Analiza fluorescencyjnie barwionych kropelek lipidów z rekonstrukcją 3D w celu oceny stłuszczenia wątroby
2 czerwca 2023
Tutaj demonstrujemy zoptymalizowany protokół oparty na fluorescencji BODIPY 493/503 do charakterystyki kropelek lipidów w tkance wątroby. Dzięki zastosowaniu projekcji ortogonalnych i rekonstrukcji 3D, fluorofor pozwala na skuteczne rozróżnienie stłuszczenia mikropęcherzykowego i makropęcherzykowego i może stanowić podejście uzupełniające do klasycznych protokołów histologicznych do oceny stłuszczenia wątroby.
Takie podejście do obrazowania pozwala na trójwymiarową rekonstrukcję odkładania się kropelek lipidów w wątrobie i przezwycięża główne wady klasycznego barwienia histologicznego, które zawężają skuteczne rozróżnienie między stłuszczeniem makro i mikropęcherzykowym. Ocena stłuszczenia mikropęcherzykowego jest uszkodzona, gdy stosuje się złote standardowe barwienia histologiczne, zarówno hematoksylinę ozynę, jak i czerwienie olejowe, z powodu zakłócenia i sporadycznego łączenia się natywnych kropelek lipidowych. Pro BODIPY stanowi alternatywę dla rutynowych protokołów oceny stłuszczenia mikrowątroby ze względu na tę odpowiednią hydrofobowość dla szybkiego wchłaniania w skutecznym znakowaniu kropelek lipidów, które są nie tylko niewrażliwe na polarność środowiska, ale także niezwykle selektywne.
To podejście do obrazowania obejmuje szersze zastosowania w połączeniu z technikami immunochemicznymi, umożliwiając jednoczesne wykrywanie innych antygenów subkomórkowych, które mogą przyspieszyć badanie kropelek lipidów, biogenezy i dynamiki, leżąc u podstaw makro i mikropęcherzykowego stłuszczenia wątroby. Włącz kriostat i wytnij odcinki o grubości 12 mikronów zamrożonej tkanki wątroby pobranej od szczura. Umieść skrawki na oznaczonych szkiełkach mikroskopowych w temperaturze pokojowej.
W przypadku barwienia BODIPY należy przemyć skrawki tkanki trzykrotnie PBS przez pięć minut każdy. Po ostatnim praniu zakreśl sekcje na szkiełku warstwą hydrofobową za pomocą pisaka barierowego. Przygotuj roztwór barwiący zawierający BODIPY 493503 i DAPI.
Następnie odpipetować 75 mikrolitrów roztworu na każde szkiełko. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 40 minut w ciemności. Po inkubacji przemyć szkiełka trzykrotnie PBS przez pięć minut każde.
Następnie, za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego, ostrożnie zamontuj szkiełka nakrywkowe na każdym szkiełku. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 30 minut, a następnie uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci. Włącz laserowy skaningowy mikroskop konfokalny i umieść szkiełko na uchwycie szkiełka.
Do wizualizacji i akwizycji obrazu wybierz obiektyw 20X. W oprogramowaniu konfokalnym wybierz tryb skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć przesłuchów między 493503 BODIPY a DAPI. Następnie wzbudz barwnik BODIPY 493503 za pomocą linii lasera argonowego o długości 488 nanometrów i barwienia DAPI za pomocą zestawu linii laserowych o długości fali 405 nanometrów.
Emisja waha się od 493 do 589 nanometrów dla BODIPY i od 410 do 464 nanometrów dla DAPI. Następnie skonfiguruj ustawienia mikroskopu, dostosowując rozmiary ramek, szybkość skanowania i uśrednianie, które obejmuje dwukrotnie pomnożoną głębię bitową jako 12 bitów, kierunek jako dwukierunkowy, obszar skanowania, zoom cyfrowy minus jeden i otwór otworkowy minus jedna jednostka obszaru. Dostosuj ustawienia wzmocnienia i wzmocnienia cyfrowego.
Upewnij się, że nie ma nasyconych pikseli, jak wskazuje wskaźnik zasięgu. Po dokładnym zidentyfikowaniu kropelek lipidów uzyskaj obraz za pomocą kanałów BODIPY i DAPI. Aby utworzyć obrazy o dużym obszarze, przełącz się na obiektyw subiektywny 10X, a następnie aktywuj tryb skanowania kafelków i skonfiguruj go tak, aby generował obrazy mozaiki pięć na pięć.
Aby wygenerować widoki 3D i ortogonalne, nałóż kroplę olejku immersyjnego na wierzch szkła nakrokowego i zmień soczewkę obiektywu na soczewkę 40X. Wybierz tryb stosu Z. Dostosuj płaszczyznę Z, aby zdefiniować pierwszą i ostatnią pozycję do przechwytywania obrazu, zapewniając grubość warstwy optycznej około 0,5 mikrona, aby uchwycić wszystkie krople w ostrości.
Wybierz moduł orto i utwórz widoki ortogonalne. Obrazy 3D można uzyskać, wybierając moduł 3D, zgodnie z trybem renderowania przezroczystości. Po uzyskaniu obrazu rozpocznij przetwarzanie i analizowanie obrazów pojedynczych płaszczyzn za pomocą profilera komórek.
Prześlij obrazy w formacie TIFF, klikając tryb obrazów w lewym górnym rogu interfejsu profilera komórek. Użyj modułu nazw i typów, aby sortować między obrazami barwionymi kroplami BODIPY i jądrami DAPI na podstawie nazw plików. Do analizy kropelek lipidów należy używać wyłącznie obrazów barwionych metodą BODIPY.
Rozpocznij budowę rurociągu, klikając Dostosuj moduły i wybierz moduł koloru na szary, aby przekonwertować obrazy na skalę szarości. Następnie, korzystając z modułu identyfikacji obiektów podstawowych, zdefiniuj kropelki lipidów o wielkości od sześciu do 300 pikseli i współczynnik korekcji progu równy jeden, aby wykryć kropelki lipidów na obrazach w skali szarości. Aby zmierzyć intensywność pikseli zidentyfikowanych kropelek lipidów, dodaj moduł pomiaru intensywności obiektu.
Dołącz dodatkowy moduł obiektów filtrujących, aby zapewnić, że tylko najsilniejsze sygnały są określane ilościowo, podczas gdy mniej intensywne sygnały są wykluczane z końcowej analizy kropelek lipidów. Następnie, aby zmierzyć kropelki lipidów związane z danymi wyjściowymi, dodaj moduł kształtu pomiaru rozmiaru obiektu. Następnie dodaj moduł konturów nakładki, aby nałożyć zidentyfikowaną kroplę na oryginalny obraz, a tym samym upewnić się, że segmentacja wygląda dokładnie również na nieprzetworzonym obrazie.
Po zakończeniu dodaj moduł eksportu do arkusza kalkulacyjnego i kliknij przycisk analizuj obrazy w lewym dolnym rogu. W porównaniu z grupą kontrolną, zwierzęta karmione HFD wykazywały wyraźny profil dyslipidemiczny i subtelny wzrost poziomu krążących trójglicerydów. Obrazy na dużym obszarze ujawniły zwiększoną ilość kropelek lipidów w wątrobie zwierząt karmionych HFD.
Analiza za pomocą profilera komórkowego wykazała zwiększoną liczbę kropelek lipidów w wątrobie, zwiększoną intensywność fluorescencji BODIPY, 360% współczynnik powierzchni i większe średnice. Rozkład wielkości u zwierząt karmionych HFD ujawnił wzrost makropęcherzyków lipidów w wątrobie o więcej niż dziewięć mikronów i zmniejszenie mikropęcherzyków o mniej niż trzy mikrony.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To badanie przedstawia zoptymalizowany protokół fluorescencyjny oparty na BODIPY 493/503 do charakteryzacji kropelek lipidowych w tkankach wątroby. Metoda umożliwia trójwymiarową rekonstrukcję i efektywne rozróżnienie między steatozą mikrowezykularne i makrowezykularne, oferując uzupełniające podejście do tradycyjnych technik histologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Histologia
Tło
- Klasyczne metody barwienia histologicznego mogą niszczyć kropelki lipidowe.
- Ocena steatozy mikrowezykularnej jest często ograniczana przez tradycyjne techniki.
- Fluorofory BODIPY zapewniają selektywną i efektywną metodę oznaczania.
- To podejście obrazowania pozwala na szersze zastosowania w badaniach nad kropelkami lipidowymi.
Cel badania
- Optymalizacja protokołu fluorescencyjnego do charakteryzacji kropelek lipidowych.
- Poprawa rozróżnienia między typami steatozy wątroby.
- Poprawa badań nad biogenezą i dynamiką kropelek lipidowych.
Stosowane metody
- Wykorzystanie fluoroforów BODIPY 493/503 do obrazowania.
- Trójwymiarowa rekonstrukcja osadów kropelek lipidowych.
- Połączenie z technikami immunochemicznymi dla jednoczesnego wykrywania.
- Przygotowanie zamrożonych sekcji tkanki wątroby do analizy.
Główne wyniki
- Skuteczna różnica między mikro i makrowezykularne steatozą.
- Pokonanie ograniczeń tradycyjnych metod barwienia histologicznego.
- Wykazanie skuteczności BODIPY w oznaczaniu kropelek lipidowych.
- Potencjał szerszych zastosowań w badaniach nad lipidami.
Wnioski
- Protokół oparty na BODIPY jest wykonalną alternatywą dla klasycznych metod.
- To podejście poprawia ocenę steatozy wątroby.
- Otwiera nowe szlaki w badaniach nad dynamiką kropelek lipidowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative 3D analysis of fluorescent-stained lipid droplets in liver tissue enables precise assessment of hepatic steatosis, addressing a key challenge in metabolic disease research. This protocol enhances predictive confidence in early discovery and target validation by providing robust, reproducible measurements of lipid droplet size and distribution. The approach supports risk-adjusted portfolio decisions by enabling reliable discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of lipid metabolism pathways in disease-relevant liver tissue.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing microvesicular from macrovesicular steatosis.
- Improves predictive confidence for target validation in metabolic and liver disease programs.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tissue-based assays for compound screening.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative outputs for lipid droplet analysis.
- Enables scalable imaging workflows suitable for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical model outputs with translational biomarkers of hepatic steatosis.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling 3D tissue analysis.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative steatosis metrics.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both early mechanistic studies and downstream translational research in metabolic disease pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification for lipid storage and metabolism.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible, and quantitative imaging outputs for compound evaluation.
- Analytics: Delivers size, intensity, and area ratio measurements for robust statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges preclinical findings with clinical biomarker strategies for hepatic steatosis.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis capability for diverse metabolic and liver disease programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in hepatic steatosis models.
- Operational Value: Standardizes tissue imaging and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of metabolic disease assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence imaging and quantitative image analysis.
- Needs access to confocal microscopy and compatible image analysis software (e.g., CellProfiler).
- Demands cross-team standardization of tissue preparation and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different tissue types or animal models.
- Limitations include dependence on imaging infrastructure and potential variability in tissue sectioning.
