Name: Wykorzystanie mózgu zarodka pisklęcia jako modelu do analiz in vivo i ex vivo zachowania ludzkich komórek glejaka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj mechanizmy inwazyjności glejaka w tkance mózgowej przy użyciu modelu zarodka pisklęcia. Ta metoda umożliwia obserwację komórek nowotworowych in vivo i ex vivo w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana z grantu dla D.S.G. z National Cancer Institute (R03CA227312) oraz z hojnego grantu od Fundacji Lisy Dean Moseley. Żywe próbki GBM uzyskano za zgodą pacjenta za pośrednictwem Centrum Pozyskiwania Tkanek w Helen F. Graham Cancer Center and Research Institute. Finansowanie A.R. zostało zapewnione przez National Center for Research Resources i National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health (UL1TR003107). Letnie stypendia naukowe dla N.P., A.L., Z.W. i K.S. zostały zapewnione przez University of Delaware Undergraduate Research Program.

Using Chick Embryo Brain as a Model to Study Human Glioblastoma Cell Behavior

<ol><li>Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+rat+glioma+growth%2C+invasion%2C+and+vascularization+in+a+novel+chick+embryo+brain+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Human and rat glioma growth, invasion, and vascularization in a novel chick embryo brain tumor model.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 22 (3), 225-236 (2005).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+stimulation+of+human+glioma+cell+motility+correlates+with+FAK+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">L1 stimulation of human glioma cell motility correlates with FAK activation.</a> Journal of Neuro-Oncology. 105 (1), 27-44 (2011).</li>
<li>Mohanan, V., Temburni, M. K., Kappes, J. C., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1CAM+stimulates+glioma+cell+motility+and+proliferation+through+the+fibroblast+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">L1CAM stimulates glioma cell motility and proliferation through the fibroblast growth factor receptor.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 30 (4), 507-520 (2013).</li>
<li>Anderson, H. J., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+FGFR%2C+integrins+and+FAK+selectively+decrease+L1CAM-stimulated+glioblastoma+cell+motility+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of FGFR, integrins and FAK selectively decrease L1CAM-stimulated glioblastoma cell motility and proliferation.</a> Cellular Oncology. 39 (3), 229-242 (2016).</li>
<li>Pace, K. R., Dutt, R., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+L1CAM+stimulates+glioblastoma+cell+motility%2C+proliferation%2C+and+invasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Exosomal L1CAM stimulates glioblastoma cell motility, proliferation, and invasiveness.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3982(2019).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+glioma+cell+invasion+using+organotypic+brain+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture.</a> Cancer Research. 58 (14), 2935-2940 (1998).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Aaberg-Jessen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+primary+glioma-+and+cell+line-derived+spheroids+implanted+into+corticostriatal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (4), 546-560 (2013).</li>
<li>Matsumura, H., Ohnishi, T., Kanemura, Y., Maruno, M., Yoshimine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+glioma+cell+invasion+by+confocal+laser+scanning+microscopy+in+a+novel+brain+slice+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of glioma cell invasion by confocal laser scanning microscopy in a novel brain slice model.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 269 (2), 513-520 (2000).</li>
<li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+and+anti-invasion+research+of+glioma+cells+in+an+improved+model+of+organotypic+brain+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Tumori%22%5BJournal%5D)">Invasion and anti-invasion research of glioma cells in an improved model of organotypic brain slice culture.</a> Tumori. 101 (4), 390-397 (2015).</li>
<li>Fayzullin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+phenotyping+of+invasive+glioma+cells+ex+vivo+reveals+subtype-specific+movement+patterns+guided+by+tumor+core+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Time-lapse phenotyping of invasive glioma cells ex vivo reveals subtype-specific movement patterns guided by tumor core signaling.</a> Experimental Cell Research. 349 (2), 199-213 (2016).</li>
<li>Jensen, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+tumor+stem+cell-based+glioblastoma+invasion+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a tumor stem cell-based glioblastoma invasion model.</a> PloS One. 11 (7), e0158746(2016).</li>
<li>Marques-Torrejon, M. A., Gangoso, E., Pollard, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+glioblastoma+tumour-host+cell+interactions+using+adult+brain+organotypic+slice+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modelling glioblastoma tumour-host cell interactions using adult brain organotypic slice co-culture.</a> Disease Models & Mechanisms. 11 (2), 031435(2018).</li>
<li>Tamura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+spatiotemporal+dynamics+of+human+glioma+stem+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Visualization of spatiotemporal dynamics of human glioma stem cell invasion.</a> Molecular Brain. 12 (1), 45(2019).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+based+on+in+ovo+electroporation+for+chicken+embryonic+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture based on in ovo electroporation for chicken embryonic central nervous system.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 1813-1826 (2019).</li>
<li>Murrell, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+multipotent+stem+cells+from+the+adult+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Expansion of multipotent stem cells from the adult human brain.</a> PloS One. 8 (8), e71334(2013).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration.</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+developmental+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).</li>
<li>Shoin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+assay+as+chemosensitivity+test+for+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chick embryo assay as chemosensitivity test for malignant glioma.</a> Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).</li>
<li>Hagedorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessing+key+steps+of+human+tumor+progression+in+vivo+by+using+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (5), 1643-1648 (2005).</li>
<li>Balciūniene, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+of+human+glioblastoma+transplanted+on+chicken+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina%22%5BJournal%5D)">Histology of human glioblastoma transplanted on chicken chorioallantoic membrane.</a> Medicina. 45 (2), 123-131 (2009).</li>
<li>De Magalhães, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+new+In+vivo+tumor+spheroid+based+shell-less+chorioallantoic+membrane+3-D+model+in+bioengineering+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Applications of a new In vivo tumor spheroid based shell-less chorioallantoic membrane 3-D model in bioengineering research.</a> Journal of Biomedical Science and Engineering. 3 (1), 20-26 (2010).</li>
<li>Szmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+human+glioblastoma+model+cultured+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Morphology of human glioblastoma model cultured in ovo.</a> Journal of Veterinary Research. 56 (2), 261-266 (2012).</li>
<li>Jaworski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+tumor+morphology+and+structure+from+U87+and+U118+glioma+cells+cultured+on+chicken+embryo+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of tumor morphology and structure from U87 and U118 glioma cells cultured on chicken embryo chorioallantoic membrane.</a> Journal of Veterinary Research. 57 (4), 593-598 (2013).</li>
<li>Yuan, Y. J., Xu, K., Wu, W., Luo, Q., Yu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+chick+embryo+chorioallantoic+membrane+in+neurosurgery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of the chick embryo chorioallantoic membrane in neurosurgery disease.</a> International Journal of Medical Sciences. 11 (12), 1275-1281 (2014).</li>
<li>Urbańska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+silver+nanoparticles+%28AgNPs%29+on+proliferation+and+apoptosis+of+in+ovo+cultured+glioblastoma+multiforme+%28GBM%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">The effect of silver nanoparticles (AgNPs) on proliferation and apoptosis of in ovo cultured glioblastoma multiforme (GBM) cells.</a> Nanoscale Research Letters. 10, 98(2015).</li>
<li>DeBord, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+as+a+versatile+patient-derived+xenograft+%28PDX%29+platform+for+precision+medicine+and+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research.</a> American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).</li>
<li>Han, J. M., Jung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+anticancer+effect+of+a+combination+of+berbamine+and+arcyriaflavin+A+against+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Synergistic anticancer effect of a combination of berbamine and arcyriaflavin A against glioblastoma stem-like cells.</a> Molecules. 27 (22), 7968(2022).</li>
<li>Ruiz-Ontañon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+confers+migratory+and+invasive+advantages+to+a+population+of+glioblastoma-initiating+cells+that+infiltrate+peritumoral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity confers migratory and invasive advantages to a population of glioblastoma-initiating cells that infiltrate peritumoral tissue.</a> Stem Cells. 31 (6), 1075-1085 (2013).</li>
<li>Cage, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+patterns+of+human+medulloblastoma+dissemination+in+the+developing+chick+embryo+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Distinct patterns of human medulloblastoma dissemination in the developing chick embryo nervous system.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 29 (4), 371-380 (2012).</li>
<li>Darrigues, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biobanked+glioblastoma+patient-derived+organoids+as+a+precision+medicine+model+to+study+inhibition+of+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biobanked glioblastoma patient-derived organoids as a precision medicine model to study inhibition of invasion.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10720(2021).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie pozostaje w konflikcie interesów.

Krytyczne kroki w protokole wstrzykiwania komórek do komory śródmózgowia (optic tectum) obejmują nieuszkadzanie naczyń krwionośnych w błonie kosmówkowo-omoczniowej w komórce jajowej lub otaczającej zarodek przed i podczas wstrzyknięcia, chociaż błonę owodniową bezpośrednio otaczającą zarodek można delikatnie pociągnąć i przytrzymać, aby ustawić głowę podczas wstrzykiwania komórek do śródmózgowia. Owodnia jest stosunkowo twarda i można ją ciągnąć cienkimi kleszczami, aby ustawić głowę i przytrzymać ją stabilnie jedną ręką, w celu wstrzyknięcia komórek drugą ręką do tektum wzrokowego, które jest dużą, okrągłą strukturą w środku mózgu. Ogólnie rzecz biorąc, żywotność wstrzykniętych zarodków waha się od 25% do 75%, w zależności od nieznanych czynników, a praktycznie każdy zarodek, który przeżyje, zawiera co najmniej mały guz w tektum wzrokowym. Kluczowe kroki w generowaniu żywotnych wycinków mózgu obejmują osuszanie tkanki z nadmiaru płynu, tak aby agaroza przylegała do mózgu podczas krojenia oraz utrzymywanie tkanki i plastrów w niskiej temperaturze, dopóki nie zostaną umieszczone na wkładce membranowej. Ponieważ różne typy komórek tworzą sferoidy w różny sposób (pod względem szybkości i wielkości), gęstość komórek posianych na płytkach poli-HEMA oraz czas przed zbiorem sferoid powinny być zoptymalizowane dla każdego typu komórek.
Praca w tym miejscu nie została poddana formalnemu badaniu podłużnemu żywotności wycinków mózgu. Yang i wsp. użyli kultur wycinków mózgu zarodków piskląt podobnych do tych użytych tutaj i wykazali dobrą żywotność wycinków przez co najmniej 7 dni16. Wcześniejsze prace wykazały, że gdy tkanka OT była przechowywana w nieoptymalnym podłożu, w tkance pojawiło się wiele jąder piknotycznych , które nie wystąpiły w wycinkach w niniejszej pracy. Dodatkowo, gdy plastry degenerują się w nieoptymalnych warunkach, naczynia krwionośne rozpadają się i pojawiają się jako rzędy kulek lamininowo-dodatnich (nie pokazano). Tak więc, chociaż żywotność w tym przypadku nie została sprawdzona metodami takimi jak elektrofizjologia lub aktywna ekspresja kaspazy-3, nie pojawił się tutaj żaden ze wskaźników śmierci komórki, które zaobserwowano w nieoptymalnych warunkach hodowli.
OT został skoncentrowany w eksperymentach in vivo z guzem mózgu, ponieważ jest to najłatwiejszy do wstrzyknięcia region z największą komorą. W E5, czyli w ostatnim dniu, w którym zarodek jest wystarczająco mały, aby pozostać dostępny na wierzchu żółtka, należy wykonać wstrzyknięcia do komory, ponieważ wszystkie obszary mózgu są niczym więcej niż cienką strefą komorową. Niemniej jednak zastrzyki te z powodzeniem skutkują osadzonymi guzami z komórkami, które atakują miąższ mózgu. Czasami powstałe guzy znajdują się w przodomózgowiu lub móżdżku, ale nie jest to powszechne. Warstwy ex vivo tektum optycznego E15 zostały tutaj wykorzystane przede wszystkim do eksperymentów, tak aby wyniki wspólnej hodowli ex vivo można było skorelować z eksperymentami z iniekcjami in vivo . Jednak plastry przodomózgowia są również odpowiednie i mają większą powierzchnię i bardzo cienką komorę w porównaniu z tektum nerwu wzrokowego, co może sprawić, że przodomózgowie będzie bardziej odpowiednie dla kokultur ex vivo , które nie są skorelowane z zastrzykami in vivo .
Wykazano tutaj, że wstrzyknięcia in vivo , a następnie utrwalenie tkanki, wibracyjne cięcie fragmentatora tkanek i barwienie immunologiczne lamininy i innych markerów, dały w wyniku obrazy o wysokiej rozdzielczości komórek GBM i GSC w tkance mózgowej w bliskiej odległości od naczyń krwionośnych. Możliwość określenia wzajemnych relacji między komórkami nowotworowymi a naczyniami krwionośnymi została znacznie ułatwiona dzięki tworzeniu renderów objętościowych 3D z z-stosów konfokalnych sekcji optycznych przy użyciu oprogramowania konfokalnego i instrukcji producenta. Możliwe było obrazowanie poklatkowe przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej komórek znakowanych GFP, mCherry i DiD; Jednak migrujące komórki, które znajdowały się w bliskiej odległości od wysoce fluorescencyjnych sferoid, były czasami przesłonięte przez "poświatę" sferoidy. Ten niepożądany efekt można nieco zminimalizować, ostrożnie dostosowując czasy naświetlania do zbierania obrazów szerokokątnych. Obrazowanie poklatkowe przy użyciu konfokalnych stosów z w czasie (4D) wyeliminowało nieostrą poświatę sferoid i zaowocowało ostro zarysowanymi migrującymi komórkami z ciemnym tłem. Nie zostało to opisane w protokole, ale zostało przeprowadzone podobnie do obrazowania poklatkowego w szerokim polu, które wykonano, gdy wycinki mózgu znajdowały się na przezroczystych wkładkach membranowych w 6-dołkowej plastikowej płytce. Chociaż konfokalne obrazowanie poklatkowe daje znacznie wyraźniejsze obrazy pojedynczych komórek i ich zachowania, wielopunktowy eksperyment poklatkowy zbierający stosy z 10 płaszczyznami z / punkt, w odstępach 10 minut w okresie 20 godzin, jest szerokim zastosowaniem galwanometrów z głowicą skanującą. Ponieważ może to znacznie skrócić żywotność galwanometrów, metoda ta jest stosowana rozsądnie.
Chociaż system zarodków piskląt jest bardzo odpowiedni zarówno do iniekcji in vivo , jak i eksperymentów z kokulturą ex vivo , które badają zachowanie komórek GBM, istnieje kilka ograniczeń tego systemu modelowego. Podobnie jak w przypadku każdego systemu ksenoprzeszczepu, środowiskiem, w którym wszczepiane są ludzkie komórki, nie jest ludzki mózg, ale zachowanie komórek GBM wydaje się naśladować to w modelach gryzoni i u ludzi. Po przeprowadzeniu eksperymentów in vivo z wstrzyknięciem E5, guzy zwykle mogą się tworzyć przez 10 dni, aż do E15. To zdecydowanie za mało czasu, aby zbadać wszystkie aspekty nowotworzenia i inwazji komórek. Jednak tutaj wykazano, że guzy lite tworzą się w miąższu mózgu, komórki oddziałują i przegrupowują się w obrębie guza, a znaczna inwazja mózgu następuje zarówno wzdłuż naczyń krwionośnych, jak i rozlanie w tym stosunkowo krótkim czasie. Innym ograniczeniem systemu zarodków piskląt in vivo jest to, że nie nadaje się on do leczenia farmakologicznego lub innego leczenia ze względu na duże żółtko i pozazarodkowy układ krążenia, który działa podczas rozwoju zarodka pisklęcia. Miejscowe leczenie płynnymi lekami skutkowałoby bardzo zmiennym i nieznanym stężeniem w mózgu z powodu dyfuzji z zarodka do znacznie większej masy żółtka. Podobnie, dożylne wstrzyknięcie leków do bardzo delikatnego pozaembrionalnego układu krążenia wyciekłoby lub rozlałoby się z naczyń krwionośnych, a także spowodowałoby nieznane stężenia w mózgu. Jest to jeden z głównych powodów, dla których przyjęto metodę hodowli warstwowej ex vivo - nie tylko po to, aby można było obserwować i śledzić zachowanie komórek za pomocą mikroskopii poklatkowej, ale także po to, aby terapie, które odniosły sukces w zmianie zachowania komórek GBM w naczyniu4 , mogły być testowane w bardziej odpowiednim środowisku tkanki mózgowej.
Opracowanie ortotopowego systemu modelowania guza mózgu u zarodka pisklęcia jest postrzegane jako znaczące uzupełnienie systemów i narzędzi dostępnych do badania powstawania guza GBM i inwazyjnego zachowania komórek. Zapłodnione jaja kurze są prawdopodobnie łatwo dostępne na większości obszarów, są niedrogie w porównaniu z gryzoniami, nie ma kosztów opieki nad zwierzętami, zarodki są bardzo odporne i odporne na infekcje (tj. większość pracy wykonuje się na stole laboratoryjnym), zarodki są wysoce podatne na manipulację i mogą być hodowane w kulturze bez skorupy19, a zarodki piskląt nie są uważane za kręgowce, a zatem nie wymagają zatwierdzenia przez IACUC zgodnie z wytycznymi NIH (wymagania instytucjonalne może się różnić). Tak więc te liczne zalety sprawiają, że system zarodków piskląt jest bardzo atrakcyjny, jeśli ograniczy się pytania i eksperymenty do tych, które mieszczą się w jego ograniczeniach. Wiele badań na komórkach GBM zostało przeprowadzonych przez innych przy użyciu zarodka pisklęcia, ale prawie wyłącznie wykorzystywano błonę kosmówkowo-omocznikową (CAM) zarodka 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 i zawiązek kończyny 30, a nie mózg. Pojawiły się również doniesienia o wszczepieniu rdzeniaka zarodkowego do mózgu pisklęcia na E231. Niewątpliwie, wykorzystanie zarodka pisklęcia jako ortotopowego systemu modelowego ksenoprzeszczepu, jak opisano tutaj, powinno przynieść wyniki, które są znacznie bardziej znaczące dla biologii ludzkiego guza GBM niż badania z użyciem CAM.
Chociaż badania te dopiero zaczęły w pełni wykorzystywać system modelowy guza mózgu zarodka pisklęcia do badań nad ludzkimi komórkami GBM i zachowaniem GSC, istnieje nadzieja, że inni rozszerzą zastosowania i znajdą dalsze potencjalne zastosowania. Można sobie wyobrazić, że system ten nie tylko odkryje mechanizmy regulujące powstawanie guza GBM i zachowanie komórek, ale także umożliwi przedkliniczne testowanie określonych leków i substancji na komórkach konkretnych pacjentów. Na przykład, jeśli hodowle wycinków mózgu zostały ustawione z wyprzedzeniem, wówczas komórki nowotworowe, fragmenty chirurgicznych resekcji guza lub organoidy GBM pochodzące od pacjenta32 można by umieścić bezpośrednio w kokulturze ex vivo , a różne terapie można by ocenić w ciągu kilku dni. Podobnie, zdysocjowane komórki pacjenta mogą być wstrzykiwane bezpośrednio do śródmózgowia E5 in ovo , aby ocenić ich zdolność do tworzenia guzów i atakowania miąższu mózgu. W związku z tym istnieje nadzieja, że opisy metod i reprezentatywne wyniki ułatwią i zachęcą do zwiększonego wykorzystania tego wysoce niewykorzystanego systemu do badań nad rakiem mózgu.

Badania in vitro zachowań komórek nowotworowych są często wykorzystywane do analizy potencjalnych mechanizmów, które działają podczas bardziej złożonego zachowania, które obserwuje się podczas tworzenia guza i inwazji komórek w modelach ksenoprzeszczepów in vivo. Na przykład w przypadku glejaka wielopostaciowego (GBM) badania in vitro ujawniły mechanizmy potencjalnego działania L1CAM podczas tworzenia guza i inwazji mózgu w nowym modelu guza mózgu z ksenoprzeszczepem zarodka pisklęcia1,2,3,4,5. Chociaż eksperymenty in vitro i in vivo uzupełniają się nawzajem w użyteczny sposób, pozostawiają istotną lukę w sposobie korelacji wyników. Na przykład, mechanistyczne analizy ruchliwości komórek GBM na szalce są wysoce sztuczną sytuacją, a modele ksenoprzeszczepów in vivo mogą ujawnić jedynie statyczne analizy punktów czasowych lub końcowych powstawania guza i zachowania komórek. Badania in vivo z wykorzystaniem gryzoni lub zarodków piskląt nie nadają się łatwo do monitorowania zachowania komórek, gdy komórki atakują tkankę mózgową w tych modelach ksenoprzeszczepów. Niemniej jednak model ksenoprzeszczepu zarodka pisklęcia wykazał, że białko adhezyjne L1CAM odgrywa rolę stymulującą w zdolności inwazyjnej ludzkich komórek T98G GBM2,5.
Odpowiednie rozwiązanie tego problemu można osiągnąć poprzez połączenie metod zarówno in vivo, jak i in vitro przy użyciu organotypowego modelu hodowli wycinków mózgu, określanego jako model ex vivo. W tym modelu ex vivo żywa tkanka mózgowa może być utrzymywana na grubości kilkuset mikronów przez okres do kilku tygodni, co umożliwia wszczepienie komórek rakowych, obserwację ich zachowania w rzeczywistej tkance w czasie, a następnie przeprowadzenie bardziej szczegółowej analizy markerów w punkcie końcowym eksperymentu.
Popularna metoda hodowli organicznotypowych plastrów polegała na hodowli kilkusetmikronowego wycinka mózgu na wierzchu półprzezroczystej lub przezroczystej porowatej membrany, pozostawiając tkankę wystawioną na działanie powietrza, ale pozwalając pożywce na utrzymanie tkanki od spodu błony (patrz Stoppini et al.6). Różne warianty tej metody zostały wykorzystane do różnych badań, w tym przy użyciu różnych pożywek lub różnych wkładek membranowych. Różne wkładki membranowe obejmują porowatą (0,4 μm) wkładkę membranową o średnicy 30 mm w naczyniu hodowlanym 35 mm6 oraz wkładki do hodowli komórkowych (0,4 μm) dla płytek 6-dołkowych7. Różne podłoża obejmują 50% MEM / HEPES + 25% inaktywowaną termicznie surowicę końską + 25% zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) 8, 50% zredukowaną pożywkę surowicy + 25% surowicę końską + 25% HBSS9, a także inne. Jeśli półprzezroczysta lub przezroczysta membrana jest używana wraz z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami GBM, takie kultury można obrazować od dołu za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego szerokopolowego lub konfokalnego10,11,12,13,14,15.
Podczas gdy wiele in vivo ortotopowych ksenoprzeszczepów guzów mózgu i organicznych modeli hodowli ex vivo na wycinkach mózgu zostało stworzonych przy użyciu gryzoni, jak wspomniano powyżej, zarodek pisklęcia (Gallus gallus) nie został w pełni wykorzystany do tych celów. Wykazano jednak, że zarodek pisklęcia może być wykorzystany jako ortotopowy model ksenoprzeszczepu in vivo do badania inwazji glejaka zarówno u ludzi, jak i szczurów1,2,5. Ksenoprzeszczepowane komórki w mózgach zarodków kurcząt wykazywały wzorce inwazji podobne do tych obserwowanych w modelach gryzoni, co dodatkowo wspiera wykorzystanie zarodków piskląt jako modelu in vivo do analizy komórek nowotworowych GBM. Zarodki piskląt są również niedrogie, mogą być łatwiejsze w utrzymaniu niż zarodki gryzoni (np. w skorupkach jaj w inkubatorze laboratoryjnym) i są znacznie łatwiejsze w obróbce, co czyni je atrakcyjną opcją dla krótkoterminowych badań in vivo GBM. Niedawny artykuł opisywał użycie kultur wycinków mózgu zarodków piskląt do tworzenia i wzrostu aksonów podczas normalnego rozwoju mózgu, gdzie wycinki były żywotne przez co najmniej 7 dni16. Brakuje jednak wykorzystania takich kultur wycinków mózgu zarodków piskląt do analizy ex vivo zachowania komórek GBM w środowisku tkankowym. W artykule opisano zarówno przeszczepianie ludzkich komórek GBM i komórek macierzystych GBM (GSC) do mózgu wczesnego zarodka pisklęcia in vivo, jak i wprowadzanie komórek GBM do żywych kultur wycinków mózgu piskląt kurcząt ex vivo. Podano również kilka reprezentatywnych przykładów powstałych nowotworów i wzorców inwazji komórek uzyskanych z tych preparatów.

<table><tbody><tr><td>Dziurkacz do papieru o wymiarach kwadratowych 1 cm x 1 cm</td> Długopis do biopsji <td>Birabira</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1 mm Dziurkacz do biopsji</td><td>Robbins Instruments</td><td>20335</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka (Corning Transwell)</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3450</td><td></td></tr><tr><td>9-calowe jednorazowe pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Corning Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-9</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1423-500</td><td>do osadzania stałych mózgów</td></tr><tr><td>Alexafluor 488-sprzężony GAM IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-605-146</td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 647-sprzężony GAM IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-146</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>ReynoldsWrap</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-9518</td><td></td></tr><tr><td>antyintegryna alfa-6 przeciwciało monoklonalne GOH3</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-19622</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-L1CAM UJ127</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-53386</td><td></td></tr><tr><td>antylaminina przeciwciało monoklonalne</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>3H11</td><td></td></tr><tr><td>anty-nestinowe przeciwciało monoklonalne 10c2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało monoklonalne anty-Sox2 E-4</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365823</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement bez witaminy A</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>bisbenzimid (Hoechst 33258)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2883</td><td>plama jądrowa</td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli komórkowych</td><td>Forma</td><td></td><td>standardowy nawilżany inkubator CO2</td></tr><tr><td>Wirówka</td> Mikroskop konfokalny <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon Instruments</td><td>C2si +</td> <td>Z wykonaną na zamówienie komorą inkubatora komórkowego</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny soczewki obiektywowe</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>Soczewki Plan Apo, z wyjątkiem S Obiektyw obiektywowy Plan Fluor ELWD 20x 0,45 NA do konfokalnego obrazowania poklatkowego</td></tr><tr><td>Oprogramowanie mikroskopu konfokalnego</td><td>Nikon Instruments</td><td>NIS Elements</td><td>Wersja 5.2</td></tr><tr><td>Zakrzywione forecepsy</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>504478</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki</td><td>Narzędzia</td><td></td><td></td>do nauki</tr><tr><td>precyzyjnej Zakrzywiona szpatułka</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-375-20</td><td></td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>Krazy Glue</td><td>KG-585 12R</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DiD far red fluorescencyjny barwnik</td><td>Invitrogen</td><td>V22887</td><td>Vybrant DiD</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5671</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) firmy Dulbecco:</td> <td>inkubator jaj Sigma Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td></td> Taśma izolacyjna <td>Humidaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(grubość 10 mil / 254 i mikro; m)</td> <td>Scotch</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Szybki zielony barwnik FCF</td><td>Chemikalia badawcze awokado</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini Bio-products</td> Bibuła filtracyjna <td>900-108</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Dynarex</td><td>3353</td><td></td></tr><tr><td>Szklane kapilary do mikroiniekcji</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP228-1</td><td>do mocowania pożywek</td></tr><tr><td>GSC (ludzkie komórki macierzyste glejaka)</td><td>Nie dotyczy</td><td></td><td>Wyizolowany z próbek GBM pacjenta w laboratorium Galileo w pożywce GSC, a następnie transdukowany wektorem lentiwirusowym kodującym GFP.&nbsp; Użyte komórki znajdowały się między pasażem 10 a 30.</td></tr><tr><td>Hanks Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Hausser scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2524-100</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Surowica konia (HI)</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Człowiek FGF-2</td><td>BioVision</td><td>4037-1000</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki TGF-&alfa;</td><td>BioVision</td><td>4339-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kontrastowy z odwróconą fazą</td><td>Nikon Instruments</td><td>TMS</td><td>do rutynowego oglądania hodowanych komórek</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Film laboratoryjny</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labquake Shaker</td><td>LabIndustries</td><td>T400-110</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut:Pióro:Strep</td><td>Gemini Bio-products</td><td>400-110</td><td></td></tr><tr><td>Niskotopliwa agaroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1360</td><td>do osadzania żywych mózgów</td></tr><tr><td>Matrix</td><td>Corning Matrigel</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>GIBCO</td><td>11150-059</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Metalowy blok</td><td></td><td></td><td></td>wibratomu</tr><tr><td>Końcówki do mikropipet (20, 200, 1 000 i mikro; L)</td> <td>Mikropipety Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(20, 200, 1,000 i mikro; L)</td><td></td> Szkło nakrywkowe mikroskopu Gilson <td></td><td></td></tr><tr><td>(grubość nr 1,5)</td> <td>Fisherbrand</td><td>12544A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 + H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>Normalna kozia surowica</td><td>Millipore Sigma</td><td>526-M</td><td></td></tr><tr><td>N-propyl galusan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3130</td><td>do montażu mediów</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Parafilm Paraformaldehyd</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ołówek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zwykłe szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa szalka Petriego 35 mm</td><td></td> Pneumatyczna pompa pikopump <td>Becton Dickinson</td> 351008 <td></td></tr><tr><td></td><td>Świat Precyzyjne Instrumenty</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>Poli(2-hydroksyetylometakrylan)&nbsp; (poli-HEMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3932</td><td></td></tr><tr><td>żyletka - dwukrawędziowa</td><td>PACE</td><td></td><td>do cięcia stałych plasterków mózgu</td></tr><tr><td>nóż szafirowy</td> Delaware <td>Diamond Knives</td><td></td><td>do cięcia żywych plasterków mózgu</td></tr><tr><td>Skalpel</td><td>TruMed</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Bufor kakodylanu sodu 0,2 M pH 7,4</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>Komora na próbki do wibratom</td><td>wykonany na zamówienie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereofoniczny mikroskop preparacyjny</td><td>Instrumenty Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>Wyposażony w epifluorescencyjne</td></tr><tr><td>proste forecepsy</td><td>Świat Precyzyjne instrumenty</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>proste nożyczki</td><td>Narzędzia</td><td></td><td></td>do nauki</tr><tr><td>o sacharozie</td><td>Mallinckrodt</td><td>7723</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencja poklatkowa mikroskop (fluorescencja szerokokątna)</td><td>Instrumenty Nikon</td><td>TE2000-E</td><td>Z wykonaną na zamówienie komorą inkubatora komórkowego (patrz Fotos et al., 2006)</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych polistyren 100 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130182</td><td>do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych polistyren 60 mm</td><td>Becton Dickinson</td><td>353004</td><td>do hodowli komórek</td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>American Central Scientific Co.</td><td>FFP011</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta taśma</td><td>Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna (0,25%) + 2,21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>U-118 MG ludzka linia komórkowa GBM</td><td>ATCC</td><td>HTB-15</td><td>Komórki transdukowano wektorem lentiwirusowym kodującym całą sekwencję ektodomenową białka adhezyjnego L1CAM, a następnie wektorem lentiwirusowym pUltra-gorące kodowanie mCherry.&nbsp; Numery przejazdów nie są znane.</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07532-40</td> <td>"Air Cadet"</td></tr> <tr><td>Wibracyjna krajalnica do tkanek</td><td>Vibratome</td><td>3000</td><td>do cięcia żywych i nieruchomych plastrów mózgu</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie mózgu zarodka pisklęcia jako modelu do analiz in vivo i ex vivo zachowania ludzkich komórek glejaka

Using the Chick Embryo Brain as a Model for In Vivo and Ex Vivo Analyses of Human Glioblastoma Cell Behavior

Embrion pisklęcia był idealnym modelowym systemem do badania rozwoju kręgowców, szczególnie do eksperymentalnych manipulacji. Zastosowanie zarodka kurcząt zostało rozszerzone do badania powstawania guzów mózgu ludzkiego glejaka (GBM) in vivo oraz inwazyjności komórek nowotworowych w otaczającej tkance mózgowej. Guzy GBM mogą powstawać przez wstrzyknięcie zawiesiny komórek znakowanych fluorescencyjnie do komory śródmózgowia E5 (optic tectum) in ovo. 
W zależności od komórek GBM, w komorze i w ścianie mózgu losowo tworzą się zwarte guzy, a grupy komórek atakują tkankę ściany mózgowej. Grube skrawki tkanek (350 μm) utrwalonej tekty E15 z guzami mogą być barwione immunologicznie, aby ujawnić, że atakujące komórki często migrują wzdłuż naczyń krwionośnych podczas analizy za pomocą rekonstrukcji 3D konfokalnych obrazów stosu z. Żywe plastry śródmózgowia i przodomózgowia E15 (250-350 μm) można hodować na wkładkach błonowych, gdzie znakowane fluorescencyjnie komórki GBM można wprowadzić w nielosowe miejsca, aby zapewnić kokultury ex vivo w celu analizy inwazji komórek, która może również wystąpić wzdłuż naczyń krwionośnych, przez okres około 1 tygodnia. Te kokultury ex vivo mogą być monitorowane za pomocą mikroskopii poklatkowej fluorescencji szerokokątnej lub konfokalnej w celu obserwacji zachowania żywych komórek. 
Współhodowane plastry mogą być następnie utrwalone, wybarwione immunologicznie i analizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, aby określić, czy inwazja nastąpiła wzdłuż naczyń krwionośnych lub aksonów. Ponadto system kohodowli może być wykorzystywany do badania potencjalnych interakcji między komórkami poprzez umieszczanie agregatów o różnych typach i kolorach komórek w różnych precyzyjnych lokalizacjach i obserwowanie ruchów komórek. Leczenie farmakologiczne może być wykonywane na kulturach ex vivo, podczas gdy zabiegi te nie są kompatybilne z systemem in ovo. Te dwa uzupełniające się podejścia pozwalają na szczegółową i precyzyjną analizę zachowania ludzkich komórek GBM i powstawania nowotworów w środowisku mózgu kręgowców, którym można manipulować.

Embriony piskląt są używane do badania ludzkich guzów mózgu z glejakiem (GBM) in ovo i w kokulturach ex vivo. Zachowanie komórek GBM można rejestrować za pomocą mikroskopii poklatkowej w kokulturach ex vivo, a oba preparaty można analizować w eksperymentalnym punkcie końcowym za pomocą szczegółowej analizy konfokalnej 3D.

Wykorzystanie mózgu zarodka pisklęcia jako modelu do analiz in vivo i ex vivo zachowania ludzkich komórek glejaka

The chick embryo has been an ideal model system for the study of vertebrate development, particularly for experimental manipulations. Use of the chick ...

Zakres naszych badań polega na próbie odkrycia mechanizmów, które sprzyjają rozprzestrzenianiu się komórek glejaka w tkance mózgowej. Konkretne pytania dotyczą różnic w typach komórek glejaka, czyli stanach i mechanizmach molekularnych, które promują te komórki jako wysoce inwazyjne. Na przykład, w jaki sposób ekspresja L1CAM sprzyja inwazyjności?Zarówno modele in vitro, jak i in vivo są niewystarczające do dokładnej analizy zachowania komórek glejaka. Modele in vitro prawie na pewno modyfikują i nadmiernie upraszczają zachowania komórek in vivo. Podczas gdy modele in vivo nie pozwalają na łatwą obserwację zachowań w momencie ich występowania, zamiast tego pozwalają na analizy po wystąpieniu zachowań.Wykazaliśmy, że mózg zarodka pisklęcia jest dobrym modelem do badania zachowania ludzkich komórek rakowych mózgu, zarówno in vivo, jak i w hodowlach warstwowych ex vivo. Ustaliliśmy również, że ekspresja L1CAM przez komórki glejaka może mieć głęboki wpływ na proliferację, inwazję i rozmieszczenie komórek w guzie. Oprócz kilku zalet stosowania zarodków piskląt, nasz protokół sferoidalny ex vivo wprowadza komórki do żywych plastrów bez dodatkowych uszkodzeń, podczas gdy inne metody wprowadzania komórek obejmują przekłuwanie tkanki i implantowanie komórek.Dodatkowo protokół pozwala na obrazowanie poklatkowe na żywo, którego nie zapewniają techniki in vivo. Nasze odkrycia sugerują, że zarodek pisklęcia jest dobrym modelem do badań nad rakiem, w szczególności rakiem mózgu, i jest niezwykle korzystny dla społeczności naukowej, ponieważ jest znacznie łatwiej dostępny dla tych, którzy mogą nie mieć funduszy, obiektów lub wiedzy specjalistycznej na temat modeli gryzoni. Będziemy nadal koncentrować się na mechanizmach molekularnych, które kontrolują inwazyjność komórek glejaka w tkance mózgowej, szczególnie wzdłuż naczyń krwionośnych.Innym kluczowym pytaniem jest to, czy komórki macierzyste glejaka są odrębnym i stabilnym fenotypem, czy też stanem funkcjonalnym, który można przyjąć w razie potrzeby. Ma to ogromne implikacje dla leczenia. Na początek wysiaduj zapłodnione jaja kurze w nawilżonym inkubatorze do jaj spiczastym końcem skierowanym w dół w temperaturze 37,5 stopni Celsjusza.W szóstym dniu inkubacji, czyli E5, wysterylizuj skorupkę jajka, spryskując ją 70% etanolem. Za pomocą świecy do jaj obrysuj ołówkiem wzdłuż obwodu przestrzeni powietrznej nad zarodkiem i przykryj zarysowany obszar przezroczystą taśmą. Delikatnie przeciąć wokół śledzonego obszaru zakrzywionymi nożyczkami bez nacinania błon embrionalnych lub naczyń krwionośnych.Wyrzuć górną część skorupki jajka. Dodaj kilka kropli soli fizjologicznej lub pożywki do hodowli komórkowych na membranę przestrzeni powietrznej, aby ją zwilżyć, aby łatwo się oderwała. Za pomocą cienkich kleszczyków ostrożnie przebij błonę przestrzeni powietrznej nad górną częścią zarodka.Usuń to. Chwyć przezroczystą błonę owodniową, która bezpośrednio otacza zarodek, aby ustawić głowę i wstrzyknąć około 50 000 komórek w pięciu mikrolitrach odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowej do osłony optycznej za pomocą szklanej mikropipety i pneumatycznej pompy pico. Dodaj kilka kropli po 50 miligramów na mililitr ampicyliny na wierzch zarodka.I zakryj otwór w górnej części jaj przezroczystą taśmą. Umieść je w nawilżonym inkubatorze do jaj do E15 w celu rozwarstwienia. Na tym rysunku pokazano guzy, które powstały w tektum nerwu wzrokowego E5 in vivo po wstrzyknięciu glejaka wielopostaciowego lub komórek macierzystych GBM lub GSC eksprymujących białko zielonej fluorescencji w E15.GSC przyczepiają się do powierzchni komory i tworzą inwazyjne guzy w ścianie mózgu. Do zidentyfikowania pięciu cech w tym eksperymencie użyto czterech kolorów: zielonych GSC, białych jąder, białych naczyń krwionośnych, niebieskiej integryny 6 i czerwonej SOX2 lub czerwonej Nestiny. Liczby te pokazują, że GSC znajdują się w naczyniach krwionośnych i wydają się migrować wzdłuż nich.Filmy przedstawiające obracające się rendery objętości 3D do utrwalonych i immunologicznych wycinków guzów GSC in vivo są pokazane tutaj. Za pomocą świecznika do jaj obrysuj ołówkiem wzdłuż obwodu kieszeni powietrznej nad zarodkiem E14 lub E15 i przykryj zarysowany obszar przezroczystą taśmą. Za pomocą zakrzywionych lub cienkich nożyczek delikatnie przeciąć wokół śledzonego obszaru.Uważaj, aby nie przeciąć błony zarodka ani naczyń krwionośnych. Następnie wyrzuć górną część skorupy. Po odcięciu głowy zarodkowi pisklęcia umieść głowę w 10-centymetrowym naczyniu z zimnym, sterylnym roztworem CMF.Za pomocą sterylnych cienkich kleszczyków oderwij skórę pokrywającą mózg, aby odsłonić leżącą pod spodem oponę twardą. Usuń tworzące się kości czaszki po lewej i prawej stronie mózgu. Tworzące się kości czaszki nie pokrywają jeszcze większości mózgu.Delikatnie użyj cienkich, spiczastych kleszczy, aby przebić się przez opony mózgowe leżące nad środkiem mózgu i oderwij je z każdej strony, aby odsłonić mózg. Za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczy zgarnij mózg od dołu z przodu i delikatnie wyciągnij go z jamy. Przeanalizuj mózg na trzy główne części: przodomózgowie, śródmózgowie lub tektę wzrokową i móżdżek.Usuń leżącą pia mater z tecta za pomocą cienkich kleszczy i umieść wypreparowane obszary mózgu w małym sterylnym naczyniu na lodzie. Aby osadzić i pokroić mózg, delikatnie podnieś tektum wzrokowe lub obszar przodomózgowia za pomocą zakrzywionych kleszczy jako miarki i lekko osusz sterylną gazę, aby usunąć nadmiar płynu. Przygotuj prostą formę, formując folię aluminiową wokół przedmiotu o odpowiedniej wielkości.W tym przypadku jako obiekt używany jest mały prostokątny metalowy wibracyjny blok krajalnicy do tkanek. Użyj sterylnej pipety transferowej i napełnij formę niskotopliwą agarozą. Szybko umieść obszar mózgu w agarozie i pozwól mu zastygnąć przez około cztery do pięciu minut na lodzie.Wytnij sekcje na wibrującej krajalnicy do tkanek za pomocą szafirowego noża. Użyj sterylnej szpatułki, aby nabrać i wyjąć plasterek z tacy. Delikatnie zsuń wycinek ze szpatułki na wkładkę membranową za pomocą innej sterylnej szpatułki.Umieść sześciodołkową płytkę z wycinkami mózgu na wkładkach membranowych w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia po posiewie należy użyć sterylnego pasteura lub pipety, aby zassać pożywkę spod wkładki i dodać jeden mililitr świeżej pożywki w plasterkach do każdej studzienki pod wkładką membranową. Następnie, aby wprowadzić komórki GBM do wycinków mózgu, usuń od jednej do kilku sferoid z ich hodowlanej płytki za pomocą mikropipety o pojemności 20 mikrolitrów ustawionej na pięć mikrolitrów.Delikatnie wyrzuć pożywkę ze sferoidami na żądany wycinek mózgu i pozwól sferoidom rozmnażać się na wycinku przez dwa do pięciu dni. Wyniki żywotności wycinków tectum optycznej ex vivo po tygodniu hodowli przedstawiono na tym rysunku. Konfokalne obrazy wycinka mózgu wybarwionego na jądra bisbenzamidem i wybarwionego immunologicznie na lamininę wyraźnie pokazują normalne i nienaruszone naczynia krwionośne optycznie pocięte w różnych konfiguracjach.Maksymalny obraz projekcyjny konfokalnego stosu Z wycinka mózgu wybarwionego pod kątem czynnika transkrypcyjnego SOX2 i całkowitych jąder bisbenzamidu pokazano tutaj. Wyniki te sugerują, że wycinki mózgu zarodków piskląt mogą być hodowane na wkładkach błonowych przez około dwa tygodnie i pozostają żywotne z normalnie wyglądającymi naczyniami krwionośnymi i ekspresją czynnika transkrypcyjnego.

using-chick-embryo-brain-as-model-for-vivo-ex-vivo-analyses-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Ta praca opisuje rozwój elastycznych elektrod międzypalcowych do implementacji w modelach 3D guzów mózgu, a mianowicie w hodowli in vitro, modelu in ovo i modelu mysim in vivo. Proponowana metoda może być wykorzystana do oceny wpływu pulsacyjnych pól elektrycznych na nowotwory na różnych poziomach złożoności.

Elastyczne organiczne urządzenia elektroniczne do terapii pulsacyjnym polem elektrycznym glejaka

Tutaj opisujemy przedkliniczny ortotopowy model myszy dla GBM, stworzony przez wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych guzów myszy. Model ten wykazuje cechy charakterystyczne dla GBM u ludzi. W przypadku badań translacyjnych guz mózgu myszy jest śledzony za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo i histopatologii.

Translacyjne modele ortotopowe glejaka wielopostaciowego

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Opisano technikę szerokiego otwierania bariery krew-mózg u myszy z wykorzystaniem mikropęcherzyków i ultradźwięków. Dzięki zastosowaniu tej metody do mózgu myszy można wprowadzić mangan. Ponieważ mangan jest środkiem kontrastowym do MRI, który kumuluje się w zdepolaryzowanych neuronach, podejście to umożliwia obrazowanie aktywności neuronalnej.

Funkcjonalne obrazowanie neuronaukowe z wykorzystaniem ultrasonicznego otwierania bariery krew-mózg i MRI z wzmocnieniem manganem

Niniejszy artykuł opisuje metodę, za pomocą której można naśladować in vivo opracowanie Muszka owocówka ciało grzybowate w ex vivo system...

Hodowla ex vivo całych, rozwijających się mózgów Drosophila

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Opisujemy protokół znakowania in vivo węchowych neuronów czuciowych za pomocą elektroporacji, a następnie konfokalnego skanowania laserowego lub mikroskopii wielofotonowej w celu wizualizacji morfologii neuronów i ich rozwoju w czasie.

Układ węchowy jako model do badania wzorców wzrostu i morfologii aksonów in vivo

W tym filmie opisujemy procedurę wszczepienia przewlekłej komory obrazowania optycznego do grzbietowego rdzenia kręgowego żywej myszy. Komora, zabieg chirurgiczny i przewlekłe obrazowanie są oceniane i demonstrowane.

Procedura wszczepienia komory rdzeniowej do podłużnego obrazowania in vivo rdzenia kręgowego myszy

Poznaj mechanizmy inwazyjności glejaka w tkance mózgowej przy użyciu modelu zarodka pisklęcia. Ta metoda umożliwia obserwację komórek nowotworowych in vivo i ex vivo w czasie rzeczywistym.

Wykorzystanie mózgu zarodka pisklęcia jako modelu do analiz in vivo i ex vivo zachowania ludzkich komórek glejaka

Przeglądaj więcej filmów