Pierwotna hodowla komórek macierzystych miazgi zębowej
5 maja 2023
Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku, jak założyć pierwotną hodowlę komórek macierzystych miazgi zębowej przy użyciu metody hodowli eksplantatów i charakterystykę tych komórek w oparciu o wytyczne ICSCRT. Komórki wyizolowane za pomocą tego protokołu można uznać za mezenchymalne komórki macierzyste do dalszych zastosowań.
Badamy potencjał DPC w zastosowaniach komórkowych i bezkomórkowych w modelach chorób, jednocześnie badając mechanizmy komórkowe i molekularne zaangażowane w regenerację tkanek. Ponadto badamy rolę czynników bezpieczeństwa pochodzących z komórek macierzystych w kontrolowaniu losu komórek macierzystych i promowaniu regeneracji tkanek. Obecnie koncentrujemy się na wykorzystaniu technik hodowli 3D w celu głębszego zrozumienia mechanizmów molekularnych, zmian genetycznych i epigenetycznych związanych z regeneracją tkanek.
Wykorzystujemy zaawansowane techniki, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji, sekwencjonowanie RNA i sekwencjonowanie chipów, aby odkryć domeny regulacyjne rządzące różnymi procesami komórkowymi. Stosując metody eksplantacji do izolacji DPC, można skutecznie zebrać jednorodną populację komórek macierzystych, wolną od innych komórek, takich jak śródbłonek i perycyty. Te typy komórek pozostają w hodowli komórkowej, gdy DPC są ustalane przy użyciu procedur enzymatycznych.
Nasze badania z wykorzystaniem DPC jako modelu komórkowego do barwienia leków i regeneracji tkanek mogą opracować nowatorskie terapie, rozwinąć medycynę spersonalizowaną i mieć daleko idące implikacje w medycynie regeneracyjnej, w tym rekonstrukcję twarzoczaszki i nieocenioną regenerację kości po ekstrakcji zębów. Obecnie badamy, w jaki sposób DPC mogą być wykorzystywane do rozwiązywania problemów z wadami kości, takimi jak ubytki kości długich i kalwarii. Ponadto badamy potencjalne implikacje terapeutyczne wydzielanych cząsteczek pochodzących z DPC w różnych modelach chorobowych, w tym neuroregeneracji i glukagonu.
Na początek przepłucz usunięty ząb sterylnym roztworem soli fizjologicznej, aby usunąć krew. Ostrożnie przetnij ząb wzdłuż na dwie części za pomocą frezu szczelinowego z węglika spiekanego, jednocześnie nawadniając sterylną solą fizjologiczną. Następnie przetransportuj ząb i jego nienaruszoną miazgę w sterylnej pożywce alfa MEM na lodzie do laboratorium hodowli komórek i tkanek, a następnie umieść pobraną próbkę zęba na sterylnej szalce Petriego do hodowli i dokładnie spłucz trzy do czterech razy sterylnym PBS.
Za pomocą ostrej koparki i kleszczy ostrożnie usuń tkankę miazgi jamowej i dokładnie wyczyść ją sterylnym PBS, aby usunąć ślady krwi. Teraz podziel powierzchnię naczynia na cztery części, umieszczając od jednego do dwóch mililitrów sterylnego PBS w każdej części. Umieść próbkę tkanki miazgi w jednym miejscu i pokrój ją na małe kawałki za pomocą ostrza chirurgicznego.
Przenieś kawałki tkanki, podnosząc je do kolejnych obszarów za pomocą PBS. W międzyczasie dodaj około 0,8 do jednego mililitra alfa MEM zawierającego aminokwasy endogenne z 10% FBS i koktajl antybiotykowy na sześciodołkowej płytce i przesuń go, aby równomiernie rozprowadzić podłoże. Przedstawiono różne etapy rozwoju hodowli pierwotnej komórek macierzystych miazgi zęba.
Zaokrąglone komórki pęcherzykowe z tkanki zęba zaobserwowano w drugim dniu wysiewu. Podobną do bałaganu sieć komórek wychodzących z tkanki zaobserwowano czwartego dnia. Jednak do 13 dnia liczba komórek, które wyłoniły się z eksplantatów, wzrosła, a pod koniec drugiego tygodnia większość eksplantatów została otoczona wieloma przylegającymi komórkami o wrzecionowatej morfologii.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie szczegółowo opisuje proces tworzenia pierwotnych kultur mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (DPCs) z wykorzystaniem metody kultur eksplantacyjnych, mając na celu zrozumienie komórkowych i molekularnych mechanizmów regeneracji tkanek. Badania podkreślają potencjał tych komórek w opracowywaniu nowych terapii w leczeniu takich schorzeń, jak ubytki kostne, oraz w zastosowaniach w zakresie regeneracji tkanek zęba.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Regeneracja tkanek
- Izolacja i charakterystyka komórek macierzystych
- Medycyna regeneracyjna
Wstęp
- Znaczenie macierzystych komórek miazgi zęba w terapiach regeneracyjnych
- Obecne ograniczenia metod izolacji enzymatycznej
- Konieczność zastosowania skuteczniejszych technik hodowli w celu poprawy homogeniczności komórek
Zastosowane metody
- Metoda hodowli eksplantów do izolacji DPC
- Miazga zębowa jako system biologiczny
- Techniki takie jak sekwencjonowanie następnej generacji oraz sekwencjonowanie RNA
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja homogennej populacji DPCs
- Charakterystyka morfologii komórkowej podczas rozwoju hodowli
- Potencjalne implikacje dla medycyny personalizowanej i terapii regeneracji kości
Wnioski
- Badanie przedstawia skuteczną metodologię izolacji DPC, która może przyczynić się do rozwoju badań nad regeneracją tkanek.
- Niniejsza praca ma istotne znaczenie dla medycyny regeneracyjnej, w szczególności w zakresie rekonstrukcji kraniomaksylofacialnej i kostnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pierwotna hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (DPSCs) umożliwia generowanie jednorodnych, multipotencjalnych populacji komórek do badań nad regeneracją i modelowania przedklinicznego. Możliwość ta zwiększa wiarygodność prognoz w zakresie naprawy tkanek, regeneracji kości oraz modelowania chorób, co bezpośrednio wpływa na decyzje dotyczące portfela projektów we wczesnej fazie. Powtarzalność i czystość tej metody ułatwiają ciągłość translacyjną od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie ścieżek regeneracyjnych i mechanizmów komórkowych w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez zapewnienie spójnego źródła komórek macierzystych do badań mechanistycznych.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez fenotypową i molekularną charakterystykę populacji komórek macierzystych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, rozszerzalne kultury komórek macierzystych do standaryzowanej optymalizacji testów.
- Gwarantuje powtarzalność i mierzalne wyniki w badaniach przesiewowych związków oraz testach funkcjonalnych.
- Umożliwia skalowalne przygotowanie komórek macierzystych dla platform wysokoprzepustowego przesiewu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla chorób w badaniach nad regeneracją kości, tkanek nerwowych i wątroby.
- Zapewnia ciągłość od odkryć in vitro do przedklinicznej walidacji terapii regeneracyjnych in vivo.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne, umożliwiając ocenę biomarkerów i wyników funkcjonalnych w odpowiednich typach komórek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda izolacji DPSC oparta na eksplantach integruje etapy od wczesnych odkryć po badania przedkliniczne, wspierając identyfikację wiodących kandydatów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesach rozwoju medycyny regeneracyjnej.
- Biologia odkrywcza: Usprawnia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w modelach naprawy tkanek opartych na komórkach macierzystych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, homogeniczne populacje komórek do analiz i oceny ilościowej.
- Analityka: Wspiera odczyty molekularne i fenotypowe, w tym analizy oparte na sekwencjonowaniu do mapowania domen regulacyjnych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z modelami przedklinicznymi w zastosowaniach dotyczących regeneracji kości i układu nerwowego.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowany, wielokrotnego użytku schemat izolacji komórek macierzystych dla wielu programów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad regeneracją.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów hodowli komórek macierzystych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez umożliwienie solidnego modelowania przedklinicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów do terapii regeneracyjnych.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biologii komórek macierzystych oraz sterylnego obchodzenia się z tkankami.
- Wymaga dostępu do zaplecza hodowli komórkowych oraz zaawansowanych platform analitycznych (np. sekwencjonowania).
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Możliwość dostosowania do różnych źródeł tkanek i modeli chorób poprzez optymalizację protokołu.
- Potencjalne ograniczenia obejmują dostępność tkanek oraz skalowalność w przypadku badań na dużą skalę.
