Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

Nasze badania mają na celu odkrycie, w jaki sposób organizacja chromatyny kontroluje ekspresję genów. Nacisk kładziony jest na określenie, jakie czynniki regulują chromatynę na poziomie genu, aby kontrolować aktywność genów. Obecnie do osiągnięcia postępu w tej dziedzinie wykorzystuje się technologię podobną do wychwytywania chromosomów lub 3C.

Postęp w technologiach pobierania i sekwencjonowania próbek pozwolił nam na to, co techniki 3C mogą nam pokazać. Największym wyzwaniem eksperymentalnym jest obecnie pobranie próbek o jednolitej architekturze chromatyny. Niejednorodność próbek prowadzi do mylących wyników.

W przyszłości skupimy się na tym, jak zmiany w organizacji chromatyny odgrywają rolę w raku. Pierwszego dnia, po usieciowaniu chromatyny i pobraniu jąder od 5 000 młodych dorosłych robaków Caenorhabditis elegans, przenieś osad jądrowy zawieszony w 450 mikrolitrach czystej wody do czystej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Następnie dodaj do niego 60 mikrolitrów 10x buforu enzymu restrykcyjnego DpnII i dobrze wymieszaj.

Inkubować próbki z 15 mikrolitrami 10% dodecylosiarczanu sodu w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę z mieszaniem. Ugasić reakcję, dodając 75 mikrolitrów 20% Triton X-100 i inkubując, jak pokazano wcześniej. Podwielokrotność 10 mikrolitrów z próbki jako niestrawionej kontroli i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po dodaniu 400 jednostek DpnII do reszty próbki, inkubuj ją przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem w celu trawienia chromatyny. Drugiego dnia dodaj do próbki dodatkowe 200 jednostek DpnII. Aby zakończyć trawienie usieciowanej próbki, inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem przez cztery godziny.

Ciepło dezaktywować enzym restrykcyjny poprzez inkubację próbki przez 20 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Jeśli enzymu nie można inaktywować za pomocą ciepła, dodaj 80 mikrolitrów 10% dodecylosiarczanu sodu i inkubuj. Następnie dodaj 375 mikrolitrów 20% Triton X-100 do próbki i wymieszaj, mieszając.

Odłóż na bok 10 mikrolitrów podwielokrotności z próbki jako kontrolę trawienia. W przypadku ligacji chromatyny przenieś próbkę do czystej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Dostosuj objętość próbki do 5,7 mililitra wodą molekularną i wymieszaj przez wirowanie.

Następnie dodaj 700 mikrolitrów 10x buforu ligazy T4, a następnie 60 jednostek ligazy DNA T4 i inkubuj próbkę przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza. Trzeciego dnia przystąp do trawienia białek i odwrotnego sieciowania. Dodać 30 mikrolitrów 10 miligramów na mililitr proteinazy K do próbki 3C i inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc z mieszaniem.

Aby rozpocząć oczyszczanie biblioteki 3C w czwartym dniu, dodaj 30 mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr RNazy A do próbki i wymieszaj przez wirowanie. Po inkubacji dodać do próbek siedem mililitrów chloroformu fenylowego i wymieszać przez wstrząsanie. Odwirowywać próbkę przez 15 minut w temperaturze 3,270 G i temperaturze pokojowej.

Zebrać i przenieść fazę wodną do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodać równe objętości chloroformu i wymieszać próbkę przez wstrząsanie. Po ponownym odwirowaniu próbki, jak pokazano, przenieść fazę wodną do innej czystej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.

Dodaj 7,5 mililitra wody molekularnej, 35 mililitrów 100% etanolu i siedem mikrolitrów jednego miligrama na mililitr glikogenu. Odpowiednio wymieszaną próbkę zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Podczas gdy próbka zamarza, rozpocznij oczyszczanie próbek kontrolnych, dostosowując objętość kontrolek do 500 mikrolitrów przy użyciu wody molekularnej.

Dodaj dwa mikrolitry po 10 miligramów na mililitr RNazy A i wymieszaj, przesuwając probówkę. Następnie dodać jeden mililitr chloroformu fenylowego do probówek zawierających kontrole i wymieszać przez potrząsanie. Odwirować probówki.

Po przeniesieniu fazy wodnej do czystej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra, dodaj równe objętości chloroformu. Odwirować, jak wykazano wcześniej, przed pobraniem fazy wodnej. Do zebranej fazy wodnej dodać jeden mililitr etanolu i dwa mikrolitry jednego miligrama na mililitr glikogenu.

Po wymieszaniu próbki przez wstrząsanie inkubować ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie odwirować próbkę przez 15 minut w temperaturze 3,270 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu dodać 750 mikrolitrów schłodzonego 70% etanolu i odwirować.

Ponownie zawiesić wysuszony na powietrzu granulat w 50 mikrolitrach wody molekularnej. W tym miejscu zawieszenie można zamrozić, jeśli nie należy natychmiast kontynuować działania. Aby kontynuować oczyszczanie próbki 3C, należy wyjąć próbkę z zamrażarki i odwirować przy stężeniu 3,270 G przez 30 minut.

Dodaj 10 mililitrów schłodzonego 70% etanolu i rozbij osad DNA. Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu próbkę należy częściowo wysuszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 150 mikrolitrach 10-milimolowego Tris-HCl o pH 7,5, pipetując w górę iw dół, aby uzyskać oczyszczoną bibliotekę 3C.

QPCR przeprowadzony na jednej eksperymentalnej i dwóch kontrolnych próbkach 3C pomógł wygenerować dane dotyczące wydajności trawienia. Próbka 3C miała około 88% wydajność trawienia w siedmiu testowanych loci genomowych. Pobrać potwierdzenie chromosomu lub próbkę 3C i kontrolę i przeprowadzić QPCR.

Należy wyciąć pasma produktu odpowiadające oczekiwanej wielkości fragmentu. Aby przeprowadzić ekstrakcję żelową produktów PCR, użyj zestawu komercyjnego lub postępuj zgodnie z domowym protokołem. W tym drugim przypadku skonstruuj domowy wkład oczyszczający, przebijając igłą otwór w dnie rurki o pojemności 0,5 mililitra.

Zapakuj niewielką ilość bawełny na dno tuby z otworem, wypełniając nie więcej niż połowę tuby. Umieść rurkę w tubie o pojemności 1.5 mililitra, upewniając się, że mniejsza rurka spoczywa na krawędzi większej rurki, a nie w rurce. Ostrożnie pokrój fragment żelu na mniejsze kawałki i umieść go w małej tubce wkładu.

Umieść zespół w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na pięć minut. Następnie wiruj zestaw przez trzy minuty w temperaturze 13 000 G i temperaturze pokojowej. Wyrzuć małą probówkę zawierającą szczątki agarozy i trzymaj 1,5-mililitrową probówkę z wyekstrahowanym DNA w buforze.

Próbki przetestowano pod kątem obecności kontaktów chromatyny dalekiego zasięgu między różnymi loci genomowymi przy użyciu kombinacji starterów specyficznych dla loci i QPCR. Obfitość produktu w stosunku do kontrolnego zestawu starterów została obliczona i przedstawiona na wykresie w celu porównania. Dane wskazywały, że osiem z 10 reakcji było warunkowo dodatnich.

Oczyszczanie żelu i sekwencjonowanie oczekiwanego produktu PCR dla ośmiu warunkowo dodatnich i jednej negatywnej reakcji oczyszczono żelem i zsekwencjonowano. Przedstawiono wyniki dla reprezentatywnych reakcji pozytywnych i negatywnych.