożenia = (całkowita liczba robaków - liczba robaków poza trawnikiem)/całkowita liczba robaków 
	UWAGA: Robaki będą wchodzić i wychodzić z trawnika podczas filmu, ale nie zmieni to znacząco wyników. Spróbuj wybrać liczbę, która wydaje się być średnią lub liczbą robaków dokładnie w momencie godziny (5 s w filmie).</li>
</ol>

Smartphone-Based Imaging for C. elegans Lawn Avoidance Assay

<ol><li>Pradel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+avoidance+of+a+natural+product+from+the+pathogenic+bacterium+Serratia+marcescens+by+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection and avoidance of a natural product from the pathogenic bacterium Serratia marcescens by Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (7), 2295-2300 (2007).</li>
<li>Reddy, K. C., Hunter, R. C., Bhatla, N., Newman, D. K., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+NPR-1-mediated+behaviors+are+suppressed+in+the+presence+of+mucoid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans NPR-1-mediated behaviors are suppressed in the presence of mucoid bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (31), 12887-12892 (2011).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioredoxin+shapes+the+C.+elegans+sensory+response+to+Pseudomonas+produced+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Thioredoxin shapes the C. elegans sensory response to Pseudomonas produced nitric oxide.</a> eLife. 7, 36833(2018).</li>
<li>Liu, Y., Samuel, B. S., Breen, P. C., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+pathways+that+surveil+and+defend+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans pathways that surveil and defend mitochondria.</a> Nature. 508 (7496), 406-410 (2014).</li>
<li>Melo, J. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+conserved+C.+elegans+genes+engages+pathogen-+and+xenobiotic-associated+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses.</a> Cell. 149 (2), 452-466 (2012).</li>
<li>Meisel, J. D., Panda, O., Mahanti, P., Schroeder, F. C., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensation+of+bacterial+secondary+metabolites+modulates+neuroendocrine+signaling+and+behavior+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chemosensation of bacterial secondary metabolites modulates neuroendocrine signaling and behavior of C. elegans.</a> Cell. 159 (2), 267-280 (2014).</li>
<li>Singh, J., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+infection+regulates+behavior+and+learning+via+neuroendocrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Intestinal infection regulates behavior and learning via neuroendocrine signaling.</a> eLife. 8, 50033(2019).</li>
<li>Lee, K., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intestine-derived+neuropeptide+controls+avoidance+behavior+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">An intestine-derived neuropeptide controls avoidance behavior in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Reports. 20 (10), 2501-2512 (2017).</li>
<li>Singh, J., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+lawn+avoidance+and+bacterial+two+choice+preference+assays+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Bacterial lawn avoidance and bacterial two choice preference assays in Caenorhabditis elegans.</a> Bio-Protocol. 10 (10), 3623(2020).</li>
<li>Reddy, K. C., Andersen, E. C., Kruglyak, L., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymorphism+in+npr-1+is+a+behavioral+determinant+of+pathogen+susceptibility+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A polymorphism in npr-1 is a behavioral determinant of pathogen susceptibility in C. elegans.</a> Science. 323 (5912), 382-384 (2009).</li>
<li>de Bono, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+variation+in+a+neuropeptide+Y+receptor+homolog+modifies+social+behavior+and+food+response+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans.</a> Cell. 94 (5), 679-689 (1998).</li>
<li>Mathew, M. D., Mathew, N. D., Ebert, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WormScan%3A+a+technique+for+high-throughput+phenotypic+analysis+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">WormScan: a technique for high-throughput phenotypic analysis of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33483(2012).</li>
<li>Stroustrup, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+lifespan+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans lifespan machine.</a> Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).</li>
<li>Churgin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+in+a+microfabricated+device+reveals+variation+in+behavioral+decline+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging.</a> eLife. 6, 26652(2017).</li>
<li>Marquina-Solis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidergic+signaling+controls+the+dynamics+of+sickness+behavior+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Peptidergic signaling controls the dynamics of sickness behavior in Caenorhabditis elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Churgin, M. A., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+imaging+system+for+monitoring+C.+elegans+behavior+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An imaging system for monitoring C. elegans behavior and aging.</a> Methods in Molecular Biology. 2468, 329-338 (2022).</li>
<li>Barlow, I. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megapixel+camera+arrays+enable+high-resolution+animal+tracking+in+multiwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Megapixel camera arrays enable high-resolution animal tracking in multiwell plates.</a> Communications Biology. 5 (1), 253(2022).</li>
<li>Kawazoe, Y., Yawo, H., Kimura, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+optogenetic+system+for+behavioral+analysis+of+freely+moving+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">A simple optogenetic system for behavioral analysis of freely moving small animals.</a> Neuroscience Research. 75 (1), 65-68 (2013).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Obrazowanie zachowań zwierząt, zamiast opierać się na bezpośredniej obserwacji, jest nie tylko wygodne, ale ma również tę zaletę, że pozostawia dokumentację wizualną. Pozwala to na ślepą analizę przez obiektywną osobę trzecią, a nawet może być wykorzystane do automatycznej analizy przy użyciu technik rozpoznawania obrazu. Pomimo zalet, zwykle oferowane standardowe wyposażenie jest drogie, więc po zakupie należy zobowiązać się do konfiguracji.
Używanie smartfonów do zbierania nagrań wideo prost...

Wśród wielu zalet badania C. elegans, jego prosty układ nerwowy oferuje możliwość zbadania, jak zmiany na poziomie genetycznym i komórkowym wpływają na funkcjonowanie sieci i wyniki behawioralne. Pomimo ograniczonej liczby neuronów, C. elegans wykazują szeroki zakres złożonych zachowań. Jednym z nich jest unikanie trawnika, w którym nicienie bakteriożerne reagują na szkodliwe źródło pożywienia, opuszczając trawnik bakteryjny. C. elegans unika trawników z bakteriami chorobotwórczymi1,2,3, trawniki bakterii wytwarzających toksyny lub naszpikowanych toksynami1,4, a nawet bakterii wykazujących ekspresję RNAi, których eliminacja genu docelowego jest szkodliwa dla zdrowia robaków4,5. Badania wykazały, że robaki reagują na sygnały zewnętrzne, takie jak metabolity wytwarzane przez bakterie chorobotwórcze1,6, lub wewnętrzne sygnały wskazujące, że jedzenie powoduje u nich chorobę4,7. Te sygnały są przetwarzane przez konserwatywne szlaki sygnałowe, takie jak szlak kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) i szlak transformującego czynnika wzrostu beta (TGFβ), i wymagają komunikacji między jelitami a układem nerwowym4,6,7,8.
Chociaż test jest prosty, wyuczone zachowanie rozwija się przez wiele godzin, często z dnia na dzień. Chociaż istnieją mutanty, które nie są w stanie odejść, w którym to przypadku unikanie punktacji tylko w jednym punkcie czasowym wystarczy, aby wykazać wadę, wiele mutantów w końcu odchodzi, ale wolniej się wychodzi. W tym celu ruch robaków musi być śledzony co kilka godzin, co może być trudne do zrobienia z dnia na dzień. Samo liczenie również wymaga czasu, co powoduje opóźnienie między płytami, a tym samym ogranicza liczbę płytek, które można testować w tym samym czasie. Użycie zestawu do obrazowania do jednoczesnego rejestrowania wielu płytek przez cały czas trwania testu byłoby bardzo przydatne, ale koszt instalacji może być zaporowy, w zależności od sytuacji finansowej laboratorium badawczego.
Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy bardzo prostą metodę, która wykorzystuje smartfony do rejestrowania testów unikania. Każdy telefon może nagrywać filmy poklatkowe z maksymalnie sześcioma płytkami testowymi. Aby zapewnić światło przechodzące, używamy kasetonu świetlnego z diodą elektroluminescencyjną (LED), który można łatwo kupić online. Płytki testowe są umieszczone na podwyższonej platformie, wspartej na pustych prostokątnych tunelach, które skupiają wpadające światło, tworząc kontrast. Udostępniamy również skrypt w języku Python, który konwertuje filmy na pliki audio video interplot (AVI) pokazujące 10-sekundowe klipy z każdego godzinowego punktu czasowego. Filmy są następnie przycinane do pojedynczych płyt i zapisywane w osobnych plikach do wykorzystania do ręcznego liczenia.
Metoda zapewnia tanią procedurę, która jest również niezwykle łatwa w użyciu, przy użyciu elementów, które są łatwo dostępne dla większości ludzi. W tym miejscu opisujemy metodę przy użyciu dobrze znanego testu unikania trawników przeciwko ludzkiemu patogenowi Pseudomonas aeruginosa (PA14), którego protokół został wcześniej opisany2,9. Na koniec dokonujemy również przeglądu rozważań i ograniczeń metody obrazowania dla tych, którzy chcą ją zastosować do innych eksperymentów behawioralnych C. elegans.

<table><tbody><tr><td>35 mm szalka Petriego</td><td>SPL</td><td>#10035</td><td></td></tr><tr><td>Agar baktonowy</td><td>BD</td><td>#214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>#211677</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>DAEJUNG</td><td>2507-1400</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>BioBasic</td><td>CD0122</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan dipotasu (K2HPO4)</td><td>JUNSEI</td><td>84120-0350</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>BioBasic</td><td>GB0232</td><td></td></tr><tr><td>King B Bulion</td><td>MB cell</td><td>MB-K0827</td><td></td></tr><tr><td>LED light box multi-pad</td><td>Artmate</td><td>N/A</td><td>Jest to zasilana przez USB podkładka świetlna LED do celów śledzenia i rysowania. Artmate to koreańska marka, ale wyszukiwanie "LED light box for tracing" w dowolnej wyszukiwarce powinno dać wiele opcji od innych marek. Całkowity wymiar to około 9 "x 12" (rozmiar A4). Na przykład z amazon US: https://www.amazon.com/LITENERGY-Ultra-Thin-Adjustable-Streaming-Stenciling/dp/B07H7FLJX1/ref=sr_1_5?crid=YMYU0VYY226R&keywords= LED%2Blight%2Bbox& qid=1674183224& przedrostek =led%2Blight%2Bbo%2Caps%2C270& sr=8-5& th=1</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>DAEJUNG</td><td>5514-4400</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa tuleja papierowa (przezroczysta)</td><td>Smead</td><td>#85753</td><td>Jako stolik można użyć dowolnego przezroczystego arkusza z tworzywa sztucznego o odrobinie sztywności. Na przykład z Amazon US: https://www.amazon.com/Smead-Organized-Translucent-Project-85753/dp/B07HJTRCT7/ref=psdc_1069554_t3_B09J48GXQ 8</td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu (KH2PO4)</td><td>JUNSEI</td><td>84185-0350</td><td></td></tr><tr><td>Listwa zasilająca&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Aby pomieścić 3 telefony i jeden box LED, potrzebujesz co najmniej 4 gniazdek.</td></tr><tr><td>Smartfon</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Minimalne wymaganie: szerokokątny aparat 12 MP, nagrywanie wideo HD 1080p przy 30 klatkach na sekundę</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td> <td>DAEJUNG</td><td>#7548-4100</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny (Na2HPO4)</td><td>YAKURI</td><td>#31727</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda obrazowania oparta na smartfonach do oznaczania unikania trawników c. elegans

A Smartphone-Based Imaging Method for C. elegans Lawn Avoidance Assay

Po wystawieniu na kontakt z toksycznymi lub chorobotwórczymi bakteriami, nicień Caenorhabditis elegans wykazuje wyuczone zachowanie unikania trawnika, w którym robaki stopniowo opuszczają swoje źródło pożywienia i wolą pozostać poza trawnikiem bakteryjnym. Test jest łatwym sposobem na przetestowanie zdolności robaków do wyczuwania zewnętrznych lub wewnętrznych sygnałów, aby prawidłowo reagować na szkodliwe warunki. Chociaż jest to prosty test, liczenie jest czasochłonne, szczególnie w przypadku wielu próbek, a czas trwania testu, który trwa przez noc, jest niewygodny dla badaczy. System obrazowania, który może obrazować wiele płyt przez długi czas, jest przydatny, ale kosztowny. W tym miejscu opisujemy metodę obrazowania opartą na smartfonie, która rejestruje unikanie trawnika u C. elegans. Metoda wymaga jedynie smartfona i kasetonu z diodą elektroluminescencyjną (LED), które służą jako źródło światła przechodzącego. Korzystając z bezpłatnych aplikacji do aparatów poklatkowych, każdy telefon może obrazować do sześciu płyt, z wystarczającą ostrością i kontrastem, aby ręcznie policzyć robaki poza trawnikiem. Powstałe filmy są przetwarzane na 10-sekundowe pliki audio wideo z przeplotem (AVI) dla każdego godzinowego punktu czasowego, a następnie przycinane w celu pokazania każdej pojedynczej płyty, aby były bardziej podatne na zliczanie. Metoda ta jest opłacalnym sposobem dla tych, którzy chcą zbadać wady unikania i może być potencjalnie rozszerzona na inne testy C. elegans.

Pierwszy film wygenerowany przez skrypt pochodzi z 1 h od rozpoczęcia testu. Film dla 0 h nie jest zapisywany, ponieważ nicienie rozpoczynają test wewnątrz lawns, w związku z czym wskaźnik zajętości zawsze wynosi 100%.
Niczatki typu dzikiego N2 są porównywane z mutantami npr-1, których defekt unikania lawns biekteryjnych jest dobrze udokumentowany w literaturze6,10 (Rysunek 3A-<st...

Ten artykuł opisuje prostą, tanią metodę rejestrowania zachowania Caenorhabditis elegans polegającego na unikaniu trawnika, przy użyciu łatwo dostępnych przedmiotów, takich jak smartfon i kaseton świetlny z diodą elektroluminescencyjną (LED). Udostępniamy również skrypt w języku Python do przetwarzania pliku wideo do formatu bardziej podatnego na zliczanie.

Metoda obrazowania oparta na smartfonach do oznaczania unikania trawników C. elegans

When exposed to toxic or pathogenic bacteria, the nematode Caenorhabditis elegans displays a learned lawn avoidance behavior, in which the worms gradually ...

Wśród wielu zachowań wykazywanych przez C.elegans, unikanie patogennego trawnika jest strategią obronną robaka mającą na celu zminimalizowanie jego narażenia na szkodliwe patogeny. W naszym laboratorium używamy tego zachowania jako narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w prawidłowe funkcjonowanie neuronów, które pośredniczą w tym zachowaniu. Zachowanie unikania trawnika jest prostym testem.Rozwija się jednak przez wiele godzin. Dlatego wygodnie jest, jeśli test można rejestrować w celu obserwacji zachowania przez długi czas. Ponadto, jeśli można rejestrować wiele testów w tym samym czasie, jest to jeszcze lepsze.Chociaż w literaturze opisano wiele rozwiązań do obrazowania, nawet kilka kamer w umiarkowanej cenie może być poza zasięgiem laboratoriów o ograniczonych zasobach. Ponadto niektórzy mogą chcieć wypróbować test, ale nie planują tego robić w dłuższej perspektywie. W takich przypadkach pomocne mogą być rozwiązania krótkoterminowe, takie jak ten protokół.Nasz protokół obrazowania oferuje łatwy i tani sposób rejestrowania zachowania robaków. Używamy smartfonów do nagrywania testu, a następnie przetwarzamy wideo za pomocą skryptu Pythona, który sprawia, że nadaje się do liczenia. Aby skonfigurować aparat do obrazowania, użyj smartfona z minimalną specyfikacją 12-megapikselowego aparatu, rozdzielczością 1080 pikseli, pięciogigabajtową przestrzenią dyskową i aplikacją do filmów poklatkowych ze sklepu z aplikacjami.Umieść kaseton świetlny LED na dolnym stojaku inkubatora ustawionego na 25 stopni Celsjusza, w miejscu, w którym odbędzie się test. Aby ukryć kropkowany wzór na powierzchni światła LED, rozłóż dwa arkusze chusteczek, aby pokryć całą powierzchnię pudełka LED. Wybrać podwyższony stopień dla próbki składający się z przezroczystego arkusza z tworzywa sztucznego wspartego na pustych prostokątnych tunelach.Upewnij się, że ściany tuneli są nieco ciemne, aby zminimalizować rozproszenie światła. Umieść kolejny stojak nad sceną, aby umieścić telefony do nagrywania. Każdy telefon nagra od trzech do sześciu płyt, więc odpowiednio dostosuj wysokość stojaka.Umieść listwę zasilającą wewnątrz inkubatora, aby podłączyć telefony podczas nocnego nagrywania. Aby przygotować się do nagrania, podłącz smartfon do listwy zasilającej podłączonej do gniazdka elektrycznego. Upewnij się, że wyłączyłeś ustawienie automatycznej blokady, aby zapobiec powrotowi telefonu do ekranu blokady podczas nagrywania.Otwórz aplikację aparatu poklatkowego i ustaw jakość wideo na 1080 pikseli przy 30 klatkach na sekundę. Ustaw interwał poklatkowy na dwie sekundy. Umieść smartfon ekranem skierowanym do góry, aby nagrywać za pomocą tylnej kamery i upewnij się, że tunele papierowego pudełka mieszczą się w polu view.Za pomocą wykałaczki z drutu platynowego przenieś 30 zsynchronizowanych ślimaków L4-stage na płytkę PA14. Umieść robaki na środku trawnika z bakteriami PA14. W tym badaniu, dla każdego schorzenia, przetestowano dwie płytki.Umieść dwie płytki na podniesionym stoliku aparatu rejestrującego z pokrywą skierowaną w dół, tak aby strona agarowa była skierowana do góry w kierunku kamery. Na ekranie smartfona dotknij miejsca, w którym znajduje się płytka, aby aparat mógł ustawić ostrość na płytkach testowych. Rozpocznij nagrywanie, a następnie dodaj więcej płyt do stołu montażowego.Nagrywaj przez 20 godzin od ostatniego zestawu płyt umieszczonych na scenie. W końcowym filmie poklatkowym 20 godzin nagrywania da 20-minutowy film. Robaki N2 typu dzikiego porównano z mutantami npr-1.Robaki typu dzikiego stopniowo opuszczały bakteryjny trawnik i pozostawały na zewnątrz. Robaki na zewnątrz gęstego bakteryjnego trawnika były wyraźnie widoczne na filmie, ale robaki wewnątrz bakteryjnego trawnika były trudniejsze do odróżnienia. Zidentyfikuj wymiary płytki PA14 zawierającej robaki L4-stage, uruchamiając skrypt Pythona extract_frame.py.Następnie otwórz plik JPEG w ImageJ. Z menu wybierz Analizuj, a następnie Ustaw pomiary. Upewnij się, że pole Wyświetl etykietę jest zaznaczone i zamknij okno.Za pomocą narzędzia Linia prosta zmierz średnicę płyty, rysując na niej linię. Następnie wybierz z menu opcję Analizuj, a następnie Zmierz. Jeśli film ma 1080 pikseli, każda płyta będzie miała szerokość około 480 pikseli.Wprowadź te informacje w Notatniku, aby użyć ich później, i zamknij okno Wyniki. Za pomocą narzędzia do tworzenia wielu punktów zaznacz punkty w lewym górnym rogu każdej płyty, które staną się lewym górnym rogiem przyciętych filmów. Zaznacz go w kolejności, w jakiej zostały uruchomione płyty.Po utworzeniu punktu dla wszystkich płyt wybierz z menu opcję Analizuj, a następnie Zmierz. Pomiary, w tym współrzędne X i Y punktów, pojawią się w oknie Wyniki. Aby przetworzyć wiele filmów, powtórz ten proces w ImageJ z innymi plikami JPEG.Wszystkie współrzędne X i Y zostaną wyświetlone w tym samym oknie wyników. Zapisz okno Wyniki w pliku CSV. Plik powinien być zapisany w tym samym katalogu, co pliki filmowe.Aby znaleźć czas rozpoczęcia dla każdej płyty, odtwórz film na komputerze lub telefonie i zanotuj czas rozpoczęcia każdego zestawu płyt umieszczonego pod aparatem. Otwórz wyniki. csv ze współrzędnymi i dodaj kolumnę startową.Dla każdego wiersza odpowiadającego poszczególnym blachom wprowadź odpowiedni czas rozpoczęcia w sekundach pod kolumną początkową. Zapisz plik. Aby przyciąć i przyciąć filmy, uruchom crop_n_trim.Skrypt py. Wybierz wyniki. Plik csv.Wprowadź podane wcześniej wymiary blachy i wartość piksela. Skrypt odczyta teraz każdy wiersz wyników. csv, aby znaleźć właściwy plik filmowy po zakończeniu działania skryptu.Pojawi się folder o tej samej nazwie co film, po którym nastąpi godzina rozpoczęcia, w której zostaną zapisane filmy odpowiadające testowi. Aby zliczyć ręcznie, otwórz każdy plik AVI w ImageJ. Policz robaki, które są widoczne na zewnątrz trawnika, a następnie oblicz wskaźnik zajętości dla każdego punktu czasowego.Dzikie robaki N2 stopniowo opuszczały trawnik bakteryjny i pozostawały na zewnątrz, jak zauważono we wskaźniku zajętości w czasie. Zliczenia dokonane bezpośrednio na płytkach porównano z liczeniami zobrazowanych robaków. Zliczenia wykonane na podstawie zobrazowanych robaków okazały się bardzo dokładne.Gdy trzy próby dla każdego szczepu zostały uśrednione razem, szczepy N2 i npr-1 uzyskały odpowiednio 99,5% i 96,2% dokładności.

a-smartphone-based-imaging-method-for-c-elegans-lawn-avoidance-assay

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Opracowaliśmy system mikroskopu śledzącego w czasie rzeczywistym, który umożliwia rejestrację i kwantyfikację zachowania C. elegans z wysoką rozdzielczością i przy dużych prędkościach. Opracowaliśmy również metody obliczeniowe pozwalające na redukcję wymiarowości obrazów nicieni do podstawowego zestawu pomiarów, które w pełni opisują kształt organizmu.

Śledzenie i pomiar zachowania C. elegans

Badacze mogą uruchomić ruch na żądanie u C. elegans, stosując pole elektryczne, które robaki wyczuwają i na które reagują. Ten film przedstawia zachowanie elektrotaktyczne i pokazuje przykładowy protokół, który jest wykonywany w urządzeniu mikroprzepływowym.

Test elektrotaksji: metoda obserwacji lokomocji u C. elegans

Film opisuje unikanie i testowanie metodą thigmotaxis larw danio pręgowanego. Film bada zachowanie larw danio pręgowanego w odpowiedzi na wizualny bodziec awersyjny.

Test unikania danio pręgowanego i thigmotaxsji: wysokoprzepustowa metoda badania zachowania larw w odpowiedzi na awersyjny bodziec wzrokowy

Opisano metodę ilościowej oceny reakcji chemotaktycznej Caenorhabditis elegans. Zastosowano wskaźnik chemotaksyczny (CI) jako sposób dokładnej oceny reakcji robaków na określone cele oraz jako platformę porównawczą między odmianami i związkami interesującymi.

C. elegans Test chemotaktyksy

Prezentujemy konfigurację i protokół rejestracji zachowania, który umożliwia automatyczną analizę nicieni, preferencji Caenorhabditis elegans dla rozpuszczalnych związków w teście populacyjnym. W tym artykule opisano budowę komory behawioralnej, protokół testu behawioralnego i wykorzystanie oprogramowania do analizy wideo.

Zautomatyzowana analiza populacyjnego testu preferencji chemosensorycznej na podstawie populacji nicieni

Użycie dostosowanego "chipa węchowego" do efektywnego obrazowania wapnia u samców C. elegans jest opisane tutaj. Pokazano również badania dotyczące narażenia mężczyzn na glicerol i feromon.

Wykorzystanie dostosowanego mikroprzepływowego chipa węchowego do obrazowania aktywności neuronalnej w odpowiedzi na feromony w męskich neuronach głowy C. elegans

Tutaj prezentujemy podejście kombinatoryczne wykorzystujące mikroskopię o wysokiej rozdzielczości, narzędzia obliczeniowe i znakowanie pojedynczych komórek w żywych zarodkach C. elegans, aby zrozumieć dynamikę pojedynczej komórki podczas rozwoju neurologicznego.

Izotropowa mikroskopia świetlna i zautomatyzowane analizy linii komórkowych w celu skatalogowania embriogenezy Caenorhabditis elegans z rozdzielczością subkomórkową

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje dwa czułe testy do rozróżniania między łagodnym, umiarkowanym i ciężkim upośledzeniem motorycznym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans, z ogólną użytecznością dla szczepów C. elegans, ze zmienioną ruchliwością.

Ocena upośledzenia motorycznego w modelach stwardnienia zanikowego bocznego C. elegans

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Poznaj metodę obrazowania zachowań C. elegans przy użyciu smartfona i diodowej skrzynki świetlnej. To tanie rozwiązanie umożliwia długoterminową obserwację unikania trawników patogennych i analizę funkcji neuronalnych.

Metoda obrazowania oparta na smartfonach do oznaczania unikania trawników C. elegans

Przeglądaj więcej filmów