Name: Procedura kriosekcji kriosekcji zwoju korzenia grzbietowego myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-09T13:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 20 s
Description: Naucz się techniki kriosekcji zwojów korzeni grzbietowych myszy w celu uzyskania płaskich, nieuszkodzonych preparatów do badań immunohistochemicznych. Ta metoda umożliwia niezawodne pozyskiwanie próbek do neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dla niniejszego badania, eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez UCSF Institutional Animal Care and Use Committee i zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystano tu dorosłe, 8-12-tygodniowe samce i samice myszy C57BL/6 (wyhodowane w domu).
1. Przygotowanie próbki DRG
<ol>
	<li>Znieczulić myszy 2,5% Avertin (patrz Tabela Materiałów). Zapewnij odpowiednie znieczulenie przy braku reakcji na bolesną stymulację. Perfuzję zwierząt przezskórnie z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), a następnie 4% formaldehydem, jak opisano wcześniej14,15,16.</li>
	<li>Wypreparuj tkankę DRG z rdzenia kręgowego, zgodnie z wcześniejszym opisem14,15,16.</li>
	<li>Po utrwaleniu wypreparowanych DRG w 4% formaldehydzie przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić DRG w 30% sacharozie w PBS w temperaturze 4 °C na noc.</li>
	<li>Przygotowanie podstawy optymalna temperatura cięcia (OCT)
	<ol>
		<li>Dodaj związek OCT (patrz Tabela materiałów), aby pokryć górną powierzchnię bloku aluminiowego i zamrażać w temperaturze -20 °C przez 5-10 minut (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Odetnij górną część OCT za pomocą kriostatu (patrz Tabela materiałów) o grubości 30 μm, aż jego powierzchnia będzie płaska jak baza OCT (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Zrób znak na dole (pozycja godziny szóstej) podstawy OCT, aby zaznaczyć jego orientację, zanim zdejmiesz aluminiowy blok z kriostatu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
		<li>W kolejnych krokach utrzymuj znak na godzinie szóstej, aby zachować tę samą orientację, co może prowadzić do uzyskania większej liczby sekcji próbki DRG. 
		UWAGA: Jeśli orientacja zostanie utracona, a próbka DRG zostanie przycięta pod innym kątem, próbki DRG nie można całkowicie przeciąć od góry do dołu, co pozostawi niektóre próbki pozostawione na bazowym OCT i zmarnowane, ponieważ podczas próby przecięcia próbki DRG napotka się podstawowy OCT (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonywanie osadzania OCT DRG
	<ol>
		<li>Wysuszyć tkankę DRG przed umieszczeniem jej na OCT.
		<ol>
			<li>Przed dodaniem DRG do bloku należy upewnić się, że usunięto 30% roztwór sacharozy/PBS wokół próbki.</li>
			<li>Wysuszyć próbkę DRG, umieszczając ją na suchej szalce Petriego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A) i przenosząc ją z jednego miejsca na drugie dwa lub trzy razy za pomocą suchej pęsety (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
			<li>Osusz pęsetę niestrzępiącą się chusteczką przed przeniesieniem kolejnej próbki DRG (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieść suchy DRG na podstawie OCT.
		<ol>
			<li>Za pomocą suchej pęsety umieść suchy DRG na podstawie OCT w pozycji godziny 12 (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D).</li>
			<li>Zachować co najmniej 5 mm między górną krawędzią DRG a górną krawędzią podstawowego KTZ.</li>
			<li>Umieść grzbietową część DRG w pozycji godziny 12, a część brzuszną w pozycji godziny szóstej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Osadź tkankę DRG za pomocą OCT.
		<ol>
			<li>Dodaj więcej OCT, aby pokryć całą próbkę DRG w okrągłym lub owalnym kształcie, z DRG w środku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
			<li>Upewnij się, że górna krawędź OCT zakrywa DRG na górnej krawędzi podstawowego OCT (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1F), ponieważ ułatwia to przeniesienie sekcji na szkiełko (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3A). 
			UWAGA: Jeśli pokrywa OCT znajduje się w środku podstawowego OCT , górna krawędź podstawy OCT zablokuje szklany szkiełko, aby zebrać sekcję (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B).</li>
			<li>Zamrozić próbkę OCT i DRG w temperaturze -20 °C przez kolejne 5 minut (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G). Nie przycinaj OCT wokół DRG sample.</li>
			<li>Odetnij górną część pokrywy OCT o grubości 30 μm, aż DRG będzie widoczny.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kriosekcja DRG
<ol>
	<li>Zmień grubość przekroju kriostatu na 12 μm, aby przyciąć sekcje DRG na szkiełku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H).</li>
	<li>Przytrzymaj sekcję OCT na dole małym pędzlem schłodzonym do -20 °C. 
	UWAGA: Ważne jest, aby nie ciąć całego odcinka całkowicie, ale pozostawić 1-3 mm nieprzycięte (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I).</li>
	<li>Za pomocą końcówki pęsety o temperaturze pokojowej delikatnie dotknij spodu (pozycja godziny szóstej) sekcji, tak aby przykleiła się do powierzchni platformy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1J). Zapobiega to zakrzywianiu się sekcji do tyłu w rolce, co utrudnia zebranie sekcji na szkiełku. 
	UWAGA: Gdy dolna część sekcji przylega do powierzchni platformy, a górna część sekcji nadal łączy się z pokrywą OCT, sekcja ma płaski kształt (<silna klasa="xfig">Rysunek 1K), co znacznie ułatwia zebranie sekcji na zjeżdżalni.</li>
	<li>Weź naładowane szkiełko (patrz Tabela materiałów) i powoli umieść szkiełko na sekcji. Jak tylko sekcja zacznie przylegać do suwaka, delikatnie pociągnij suwak do tyłu (Rysunek 1L).</li>
	<li>Postępuj zgodnie z tym samym procesem, aby umieścić więcej sekcji DRG na slajdzie bez nakładania się sekcji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1M). Upewnij się, że nowy odcinek DRG nie jest umieszczony nad OCT innego odcinka DRG (<silna klasa="xfig">Rysunek 4), ponieważ taki odcinek nie może dobrze pozostać na szkiełku i może zostać zmyty podczas procesu barwienia immunochemicznego.</li>
</ol>
3. Barwienie Nissl sekcji DRG na szkiełku
<ol>
	<li>Myć sekcje przez 10 minut w PBS plus 0,1% Triton X-10. Następnie umyj skrawki dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Na szkiełko nanieść barwnik 1:300 Nissl (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj sekcję PBS plus 0,1% Triton X-100. Następnie należy dwukrotnie umyć skrawki PBS przez 5 min, a następnie przez 2 h w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Nałożyć 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) fluoromount-G (patrz tabela materiałów) w celu przykrycia odcinków szkiełkiem nakrywkowym.</li>
</ol>

Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning

<ol><li>Guan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injured+sensory+neuron-derived+CSF1+induces+microglial+proliferation+and+DAP12-dependent+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+root+ganglion+macrophages+contribute+to+both+the+initiation+and+persistence+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain.</a> Nature Communications. 11 (1), 264(2020).</li>
<li>Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+glial+cells+in+sensory+ganglia%3A+its+role+in+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain.</a> Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).</li>
<li>Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profile+of+dorsal+root+ganglion+neurons%3A+study+of+oxytocin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain%22%5BJournal%5D)">Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression.</a> Molecular Brain. 15 (1), 44(2022).</li>
<li>Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuro-immune+interactions+in+chronic+pain%3A+implications+for+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain+Research%22%5BJournal%5D)">The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice.</a> Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).</li>
<li>Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+characteristics+of+the+dorsal+root+ganglion+as+a+target+for+neuromodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Pain+Medicine%22%5BJournal%5D)">Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation.</a> Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).</li>
<li>Chen, X. J., Sun, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+circuit+mechanisms+of+itch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Central circuit mechanisms of itch.</a> Nature Communications. 11 (1), 3052(2020).</li>
<li>Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contemporary+views+on+inflammatory+pain+mechanisms%3A+TRPing+over+innate+and+microglial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways.</a> F1000Research. , (2016).</li>
<li>Boadas-Vaello, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroplasticity+of+ascending+and+descending+pathways+after+somatosensory+system+injury%3A+reviewing+knowledge+to+identify+neuropathic+pain+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets.</a> Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).</li>
<li>Guha, D., Shamji, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsal+root+ganglion+in+the+pathogenesis+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain.</a> Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).</li>
<li>Shorrock, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UBA1%2FGARS-dependent+pathways+drive+sensory-motor+connectivity+defects+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy.</a> Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).</li>
<li>Sleigh, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trk+receptor+signaling+and+sensory+neuron+fate+are+perturbed+in+human+neuropathy+caused+by+Gars+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).</li>
<li>Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+somatosensory+neuron+involvement+in+the+SOD1%28G93A%29+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model.</a> Scientific Reports. 12 (1), 7600(2022).</li>
<li>Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+protocol+for+rapid+dissection+of+mouse+dorsal+root+ganglia+from+defined+spinal+levels%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels.</a> BMC Research Notes. 13 (1), 302(2020).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Research Notes. 9, 82(2016).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).</li>
<li>Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+dorsal+root+ganglion+neuron+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184(2020).</li>
<li>Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+transcriptional+signatures+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Common transcriptional signatures of neuropathic pain.</a> Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).</li>
<li>Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+dorsal+root+ganglia+following+peripheral+nerve+injury%3A+roles+in+inflammation%2C+cell+death+and+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception.</a> Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).</li>
<li>Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+and+chemokine+regulation+of+sensory+neuron+function%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+outgrowth%2C+neuropeptides+expression+and+receptors+tyrosine+kinase+phosphorylation+in+3D+organotypic+cultures+of+adult+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia.</a> PLoS One. 12 (7), e0181612(2017).</li>
<li>Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+nature+of+dorsal+root+ganglion+neurons%3A+Linking+structure+with+polarity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiolology%22%5BJournal%5D)">The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function.</a> Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).</li>
<li>Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+sensory+afferent+compartments+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">The structure of sensory afferent compartments in health and disease.</a> Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).</li>
<li>Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+transcriptomic+analysis+of+human+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons.</a> eLife. 10, e71752(2021).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li>
<li>Hunt, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRGquant%3A+A+new+modular+AI-based+pipeline+for+3D+analysis+of+the+DRG%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG.</a> Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497(2022).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten zapewnia łatwą procedurę krok po kroku do cięcia kriostatu myszy DRG w celu niezawodnego uzyskania wysokiej jakości przekrojów DRG na szkiełkach. W tym protokole istnieją cztery kluczowe kroki. Po pierwsze, próbka DRG i pęseta muszą być suche przed umieszczeniem próbki DRG na podstawie OCT. Każda ciecz otaczająca próbkę DRG utworzy wokół niej lodową skorupę, co spowoduje oddzielenie się odcinków DRG od OCT i zakrzywienie do góry. Po drugie, jeśli blok aluminiowy nie ma znaku lub jeśli OCT podstawy zakrywa zn...

Zwój korzenia grzbietowego (DRG) zawiera główne neurony czuciowe, makrofagi tkankowe i komórki satelitarne, które otaczają główne neurony czuciowe1,2,3,4. Jest to kluczowa struktura anatomiczna w przetwarzaniu nieszkodliwych i szkodliwych sygnałów i odgrywa kluczową rolę w bólu, swędzeniu i różnych zaburzeniach nerwów obwodowych5,6,7,8,9,10,11,12,13. Chociaż opracowano kilka metod preparowania tkanki DRG z rdzenia kręgowego myszy14,15,16, kriosekcja tkanki DRG pozostaje wyzwaniem, ponieważ tkanka DRG jest dość mała, a skrawki kriostatu próbek DRG mają tendencję do zakrzywiania się w rolki, co utrudnia prawidłowe przeniesienie sekcji kriostatu na szkiełka podstawowe. Jednak prawidłowa kriosekcja tkanki DRG ma kluczowe znaczenie dla badań immunohistochemicznych i struktury neuronów czuciowych DRG17,18,19,20,21,22,23. Ponadto, ponieważ wyniki sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki ujawniły niezwykłą heterogeniczność neuronów czuciowych DRG zarówno u ludzi24, jak i myszy25, prawidłowa kriosekcja tkanki DRG ma kluczowe znaczenie dla zbadania funkcjonalnej roli różnych komórek DRG w różnych stanach fizjologicznych i patologicznych.
Chociaż technika oczyszczania tkanek została zastosowana do zbadania rekonstrukcji 3D DRG26 jako alternatywna technika kriosekcji DRG, technika oczyszczania tkanek jest czaso- i pracochłonna. Dla porównania, kriosekcja DRG jest szybka i stosunkowo łatwa do przeprowadzenia, a zatem pozostaje kluczową techniką w badaniach immunohistochemicznych i strukturalnych DRG i innych obszarów ośrodkowego układu nerwowego. Jednak uzyskanie wysokiej jakości, nienaruszonych i płaskich skrawków kriostatu na szkiełkach podstawowych pozostaje wyzwaniem w badaniach neurobiologicznych ze względu na niewielki rozmiar próbki tkanek, takich jak DRG i niektóre regiony mózgu, i nie ma w tym momencie artykułu opisującego optymalny protokół kriosekcji małych próbek tkanek, takich jak DRG myszy.
Ten protokół zapewnia łatwą, krok po kroku technikę kriostatu do cięcia DRG myszy, aby niezawodnie uzyskać jak najwięcej wysokiej jakości przekrojów DRG na szkiełkach do kolejnych badań DRG. Chociaż technika ta została specjalnie zaprojektowana do kriosekcji próbek DRG, może być potencjalnie stosowana do kriosekcji różnych innych tkanek o małym rozmiarze próbki.

<table><tbody><tr><td>Avertin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td>Znieczulenie zwierząt</td></tr><tr><td>Epredia&nbsp; Kriokassety kriostotowe Cryocasettes, średnica 25 mm Zakreskowany</td><td>Fisherbrand</td><td>1910</td><td>Przytrzymaj sekcję OCT na dole&nbsp;</td></tr><tr><td>Pęseta Ergo</td><td>Fisherbrand</td><td>S95310</td><td>Za pomocą końcówki pęsety delikatnie dotknij dna (6 o' zegar) sekcji tak, aby przylegała do powierzchni platformy, aby zapobiec zakrzywianiu się sekcji do tyłu w rolce&nbsp;</td></tr><tr><td>Marka rybacka&nbsp; Szkiełka mikroskopowe Superfrost Plus</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td>Aby zebrać sekcję DRG&nbsp;</td></tr><tr><td>Pisaki do znakowania</td><td>Fisherbrand</td><td>133794</td><td>&nbsp; Zaznacz orientację bazy OCT</td></tr><tr><td>Scigen&nbsp; Tissue-Plus O.C.T. Compound</td><td>Fisherbrand</td><td>&nbsp; 23730571</td><td>Podłoże do zatapiania zamrożonych próbek tkanek w celu zapewnienia optymalnej temperatury cięcia (O.C.T.).</td></tr></tbody></table>

procedura kriosekcji kriosekcji zwoju korzenia grzbietowego myszy

A Procedure for Mouse Dorsal Root Ganglion Cryosectioning

Wysokiej jakości sekcje kriostatu kriostatu zwoju korzenia grzbietowego myszy (DRG) są kluczowe dla prawidłowego barwienia immunochemicznego i badań RNAscope w badaniach nad bólem zapalnym i neuropatycznym, swędzeniem, a także innymi obwodowymi schorzeniami neurologicznymi. Jednak konsekwentne uzyskiwanie wysokiej jakości, nienaruszonych i płaskich skrawków kriostatu na szkiełkach podstawowych pozostaje wyzwaniem ze względu na niewielki rozmiar próbki tkanki DRG. Do tej pory nie ma artykułu opisującego optymalny protokół kriosekcji DRG. Protokół ten przedstawia metodę krok po kroku mającą na celu rozwiązanie często napotykanych trudności związanych z kriosekcją DRG. W prezentowanym artykule wyjaśniono, w jaki sposób usunąć otaczającą ciecz z próbek tkanek DRG, umieścić skrawki DRG na szkiełku skierowanym w tę samą orientację i spłaszczyć skrawki na szkiełku bez zakrzywiania się do góry. Chociaż protokół ten został opracowany do kriosekcji próbek DRG, może być stosowany do kriosekcji wielu innych tkanek o małej wielkości próbki.

W niniejszym badaniu pobrano około 16 ciągłych, wysokiej jakości przekrojów z jednego zwoju korzeni grzbietowych (DRG) kręgu L4 myszy. Uzyskane przekroje nie wykazywały żadnych zniekształceń. Rysunek 1 przedstawia procedurę kriosekcjonowania krok po kroku. Usuwanie nadmiaru cieczy z przekrojów tkankowych pokazano na Rysunku 2. Proces zatapiania tkanek w OCT przedstawiono na Rysunku 3. Rysunek 4 ukazuje ...

Prezentowany jest tutaj rozwój konsekwentnego pozyskiwania wysokiej jakości sekcji kriostatu zwoju korzenia grzbietowego.

Procedura kriosekcji kriosekcji zwoju korzenia grzbietowego myszy

High-quality mouse dorsal root ganglion (DRG) cryostat sections are crucial for proper immunochemistry staining and RNAscope studies in the research of ...

Wyzwaniem pozostaje ciągłe uzyskiwanie wysokiej jakości, nienaruszonych i płaskich wycinków kriostatu zwojowego korzenia grzbietowego myszy. Badania mają na celu znalezienie odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób uzyskać idealny przekrój krystatu zwoju korzenia grzbietowego myszy. Protokół ten zapewnia łatwą technikę krok po kroku od sekcji kriostatu DRG myszy do wysokiej jakości, nienaruszonych i płaskich przekrojów DRG myszy.W tym przedstawionym artykule wyjaśniono, jak usunąć otaczającą ciecz z tkanki próbki DRG myszy, umieszczając sekcje DRG na szkiełkach skierowanych w tę samą orientację i spłaszczając sekcje DRG bez zakrzywiania się w górę. Jednym z głównych wyzwań jest to, że sekcje OCT myszy DRG mają tendencję do zakrzywiania się w rzęd, co utrudnia umieszczenie ich na szklanym szkiełku. Trudno jest również uzyskać wystarczającą liczbę skrawków z jednej próbki ze względu na mały rozmiar DRG myszy.Zacznij od utrwalenia tkanki DRG wyciętej z rdzenia kręgowego znieczulonej myszy w 4% formaldehydzie przez trzy godziny w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj tkankę w 30% sacharozie w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie przygotuj bazowy OCT, dodając związek OCT i pokrywając górną powierzchnię bloku aluminiowego.Zamroź pokryty blok aluminiowy w temperaturze 20 stopni Celsjusza na pięć do 10 minut. Odetnij górną część OCT o grubości 30 mikrometrów za pomocą kriostatu, aż jego powierzchnia będzie tak płaska jak podstawa OCT. Zaznacz spód podstawy OCT w pozycji godziny szóstej przed zdjęciem aluminiowego bloku z kriostatu.Aby wykonać osadzanie DRG OCT, wysusz tkankę DRG, umieszczając ją na suchej szalce Petriego i przenosząc z jednego miejsca na drugie dwa lub trzy razy za pomocą suchej pęsety. Następnie umieść suchy DRG na podstawie OCT w pozycji godziny 12 za pomocą suchej pęsety. Upewnij się, że zachowana jest odległość co najmniej pięciu milimetrów między górną krawędzią DRG a górną krawędzią podstawy OCT, przy czym część grzbietowa znajduje się w pozycji godziny 12, a część brzuszna w pozycji godziny szóstej.Następnie dodaj OCT w okrągłym lub owalnym kształcie, aby osadzić całą tkankę DRG z DRG pośrodku. Zamrozić próbkę OCT i DRG w temperaturze 20 stopni Celsjusza na pięć minut. Po zakończeniu odetnij górną część pokrywy OCT o grubości 30 mikrometrów, aż DRG będzie widoczny.Kriosekcję należy rozpocząć od przytrzymania sekcji DRG o optymalnej temperaturze cięcia na dole za pomocą małego pędzelka schłodzonego w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Delikatnie dotknij dolnej części sekcji za pomocą końcówki pęsety o temperaturze pokojowej, tak aby przykleiła się do powierzchni platformy. Następnie powoli umieść naładowany szkiełko na sekcji.Gdy tylko sekcja przyklei się do suwaka, delikatnie pociągnij suwak do tyłu. Wykonaj ten sam proces, aby umieścić więcej sekcji DRG na slajdzie bez nakładania się sekcji. Prawidłowe rozmieszczenie skrawków DRG na szkiełkach podstawowych jest widoczne tam, gdzie tkanki nie zachodzą na przekrój DRG i OCT innych odcinków DRG.Obraz z konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej wykazał jakość przekrojów DRG uzyskanych za pomocą tego protokołu. Dzięki tej technice badania immunohistochemiczne DRG można przeprowadzać przy użyciu różnych przeciwciał.

a-procedure-for-mouse-dorsal-root-ganglion-cryosectioning

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny z tkanki zwojów korzeni grzbietowych po uszkodzeniu aksonów. Podejście to może być wykorzystane do identyfikacji specyficznych miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych oraz modyfikacji epigenetycznych histonów i DNA, które są istotne dla regeneracji uszkodzonych aksonów zarówno w obwodowym, jak i ośrodkowym układzie nerwowym.

Immunoprecypitacja chromatyny z tkanki zwojów korzeni grzbietowych po uszkodzeniu aksonalnym

Ten film demonstruje bezenzymatyczny protokół izolacji makrofagów z ganglionu korzenia grzbietowego myszy (DRG) za pomocą techniki mechanicznej dysocjacji. Po homogenizacji świeżo pobranej tkanki DRG, przeciwciała przeciwko receptorom na powierzchni komórki na makrofagach są używane do fluorescencyjnego znakowania komórek, a następnie wykonuje się cytometrię przepływową w celu potwierdzenia obecności makrofagów w próbce.

Izolacja makrofagów z ganglionu korzenia grzbietowego myszy za pomocą dysocjacji mechanicznej

Ten film demonstruje metodę pobierania neuronów z grzbietowych zwojów korzeniowych (DRG). DRG z kręgosłupa szczura jest izolowany, traktowany enzymami, a następnie mechanicznie dysocjowany w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Neurony są oddzielane od komórek glejowych za pomocą wirowania w gradiencie gęstości i hodowane w pożywce wzrostowej.

Technika zbierania i dysocjacji zwojów korzenia grzbietowego dla kultur neuronalnych

Tutaj prezentujemy protokół hydraulicznego wytłaczania rdzenia kręgowego, jak również identyfikacji i izolacji specyficznych zwojów korzenia grzbietowego (DRG) u tego samego gryzonia. W porównaniu ze standardowymi metodami izolacji rdzenia kręgowego, metoda ta jest znacznie szybsza i zmniejsza ryzyko uszkodzenia tkanek.

Hydrauliczne wytłaczanie rdzenia kręgowego i izolacja zwojów korzenia grzbietowego u gryzoni

Tutaj prezentujemy protokół mechanicznej dysocjacji do szybkiego izolowania makrofagów z grzbietowego zwoju korzenia w celu fenotypowania i analizy funkcjonalnej.

Szybka izolacja makrofagów zwoju korzenia grzbietowego

Prezentowana jest wygodna metoda perfuzji grawitacyjnej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy. Immunofluorescencyjne wykrywanie fosforylowanej α-synukleiny wykazano w mysim modelu choroby Parkinsona. Praca ta kompleksowo opisuje również etapy perfuzji przezsercowej, rozwarstwienia, zamrażania/osadzania tkanek i zamrażania sekcji.

Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

Ten artykuł opisuje protokół immunopaningu dla zwojów korzenia grzbietowego dorosłej myszy. Przylegając przeciwciała do płytek hodowlanych, możemy negatywnie selekcjonować i usuwać komórki nieneuronalne. Pokazujemy, że kultury są wzbogacone o neurony przy użyciu tego protokołu, co pozwala na dogłębne badanie reakcji neuronów na manipulację.

Wzbogacanie kultur neuronów zwojów zwojów korzenia grzbietowego dorosłych myszy za pomocą immunopanningu

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Ten artykuł przedstawia manipulację w leczeniu przewlekłego ucisku zwoju korzenia grzbietowego u szczurów za pomocą terapii Tuina, wraz z metodą oceny jej skuteczności na podstawie zachowania bólu i wyników histopatologicznych.

Przeciwbólowe działanie tuiny na modele szczurów z kompresją bólu zwoju korzenia grzbietowego

Obecny protokół opisuje praktyczną strategię przyspieszenia etapu weryfikacji współrzędnych iniekcji stereotaktycznej przed przeprowadzeniem śledzenia wirusa za pomocą barwników i zamrożonych skrawków.

Wstępna walidacja współrzędnych iniekcji stereotaktycznej za pomocą kriosekcji

Czubki korzeniowe grzbietowe (DRG) zawierają pierwotne ciała komórkowe neuronów czuciowych i przekazują obwodowe sygnały czuciowe do rdzenia kręgowego. Niniejszy protokół opisuje metodę rozpinania czupczyków korzeniowych grzbietowych u myszy, która wspiera standaryzowaną izolację strukturalnie nietkniętych czupczyków, identyfikację anatomiczną segmentów, intuicyjną instrukcję dla początkujących użytkowników oraz zmniejszone uszkodzenie tkanki podczas procedury.

Sekcja i odizolowanie klastrów czuciowych rdzenia kręgowego myszy

Naucz się techniki kriosekcji zwojów korzeni grzbietowych myszy w celu uzyskania płaskich, nieuszkodzonych preparatów do badań immunohistochemicznych. Ta metoda umożliwia niezawodne pozyskiwanie próbek do neurobiologii.

Procedura kriosekcji kriosekcji zwoju korzenia grzbietowego myszy

Przeglądaj więcej filmów