Name: Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Poznaj technikę przechwytywania konformacji chromosomów 3C w badaniach organizacji chromatyny i ekspresji genów z udziałem studentów. Metoda umożliwia analizę architektury chromatyny in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była częściowo wspierana przez Rhode Island Institutional Development Award (IDeA) Network of Biomedical Research Excellence z National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health w ramach grantu numer P20GM103430 oraz Bryant Center of Health and Behavioral Sciences.

Chromosome Conformation Capture (3C) for Undergraduate Research and Teaching

<ol><li>McBryant, S. J., Adams, V. H., Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+architectural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin architectural proteins.</a> Chromosome Research. 14 (1), 39-51 (2006).</li>
<li>Nalabothula, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+architectural+proteins+HMGD1+and+H1+bind+reciprocally+and+have+opposite+effects+on+chromatin+structure+and+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The chromatin architectural proteins HMGD1 and H1 bind reciprocally and have opposite effects on chromatin structure and gene regulation.</a> BMC Genomics. 15, 92(2014).</li>
<li>John, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+pre-determines+glucocorticoid+receptor+binding+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns.</a> Nature Genetics. 43 (3), 264-268 (2011).</li>
<li>Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+occurrence+of+a+fibrous+lamina+on+the+inner+aspect+of+the+nuclear+envelope+in+certain+cells+of+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">On the occurrence of a fibrous lamina on the inner aspect of the nuclear envelope in certain cells of vertebrates.</a> The American Journal of Anatomy. 119 (1), 129-145 (1966).</li>
<li>Reddy, K. L., Zullo, J. M., Bertolino, E., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+repression+mediated+by+repositioning+of+genes+to+the+nuclear+lamina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional repression mediated by repositioning of genes to the nuclear lamina.</a> Nature. 452 (7184), 243-247 (2008).</li>
<li>Finlan, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+to+the+nuclear+periphery+can+alter+expression+of+genes+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Recruitment to the nuclear periphery can alter expression of genes in human cells.</a> PLoS Genetics. 4 (3), e1000039(2008).</li>
<li>Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+re-organisation+of+the+Hoxb+complex+during+mouse+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development.</a> Development. 132 (9), 2215-2223 (2005).</li>
<li>Chambeyron, S., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+decondensation+and+nuclear+reorganization+of+the+HoxB+locus+upon+induction+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription.</a> Genes and Development. 18 (10), 1119-1130 (2004).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Gilchrist, S., Baldock, R. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+active+and+inactive+genes+and+noncoding+DNA+within+chromosome+territories%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories.</a> The Journal of Cell Biology. 157 (4), 579-589 (2002).</li>
<li>Mahy, N. L., Perry, P. E., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+density+and+transcription+influence+the+localization+of+chromatin+outside+of+chromosome+territories+detectable+by+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by FISH.</a> The Journal of Cell Biology. 159 (5), 753-763 (2002).</li>
<li>Li, B., Carey, M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+chromatin+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of chromatin during transcription.</a> Cell. 128 (4), 707-719 (2007).</li>
<li>Chen, A., Chen, D., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+of+DNase-seq+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Advances of DNase-seq for mapping active gene regulatory elements across the genome in animals.</a> Gene. 667, 83-94 (2018).</li>
<li>Hughes, A. L., Rando, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+nucleosome+positioning+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying nucleosome positioning in vivo.</a> Annual Review of Biophysics. 43, 41-63 (2014).</li>
<li>Weiner, A., Hughes, A., Yassour, M., Rando, O. J., Friedman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+nucleosome+mapping+reveals+transcription-dependent+promoter+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-resolution nucleosome mapping reveals transcription-dependent promoter packaging.</a> Genome Research. 20 (1), 90-100 (2010).</li>
<li>Hughes, A. L., Jin, Y., Rando, O. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+evolutionary+approach+to+identify+determinants+of+nucleosome+positioning%3A+A+unifying+model+for+establishing+the+genome-wide+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A functional evolutionary approach to identify determinants of nucleosome positioning: A unifying model for establishing the genome-wide pattern.</a> Molecular Cell. 48 (1), 5-15 (2012).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>van Berkum, N. L., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+spatial+chromatin+organization+of+large+genomic+regions+using+5C+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Determining spatial chromatin organization of large genomic regions using 5C technology.</a> Methods in Molecular Biology. 567, 189-213 (2009).</li>
<li>Smith, E. M., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+TAD+boundaries+constrain+cell-type-specific+looping+interactions+between+promoters+and+distal+elements+around+the+CFTR+locus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Invariant TAD boundaries constrain cell-type-specific looping interactions between promoters and distal elements around the CFTR locus.</a> American Journal of Human Genetics. 98 (1), 185-201 (2016).</li>
<li>Crane, E. E. Two inputs into C. elegans dosage compensation: Chromosome conformation and the miRNA-specific argonaute ALG-2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+California%2C+Berkeley%22">University of California, Berkeley</a>. , PhD thesis (2012).</li>
<li>Bell, A. C., West, A. G., Felsenfeld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+CTCF+is+required+for+the+enhancer+blocking+activity+of+vertebrate+insulators%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein CTCF is required for the enhancer blocking activity of vertebrate insulators.</a> Cell. 98 (3), 387-396 (1999).</li>
<li>Cuadrado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+contributions+of+cohesin-SA1+and+cohesin-SA2+to+TADs+and+polycomb+domains+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Specific contributions of cohesin-SA1 and cohesin-SA2 to TADs and polycomb domains in embryonic stem cells.</a> Cell Reports. 27 (12), 3500-3510 (2019).</li>
<li>Sarro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupting+the+three-dimensional+regulatory+topology+of+the+Pitx1+locus+results+in+overtly+normal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Disrupting the three-dimensional regulatory topology of the Pitx1 locus results in overtly normal development.</a> Development. 145 (7), (2018).</li>
<li>Tolhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+among+polycomb+domains+are+guided+by+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Interactions among polycomb domains are guided by chromosome architecture.</a> PLoS Genetics. 7 (3), e1001343(2011).</li>
<li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology%3A+From+fixation+to+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li>
<li>Fernández-Miñán, A., Bessa, J., Tena, J. J., Gómez-Skarmeta, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+21+-+Assay+for+transposase-accessible+chromatin+and+circularized+chromosome+conformation+capture%2C+two+methods+to+explore+the+regulatory+landscapes+of+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 21 - Assay for transposase-accessible chromatin and circularized chromosome conformation capture, two methods to explore the regulatory landscapes of genes in zebrafish.</a> Methods in Cell Biology. 135, 413-430 (2016).</li>
<li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+%26%2334%3BC%26%2334%3B+s+of+chromosome+conformation+capture%3A+controls%2C+controls%2C+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The three &#34;C&#34; s of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nature Methods. 3 (1), 17-21 (2006).</li>
<li>Hagège, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+%283C-qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature Protocols. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li>
<li>Lajoie, B. R., van Berkum, N. L., Sanyal, A., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((My5C%3A+Webtools+for+chromosome+conformation+capture+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">My5C: Webtools for chromosome conformation capture studies.</a> Nature Methods. 6 (10), 690-691 (2009).</li>
<li>Han, M., Wei, G., McManus, C. E., Hillier, L. W., Reinke, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+C.+elegans+germ+nuclei+exhibit+distinct+genomic+profiles+of+histone+modification+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Isolated C. elegans germ nuclei exhibit distinct genomic profiles of histone modification and gene expression.</a> BMC Genomics. 20 (1), 500(2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

3C to potężna technika, która jest zakorzeniona w podstawowych technikach molekularnych. To właśnie ta podstawa podstawowych narzędzi sprawia, że 3C jest tak intrygującą techniką do wykorzystania w pracy ze studentami. Przy tak wielu ostatnich badaniach obserwujących dynamikę chromatyny w tak szerokiej skali, wykorzystanie tych wyników do opracowania wąsko ukierunkowanego eksperymentu na pojedynczym genie lub regionie genomu ma potencjał, aby stworzyć unikalny i wpływowy eksperyment w badaniach licencjackich. Często eksperymenty takie jak te są uważane za zbyt zaawansowane dla studentów, ale przy starannym planowaniu są one łatwo osiągalne. Ważne jest, aby pamiętać, że testy zaprojektowane do badania połączeń chromatyny przechwyconych przez bibliotekę 3C mogą się różnić od półilościowego PCR punktu końcowego do sekwencjonowania całego genomu. W rzeczywistości dane z pierwszego artykułu 3C16 zostały wygenerowane z qPCR. Ten szeroki zakres testów może być stosowany, ponieważ wszystkie technologie 3C wytwarzają ten sam produkt - bibliotekę fragmentów DNA reprezentujących połączenia 3D w jądrze.
Przedstawiono tutaj adaptację bardziej elastycznego i dostosowanego protokołu, który jest lepiej dopasowany do potrzeb naukowców na studiach licencjackich. Wymienione powyżej okresy pauzy oznaczają opóźnienia w nocy; Jednak przerwy te mogą rozciągać się na weekendy, a w przypadku komórek i jąder tygodni. Najważniejszą kwestią jest to, kiedy praca zostanie wykonana. Często w protokołach występują kroki, w których czas jest wrażliwy, gdy pauza nie jest opcją. Poza kilkoma punktami (dzień 1 i dzień 2) jest wiele miejsc, w których można się zatrzymać i zamrozić próbkę. Ma to kluczowe znaczenie podczas pracy ze studentami, gdzie harmonogramy i terminy prac laboratoryjnych muszą być elastyczne. Oprócz włączenia tych przystanków do protokołu, studenci są zachęcani do pracy w parach, a nawet w małych grupach po trzy lub cztery. Grupy dobrze sprawdzają się w tym protokole, ponieważ uczniowie mogą się nawzajem wspierać i tworzyć system koleżeński, aby wszyscy pracowali bezpiecznie. Praca w laboratorium jest również przyjemniejsza, gdy inni są zaangażowani. W grupach uczniowie mogą również pracować nad różnymi pytaniami dotyczącymi organizacji chromatyny, jednocześnie wykonując ten sam protokół. W ten sposób, nawet gdy uczniowie pracują nad oddzielnymi projektami, protokół łączy ich wysiłki i dzięki temu mogą się nawzajem wspierać.
Inne adaptacje mają na celu obejście faktu, że niektóre specjalistyczne narzędzia i sprzęt niekoniecznie można znaleźć we wszystkich instytucjach licencjackich. Do tych elementów wyposażenia należą między innymi termocyklery qPCR, systemy dokumentacji żeli i spektrometry nanoobjętościowe. Rzeczywiście, te elementy wyposażenia są wygodne, ale nie są wymagane. Tutaj klasyczna metoda 3C jest również opisana w części dotyczącej projektu podkładu; Wiąże się to z identyfikacją interesującego miejsca genomu, a następnie oceną innych loci genomowych pod kątem dalszych punktów kontaktowych chromatyny. Ta technika działa również dobrze, jeśli używany jest opublikowany zestaw danych, taki jak zestaw danych wykorzystujący Hi-C, w którym identyfikowane są znane dodatnie (łączące) i ujemne (niełączące) loci. Projektowanie eksperymentów z wykorzystaniem tych opublikowanych zestawów danych jest kolejną świetną adaptacją dla laboratoriów dydaktycznych, ponieważ szansa na pomyślną identyfikację połączeń chromatyny jest zwykle większa. Ponadto artykuł naukowy może być omawiany na zajęciach i może być używany jako odniesienie.
Protokół ten wykorzystuje zmodyfikowane podejście qPCR do wizualizacji tworzenia się produktu 3C. Kontrole mają zasadnicze znaczenie dla powodzenia techniki 3C. W każdym eksperymencie wykorzystuje się zarówno kontrolę próbki, jak i kontrolę startera, aby określić zakończenie procedury 3C. Kontrola próbki obejmuje kontrolę niestrawioną (genomowe DNA) i kontrolę strawioną. Niestrawiona kontrola określa sygnał wyjściowy dla zestawów starterów i jest używana z kontrolą trawienia usieciowanego w celu określenia wydajności trawienia. Oczekuje się, że nastąpi spadek produktu dla wszelkich starterów skierowanych przez miejsce ograniczenia. Porównanie tej wartości z niestrawioną kontrolą wskazuje na to, jak dobrze próbka została strawiona.
Startery do PCR obejmują starter kontrolny i startery testowe. Starter kontrolny to zestaw starterów, który znajduje się w pobliżu badanego regionu genomu i nie zawiera miejsca ograniczenia. Stanowi to punkt odniesienia do określenia obfitości testowych produktów PCR ze starterem. Startery testowe to startery do przodu i do tyłu, które otaczają miejsce restrykcyjne dla określonego interesującego miejsca genomu (ryc. 3). Reakcje z użyciem tych zestawów starterów są porównywane w celu określenia wydajności trawienia, ponieważ obfitość produktu powinna spaść, jeśli miejsce ograniczenia zostało przecięte. Określając organizację chromatyny, jeden starter testowy z jednego locus jest sparowany z innym starterem testowym z innego locus genomowego, aby określić, czy te dwa loci są blisko siebie w przestrzeni 3D. W takim przypadku oczekuje się, że produkt PCR zostanie znaleziony tylko przy użyciu próbki 3C jako szablonu.
Ważne jest, aby pamiętać, że nawet zwalidowane startery mają tendencję do zawodzenia (Rysunek 4: zestaw starterów r14). Ponadto produkty PCR są często identyfikowane w reakcjach kontrolnych oraz w reakcjach, w których nie przewiduje się połączenia chromatyny (takich jak strawiona kontrola, ponieważ nie jest ligowana). Te instancje są sekwencjonowane i albo nie przechodzą kontroli jakości Sangera, albo wracają bez zdefiniowanej sekwencji (rysunek 5). Dodatkowo, tradycyjne eksperymenty 3C generują "matrycę kontrolną", nieusieciowaną, strawioną i zligowaną próbkę DNA, która reprezentuje wszystkie możliwe zligowane fragmenty, które można wytworzyć przy danej ilości DNA. "Szablon kontrolny" odgrywa ważną rolę w porównywaniu intensywności sygnałów qPCR między dwoma loci genomowymi w celu określenia, czy sygnał reprezentuje prawdziwą interakcję, czy tylko losowe powiązanie. Stworzenie "matrycy kontrolnej" może być problematyczne, ponieważ duża część badanej chromatyny musi zostać wychwycona w postaci sztucznego chromosomu i przetworzona wraz z próbkami 3C. Zabezpieczenie takiego konstruktu może okazać się niewykonalne, a jego stworzenie może wykraczać poza ramy projektu semestralnego. Ze względu na te trudności sugerujemy użycie podkładu kontrolnego. Elementarz kontrolny nie zastępuje wszystkich funkcji "szablonu kontrolnego", ale nadal daje możliwość analizy danych w celu określenia "obecności" lub "nieobecności".
Podczas wykonywania qPCR ważne jest użycie równych ilości próbki. Należy to ustalić, nawet w przypadku użycia nanospektrofotometru, takiego jak nanokropla, poprzez wygenerowanie krzywej wzorcowej z genomowego DNA o znanym stężeniu i dopasowanie próbek 3C do tej linii. Ilości te powinny być rejestrowane i wykorzystywane w kolejnych PCR. Ważna jest również jakość reakcji PCR. Ponieważ PCR przebiega w qPCR, obfitość produktu jest mierzona za pomocą fluorescencji i rejestrowana. To nagranie jest dostępne na wykresie amplifikacji. Po zakończeniu programu ważne jest, aby sprawdzić wykres amplifikacji i upewnić się, że reakcje (z wyjątkiem kontroli bez szablonu) mają trzy fazy: linię bazową, wykładniczą i fazę plateau/nasycenia. Ważne jest, aby sprawdzić, czy reakcje mają fazę wykładniczą, w szczególności w celu ustalenia progu (patrz poniżej). Dodatkowo, w przypadku próbek rozcieńczanych seryjnie, powinno nastąpić przesunięcie wartości Ct zgodne z rozcieńczeniem próbki (najwyższe stężenie będzie miało najniższe wartości Ct, podczas gdy najniższe stężenie będzie miało najwyższe wartości Ct). Próbki, które nie odzwierciedlają tej zmiany na wykresie amplifikacji, wymagają nowego rozcieńczenia lub wskazują na większy problem z tworzeniem się próbki 3C. Na koniec, podczas generowania krzywej wzorcowej, oprogramowanie PCR obliczy wydajność PCR i wartość R2 . Skuteczność PCR powinna być większa niż 90%, a wartość R2 powinna być większa niż 0,99. Jeśli którykolwiek z tych warunków nie jest spełniony, prawdopodobnie coś jest nie tak z próbką lub starterami PCR.
Po qPCR procentowe trawienie i obecność oddziaływań 3C można obliczyć za pomocą qPCR Ct dla każdej reakcji. Aby je określić, najpierw należy ustalić próg dla reakcji PCR. Zwykle odbywa się to za pomocą oprogramowania dołączonego do maszyny qPCR. Ustawienie progu określi stężenie produktu PCR, który zostanie użyty do porównania wartości Ct próbki. Próg powinien przecinać krzywe amplifikacji reakcji PCR w wykładniczej fazie amplifikacji. Można porównywać tylko reakcje PCR z amplifikacją wykładniczą (w tym przypadku startery kontrolne i reakcje starterów testowych), ponieważ jest to jedyny sposób, aby upewnić się, że reakcje amplifikują DNA w tym samym tempie i można je wiernie porównać. Analizując wykresy 3C, reakcje warunkowo dodatnie są identyfikowane jako te, w których jest więcej produktu w porównaniu z próbkami kontrolnymi, kontrolą genomu i kontrolą trawienia (ryc. 4B). Próbki te muszą być jednak dalej walidowane przy użyciu sekwencjonowania Sangera po oczyszczeniu produktu PCR w żelu.
Po sekwencjonowaniu Sangera próbki, które przeszły kontrolę jakości, mogą być analizowane za pomocą Blat. Celem tej analizy jest ustalenie, czy próbka ma sekwencję obu docelowych loci genomowych flankujących miejsce restrykcyjne (DpnII w przypadku tego protokołu). Jeśli obie sekwencje zostaną zidentyfikowane, wówczas fragment 3C można uznać za zwalidowany. Jeśli wyniki Blat nie zwrócą oczekiwanej sekwencji, może to oznaczać, że jeden lub oba startery nie są optymalne, co skutkuje fałszywie dodatnim wynikiem qPCR. Pliki śledzenia dla próbek fałszywie dodatnich będą miały niezdefiniowane piki podstawowe, a raporty Seq będą zawierać głównie wywołania podstawowe "n".
Walidacja Sangera jest niezbędna, ponieważ możliwe są fałszywe alarmy z tworzenia sztucznego produktu PCR. Te fałszywie dodatnie wyniki można zidentyfikować, gdy produkty sekwencjonowania nie mają oczekiwanej sekwencji docelowej lub miejsca DpnII charakterystycznego dla właściwego fragmentu 3C (Figura 5). Sekwencjonowanie fragmentów PCR stanowi również kolejny punkt danych dla eksperymentu i uświadamia studentom, że technika 3C identyfikuje odległe loci genomu, które łączą się w przestrzeni 3D w jądrach.
Technika 3C zapewnia bogactwo podstawowych technik molekularnych dla studentów w elastycznej, prostej procedurze. Ta technika 3C jest również punktem wyjścia dla innych technik 3C, które obejmują sekwencjonowanie nowej generacji (NGS). Tego typu eksperymenty mogą zapoznać studentów z ważnymi aspektami bioinformatyki i są zakorzenione w podstawowych zasadach przedstawionych tutaj. Doświadczenie i zaangażowanie studentów są kluczem do ich sukcesu i rozwoju jako młodych naukowców. Zapewniając te możliwości, studenci mogą wzmocnić swoje zrozumienie podstawowych zasad, jednocześnie budując pewność siebie w radzeniu sobie z najnowocześniejszymi technikami i pytaniami.

Genom organizmu zawiera nie tylko wszystkie geny niezbędne do funkcjonowania, ale także wszystkie instrukcje, jak i kiedy ich używać. To sprawia, że regulacja dostępu do genomu jest jedną z najważniejszych funkcji komórki. Istnieje wiele mechanizmów kontrolujących funkcję genów; jednak na poziomie podstawowym regulacja genów sprowadza się do zdolności regulatorowych czynników transkrypcyjnych (trans-czynników) do wiązania się z ich specyficznymi sekwencjami DNA (sekwencje cis-regulatorowe). Nie jest to wrodzona zdolność; Zamiast tego jest regulowany przez organizację/strukturę genomu w jądrze, która kontroluje dostępność/ekspozycję sekwencji regulatorowych CIS na czynniki trans1,2,3. Jeśli trans-faktory nie mogą znaleźć swoich sekwencji cis-regulatorowych, to trans-faktory nie mogą wykonywać swoich zadań regulacyjnych. To sprawiło, że zrozumienie, w jaki sposób genomy są zorganizowane w jądrze, stało się ważnym źródłem badań.
Powszechnie przyjmuje się, że podczas interfazy, eukariotyczne chromosomy w jądrze zajmują swoją własną domenę zakotwiczoną w blaszce jądrowej i macierzy jądrowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), co sprawia, że chromosom bardziej przypomina kawałek pizzy, a nie makaron na talerzu spaghetti. Chromosomy są częściowo skondensowane przez interakcje białko-DNA (chromatyna), które skręcają i zapętlają części chromosomu. Dzięki mikroskopii elektronowej, trójwymiarowej hybrydyzacji in situ fluorescencji DNA (FISH) i technikom znakowania DNA (tj. fluorescencyjnej i sztucznej metylacji DNA) stwierdzono, że nieaktywne domeny chromatyny są ciasno upakowane wzdłuż obwodu jądra komórkowego4,5,6, podczas gdy fragmenty aktywnej, mniej skondensowanej chromatyny znajdują się we wnętrzu jądra7, 8,9,10. Eksperymenty te zapewniają szerokokątny obraz dynamiki chromosomów, ale niewiele robią, aby uchwycić zmiany zachodzące lokalnie wokół promotorów genów obserwowanych w badaniach DNase11,12 i nucleosome13,14,15 badań.
Kluczem do odblokowania dynamiki chromatyny o wyższej rozdzielczości było opracowanie techniki mapowania chromosomów 3D, 3C. Sama technika 3C składa się z czterech głównych etapów: sieciowania chromatyny, trawienia chromatyny przez enzymy restrykcyjne, ligacji chromatyny i oczyszczania DNA (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Nowe sztuczne fragmenty DNA wygenerowane w tym procesie mogą być następnie scharakteryzowane, aby ujawnić ścisły fizyczny związek między liniowo odległymi fragmentami DNA16. Technika 3C stała się podstawą do stworzenia wielu technik spin-off, które wykorzystują początkowe etapy 3C do zadawania szerszych pytań dotyczących całego genomu (np. Hi-C, 4C, ChIP-C). Ta rodzina technik 3C pozwoliła ustalić, że chromosomy są zorganizowane w wiele odrębnych jednostek zwanych domenami powiązanymi topologicznie (TAD). TAD są kodowane w genomie i są definiowane przez pętle chromatyny otoczone niezapętlonymi granicami16,17,18,19. Granice TAD są utrzymywane przez dwa ewolucyjnie konserwatywne i wszechobecne czynniki, w tym czynnik wiążący CCCT (CTCF) i spójność, które zapobiegają interakcji pętli w obrębie oddzielnych TAD16,20. Pętle są zapośredniczone przez interakcję trans-czynników z ich sekwencjami regulatorowymi, a także CTCF i kohesion21.
Chociaż wiele badań wykorzystujących technologie 3C zadaje szerokie pytania dotyczące całego genomu i stosuje skomplikowane techniki pobierania próbek, formułowanie techniki 3C opiera się na podstawowych technikach biologii molekularnej. To sprawia, że 3C jest intrygujące do wdrożenia zarówno w laboratoriach badawczych na studiach licencjackich, jak i dydaktycznych. Technika 3C może być stosowana w przypadku mniejszych, skoncentrowanych pytań i jest z natury elastyczna w skalowaniu w górę lub w dół (pojedyncze geny22, chromosomes16, i/lub genomes18) w zależności od ostrości i kierunku zadawanych pytań. Technika ta została również zastosowana w szerokiej gamie systemów modelowych7,16,19,23 i udowodniono, że jej zastosowanie jest wszechstronne. To sprawia, że 3C jest doskonałą techniką dla studentów studiów licencjackich, ponieważ studenci mogą zdobyć doświadczenie w typowych technikach biologii molekularnej, jednocześnie zdobywając cenne doświadczenie w odpowiadaniu na skierowane pytania.
Prezentowany tutaj jest dostosowany protokół do przygotowania biblioteki 3C na podstawie wcześniej opublikowanych protokołów24,25,26,27. Protokół ten został zoptymalizowany dla około 1 × 107 komórek, chociaż wygenerował biblioteki 3C z zaledwie 1 × 105 komórek. Protokół ten okazał się wszechstronny i został wykorzystany do generowania bibliotek 3C z zarodków danio pręgowanego, linii komórkowych danio pręgowanego i młodych dorosłych (YA) Caenorhabditis elegans (glisty). Protokół powinien być również odpowiedni dla linii komórkowych ssaków oraz, po dalszym dostosowaniu, drożdży.
Celem tych adaptacji jest uczynienie 3C bardziej dostępnym dla studentów. Dołożono wszelkich starań, aby stosować techniki podobne do tych, które można osiągnąć w laboratorium dydaktycznym na studiach licencjackich. Technika 3C zapewnia studentom wiele możliwości uczenia się, aby nauczyć się podstawowych technik biologii molekularnej, które przyniosą korzyści ich rozwojowi na ławce, w klasie i w ich staraniach po ukończeniu studiów.

<table><tbody><tr><td>37% Formaldehyd&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Millapore-Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MP Biomedyczny</td><td>215350280</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Millapore-Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>cOmkompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Millapore-Sigma</td><td>COEDTAF-RO</td><td>zmieszany do 50x w wodzie. Rozcieńczony do 1x w buforze sacharozy i buforze GB świeży</td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Millapore-Sigma</td><td>D0632</td><td>1 M zapas rozcieńczony do 500 &mikro; M w buforze sacharozy i buforze GB świeży</td></tr><tr><td>DpnII</td><td>NEB</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Millapore-Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>glicyna</td><td>Millapore-Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>glikogen</td><td>Millapore-Sigma</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millapore-Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>zielony metylowy pyronin&nbsp; &nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>HT70116</td><td></td></tr><tr><td>MgAc2</td><td>Thermoscientific</td><td>1222530</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>fenol-chloroform&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Millapore-Sigma</td><td>11459643001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>IBI Scientific</td><td>IB05406</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Gotowa mieszanka (Phire Taq itp.)</td> <td>Millapore-Sigma</td><td>KCQS07</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>R6148</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Millapore-Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Millapore-Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>Promega</td><td>M1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Millapore-Sigma</td><td>108319</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Millapore-Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA&nbsp;</td><td>Millapore-Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

uzyskanie a z 3cs: przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Przechwytywanie konformacji chromosomów (3C) to potężne narzędzie, które stworzyło rodzinę podobnych technik (np. Hi-C, 4C i 5C, określanych tutaj jako techniki 3C), które dostarczają szczegółowych informacji o trójwymiarowej organizacji chromatyny. Techniki 3C zostały wykorzystane w szerokim zakresie badań, od monitorowania zmian w organizacji chromatyny w komórkach nowotworowych po identyfikację kontaktów wzmacniających z promotorami genów. Podczas gdy wiele badań wykorzystujących te techniki zadaje duże pytania dotyczące całego genomu ze skomplikowanymi typami próbek (tj. analiza pojedynczych komórek), często zapomina się, że techniki 3C są oparte na podstawowych metodach biologii molekularnej, które mają zastosowanie w szerokim zakresie badań. Odpowiadając na ściśle skoncentrowane pytania dotyczące organizacji chromatyny, ta najnowocześniejsza technika może być wykorzystana do zwiększenia doświadczenia w laboratoriach badawczych i dydaktycznych na studiach licencjackich. W niniejszym artykule przedstawiono protokół 3C oraz przedstawiono adaptacje i punkty nacisku do wdrożenia głównie w instytucjach licencjackich w badaniach licencjackich i doświadczeniach dydaktycznych.

Niniejsza procedura pozwoli na przygotowanie jednej eksperymentalnej próbki 3C oraz dwóch próbek kontrolnych (nietrawionej i trawionej). Z wykorzystaniem tych trzech próbek przeprowadzono analizę qPCR. Na podstawie uzyskanych wyników obliczono wydajność trawienia (równanie 1) i odnotowano ją (Tabela 1). Z przeprowadzonych obliczeń ustalono, że próbka 3C wykazała wydajność trawienia na poziomie około 88% (średnia z Tabeli 1) w siedmiu badanych loci genomowych.
Następnie próbki przetestowano pod kątem obecności dalekosiężnych kontaktów chromatyny między różnymi loci genomowymi, wykorzystując kombinacje starterów specyficznych dla danych loci (Tabela 2) oraz qPCR. Na podstawie uzyskanych wyników obliczono obfitość produktów względem kontrolnego zestawu starterów (równanie 2) i przedstawiono je na wykresie w celu porównania (Rycina 4). Dane te wskazały, że 8 z 10 reakcji było warunkowo dodatnich w kierunku oddziaływań dalekosiężnych.
Reakcje PCR przeprowadzono następnie w żelu agarozowym. Oczekiwany produkt PCR dla ośmiu wyników dodatnich warunkowo oraz jednej reakcji ujemnej oczyszczono w żelu i przekazano do sekwencjonowania metodą Sangera. Wyniki dla reprezentatywnych reakcji dodatnich (niebieska strzałka, niebieska ramka) i ujemnych (czerwona strzałka, czerwona ramka) przedstawiono na (Rycina 5).
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Struktura chromosomu w jądrze komórkowym. Hipotetyczna organizacja chromosomów wewnątrz jądra. (A) otoczka jądrowa, linie czarne; (B) lamina jądrowa, kolor pomarańczowy; (C) heterochromatyna, linie zagęszczone; (D) euchromatyna, luźne pętle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig02.jpg" /> 
Rysunek 2: Schemat protokołu 3C. Odległe fragmenty liniowych chromosomów (niebieski, żółty i różowy) zostają zbliżone do siebie w obrębie jądra komórkowego poprzez pętle regulacyjne. (A) Struktury pętli są tworzone przy udziale czynników transkrypcyjnych (szare koło i czarna gwiazdka); oddziaływania te są utrwalane poprzez chemiczne sieciowanie. (B) Pętle są rozrywane poprzez trawienie enzymatyczne (czarne linie). (C) Odległe fragmenty chromatyny są ligowane ze sobą dzięki lepkim końcom powstałym w wyniku trawienia. (D) DNA zostaje oczyszczone z białek. (E) Sekwencja w obrębie fragmentów zostaje zidentyfikowana i zmapowana z powrotem do genomu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig03.jpg" /> 
Rycina 3: Schemat starterów 3C. Startery 3C są zaprojektowane wokół miejsc restrykcyjnych znajdujących się w różnych odległościach od interesującej lokalizacji genomicznej. Różowe strzałki reprezentują eksperymentalne zestawy starterów otaczające miejsce DpnII. Startery eksperymentalne można mieszać i łączyć w celu oceny zapętlenia chromatyny w danym regionie. Pomarańczowe startery reprezentują kontrolę negatywną bez miejsca DpnII. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig04.jpg" /> 
Rycina 4: Reprezentatywne dane qPCR dla eksperymentu 3C. Względna liczebność testowych zestawów starterów 3C. (A>) Wykres kontrolny pokazujący względną liczebność produktu w kontroli niepoddanej trawieniu (niebieski), kontroli poddanej trawieniu (szary) oraz próbce 3C (pomarańczowy). (B>) Eksperyment 3C; względna liczebność produktu z kombinacji starterów testowych w kontroli niepoddanej trawieniu (niebieski), kontroli poddanej trawieniu (szary) oraz próbce 3C (pomarańczowy). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65213/65213fig05.jpg" /> 
Rysunek 5: Wizualizacja produktów 3C qPCR. Góra: żel z produktami końcowymi qPCR dla wskazanych próbek. Dół: reprezentatywne pliki śladów sekwencjonowania metodą Sangera dla wskazanych reakcji. Próbka pomarańczowa jest przykładem wyniku fałszywie dodatniego (patrz Rysunek 4, r38/34), a próbka niebieska jest przykładem wyniku prawdziwie dodatniego ze wskazanym powyżej śladu miejscem cięcia DpnII. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65213/65213fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Miejsce</td>
			<td>% trawienia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r8</td>
			<td>86.98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r3</td>
			<td>88.44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r38</td>
			<td>89.64</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r34</td>
			<td>87.55</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r33</td>
			<td>87.85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r14</td>
			<td>86.97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r47</td>
			<td>89.45</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Obliczona wydajność trawienia.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa</td>
			<td colspan="3">Sekwencja</td>
			<td>Loci genomiczne</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r3 FWD</td>
			<td colspan="3">ACGCAAGTAAAATTCTGGTTTTTGACC</td>
			<td>chrX:11361475</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r3 RVS</td>
			<td colspan="3">TTTCCTGAGCTCTAACCATGTTTGC</td>
			<td>chrX:11361561</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r38 FWD</td>
			<td colspan="3">TTACTTCTGAAGTAATCTTTTCTTATCCCC</td>
			<td>chrX:5859700</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r38 RVS</td>
			<td colspan="3">AGACGAGCTGATTAAAAGTAGTTGAGAG</td>
			<td>chrX:5859775</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r34 FWD</td>
			<td colspan="3">ATTTGTGGATTGCGTGGAGACG</td>
			<td>chrX:5429702</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r34 RVS</td>
			<td colspan="3">AATAATCCTCTTAACAAACGTGGCC</td>
			<td>chrX:5429777</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r33 FWD</td>
			<td colspan="3">AAGAGTTGTCCAAAATAAATTGAGCTAAC</td>
			<td>chrX:6296704</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r33 RVS</td>
			<td colspan="3">TTCAGAAAAGTAAACTTTGACTTGGAACG</td>
			<td>chrX:6296807</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r14 FWD</td>
			<td colspan="3">AATTATCGATTTTTCCATCGCGCAG</td>
			<td>chrX:8036367</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r14 RVS</td>
			<td colspan="3">ATTTCAATGAAAATGTAAAAATGTTCCTTC</td>
			<td>chrX:8036427</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r47 FWD</td>
			<td colspan="3">ATCTAGACTTGATAATATTTGTGTGTCCTC</td>
			<td>chrX:9464939</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r47 RVS</td>
			<td colspan="3">AAGTTCTGCAACTGTTAGATGAATAACAC</td>
			<td>chrX:9465064</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r8 FWD</td>
			<td colspan="3">GAGAATGTTGTTCTGTAACTGAAAACTTG</td>
			<td>chrX:11094257</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>r8 RVS</td>
			<td colspan="3">TTACGAAATTTGGTAGTTTTGGACC</td>
			<td>chrX:11094362</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starter kontrolny FWD</td>
			<td colspan="3">CAATCGTCTCGCTCACTTGTC</td>
			<td>chrX:7608049</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer kontrolny RVS</td>
			<td colspan="3">GATGTGAGCAACAAGGCACC</td>
			<td>chrX:7608166</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Primery do reprezentacyjnego eksperymentu 3C.

Tutaj szczegółowo prezentujemy adaptację techniki przechwytywania konformacji chromosomów (3C) z naciskiem na zaangażowanie i naukę na studiach licencjackich.

Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...

Nasze badania mają na celu odkrycie, w jaki sposób organizacja chromatyny kontroluje ekspresję genów. Nacisk kładziony jest na określenie, jakie czynniki regulują chromatynę na poziomie genu, aby kontrolować aktywność genów. Obecnie do osiągnięcia postępu w tej dziedzinie wykorzystuje się technologię podobną do wychwytywania chromosomów lub 3C.Postęp w technologiach pobierania i sekwencjonowania próbek pozwolił nam na to, co techniki 3C mogą nam pokazać. Największym wyzwaniem eksperymentalnym jest obecnie pobranie próbek o jednolitej architekturze chromatyny. Niejednorodność próbek prowadzi do mylących wyników.W przyszłości skupimy się na tym, jak zmiany w organizacji chromatyny odgrywają rolę w raku. Pierwszego dnia, po usieciowaniu chromatyny i pobraniu jąder od 5 000 młodych dorosłych robaków Caenorhabditis elegans, przenieś osad jądrowy zawieszony w 450 mikrolitrach czystej wody do czystej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Następnie dodaj do niego 60 mikrolitrów 10x buforu enzymu restrykcyjnego DpnII i dobrze wymieszaj.Inkubować próbki z 15 mikrolitrami 10% dodecylosiarczanu sodu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę z mieszaniem. Ugasić reakcję, dodając 75 mikrolitrów 20% Triton X-100 i inkubując, jak pokazano wcześniej. Podwielokrotność 10 mikrolitrów z próbki jako niestrawionej kontroli i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po dodaniu 400 jednostek DpnII do reszty próbki, inkubuj ją przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem w celu trawienia chromatyny. Drugiego dnia dodaj do próbki dodatkowe 200 jednostek DpnII. Aby zakończyć trawienie usieciowanej próbki, inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem przez cztery godziny.Ciepło dezaktywować enzym restrykcyjny poprzez inkubację próbki przez 20 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Jeśli enzymu nie można inaktywować za pomocą ciepła, dodaj 80 mikrolitrów 10% dodecylosiarczanu sodu i inkubuj. Następnie dodaj 375 mikrolitrów 20% Triton X-100 do próbki i wymieszaj, mieszając.Odłóż na bok 10 mikrolitrów podwielokrotności z próbki jako kontrolę trawienia. W przypadku ligacji chromatyny przenieś próbkę do czystej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Dostosuj objętość próbki do 5,7 mililitra wodą molekularną i wymieszaj przez wirowanie.Następnie dodaj 700 mikrolitrów 10x buforu ligazy T4, a następnie 60 jednostek ligazy DNA T4 i inkubuj próbkę przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza. Trzeciego dnia przystąp do trawienia białek i odwrotnego sieciowania. Dodać 30 mikrolitrów 10 miligramów na mililitr proteinazy K do próbki 3C i inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc z mieszaniem.Aby rozpocząć oczyszczanie biblioteki 3C w czwartym dniu, dodaj 30 mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr RNazy A do próbki i wymieszaj przez wirowanie. Po inkubacji dodać do próbek siedem mililitrów chloroformu fenylowego i wymieszać przez wstrząsanie. Odwirowywać próbkę przez 15 minut w temperaturze 3,270 G i temperaturze pokojowej.Zebrać i przenieść fazę wodną do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodać równe objętości chloroformu i wymieszać próbkę przez wstrząsanie. Po ponownym odwirowaniu próbki, jak pokazano, przenieść fazę wodną do innej czystej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.Dodaj 7,5 mililitra wody molekularnej, 35 mililitrów 100% etanolu i siedem mikrolitrów jednego miligrama na mililitr glikogenu. Odpowiednio wymieszaną próbkę zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Podczas gdy próbka zamarza, rozpocznij oczyszczanie próbek kontrolnych, dostosowując objętość kontrolek do 500 mikrolitrów przy użyciu wody molekularnej.Dodaj dwa mikrolitry po 10 miligramów na mililitr RNazy A i wymieszaj, przesuwając probówkę. Następnie dodać jeden mililitr chloroformu fenylowego do probówek zawierających kontrole i wymieszać przez potrząsanie. Odwirować probówki.Po przeniesieniu fazy wodnej do czystej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra, dodaj równe objętości chloroformu. Odwirować, jak wykazano wcześniej, przed pobraniem fazy wodnej. Do zebranej fazy wodnej dodać jeden mililitr etanolu i dwa mikrolitry jednego miligrama na mililitr glikogenu.Po wymieszaniu próbki przez wstrząsanie inkubować ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie odwirować próbkę przez 15 minut w temperaturze 3,270 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu dodać 750 mikrolitrów schłodzonego 70% etanolu i odwirować.Ponownie zawiesić wysuszony na powietrzu granulat w 50 mikrolitrach wody molekularnej. W tym miejscu zawieszenie można zamrozić, jeśli nie należy natychmiast kontynuować działania. Aby kontynuować oczyszczanie próbki 3C, należy wyjąć próbkę z zamrażarki i odwirować przy stężeniu 3,270 G przez 30 minut.Dodaj 10 mililitrów schłodzonego 70% etanolu i rozbij osad DNA. Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu próbkę należy częściowo wysuszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 150 mikrolitrach 10-milimolowego Tris-HCl o pH 7,5, pipetując w górę iw dół, aby uzyskać oczyszczoną bibliotekę 3C.QPCR przeprowadzony na jednej eksperymentalnej i dwóch kontrolnych próbkach 3C pomógł wygenerować dane dotyczące wydajności trawienia. Próbka 3C miała około 88% wydajność trawienia w siedmiu testowanych loci genomowych. Pobrać potwierdzenie chromosomu lub próbkę 3C i kontrolę i przeprowadzić QPCR.Należy wyciąć pasma produktu odpowiadające oczekiwanej wielkości fragmentu. Aby przeprowadzić ekstrakcję żelową produktów PCR, użyj zestawu komercyjnego lub postępuj zgodnie z domowym protokołem. W tym drugim przypadku skonstruuj domowy wkład oczyszczający, przebijając igłą otwór w dnie rurki o pojemności 0,5 mililitra.Zapakuj niewielką ilość bawełny na dno tuby z otworem, wypełniając nie więcej niż połowę tuby. Umieść rurkę w tubie o pojemności 1.5 mililitra, upewniając się, że mniejsza rurka spoczywa na krawędzi większej rurki, a nie w rurce. Ostrożnie pokrój fragment żelu na mniejsze kawałki i umieść go w małej tubce wkładu.Umieść zespół w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na pięć minut. Następnie wiruj zestaw przez trzy minuty w temperaturze 13 000 G i temperaturze pokojowej. Wyrzuć małą probówkę zawierającą szczątki agarozy i trzymaj 1,5-mililitrową probówkę z wyekstrahowanym DNA w buforze.Próbki przetestowano pod kątem obecności kontaktów chromatyny dalekiego zasięgu między różnymi loci genomowymi przy użyciu kombinacji starterów specyficznych dla loci i QPCR. Obfitość produktu w stosunku do kontrolnego zestawu starterów została obliczona i przedstawiona na wykresie w celu porównania. Dane wskazywały, że osiem z 10 reakcji było warunkowo dodatnich.Oczyszczanie żelu i sekwencjonowanie oczekiwanego produktu PCR dla ośmiu warunkowo dodatnich i jednej negatywnej reakcji oczyszczono żelem i zsekwencjonowano. Przedstawiono wyniki dla reprezentatywnych reakcji pozytywnych i negatywnych.

getting-an-with-3cs-chromosome-conformation-capture-for

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Metoda Hi-C umożliwia bezstronną, genomową identyfikację oddziaływań chromatyny (1). Hi-C łączy ligację bliskościową z sekwencjonowaniem masowo równoległym. Wynikowe dane mogą być wykorzystane do badania architektury genomowej w wielu skalach: wstępne wyniki pozwoliły zidentyfikować takie cechy jak terytoria chromosomowe, segregacja chromatyny otwartej i zamkniętej oraz struktura chromatyny w skali megabazy.

Hi-C: Metoda badania trójwymiarowej architektury genomów.

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

Pętla chromatyny odgrywa znaczącą rolę w regulacji genów; jednak nie ma postępu technologicznego, który pozwalałby na selektywną i odwracalną modyfikację pętli chromatyny. W tym miejscu opisujemy potężny system reorganizacji pętli chromatyny za pomocą CRISPR-dCas9 (CLOuD9), który wykazano, że selektywnie i odwracalnie moduluje ekspresję genów w docelowych loci.

Reorganizacja struktury pętli chromatyny za pośrednictwem CRISPR

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Hi-C 3.0 to ulepszony protokół Hi-C, który łączy sieciujące formaldehyd i glutaran disuccinimidylu z koktajlem enzymów restrykcyjnych DpnII i DdeI, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu i rozdzielczość wykrywania interakcji chromatyny.

Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

W tym miejscu przedstawiamy protokół badania metylacji DNA w całym genomie w klinicznych badaniach przesiewowych pacjentów na dużą skalę przy użyciu technologii sekwencjonowania Methyl-Binding DNA Capture (MBDCap-seq lub MBD-seq) i późniejszej analizy bioinformatycznej.

Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta

Informujemy o małym RNA spinki do włosów (shRNA) i protokole sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji regulatorów inaktywacji chromosomu X w linii komórkowej myszy z genami oporności na lucyferazy świetlika i higromycynę połączonymi z genem białka wiążącego metylo CpG 2 (MeCP2) na nieaktywnym chromosomie X.

Zbiorcze badanie przesiewowe shRNA w celu reaktywacji MeCP2 na nieaktywnym chromosomie X

To jest metoda identyfikacji nowych białek oddziałujących z DNA w określonych docelowych loci, polegająca na specyficznym dla sekwencji wychwytywaniu usieciowanej chromatyny do kolejnych analiz proteomicznych. Nie jest wymagana żadna wcześniejsza wiedza na temat potencjalnych białek wiążących ani modyfikacji komórek. Początkowo opracowana dla drożdży, technologia została obecnie zaadaptowana do komórek ssaków.

Adaptacja wychwytywania hybrydyzacji białek związanych z chromatyną do proteomiki komórek ssaków

Elementy regulatorowe DNA, takie jak wzmacniacze, kontrolują ekspresję genów poprzez fizyczny kontakt z docelowymi promotorami genów, często poprzez interakcje chromosomowe dalekiego zasięgu obejmujące duże odległości genomowe. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identyfikuje znaczące interakcje między promotorami a regionami dystalnymi, umożliwiając przypisanie potencjalnych sekwencji regulatorowych do ich docelowych genów.

Motiver Capture Hi-C: Profilowanie interakcji promotorów w całej rozdzielczości i całym genomie

Poznaj technikę przechwytywania konformacji chromosomów 3C w badaniach organizacji chromatyny i ekspresji genów z udziałem studentów. Metoda umożliwia analizę architektury chromatyny in vivo.

Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

Przeglądaj więcej filmów