Procedura kriosekcji kriosekcji zwoju korzenia grzbietowego myszy
9 czerwca 2023
Prezentowany jest tutaj rozwój konsekwentnego pozyskiwania wysokiej jakości sekcji kriostatu zwoju korzenia grzbietowego.
Wyzwaniem pozostaje ciągłe uzyskiwanie wysokiej jakości, nienaruszonych i płaskich wycinków kriostatu zwojowego korzenia grzbietowego myszy. Badania mają na celu znalezienie odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób uzyskać idealny przekrój krystatu zwoju korzenia grzbietowego myszy. Protokół ten zapewnia łatwą technikę krok po kroku od sekcji kriostatu DRG myszy do wysokiej jakości, nienaruszonych i płaskich przekrojów DRG myszy.
W tym przedstawionym artykule wyjaśniono, jak usunąć otaczającą ciecz z tkanki próbki DRG myszy, umieszczając sekcje DRG na szkiełkach skierowanych w tę samą orientację i spłaszczając sekcje DRG bez zakrzywiania się w górę. Jednym z głównych wyzwań jest to, że sekcje OCT myszy DRG mają tendencję do zakrzywiania się w rzęd, co utrudnia umieszczenie ich na szklanym szkiełku. Trudno jest również uzyskać wystarczającą liczbę skrawków z jednej próbki ze względu na mały rozmiar DRG myszy.
Zacznij od utrwalenia tkanki DRG wyciętej z rdzenia kręgowego znieczulonej myszy w 4% formaldehydzie przez trzy godziny w temperaturze pokojowej. Następnie inkubuj tkankę w 30% sacharozie w PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie przygotuj bazowy OCT, dodając związek OCT i pokrywając górną powierzchnię bloku aluminiowego.
Zamroź pokryty blok aluminiowy w temperaturze 20 stopni Celsjusza na pięć do 10 minut. Odetnij górną część OCT o grubości 30 mikrometrów za pomocą kriostatu, aż jego powierzchnia będzie tak płaska jak podstawa OCT. Zaznacz spód podstawy OCT w pozycji godziny szóstej przed zdjęciem aluminiowego bloku z kriostatu.
Aby wykonać osadzanie DRG OCT, wysusz tkankę DRG, umieszczając ją na suchej szalce Petriego i przenosząc z jednego miejsca na drugie dwa lub trzy razy za pomocą suchej pęsety. Następnie umieść suchy DRG na podstawie OCT w pozycji godziny 12 za pomocą suchej pęsety. Upewnij się, że zachowana jest odległość co najmniej pięciu milimetrów między górną krawędzią DRG a górną krawędzią podstawy OCT, przy czym część grzbietowa znajduje się w pozycji godziny 12, a część brzuszna w pozycji godziny szóstej.
Następnie dodaj OCT w okrągłym lub owalnym kształcie, aby osadzić całą tkankę DRG z DRG pośrodku. Zamrozić próbkę OCT i DRG w temperaturze 20 stopni Celsjusza na pięć minut. Po zakończeniu odetnij górną część pokrywy OCT o grubości 30 mikrometrów, aż DRG będzie widoczny.
Kriosekcję należy rozpocząć od przytrzymania sekcji DRG o optymalnej temperaturze cięcia na dole za pomocą małego pędzelka schłodzonego w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Delikatnie dotknij dolnej części sekcji za pomocą końcówki pęsety o temperaturze pokojowej, tak aby przykleiła się do powierzchni platformy. Następnie powoli umieść naładowany szkiełko na sekcji.
Gdy tylko sekcja przyklei się do suwaka, delikatnie pociągnij suwak do tyłu. Wykonaj ten sam proces, aby umieścić więcej sekcji DRG na slajdzie bez nakładania się sekcji. Prawidłowe rozmieszczenie skrawków DRG na szkiełkach podstawowych jest widoczne tam, gdzie tkanki nie zachodzą na przekrój DRG i OCT innych odcinków DRG.
Obraz z konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej wykazał jakość przekrojów DRG uzyskanych za pomocą tego protokołu. Dzięki tej technice badania immunohistochemiczne DRG można przeprowadzać przy użyciu różnych przeciwciał.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół umożliwiający powtarzalne otrzymywanie wysokiej jakości przekrojów z kriostatu z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) z tkanki mysiej. Praca ta odnosi się do problemów związanych z integralnością i orientacją przekrojów, oferując technikę krok po kroku, która pozwala uzyskać płaskie, nienaruszone przekroje poprzeczne DRG, niezbędne do późniejszych badań immunohistochemicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Histologia
- Obróbka tkanek
Wstęp
- Przekroje zwojów korzeni grzbietowych są kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronów sensorycznych.
- Utrzymanie integralności i płaskości przekrojów stanowi powszechne wyzwanie.
- Niewłaściwe przygotowanie przekrojów może pogorszyć jakość analiz immunohistochemicznych.
- Niniejszy protokół ma na celu usprawnienie procesu pozyskiwania przekrojów DRG w celu uzyskania wiarygodnych wyników badań.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody uzyskiwania wysokiej jakości przekrojów zrazów grzbietowych (DRG) z modeli mysich.
- Zapewnienie przejrzystego protokołu dla badaczy napotykających trudności w przygotowaniu tkanek.
- Ułatwienie wykorzystania tych przekrojów w szczegółowych badaniach immunohistochemicznych.
Zastosowane metody
- W badaniu zastosowano metodę cięcia w kriotomacie dla tkanek zwojów korzeni grzbietowych myszy.
- Zwoje korzeni grzbietowe (DRG) myszy zostają wyizolowane i utrwalone pooperacyjnie w formaldehydzie, a następnie inkubowane w sacharozie w celu stabilizacji.
- Zatopienie w materiale odbywa się przy użyciu związku OCT (Optimal Cutting Temperature) w celu ułatwienia cięcia.
- Przekroje są wycinane przy grubości 30 µm i odpowiednio rozmieszczane na szkiełkach przedmiotowych.
- Badanie kładzie nacisk na kluczowe etapy pozwalające uzyskać płaskie i nieuszkodzone przekroje odpowiednie do obrazowania.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie rozwiązuje powszechny problem wyginania się skrawków podczas procesu zatapiania w OCT.
- Obrazy z konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej potwierdzają jakość otrzymanych skrawków.
- Metoda ta pozwala na uzyskanie wielu skrawków DRG z niewielkich próbek tkankowych bez ich nakładania się.
- Kluczowe wyniki podkreślają możliwość przygotowania skrawków DRG do różnorodnych zastosowań immunohistochemicznych.
Wnioski
- Badanie to pozwala badaczom na niezawodne pozyskiwanie wysokiej jakości przekrojów tkanki z zwojów korzeni grzbietowych (DRG), co ułatwia dalsze analizy neurobiologiczne.
- Ta ustandaryzowana metoda zwiększa potencjał do przeprowadzania szczegółowych badań nad neuronami czuciowymi i ich funkcjami.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia mechanizmów neuronalnych i zwiększają rygor eksperymentalny w powiązanych badaniach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Spójne przygotowanie wysokiej jakości kriosieków zwojów korzeni grzbietowych (DRG) myszy jest niezbędne do rzetelnego przeprowadzenia badań immunochemicznych oraz analiz RNAscope w badaniach nad bólem i neuropatią obwodową. Niezawodne cięcie preparatów ma bezpośredni wpływ na pewność wyników w dalszych analizach oraz w badaniach nad translacyjnymi biomarkerami. Niniejszy protokół rozwiązuje krytyczny problem w początkowych etapach odkryć i procesach przedklinicznych, umożliwiając powtarzalne przygotowanie próbek z niewielkich tkanek nerwowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną analizę szlaków neuronów sensorycznych istotnych dla bólu i stanów neuropatycznych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zapewnienie nienaruszonej architektury tkanki do badań mechanistycznych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dzięki wysokiej jakości przekrojom odpowiednim do detekcji z użyciem przeciwciał.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane przekroje zwojów korzeni grzbietowych (DRG) do standaryzowanych procedur immunohistochemii oraz RNAscope.
- Poprawia powtarzalność testów poprzez zapewnienie płaskiego, niewzajemnie nakładającego się rozmieszczenia tkanek na szkiełkach.
- Umożliwia uzyskanie ilościowych wyników obrazowania, które są kluczowe dla przesiewu związków i analizy fenotypowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje przygotowanie tkanek do modeli istotnych dla przebiegu choroby w badaniach nad biomarkerami translacyjnymi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez wspieranie spójnej jakości próbek.
- Zmniejsza ryzyko wystąpienia artefaktów technicznych, które mogłyby zaburzyć interpretację danych przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół kriosekcjonowania znajduje zastosowanie na styku wczesnych etapów odkrywania oraz badań przedklinicznych, wspierając procesy badawcze od weryfikacji hipotez, przez identyfikację wiodących kandydatów, aż po badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Dostarcza wiarygodne przekroje tkanek do analizy szlaków sygnałowych sterowanych hipotezami oraz walidacji celów terapeutycznych.
- Przesiewy: Zapewnia gotowe do analizy preparaty do powtarzalnego immunostainingu i ilościowej oceny obrazowej.
- Analityka: Umożliwia spójny pomiar markerów molekularnych i fenotypów komórkowych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów i wierność modeli chorobowych w badaniach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zestandaryzowany protokół, który można dostosować do innych małych typów tkanek, zwiększając efektywność międzyprogramową.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad tkanką nerwową.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przygotowanie próbek, poprawiając powtarzalność i skalowalność w ramach projektów.
- Wartość strategiczna: Umożliwia lepsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań poprzez minimalizację zmienności technicznej w krytycznych analizach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, zapewniając wiarygodne dane niezbędne do decyzji o dalszym rozwoju.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga specjalistycznej wiedzy w zakresie obsługi kriostatu i manipulacji małymi fragmentami tkanek.
- Wymaga dostępu do aparatury kriostatowej oraz infrastruktury obrazowania do późniejszych analiz.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności badań w różnych ośrodkach.
- Metoda może być dostosowana do innych typów małych tkanek o podobnych wymaganiach w zakresie obsługi.
- Ograniczona możliwość zastosowania w przypadku większych tkanek bez modyfikacji protokołu.
