Name: Analiza fluorescencyjnie barwionych kropelek lipidów z rekonstrukcją 3D w celu oceny stłuszczenia wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjnego barwienia BODIPY 493/503 do analizy kropelek lipidów w tkance wątroby z rekonstrukcją 3D. Technika ta umożliwia skuteczną ocenę mikro- i makrowezikularnego stłuszczenia wątroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Fundusze Krajowe i Europejskie za pośrednictwem Portugalskiej Fundacji Nauki i Technologii (FCT), Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego (FEDER) oraz Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB), oraz POCI-01-0145-FEDER-007440. Autorzy pragną podziękować za wsparcie iLAB - Laboratorium Mikroskopii i Bioobrazowania, placówki Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu w Coimbrze i członka krajowej infrastruktury PPBI-Portugalska Platforma BioObrazowania (POCI-01-0145-FEDER-022122), a także wsparcie ze strony FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142.

Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Organ ds. Dobrostanu Zwierząt Instytutu Badań Klinicznych i Biomedycznych w Coimbrze (iCBR) (ORBEA, #9/2018) i były zgodne z krajowymi i europejskimi dyrektywami dotyczącymi opieki nad zwierzętami oraz wytycznymi ARRIVE.
1. Projekt eksperymentalny
<ol>
	<li>13-tygodniowe samce szczurów rasy Wistar trzymane są w parach w wentylowanych klatkach w kontrolowanych warunkach środowiskowych o temperaturze (22 °C ± 1 °C), wilgotności (50%-60%) i świetle (12 godzin cyklu jasnego-ciemnego) oraz z dostępem ad libitum do wody z kranu i standardowej karmy dla gryzoni.</li>
	<li>Po 2-tygodniowym okresie aklimatyzacji arbitralnie przypisz szczury do dwóch grup.</li>
	<li>Grupę kontrolną (CTRL, n = 6) i dietę wysokotłuszczową (HFD, n = 6) należy karmić odpowiednio standardową karmą i dietą wysokotłuszczową (45% kcal/tłuszcz) przez 24 tygodnie.</li>
	<li>Monitoruj masę ciała (BW) co tydzień. Rejestruj dzienne spożycie żywności i napojów na klatkę.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki wątroby
<ol>
	<li>Rozwarstwienie wątroby
	<ol>
		<li>Przygotuj pompę perystaltyczną: Przepuść 70% etanolu przez rurkę, podłącz igłę 27 G do końca wylotowego rurki i zalej rurkę lodowato zimnym (4 °C) 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, pH ~ 7,4 ) (np. 200 obr./min na pompie perystaltycznej z rurką silikonową o średnicy wewnętrznej 1,6 mm, zestaw mini kroplówek dożylnych). Dostosuj do masy ciała (np. dla szczura o wadze 100-150 g użyj natężenia przepływu około 10-12 ml/min).</li>
		<li>Znieczulić szczura przez wstrzyknięcie dootrzewnowe przy użyciu protokołu znieczulenia (końcowe stężenie ketaminy = 75 mg/kg, a końcowe stężenie medetomidyny = 1 mg/kg). 
		UWAGA: Upewnij się, że szczur jest całkowicie znieczulony przy użyciu metody reakcji na uszczypnięcie palca.</li>
		<li>Umieść szczura na tacy do wycinki.</li>
		<li>Dokładnie zdezynfekuj futro 70% etanolem i osusz je ręcznikiem papierowym.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w kształcie litery "U" przez skórę i rozetnij poniżej przepony. Następnie przetnij klatkę piersiową rostrycznie na krawędziach, aby odsłonić serce.</li>
		<li>Podczas pracy 1x PBS przełóż igłę przez lewą komorę do aorty wstępującej i zaciśnij. Następnie prawy przedsionek jest wycinany, aby umożliwić drenaż po rozpoczęciu perfuzji. 
		UWAGA: Wątroba powinna zacząć blednąć, gdy krew zostanie zastąpiona PBS.</li>
		<li>Za pomocą nożyczek i kleszczy Dumonta ostrożnie usuń wątrobę i spłucz 1x PBS.</li>
		<li>Przenieś wątrobę na szalkę Petriego i zważ ją.</li>
		<li>Za pomocą skalpela pobrać próbki tkanki wątrobowej o grubości 5 mm od bocznej strony (1 cm od krawędzi) lewego płata wątroby w celu osadzania. 
		UWAGA Pozostałą tkankę można przechowywać w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzanie tkanki wątroby
	<ol>
		<li>Przygotuj pojemnik na suchy lód i odpowiednio oznacz krioformy identyfikatorem próbki i orientacją.</li>
		<li>Umieść kilka kropli matrycy do osadzania kriogenicznego na środku kriomoldu, aby uzyskać optymalną temperaturę cięcia (OCT).</li>
		<li>Upewnij się, że próbka tkanki jest prawidłowo zorientowana na przekrój poprzeczny. 
		UWAGA: Upewnij się, że strona stykająca się z dolną częścią kriomoldu jest stroną, która zostanie podzielona na sekcje jako pierwsza.</li>
		<li>Ostrożnie upuść więcej OCT na kriomold, aż zostanie całkowicie pokryty. Staraj się unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby za pomocą zwykłych kleszczy usuń wszelkie bąbelki wewnątrz OCT.</li>
		<li>Szybko umieścić kriomold z próbką pokrytą OCT w pojemniku na suchy lód. 
		UWAGA: Tkanki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez 3 lata.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Sekcja zamrożonych tkanek
<ol>
	<li>Wyregulować temperaturę kriostatu (komora: −21 °C; próbka: −18 °C) i włożyć nowe sterylne ostrze.</li>
	<li>Umieścić próbki w kriostacie na 30 minut, zanim temperatura się zrównoważy.</li>
	<li>Wykonaj pojedynczą warstwę OCT na krążku próbki, aby umożliwić przyleganie próbki. Poczekaj, aż OCT zamarznie i zamontuj próbkę tkanki w żądanej orientacji. 
	UWAGA: Powierzchnia cięcia powinna być równoległa do ostrza. Aby zachować dobrą przyczepność, umieść ekstraktor ciepła na górze próbki. Poprzednie kroki można również wykonać w pojemniku na suchy lód z suchym lodem.</li>
	<li>Umieść próbkę w główce próbki i przytnij powierzchnię tkanki (kilka odcinków próbki tkanki o wielkości 30 μm).</li>
	<li>Gdy obszar zainteresowania będzie dostępny do przekroju, wytnij skrawki o grubości 12 μm i umieść je na oznakowanych szkiełkach mikroskopowych utrzymywanych w temperaturze pokojowej (RT). 
	UWAGA: Aby zebrać wycinek, powoli przesuwaj szkiełko w kierunku przekroju tkanki. Na każdym szkiełku mogą znajdować się dwa skrawki wątroby.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 10 minut w temperaturze RT. 
	UWAGA: Szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 °C przez 6-12 miesięcy lub w temperaturze -80 °C przez okres do 3 lat.</li>
</ol>
4. Barwienie BODIPY
<ol>
	<li>Rozmrażać szkiełka w systemie barwienia szkiełek w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Umyć 1x PBS (3x po 5 min).</li>
	<li>Zakreśl sekcję warstwą hydrofobową za pomocą pisaka barierowego.</li>
	<li>Przygotować 500 μg/ml roztworu podstawowego BODIPY 493/503: Rozpuścić 1 mg BODIPY 493/503 w 2 ml rozpuszczalnika (90% DMSO; 10% 1x PBS). Chronić przed światłem. Sonikować w kąpieli ultradźwiękowej przez 1 godzinę (9,5-10 W) w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze -20 °C przez co najmniej 30 dni.</li>
	<li>Przygotować roztwór barwiący BODIPY (1 μg/ml), dodając 2 μl roztworu podstawowego BODIPY 493/503 i 0,1 μl roztworu podstawowego DAPI (5 mg/ml) do 997,9 μl 1x PBS.</li>
	<li>Inkubować szkiełka (75 μl/szkiełko) z BODIPY 493/503 (1 μg/ml) i DAPI (0,1 μg/ml) w temperaturze pokojowej przez 40 min. 
	UWAGA: Trzymaj slajdy w ciemności od tego kroku.</li>
	<li>Umyj szkiełka 1x PBS (3x po 5 min każde).</li>
	<li>Zamontuj szkiełka z szkiełkami nakrywkowymi za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego, pozostaw do wyschnięcia na 30 minut i uszczelnij je lakierem do paznokci. 
	UWAGA: Preparaty można przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu obrazowania.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja lipidów
<ol>
	<li>Zmierz poziom cholesterolu całkowitego i TG w surowicy za pomocą automatycznej, zwalidowanej metody i sprzętu.</li>
	<li>Zmierz poziom TG w wątrobie za pomocą zestawu do oznaczania kolorymetrycznego triglicerydów (tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
6. Akwizycja obrazu
<ol>
	<li>Umieść szkiełko na uchwycie szkiełka mikroskopu konfokalnego ze skaningowym laserem.</li>
	<li>Do wizualizacji i akwizycji obrazu należy użyć mikroskopu konfokalnego z soczewką obiektywową 20x (plan-apochromat: 20x/0,8).</li>
	<li>Aby uniknąć przesłuchów między BODIPY 493/503 a DAPI, użyj trybu skanowania sekwencyjnego (najlepszy sygnał) w oprogramowaniu konfokalnym.</li>
	<li>Wzbudzić BODIPY 593/503 za pomocą linii lasera argonowego 488 nm, a DAPI za pomocą linii laserowej 405 nm. Ustaw zakresy emisji na 493-589 nm dla BODIPY 493/503 i na 410-464 nm dla DAPI.</li>
	<li>Użyj następujących ustawień: otworek: 1 AU, rozdzielczość: 1 024 pikseli x 1 024 pikseli, głębia bitowa: 12, rozmiar piksela: 0,415 μm, tryb dwukierunkowy, prędkość skanowania: 7 (~1,58 μs/piksel dla obiektywu 20x), uśrednianie linii: 2x i zoom cyfrowy: 1, 
	UWAGA: Wyżej wymienione parametry skanowania muszą być zoptymalizowane dla każdego używanego mikroskopu konfokalnego i obiektywu.</li>
	<li>Ustaw odpowiednio wzmocnienie i wzmocnienie cyfrowe, aby na wskaźniku zasięgu nie zostały wykryte żadne nasycone piksele. 
	UWAGA: Skoryguj sygnał tła, dostosowując przesunięcie.</li>
	<li>Po prawidłowej identyfikacji LD uzyskaj obraz za pomocą kanałów BODIPY i DAPI. 
	UWAGA: Wszystkie zdjęcia muszą być wykonane w tych samych warunkach (ekspozycja i ustawienia ogólne) dla każdego kanału koloru.</li>
	<li>Aby tworzyć obrazy o dużym zasięgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2), zmień obiektyw na obiektyw a10x (plan-neofluarny: 10x/0,3).</li>
	<li>Wybierz tryb skanowania kafelków i utwórz mozaiki 5 na 5 obrazów. 
	UWAGA: W tej pracy każda płytka miała 10% zachodzenia na siebie, aby odpowiednio scalić płytki do analizy.</li>
	<li>Aby utworzyć widoki 3D i ortogonalne (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A), umieść kroplę olejku immersyjnego na wierzchu szkła nakrywkowego i zmień obiektyw na soczewkę obiektywową 40x (plan-neofluar: 40x/1,30 oleju).</li>
	<li>Wybierz tryb Z-Stack i dostosowując płaszczyznę Z, zdefiniuj pierwszą i ostatnią pozycję do akwizycji za pomocą warstwy optycznej o optymalnej grubości (~0,5 μm), aby upewnić się, że wszystkie kropelki zostaną wychwycone. 
	UWAGA: Aby przyspieszyć akwizycję obrazu i uniknąć wybielania, plasterek optyczny można dostosować do nieoptymalnego rozmiaru, zapewniając co najmniej 30% nadpróbkowania dla dobrej rekonstrukcji 3D.</li>
	<li>Wybierz moduł Orto i utwórz widoki ortogonalne.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy 3D, wybierając moduł 3D po trybie renderowania przezroczystości za pomocą oprogramowania mikroskopu konfokalnego.</li>
</ol>
7. Analiza obrazów
<ol>
	<li>Przetwarzaj i analizuj obrazy jednopłaszczyznowe (20-krotne powiększenie) za pomocą CellProfiler (wersja 4.2.5). 
	UWAGA: Rurociąg użyty w tej pracy został zaadaptowany z Adomshick et al.45.</li>
	<li>Kliknij moduł Obrazy w lewym górnym rogu okna CellProfiler i prześlij obrazy jako pliki .tiff.</li>
	<li>Użyj modułu NamesAndTypes, aby sortować obrazy barwione BODIPY (kropelki) i DAPI (jądra) na podstawie nazw plików. Analizę LD należy wykonywać tylko w przypadku obrazów wybarwionych metodą BODIPY.</li>
	<li>Aby rozpocząć konstruowanie potoku, kliknij Dostosuj moduły i wybierz moduł ColorToGray, aby przekonwertować obrazy na obrazy w skali szarości. 
	UWAGA: Do identyfikacji obiektów wymagane są obrazy w skali szarości.</li>
	<li>Zidentyfikuj kropelki, korzystając z modułu IdentifyPrimaryObjects przy użyciu obrazu w skali szarości. 
	UWAGA: Parametry w tym module muszą być dostosowane, aby uzyskać dobrą identyfikację LD. W tej pracy zdefiniowanie LD o rozmiarze od 6 do 300 pikseli i współczynniku korekcji progu 1,0 doprowadziło do najdokładniejszej identyfikacji.</li>
	<li>Aby zmierzyć intensywność pikseli zidentyfikowanych kropelek lipidów, dodaj moduł MeasureObjectIntensity.</li>
	<li>Dodaj dodatkowy moduł FilterObjects, aby upewnić się, że tylko najsilniejsze sygnały są określane ilościowo, podczas gdy sygnały mniej intensywne są wykluczane z końcowej analizy kropelek lipidów (minimalna intensywność: 0,15; maksymalna intensywność: 1 dowolna jednostka).</li>
	<li>Aby zmierzyć LD powiązane z danymi wyjściowymi, dodaj moduł MeasureObjectSizeShape.</li>
	<li>W tym momencie dodaj moduł OverlayOutlines, aby nałożyć zidentyfikowaną kroplę na oryginalny obraz, a tym samym upewnić się, że segmentacja wygląda dokładnie również na nieprzetworzonym obrazie. 
	UWAGA: Jest to krok opcjonalny (kontrola jakości).</li>
	<li>Dodaj moduł ExportToSpreadsheet na końcu i kliknij przycisk Analizuj obrazy w lewym dolnym rogu.</li>
</ol>
8. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wyrazić wyniki jako średnią ± błąd standardowy średniej (S.E.M.) za pomocą dowolnej aplikacji do analizy statystycznej. 
	UWAGA: W tym badaniu do analizy statystycznej wykorzystano oprogramowanie GraphPad.</li>
	<li>Przeanalizuj rozkład wartości za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa, aby ocenić znaczne odchylenia od normalności. Analizuj dane parametryczne za pomocą niesparowanego testu t-test Studenta. 
	UWAGA: Wartości p < 0,05 uznano za istotne statystycznie.</li>
</ol>

Assessing Hepatic Steatosis with 3D Fluorescence Lipid Droplet Reconstruction

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Oparty na fluorescencji protokół oceny LD opracowany w ramach projektu BODIPY 493/503 miał na celu opracowanie nowego podejścia do obrazowania do oceny stłuszczenia wątroby. Biorąc pod uwagę silną korelację między otyłością a stłuszczeniem wątroby, dieta wysokotłuszczowa w stylu zachodnim została wykorzystana do ustalenia zwierzęcego modelu stłuszczenia wątroby26. Znaczny wzrost zawartości TG w wątrobie został potwierdzony za pomocą ilościowego zestawu do kolorymetrycznego testu trójglicerydów, kt...

Kropelki lipidów (LDs), klasycznie postrzegane jako magazyny energii, są wyspecjalizowanymi organellami komórkowymi, które pośredniczą w magazynowaniu lipidów i zawierają hydrofobowy neutralny rdzeń lipidowy, który zawiera głównie estry cholesterolu i trójglicerydy (TG), otoczone monowarstwą fosfolipidową1,2,3.
LD biogeneza zachodzi w retikulum endoplazmatycznym (ER), zaczynając od syntezy triacyloglicerolu (TAG) i estrów steroli. Neutralne lipidy są dyfundowane między listkami dwuwarstwy ER w niskich stężeniach, ale łączą się w soczewki olejowe, które rosną i pączkują w prawie kuliste kropelki z błony ER, gdy ich stężenie wewnątrzkomórkowe wzrasta4. Następnie białka z dwuwarstwy ER i cytozolu, w szczególności rodzina białek perylipiny (PLIN), przemieszczają się na powierzchnie LD, aby ułatwić pączkowanie5,6,7,8,9.
Poprzez syntezę nowych kwasów tłuszczowych i fuzję lub koalescencję LD, LD rosną do różnych rozmiarów. W związku z tym rozmiar i liczba LD różnią się znacznie w zależności od typu komórek. Małe kropelki (o średnicy 300-800 nm), które są znane jako początkowe LD (iLD), mogą być tworzone przez prawie wszystkie komórki4. Później w tworzeniu LD większość komórek jest w stanie przekształcić niektóre iLD w większe rozszerzające się LD (eLD o średnicy >1 μm). Jednak tylko określone typy komórek, takie jak adipocyty i hepatocyty, mają zdolność do tworzenia gigantycznych lub przerośniętych LD (o średnicy do kilkudziesięciu mikronów)4,10.
LDs odgrywają bardzo ważną rolę w regulacji metabolizmu lipidów komórkowych, tłumieniu lipotoksyczności i zapobieganiu stresowi ER, dysfunkcji mitochondriów i ostatecznie śmierci komórek spowodowanej przez wolne kwasy tłuszczowe (FA)11,12,13,14. Co więcej, LD są również zaangażowane w regulację ekspresji genów, sekwestrację białek replikacji wirusa oraz transport i sygnalizację błonową15,16,17. Dlatego nieprawidłowa regulacja biogenezy LD jest cechą charakterystyczną chorób przewlekłych związanych z zespołem metabolicznym, otyłością, cukrzycą typu 2 (T2DM) i/lub miażdżycą, by wymienić tylko kilka18,19,20.
Wątroba, jako centrum metaboliczne, jest głównie odpowiedzialna za metabolizm lipidów poprzez przechowywanie i przetwarzanie lipidów, dlatego jest stale zagrożona lipotoksycznością21. Stłuszczenie wątroby (HS) jest powszechną cechą szeregu postępujących chorób wątroby i charakteryzuje się nadmiernym wewnątrzkomórkowym gromadzeniem lipidów w postaci cytozolowych LD, które ostatecznie mogą prowadzić do dysfunkcji metabolicznej wątroby, stanu zapalnego i zaawansowanych postaci niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby22,23,24,25. HS występuje, gdy szybkość utleniania i eksportu kwasów tłuszczowych w postaci trójglicerydów w lipoproteinach o bardzo niskiej gęstości (VLDL) jest niższa niż szybkość wychwytu kwasów tłuszczowych przez wątrobę z osocza i syntezy kwasów tłuszczowych de novo<klasa SUP="xref">26. Nagromadzenie lipidów w wątrobie często występuje w dwóch formach - stłuszczeniu mikropęcherzykowym i makropęcherzykowym - które wykazują różne cechy cytoarchitektoniczne27. Zazwyczaj stłuszczenie mikropęcherzykowe charakteryzuje się obecnością małych LD rozproszonych po całym hepatocycie z jądrem umieszczonym centralnie, podczas gdy stłuszczenie makropęcherzykowe charakteryzuje się obecnością pojedynczego dużego LD, który zajmuje większą część hepatocytu, wypychając jądro na peryferię28,29. Warto zauważyć, że te dwa rodzaje stłuszczenia są często spotykane razem i pozostaje niejasne, w jaki sposób te dwa wzorce LD wpływają na patogenezę choroby, ponieważ dowody są nadal niespójne31,32,33,34. Jednak ten rodzaj analizy jest często stosowany jako "standard odniesienia" w badaniach przedklinicznych i klinicznych w celu zrozumienia dynamicznego zachowania LD i scharakteryzowania stłuszczenia wątroby29,34,35,36.
Biopsje wątroby, złoty standard w diagnozowaniu i ocenianiu HS, są rutynowo oceniane za pomocą histologicznej analizy hematoksyliny i eozyny (H&E), gdzie kropelki lipidów są oceniane jako niebarwione wakuole w wycinkach wątroby barwionych H&E37. Chociaż jest to dopuszczalne do oceny stłuszczenia makropęcherzyków, ten rodzaj barwienia generalnie zawęża ocenę stłuszczenia mikropęcherzyków38. Rozpuszczalne w tłuszczach barwniki diazowe, takie jak Oil Red O (ORO), są klasycznie łączone z mikroskopią jasnego pola w celu analizy wewnątrzkomórkowych zapasów lipidów, ale nadal mają one szereg wad: (i) użycie etanolu lub izopropanolu w procesie barwienia, co często powoduje zakłócenie natywnych LD i sporadyczne fuzje, mimo że komórki są unieruchomione39; (ii) czasochłonność, ponieważ roztwór ORO wymaga rozpuszczenia i filtrowania świeżego proszku ze względu na ograniczony okres przydatności do spożycia, co przyczynia się do mniej spójnych wyników; (iii) oraz fakt, że ORO barwi więcej niż tylko kropelki lipidów i często przeszacowuje stłuszczenie wątroby38.
W związku z tym, przepuszczalne dla komórek lipofilowe fluorofory, takie jak czerwień nilowa, zostały użyte zarówno w żywych, jak i stałych próbkach, aby przezwyciężyć niektóre z wyżej wymienionych ograniczeń. Jednak niespecyficzny charakter znakowania komórkowych organelli lipidowych wielokrotnie zawęża oceny LD40. Co więcej, właściwości spektralne czerwieni nilowej różnią się w zależności od polaryzacji środowiska, co często może prowadzić do przesunięć widmowych41.
Lipofilowa sonda fluorescencyjna 1,3,5,7,8-pentametylo-4-bora-3a,4adiaza-s-indacen (długość fali wzbudzenia: 480 nm; maksymalna emisja: 515 nm; BODIPY 493/503) wykazuje cechy hydrofobowości, które pozwalają na jego szybki wychwyt przez wewnątrzkomórkowe LD, kumuluje się w rdzeniu kropli lipidów, a następnie emituje jasnozieloną fluorescencję12. W przeciwieństwie do czerwieni nilowej, BODIPY 493/503 jest niewrażliwy na polaryzację otoczenia i wykazano, że jest bardziej selektywny, ponieważ wyświetla wysoką jasność do obrazowania LD. W celu barwienia neutralnych LD, barwnik ten może być stosowany w żywych lub utrwalonych komórkach i z powodzeniem łączony z innymi metodami barwienia i/lub etykietowania42. Kolejną zaletą barwnika jest to, że wymaga on niewielkiego wysiłku przy umieszczaniu w roztworze i jest stabilny, co eliminuje potrzebę świeżego przygotowywania go do każdego eksperymentu42. Mimo że sonda BODIPY 493/503 została z powodzeniem wykorzystana do wizualizacji lokalizacji i dynamiki LD w hodowlach komórkowych, niektóre doniesienia wykazały również niezawodne zastosowanie tego barwnika jako narzędzia do obrazowania LD w tkankach, w tym ludzkim mięśniu obszernym bocznym 43, szczurzym mięśniu płaszczkowatym42 oraz myszym jelicie44.
Niniejszym proponujemy zoptymalizowany protokół oparty na BODIPY 493/503 jako alternatywne podejście analityczne do oceny liczby LD, obszaru i średnicy w próbkach wątroby z modelu zwierzęcego stłuszczenia wątroby. Procedura ta obejmuje przygotowanie próbki wątroby, sekcję tkanek, warunki barwienia, akwizycję obrazu i analizę danych.

<table><tbody><tr><td>Rurka silikonowa ID 1,6 mm, zestaw mini kroplówek IV</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)</td><td>Sigma-Aldrich, Lyon, Francja</td><td>D3922</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, OR</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td>Honeywell</td><td>10191455</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator CC</td><td>Adobe Inc.</td><td>Służy do projektowania figur</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny analizator Hitachi 717</td><td>Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Niemcy</td><td>8177-30-0010</td><td></td></tr><tr><td>Długopis barierowy (Liquid blocker super pap pen)</td> <td>Daido Sangyo Co., Ltd, Japon</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Leica</td><td>221052145</td><td>Używany w kriostatu</td></tr><tr><td>Cell Profiler w wersji 4.2.5</td><td>https://cellprofiler.org/releases/</td> <td>Używany do analizy pozyskane obrazy</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Menzel-Glaser, Niemcy</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Tissue-Tek</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>Kriostat (w tym tarcza próbki i ekstraktor ciepła) CM3050 S</td><td>Leica Biosystems</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich, Lyon, Francja</td><td>D-8418</td><td>Służy do rozpuszczania produktu Bodipy w roztworze podstawowym o stężeniu 5 mg/ml. UWAGA: Toksyczny i łatwopalny. Opary mogą powodować podrażnienia . Manipulować w okapie oparowym . Unikaj bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice, okulary ochronne .</td></tr><tr><td>Pojemnik na suchy lód (chłodziarka styropianowa)</td><td>Novolab</td><td>A26742</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont</td><td>Fine Science Tools, Niemcy</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego (H 25 mm, &oslash; 150 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>150318</td><td>Służy do ważenia wątroby po sekcji</td></tr><tr><td>Glicergel</td><td>DAKO Omnis</td><td>S303023</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie GraphPad Prism, wersja 9.3.1</td><td>GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dieta wysokotłuszczowa</td><td>Envigo, Barcelona, Hiszpania</td><td>MD.08811</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Nimatek&nbsp; 100 mg/mL)</td><td>Dechra</td><td>791/01/14DFVPT</td><td>Stosowany w końcowym stężeniu 75 mg/kg</td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny&nbsp; (Jednostka detekcyjna QUASAR; )</td><td>Carl Zeiss, niemcy</td><td>LSM 710 Mikroskop Axio Observer Z1</td><td></td></tr><tr><td>Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)</td><td>Dechra</td><td>1838 ESP / 020/01/07RFVPT</td><td>Stosowany w końcowym stężeniu 1 mg/kg</td></tr><tr><td>Igła</td><td>BD mikrolance</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>nr 15 Sterylny skalpel ze stali węglowej Ostrze</td><td>Swann-Morton</td><td>205</td><td></td></tr><tr><td>Obiektywy 10x (Plan-Neofluar 10x/0,3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0,8) i 40x (Plan-Neofluar 40x/1,30 Oil)</td><td>&nbsp; Carl Zeiss, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pędzle</td><td>Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X</td><td>&nbsp; Służy do obsługi kriosekcji</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna (Minipuls 3)</td><td>Gilson</td><td>1004170</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, pH ~ 7,4)</td><td>Sigma-Aldrich, Lyon, Francja</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela, 125 mm (5"), nr 3</td><td>Swann-Morton</td><td>0208</td><td></td></tr><tr><td>System barwienia szkiełek StainTray</td><td>Simport Scientific</td><td>M920</td><td></td></tr><tr><td>Dieta standardowa</td><td>&nbsp; Szkiełka mikroskopowe Mucedola</td><td>4RF21</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus</td><td>Menzel-Glaser, Niemcy</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT Nośniki montażowe</td><td>VWR CHEMICALS</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do prób kolorymetrycznych trójglicerydów</td><td>Cayman Chemical</td><td>10010303</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>Bandelin Sonorex</td><td>&nbsp;TK 52</td><td></td></tr><tr><td>Vannas spring Nożyczki - 3 mm krawędź tnąca</td><td>Fine Science Tools, Niemcy</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>ZEN Czarne oprogramowanie</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza fluorescencyjnie barwionych kropelek lipidów z rekonstrukcją 3d w celu oceny stłuszczenia wątroby

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Kropelki lipidów (LDs) to wyspecjalizowane organelle, które pośredniczą w magazynowaniu lipidów i odgrywają bardzo ważną rolę w tłumieniu lipotoksyczności i zapobieganiu dysfunkcji spowodowanych przez wolne kwasy tłuszczowe (FA). Wątroba, ze względu na swoją kluczową rolę w metabolizmie tłuszczów w organizmie, jest stale zagrożona przez wewnątrzkomórkowe gromadzenie LD w postaci stłuszczenia wątroby zarówno mikropęcherzykowego, jak i makropęcherzykowego. Charakterystyka histologiczna LD jest zwykle oparta na rozpuszczalnych w tłuszczach barwnikach diazowych, takich jak barwienie czerwienią olejową O (ORO), ale szereg wad konsekwentnie utrudnia stosowanie tej analizy z próbkami wątroby. Ostatnio lipofilowe fluorofory 493/503 stały się popularne do wizualizacji i lokalizacji LD ze względu na ich szybkie pobieranie i akumulację w neutralnym rdzeniu kropli lipidów. Mimo że większość zastosowań jest dobrze opisana w hodowlach komórkowych, istnieje mniej dowodów na niezawodne stosowanie lipofilowych sond fluoroforowych jako narzędzia do obrazowania LD w próbkach tkanek. W niniejszym dokumencie proponujemy zoptymalizowany protokół oparty na dipyrrometenach boru (BODIPY) 493/503 do oceny LD w próbkach wątroby z modelu zwierzęcego stłuszczenia wątroby wywołanego dietą wysokotłuszczową (HFD). Protokół ten obejmuje przygotowanie próbki wątroby, sekcję tkanek, barwienie BODIPY 493/503, akwizycję obrazu i analizę danych. Wykazujemy zwiększoną liczbę, intensywność, stosunek powierzchni i średnicę LD w wątrobie po karmieniu HFD. Za pomocą projekcji ortogonalnych i rekonstrukcji 3D udało się zaobserwować pełną zawartość obojętnych lipidów w rdzeniu LD, które wyglądały jak prawie kuliste kropelki. Ponadto za pomocą fluoroforu BODIPY 493/503 udało nam się wyróżnić mikropęcherzyki (1 μm < d ≤ 3 μm), pęcherzyki pośrednie (3 μm < d ≤ 9 μm) oraz makropęcherzyki (d > 9 μm), co pozwoliło na skuteczne rozróżnienie stłuszczenia mikropęcherzykowego i makropęcherzykowego. Ogólnie rzecz biorąc, ten protokół oparty na fluorescencji BODIPY 493/503 jest niezawodnym i prostym narzędziem do charakterystyki LD w wątrobie i może stanowić podejście uzupełniające do klasycznych protokołów histologicznych.

Prawidłowe wykonanie tej techniki powinno skutkować wyraźnym barwieniem kropel lipidowych, umożliwiającym jednoczesną charakterystykę morfologii LD (kształtu i gęstości rdzenia lipidowego na podstawie rekonstrukcji 3D) wraz z ich rozmieszczeniem przestrzennym, liczbą na całkowitą powierzchnię oraz średnim rozmiarem (ocenionym za pomocą opisanego powyżej schematu analizy, Rysunek 1).
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna k...

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowany protokół oparty na fluorescencji BODIPY 493/503 do charakterystyki kropelek lipidów w tkance wątroby. Dzięki zastosowaniu projekcji ortogonalnych i rekonstrukcji 3D, fluorofor pozwala na skuteczne rozróżnienie stłuszczenia mikropęcherzykowego i makropęcherzykowego i może stanowić podejście uzupełniające do klasycznych protokołów histologicznych do oceny stłuszczenia wątroby.

Analiza fluorescencyjnie barwionych kropelek lipidów z rekonstrukcją 3D w celu oceny stłuszczenia wątroby

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Takie podejście do obrazowania pozwala na trójwymiarową rekonstrukcję odkładania się kropelek lipidów w wątrobie i przezwycięża główne wady klasycznego barwienia histologicznego, które zawężają skuteczne rozróżnienie między stłuszczeniem makro i mikropęcherzykowym. Ocena stłuszczenia mikropęcherzykowego jest uszkodzona, gdy stosuje się złote standardowe barwienia histologiczne, zarówno hematoksylinę ozynę, jak i czerwienie olejowe, z powodu zakłócenia i sporadycznego łączenia się natywnych kropelek lipidowych. Pro BODIPY stanowi alternatywę dla rutynowych protokołów oceny stłuszczenia mikrowątroby ze względu na tę odpowiednią hydrofobowość dla szybkiego wchłaniania w skutecznym znakowaniu kropelek lipidów, które są nie tylko niewrażliwe na polarność środowiska, ale także niezwykle selektywne.To podejście do obrazowania obejmuje szersze zastosowania w połączeniu z technikami immunochemicznymi, umożliwiając jednoczesne wykrywanie innych antygenów subkomórkowych, które mogą przyspieszyć badanie kropelek lipidów, biogenezy i dynamiki, leżąc u podstaw makro i mikropęcherzykowego stłuszczenia wątroby. Włącz kriostat i wytnij odcinki o grubości 12 mikronów zamrożonej tkanki wątroby pobranej od szczura. Umieść skrawki na oznaczonych szkiełkach mikroskopowych w temperaturze pokojowej.W przypadku barwienia BODIPY należy przemyć skrawki tkanki trzykrotnie PBS przez pięć minut każdy. Po ostatnim praniu zakreśl sekcje na szkiełku warstwą hydrofobową za pomocą pisaka barierowego. Przygotuj roztwór barwiący zawierający BODIPY 493503 i DAPI.Następnie odpipetować 75 mikrolitrów roztworu na każde szkiełko. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 40 minut w ciemności. Po inkubacji przemyć szkiełka trzykrotnie PBS przez pięć minut każde.Następnie, za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego, ostrożnie zamontuj szkiełka nakrywkowe na każdym szkiełku. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 30 minut, a następnie uszczelnij krawędzie lakierem do paznokci. Włącz laserowy skaningowy mikroskop konfokalny i umieść szkiełko na uchwycie szkiełka.Do wizualizacji i akwizycji obrazu wybierz obiektyw 20X. W oprogramowaniu konfokalnym wybierz tryb skanowania sekwencyjnego, aby uniknąć przesłuchów między 493503 BODIPY a DAPI. Następnie wzbudz barwnik BODIPY 493503 za pomocą linii lasera argonowego o długości 488 nanometrów i barwienia DAPI za pomocą zestawu linii laserowych o długości fali 405 nanometrów.Emisja waha się od 493 do 589 nanometrów dla BODIPY i od 410 do 464 nanometrów dla DAPI. Następnie skonfiguruj ustawienia mikroskopu, dostosowując rozmiary ramek, szybkość skanowania i uśrednianie, które obejmuje dwukrotnie pomnożoną głębię bitową jako 12 bitów, kierunek jako dwukierunkowy, obszar skanowania, zoom cyfrowy minus jeden i otwór otworkowy minus jedna jednostka obszaru. Dostosuj ustawienia wzmocnienia i wzmocnienia cyfrowego.Upewnij się, że nie ma nasyconych pikseli, jak wskazuje wskaźnik zasięgu. Po dokładnym zidentyfikowaniu kropelek lipidów uzyskaj obraz za pomocą kanałów BODIPY i DAPI. Aby utworzyć obrazy o dużym obszarze, przełącz się na obiektyw subiektywny 10X, a następnie aktywuj tryb skanowania kafelków i skonfiguruj go tak, aby generował obrazy mozaiki pięć na pięć.Aby wygenerować widoki 3D i ortogonalne, nałóż kroplę olejku immersyjnego na wierzch szkła nakrokowego i zmień soczewkę obiektywu na soczewkę 40X. Wybierz tryb stosu Z. Dostosuj płaszczyznę Z, aby zdefiniować pierwszą i ostatnią pozycję do przechwytywania obrazu, zapewniając grubość warstwy optycznej około 0,5 mikrona, aby uchwycić wszystkie krople w ostrości.Wybierz moduł orto i utwórz widoki ortogonalne. Obrazy 3D można uzyskać, wybierając moduł 3D, zgodnie z trybem renderowania przezroczystości. Po uzyskaniu obrazu rozpocznij przetwarzanie i analizowanie obrazów pojedynczych płaszczyzn za pomocą profilera komórek.Prześlij obrazy w formacie TIFF, klikając tryb obrazów w lewym górnym rogu interfejsu profilera komórek. Użyj modułu nazw i typów, aby sortować między obrazami barwionymi kroplami BODIPY i jądrami DAPI na podstawie nazw plików. Do analizy kropelek lipidów należy używać wyłącznie obrazów barwionych metodą BODIPY.Rozpocznij budowę rurociągu, klikając Dostosuj moduły i wybierz moduł koloru na szary, aby przekonwertować obrazy na skalę szarości. Następnie, korzystając z modułu identyfikacji obiektów podstawowych, zdefiniuj kropelki lipidów o wielkości od sześciu do 300 pikseli i współczynnik korekcji progu równy jeden, aby wykryć kropelki lipidów na obrazach w skali szarości. Aby zmierzyć intensywność pikseli zidentyfikowanych kropelek lipidów, dodaj moduł pomiaru intensywności obiektu.Dołącz dodatkowy moduł obiektów filtrujących, aby zapewnić, że tylko najsilniejsze sygnały są określane ilościowo, podczas gdy mniej intensywne sygnały są wykluczane z końcowej analizy kropelek lipidów. Następnie, aby zmierzyć kropelki lipidów związane z danymi wyjściowymi, dodaj moduł kształtu pomiaru rozmiaru obiektu. Następnie dodaj moduł konturów nakładki, aby nałożyć zidentyfikowaną kroplę na oryginalny obraz, a tym samym upewnić się, że segmentacja wygląda dokładnie również na nieprzetworzonym obrazie.Po zakończeniu dodaj moduł eksportu do arkusza kalkulacyjnego i kliknij przycisk analizuj obrazy w lewym dolnym rogu. W porównaniu z grupą kontrolną, zwierzęta karmione HFD wykazywały wyraźny profil dyslipidemiczny i subtelny wzrost poziomu krążących trójglicerydów. Obrazy na dużym obszarze ujawniły zwiększoną ilość kropelek lipidów w wątrobie zwierząt karmionych HFD.Analiza za pomocą profilera komórkowego wykazała zwiększoną liczbę kropelek lipidów w wątrobie, zwiększoną intensywność fluorescencji BODIPY, 360% współczynnik powierzchni i większe średnice. Rozkład wielkości u zwierząt karmionych HFD ujawnił wzrost makropęcherzyków lipidów w wątrobie o więcej niż dziewięć mikronów i zmniejszenie mikropęcherzyków o mniej niż trzy mikrony.

analysis-fluorescent-stained-lipid-droplets-with-3d-reconstruction

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy barwienie in vitro neutralnych lipidów w hepatocytach w celu wykrycia stłuszczenia wątroby lub nadmiernego gromadzenia tłuszczu w wątrobie. Nadmiar tłuszczu gromadzi się w komórkach w postaci kropelek lipidów. Olej Red O jest rozpuszczalnym w tłuszczach barwnikiem, który wiąże się z wewnątrzkomórkowymi obojętnymi lipidami w tych kropelkach lipidów. Obserwowane pod mikroskopem świetlnym te wewnątrzkomórkowe kropelki lipidów wydają się intensywnie czerwone.

Barwienie czerwienią olejową O: technika barwienia obojętnych lipidów w hepatocytach w celu wykrycia stłuszczenia wątroby in vitro

Tutaj opisane są zoptymalizowane metody generowania in vivo i in vitro modeli stłuszczenia wątroby oraz analizy fenotypów stłuszczeniowych i związanych z nimi parametrów fizjologicznych.

Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

W tym badaniu opisujemy szczegółowy protokół indukowania stłuszczenia pęcherzyków wątroby w zróżnicowanych komórkach HepaRG za pomocą soli kwasu tłuszczowego oleinianu sodu i stosujemy metody wykrywania i kwantyfikacji akumulacji lipidów, w tym koherentną mikroskopię rozpraszania Ramanowskiego (CARS), analizę cytofluorymetryczną, barwienie czerwienią olejową O i qPCR.

Indukowanie i charakterystyka stłuszczenia pęcherzykowego w zróżnicowanych komórkach HepaRG

Ten protokół opisuje test do charakterystyki tworzenia się kropelek lipidowych (LD) w organoidach jelitowych człowieka po stymulacji kwasami tłuszczowymi. Omówiliśmy, w jaki sposób ten test jest używany do ilościowego oznaczania powstawania LD i jak można go wykorzystać do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które wpływają na tworzenie LD.

Test oparty na fluorescencji do charakterystyki i kwantyfikacji tworzenia kropelek lipidów w organoidach jelitowych człowieka

Ten protokół ma być narzędziem do badania stłuszczenia i molekularnych, biochemicznych, komórkowych zmian spowodowanych nadmierną ekspozycją hepatocytów na lipidy in vitro.

Model eksperymentalnego stłuszczenia in vitro: hodowla komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów

Obecny protokół opisuje, jak używać czerwonego oleju O do barwienia kropelek lipidów (LDs), obliczać wielkość i liczbę LD w modelu hepatocytów tłuszczowych indukowanych kwasami tłuszczowymi, oraz używać BODIPY 493/503 do obserwacji procesu łączenia się małych LD w duże LD za pomocą obrazowania żywych komórek.

Ocena wielkości kropelek lipidów i fuzji w komórkach wątroby bydła

Niniejsze badanie opisuje oparte na decelularyzacji metodologie wizualizacji i ilościowego określania wewnątrzmięśniowej tkanki tłuszczowej (IMAT) poprzez nienaruszoną objętość mięśni, a także ilościowe określanie metryk poszczególnych adipocytów składających się na IMAT.

Kwantyfikacja nacieku tkanki tłuszczowej mięśni szkieletowych na podstawie decelularyzacji

Choroby zwyrodnieniowe oczu, które wpływają na warstwę nabłonka barwnikowego siatkówki, mają pochodzenie monogenowe i poligenowe. Opracowano kilka modeli chorób i aplikację LipidUNet w celu badania mechanizmów choroby, a także potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Oparta na uczeniu maszynowym metoda charakterystyki i kwantyfikacji złogów lipidowych LipidUNet przy użyciu nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzącego z iPSC

Ten artykuł opisuje użycie komórek HepG2 indukowanych kwasem oleinowym jako modelu dla stłuszczeniowej choroby wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną.

Modelowanie in vitro odkładania się tłuszczu w stłuszczeniowej chorobie wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną

Protokół ten oferuje kompleksowy pipeline obrazowania umożliwiający wizualizację i modelowanie morfologii komórek wątrobowych gwiaździstych w nienaruszonej tkance wątroby. Podejście to łączy znakowanie fluorescencyjne fibroblastów z wykorzystaniem genetyki myszy, przygotowanie tkanek in situ oparte na perfuzji wątroby oraz zmodyfikowaną metodę oczyszczania tkanek iDISCO, aby uzyskać optyczną przezroczystość.

Mapowanie morfologii komórek gwiaździstych wątroby wątroby w myszych modelach włóknienia wątroby

Ten protokół umożliwia reprodukowalną wizualizację kropli lipidowych i dynamiki organelli podczas mitozy z wykorzystaniem zsynchronizowanych komórek hepatomu.

Metoda oparta na fluorescencji do wizualizowania dynamiki kropelek lipidowych i organelli podczas mitozy w komórkach hepatoma

Poznaj metodę fluorescencyjnego barwienia BODIPY 493/503 do analizy kropelek lipidów w tkance wątroby z rekonstrukcją 3D. Technika ta umożliwia skuteczną ocenę mikro- i makrowezikularnego stłuszczenia wątroby.

Analiza fluorescencyjnie barwionych kropelek lipidów z rekonstrukcją 3D w celu oceny stłuszczenia wątroby

Przeglądaj więcej filmów