Wykorzystanie mózgu zarodka pisklęcia jako modelu do analiz in vivo i ex vivo zachowania ludzkich komórek glejaka

Zakres naszych badań polega na próbie odkrycia mechanizmów, które sprzyjają rozprzestrzenianiu się komórek glejaka w tkance mózgowej. Konkretne pytania dotyczą różnic w typach komórek glejaka, czyli stanach i mechanizmach molekularnych, które promują te komórki jako wysoce inwazyjne. Na przykład, w jaki sposób ekspresja L1CAM sprzyja inwazyjności?

Zarówno modele in vitro, jak i in vivo są niewystarczające do dokładnej analizy zachowania komórek glejaka. Modele in vitro prawie na pewno modyfikują i nadmiernie upraszczają zachowania komórek in vivo. Podczas gdy modele in vivo nie pozwalają na łatwą obserwację zachowań w momencie ich występowania, zamiast tego pozwalają na analizy po wystąpieniu zachowań.

Wykazaliśmy, że mózg zarodka pisklęcia jest dobrym modelem do badania zachowania ludzkich komórek rakowych mózgu, zarówno in vivo, jak i w hodowlach warstwowych ex vivo. Ustaliliśmy również, że ekspresja L1CAM przez komórki glejaka może mieć głęboki wpływ na proliferację, inwazję i rozmieszczenie komórek w guzie. Oprócz kilku zalet stosowania zarodków piskląt, nasz protokół sferoidalny ex vivo wprowadza komórki do żywych plastrów bez dodatkowych uszkodzeń, podczas gdy inne metody wprowadzania komórek obejmują przekłuwanie tkanki i implantowanie komórek.

Dodatkowo protokół pozwala na obrazowanie poklatkowe na żywo, którego nie zapewniają techniki in vivo. Nasze odkrycia sugerują, że zarodek pisklęcia jest dobrym modelem do badań nad rakiem, w szczególności rakiem mózgu, i jest niezwykle korzystny dla społeczności naukowej, ponieważ jest znacznie łatwiej dostępny dla tych, którzy mogą nie mieć funduszy, obiektów lub wiedzy specjalistycznej na temat modeli gryzoni. Będziemy nadal koncentrować się na mechanizmach molekularnych, które kontrolują inwazyjność komórek glejaka w tkance mózgowej, szczególnie wzdłuż naczyń krwionośnych.

Innym kluczowym pytaniem jest to, czy komórki macierzyste glejaka są odrębnym i stabilnym fenotypem, czy też stanem funkcjonalnym, który można przyjąć w razie potrzeby. Ma to ogromne implikacje dla leczenia. Na początek wysiaduj zapłodnione jaja kurze w nawilżonym inkubatorze do jaj spiczastym końcem skierowanym w dół w temperaturze 37,5 stopni Celsjusza.

W szóstym dniu inkubacji, czyli E5, wysterylizuj skorupkę jajka, spryskując ją 70% etanolem. Za pomocą świecy do jaj obrysuj ołówkiem wzdłuż obwodu przestrzeni powietrznej nad zarodkiem i przykryj zarysowany obszar przezroczystą taśmą. Delikatnie przeciąć wokół śledzonego obszaru zakrzywionymi nożyczkami bez nacinania błon embrionalnych lub naczyń krwionośnych.

Wyrzuć górną część skorupki jajka. Dodaj kilka kropli soli fizjologicznej lub pożywki do hodowli komórkowych na membranę przestrzeni powietrznej, aby ją zwilżyć, aby łatwo się oderwała. Za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie przebij błonę przestrzeni powietrznej nad górną częścią zarodka.

Usuń to. Chwyć przezroczystą błonę owodniową, która bezpośrednio otacza zarodek, aby ustawić głowę i wstrzyknąć około 50 000 komórek w pięciu mikrolitrach odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowej do osłony optycznej za pomocą szklanej mikropipety i pneumatycznej pompy pico. Dodaj kilka kropli po 50 miligramów na mililitr ampicyliny na wierzch zarodka.

I zakryj otwór w górnej części jaj przezroczystą taśmą. Umieść je w nawilżonym inkubatorze do jaj do E15 w celu rozwarstwienia. Na tym rysunku pokazano guzy, które powstały w tektum nerwu wzrokowego E5 in vivo po wstrzyknięciu glejaka wielopostaciowego lub komórek macierzystych GBM lub GSC eksprymujących białko zielonej fluorescencji w E15.

GSC przyczepiają się do powierzchni komory i tworzą inwazyjne guzy w ścianie mózgu. Do zidentyfikowania pięciu cech w tym eksperymencie użyto czterech kolorów: zielonych GSC, białych jąder, białych naczyń krwionośnych, niebieskiej integryny 6 i czerwonej SOX2 lub czerwonej Nestiny. Liczby te pokazują, że GSC znajdują się w naczyniach krwionośnych i wydają się migrować wzdłuż nich.

Filmy przedstawiające obracające się rendery objętości 3D do utrwalonych i immunologicznych wycinków guzów GSC in vivo są pokazane tutaj. Za pomocą świecznika do jaj obrysuj ołówkiem wzdłuż obwodu kieszeni powietrznej nad zarodkiem E14 lub E15 i przykryj zarysowany obszar przezroczystą taśmą. Za pomocą zakrzywionych lub cienkich nożyczek delikatnie przeciąć wokół śledzonego obszaru.

Uważaj, aby nie przeciąć błony zarodka ani naczyń krwionośnych. Następnie wyrzuć górną część skorupy. Po odcięciu głowy zarodkowi pisklęcia umieść głowę w 10-centymetrowym naczyniu z zimnym, sterylnym roztworem CMF.

Za pomocą sterylnych cienkich kleszczyków oderwij skórę pokrywającą mózg, aby odsłonić leżącą pod spodem oponę twardą. Usuń tworzące się kości czaszki po lewej i prawej stronie mózgu. Tworzące się kości czaszki nie pokrywają jeszcze większości mózgu.

Delikatnie użyj cienkich, spiczastych kleszczy, aby przebić się przez opony mózgowe leżące nad środkiem mózgu i oderwij je z każdej strony, aby odsłonić mózg. Za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczy zgarnij mózg od dołu z przodu i delikatnie wyciągnij go z jamy. Przeanalizuj mózg na trzy główne części: przodomózgowie, śródmózgowie lub tektę wzrokową i móżdżek.

Usuń leżącą pia mater z tecta za pomocą cienkich kleszczy i umieść wypreparowane obszary mózgu w małym sterylnym naczyniu na lodzie. Aby osadzić i pokroić mózg, delikatnie podnieś tektum wzrokowe lub obszar przodomózgowia za pomocą zakrzywionych kleszczy jako miarki i lekko osusz sterylną gazę, aby usunąć nadmiar płynu. Przygotuj prostą formę, formując folię aluminiową wokół przedmiotu o odpowiedniej wielkości.

W tym przypadku jako obiekt używany jest mały prostokątny metalowy wibracyjny blok krajalnicy do tkanek. Użyj sterylnej pipety transferowej i napełnij formę niskotopliwą agarozą. Szybko umieść obszar mózgu w agarozie i pozwól mu zastygnąć przez około cztery do pięciu minut na lodzie.

Wytnij sekcje na wibrującej krajalnicy do tkanek za pomocą szafirowego noża. Użyj sterylnej szpatułki, aby nabrać i wyjąć plasterek z tacy. Delikatnie zsuń wycinek ze szpatułki na wkładkę membranową za pomocą innej sterylnej szpatułki.

Umieść sześciodołkową płytkę z wycinkami mózgu na wkładkach membranowych w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia po posiewie należy użyć sterylnego pasteura lub pipety, aby zassać pożywkę spod wkładki i dodać jeden mililitr świeżej pożywki w plasterkach do każdej studzienki pod wkładką membranową. Następnie, aby wprowadzić komórki GBM do wycinków mózgu, usuń od jednej do kilku sferoid z ich hodowlanej płytki za pomocą mikropipety o pojemności 20 mikrolitrów ustawionej na pięć mikrolitrów.

Delikatnie wyrzuć pożywkę ze sferoidami na żądany wycinek mózgu i pozwól sferoidom rozmnażać się na wycinku przez dwa do pięciu dni. Wyniki żywotności wycinków tectum optycznej ex vivo po tygodniu hodowli przedstawiono na tym rysunku. Konfokalne obrazy wycinka mózgu wybarwionego na jądra bisbenzamidem i wybarwionego immunologicznie na lamininę wyraźnie pokazują normalne i nienaruszone naczynia krwionośne optycznie pocięte w różnych konfiguracjach.

Maksymalny obraz projekcyjny konfokalnego stosu Z wycinka mózgu wybarwionego pod kątem czynnika transkrypcyjnego SOX2 i całkowitych jąder bisbenzamidu pokazano tutaj. Wyniki te sugerują, że wycinki mózgu zarodków piskląt mogą być hodowane na wkładkach błonowych przez około dwa tygodnie i pozostają żywotne z normalnie wyglądającymi naczyniami krwionośnymi i ekspresją czynnika transkrypcyjnego.