Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu uzyskania trafień kryształów do krystalografii białek

Uzyskanie kryształu do przeprowadzenia eksperymentów dyfrakcyjnych pozostaje wyzwaniem, ponieważ trudno jest przewidzieć, jakie parametry wpłyną na krystalizację. Faworyzujemy eksperymentatora, badając warunki krystalizacji 1536 na jednej płytce i wykorzystując zaawansowane technologie obrazowania, aby zidentyfikować nawet najmniejsze uderzenia kryształów. Techniki biologii strukturalnej szybko się rozwijają, a dziedzina ta została zrewolucjonizowana przez obliczeniowe przewidywanie struktury.

Spowodowało to, że dziedzina ta stała się bardziej integracyjna, a kilka podejść eksperymentalnych lub obliczeniowych jest częściej łączonych w celu wygenerowania bardziej szczegółowej i dokładnej reprezentacji mechanizmów biologicznych. Generowanie trafień kryształów jest kluczowym krokiem w przeprowadzaniu eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej monokryształów oraz w opracowywaniu technik, takich jak MicroED i krystalografia szeregowa. Korzystając z zaawansowanych metod obrazowania, UV-TPF i SHG, wraz z mocą algorytmu MARCO, pomagają nam zidentyfikować użyteczne kryształy we wszystkich skalach wielkości.

Nasze wysokowydajne metody krystalizacji wygenerowały dużą ilość danych do zbadania pytań dotyczących wydajności składników koktajlu krystalizacyjnego. Specjalistyczne obrazowanie, które wykonujemy, pokazuje, w jaki sposób nieliniowe metody optyczne mogą być wykorzystywane do wykrywania znikomo małych kryształów. Znalezienie warunków krystalizacji ma kluczowe znaczenie dla metod strukturalnych opartych na kryształach, które stanowią 90% wszystkich modeli strukturalnych w banku danych białkowych.

W 2021 r. z PDB pobierano blisko 2 miliony plików dziennie, co podkreśla wpływ struktur na torowanie drogi do dalszych badań naukowych. Na początek użyj zrobotyzowanego systemu obsługi cieczy do dostarczania pięciu mikrolitrów oleju parafinowego do studni na płytce 1536-dołkowej. Odwróć rozmrożony koktajl zawierający 384 dołki, aby wymieszać roztwory.

Inkubować płytki w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aby rozpuścić wszelkie uporczywe osady. Dozować równe ilości buforowanego PEG 3350 i składników sita dodatków z płytki 96-dołkowej do płytki 384-dołkowej do końcowej objętości 50 mikrolitrów. Stempluj cztery płytki 384-dołkowe w płytce 1536-dołkowej, wypełniając wszystkie cztery ćwiartki.

Za pomocą robota do obsługi cieczy wyposażonego w głowicę strzykawkową 384 wprowadź 200 nanolitrów roztworu koktajlowego do każdej studzienki z 1 536-dołkową płytką. Odwirować nieopakowaną, rozmrożoną próbkę o masie 10 000 g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Obserwuj próbkę, aby zidentyfikować wszelkie opady, kolor i warunki.

Podgrzej przygotowaną płytkę 1 536-dołkową do 23 stopni Celsjusza, a następnie odwiruj ją w 150 g przez pięć minut. Używając mikroskopu w jasnym polu, należy zrobić zdjęcia płytki zawierającej koktajl tylko po to, aby można ją było wykorzystać jako kontrolę negatywną. Dozuj 200 nanolitrów próbki do każdej studzienki za pomocą robota do obsługi cieczy.

Po odwirowaniu płytki o masie 150 g inkubować w żądanej temperaturze przez sześć tygodni. Uchwyć obrazy w jasnym polu płytek z próbkami w odstępach tygodniowych od pierwszego do szóstego tygodnia. Wykonaj obrazowanie dźwiękowe za pomocą SHG i UV-TPEF.

Zautomatyzowane obrazowanie płytek przez cały czas trwania eksperymentu pozwoliło na identyfikację szybko i wolno rosnących kryształów w jasnym polu. Obrazowanie UV-TPEF wskazało na białkowy charakter, podczas gdy obrazowanie SHG potwierdziło krystaliczny charakter próbki. Obrazowanie soniczne umożliwiło identyfikację kryształów przesłoniętych przez wytrącanie się osadu lub filmu, które nie wytwarzają sygnału SHG lub mikrokryształów, które można pomylić z osadem.

Zidentyfikowano również kryształy niebiałkowe pozbawione sygnału UV-TPEF, ale wykazujące silne jasne pole i sygnały SHG. Aby przeanalizować obrazy krystalizacji, najpierw otwórz graficzny interfejs użytkownika typu open source z obsługą sztucznej inteligencji. Następnie kliknij Importuj, wybierz Obrazy z menu rozwijanego, a następnie wybierz Z archiwum/katalogu RAW.

Kliknij na Przeglądaj w poszukiwaniu folderu w oknie pop=up, a następnie przejdź do folderu zawierającego obrazy. Wybierz żądane pliki i zaimportuj je do interfejsu, klikając przycisk Otwórz. Gdy wybrane pliki pojawią się w oknie Wybrane ścieżki, wybierz jeden lub więcej do pobrania w interfejsie, a następnie kliknij Importuj przebiegi.

Aby wyświetlić obraz pierwszego dołka, kliknij symbol większego niż po lewej stronie nazwy próbki w oknie przeglądarki pokazu slajdów. Następnie kliknij dwukrotnie na odpowiedni odczyt. Zmień rozmiar całego okna, aby powiększyć obraz.

Pole Szczegóły obrazu zawiera informacje o obrazie i punktacji. Pole Szczegóły koktajlu zawiera metadane dotyczące składników koktajlu. Aby przejść do następnej studni, kliknij przycisk Dalej w panelu nawigacyjnym lub naciśnij strzałki w prawo na klawiaturze.

Nawigacja po konkretnym odwiercie może być możliwa poprzez wprowadzenie numeru studni w oknie Według numeru studni. Wszystkie odczyty można wyświetlić, zaznaczając pole Pokaż wszystkie daty. Wszystkie widma można wyświetlić, zaznaczając pole Pokaż wszystkie widma.

Każdy pojedynczy obraz widma można wyświetlić, klikając przycisk Zamień widmo. Aby ocenić obrazy kryształów za pomocą algorytmu MARCO, najpierw wybierz konkretny przebieg z listy po lewej stronie okna, a następnie kliknij Klasyfikuj wybrany przebieg i wyświetl informacje o punktacji MARCO w oknie Szczegóły obrazu po oznaczeniu wszystkich 1 536 dołków. Aby wyświetlić podzbiór ocenionych obrazów, na przykład obrazy sklasyfikowane przez MARCO jako kryształy, w panelu Filtrowanie obrazów zaznacz pola Kryształy i MARCO, a następnie kliknij przycisk Prześlij filtry.

Aby ręcznie wygenerować zestaw ocen punktowych wykonywanych przez człowieka, przypisz punkty do każdej studni, klikając odpowiedni przycisk znajdujący się w panelu Klasyfikacja u dołu okna lub użyj klawiatury numerycznej, aby przypisać wynik.