Ex vivo Multimodalne obrazowanie oczu ludzkiego dawcy oparte na OCT do badań nad zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem
26 maja 2023
Testy laboratoryjne mogą wykorzystać wartość prognostyczną z multimodalnego obrazowania zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD) opartego na podłużnej optycznej tomografii koherentnej (OCT). Ludzkie oczy dawcy z AMD i bez AMD są obrazowane za pomocą OCT, koloru, skaningowej oftalmoskopii laserowej w bliskiej podczerwieni i autofluorescencji na dwóch długościach fal wzbudzenia przed sekcją tkanki.
Protokół ten umożliwia nowe metody leczenia i zapobiegania zwyrodnieniu plamki żółtej związanemu z wiekiem lub AMD. Jest to największa choroba z centralną neurodegeneracją, a mimo to uważamy, że jest najbardziej przystępna ze względu na precyzyjną strukturę oka i dostępność obrazowania klinicznego siatkówki na poziomie komórkowym. Powikłania neowaskularne choroby podstawowej AMD są skutecznie leczone od 15 lat u 15% pacjentów, którzy na nią cierpią.
Niedawno FDA zatwierdziła pierwszy lek stosowany w końcowym stadium choroby podstawowej. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki ujawniło repertuar molekularny ponad 100 typów komórek w siatkówce i wspierających naczyniówce. Śledzone przeze mnie optyczne tomografie koherentne (OCT) umożliwiły nam wgląd w szczegółową sekwencję progresji na poziomie komórkowym w klinice.
Istniejące systemy modeli komórkowych i zwierzęcych do badań nad AMD nie są w stanie przewidzieć patologii u ludzi i ryzyka progresji. Utrudnia to opracowywanie nowych metod leczenia i profilaktyki. Nasze laboratorium przyczyniło się do wielu najważniejszych ustaleń dotyczących AMD, w tym wczesnej utraty szerokich fotoreceptorów wymaganych do widzenia w nocy.
Zaobserwowano również, że lepiej zachowana plamka żółta z przyczepionymi siatkówkami neurosensorycznymi ma bezpośrednie znaczenie dla klinicznego obrazowania OCT. Wiele części patologii AMD stało się widocznych w klinicznym OCT, który pokazuje przekrojowe widoki siatkówki i naczyniówki. Wyniki OCT ludzkich oczu dawcy można bezpośrednio porównać z wynikami obrazowania klinicznego.
Gdyby laboratoria mogły naśladować standardy obrazowania klinicznego, wykorzystując OCT do charakteryzowania oczu lub testów oraz wyników laboratoryjnych, takich jak ekspresja genów lub proteomika, a także wykorzystywać podłużną oś czasu obrazowania klinicznego, aby skupić się na najbardziej informacyjnych wskaźnikach ryzyka. Na początek umieść całe kule odzyskane od dawcy oka na szalce Petriego wypełnionej woskiem. Po zminimalizowaniu zaburzeń pierścienia grubego ciała szklistego przyczepionego do ciała rzęskowego, należy usunąć resztki przedniego segmentu.
Po zaznaczeniu górnego bieguna w celu orientacji umieść kulę ziemską przednią stroną skierowaną w dół w naczyniu. Po znalezieniu przyczepów ścięgnistych dla mięśnia prostego górnego i mięśni skośnych górnych. Nałóż tusz do znakowania w linii 10 milimetrów w kierunku od przodu do tyłu za pomocą drewnianego aplikatora.
Napełnij grzyba zimnym buforem fosforanowym Sorensena przed fotografią. Włóż jednomilimetrowy rubinowy koralik do dna oka jako wewnętrzną podziałkę. Włóż tylny biegun gałki ocznej do 30-mililitrowego tygla kwarcowego za pomocą kleszczy.
Za pomocą lustrzanki jednoobiektywowej zamontowanej na mikroskopie stereoskopowym można uzyskiwać kolorowe obrazy za pomocą Trans-Epi i oświetlenia błyskowego przy trzech standardowych powiększeniach, aby uchwycić obrazy podkreślające określone obszary. Aby rozpocząć kolorową fotografię dna oka ex vivo, ustaw aparat z interfejsem multimedialnym o wysokiej rozdzielczości na ręczną funkcję ISO. Ustaw dwa źródła światła prostopadle do siebie i ustaw źródła światła epi-illumination na pełną moc.
W mikroskopie preparacyjnym włóż jednomilimetrowy koralik rubinowy do tylnego bieguna. Następnie włóż tylny biegun gałki ocznej do 30-mililitrowego tygla kwarcowego wypełnionego buforem. Gdy tkanka opadnie, należy umieścić usztywnienie między okiem a ścianą tygla.
Umieść kulę ziemską w tyglu na stoliku mikroskopu stereoskopowego, aby obserwować wewnętrzne dno oka przez mikroskop. Używając najmniejszego powiększenia, zorientuj oko, identyfikując znak tkankowy w pozycji 12:00, głowę nerwu wzrokowego i dołek pięć stopni poniżej głowy nerwu wzrokowego. Aby rozpocząć, włącz laserowy przyrząd do oftalmoskopii.
Ustaw głowicę OCT, przesuwając całe urządzenie i podnosząc jego wysokość. Ustaw ostrość obrazu, obracając pokrętło. Następnie zablokuj pozycję głowicy, przekręcając skrzydełkową.
Włóż próbkę oka do uchwytu. Ręcznie wyreguluj pozycję oka w uchwycie i ustabilizuj ją za pomocą przekładek bez wciskania twardówki. Ustaw uchwyt tak, aby był skierowany w stronę górnego mięśnia prostego do góry.
Po otwarciu autorskiego oprogramowania do wizualizacji i analizy dla urządzenia OCT, w lewej kolumnie pojawi się lista pacjentów indeksowana według wewnętrznego numeru kodu. Wybierz ikonę nowego pacjenta i uzupełnij informacje o pacjencie przed kliknięciem przycisku OK. Po zakończeniu wybierz operatora i badanie z menu rozwijanego. Po wyświetleniu pustego ekranu naciśnij żółty przycisk na panelu sterowania, aby rozpocząć akwizycję obrazu.
Wybierz IR OCT w module sterującym. Pozwól laserowi uzyskać obraz SLO na żywo dna oka i skan OCTB. Manipuluj głowicą lasera OCT, aby uzyskać względną pozycję i ustawić ostrość za pomocą czarnego pokrętła na urządzeniu.
Obróć okrągłą czarną tarczę na panelu sterowania, aby wyregulować intensywność. Użyj czarnego dysku, aby uzyskać średnią 100 klatek. Gdy dno oka jest już ostre, skan OCTB pojawia się w górnej 1/3 wyświetlacza.
Użyj kursora, aby przesunąć niebieską linię znajdującą się na obrazie dna oka, aby wyśrodkować dołek przed naciśnięciem przycisku Nabierz. Wybierz IR i ustawienie głośności w module sterującym, aby uzyskać woluminy OCT. Dostosuj wszystkie ustawienia sterowania OCT i skanowania.
Gdy widok dna oka odbicia w bliskiej podczerwieni zostanie pokryty niebieskimi liniami B-scan, ponownie sprawdź pozycję OCT w prawym górnym oknie i kliknij Acquire na module sterującym, aby zakończyć skanowanie woluminu. Po zakończeniu akwizycji obrazu wybierz opcję Zakończ, aby zapisać obraz. Po przetworzeniu obraz pojawi się na ekranie.
Aby rozpocząć skaningową oftalmoskopię laserową, należy przyłożyć gałkę oczną umieszczoną w uchwycie do skanującego oftalmoskopu laserowego. Na oftalmoskopie wybierz pozycję R. Następnie wybierz tryb IR, aby wyrównać i zorientować kulę ziemską.
Ustaw głowicę aparatu. Ustaw ostrość obrazu, obracając pokrętło. Obróć i zablokuj pozycję głowicy za pomocą skrzydełkowej.
Następnie ustaw czarną dźwignię w pozycji R. Po ustawieniu ostrości obrazu przesuń pokrętło wyboru z R na A.Wybierz ICGA, 100% intensywność, 30-stopniowe pole widzenia i obrazowanie jednofazowe. Po naciśnięciu czarnego dysku w celu uśrednienia wybierz opcję Pobierz. Obrazowanie ex vivo niepozornej plamki żółtej uzyskanej od dawcy ujawniło się w niepozornej plamce żółtej i hiporefleksyjnych dużych naczyniach naczyniówkowych.
Pomiędzy nimi znajduje się odblaskowy zespół RPE BBL Brooks Band. Multimodalne obrazowanie ex vivo plamki żółtej z wczesnym, pośrednim zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD) ujawniło zbliżenie dołka środkowego wykazujące przebarwienia odpowiadające zmianie witelowatej. We wczesnym, pośrednim AMD widoczne cechy obejmowały miękkie druzy z hiporefleksyjną linią u podstawy, hiporefleksyjne ognisko, podsiatkówkowe złogi druzenoidowe i zmiany w kształcie szklistości.
Podobnie badano plamkę żółtą z zanikowym AMD i plamkę żółtą z zanikiem plamki wtórnej do neowaskularnej AMD. Ponadto obrazowanie OCT ex vivo oczu dawcy ułatwiło badanie typowych artefaktów w tkankach pośmiertnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na wykorzystaniu optycznej koherentnej tomografii (OCT) do obrazowania związane z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej (AMD) w oczach ludzkich dawców. Poprzez zastosowanie różnych modalności obrazowania, w tym obrazowania kolorowego oraz refleksji w bliskiej podczerwieni, badanie ma na celu ujawnienie zmian patologicznych związanych z AMD, które wpływają na stan siatkówki i wzrok.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Oftalmologia
- Patologia
Wstęp
- AMD jest główną przyczyną centralnej neurodegeneracji.
- Kliniczne techniki obrazowania oferują szczegółowy wgląd w zmiany siatkówkowe.
- Obecne modele zwierzęce i komórkowe często nie pozwalają przewidzieć progresji AMD u ludzi.
- Ostatnie postępy obejmują zatwierdzenie nowych leków ukierunkowanych na późne stadium AMD.
Cel badania
- Walidacja OCT jako narzędzia do lepszego zrozumienia patologii AMD.
- Identyfikacja kluczowych wskaźników ryzyka progresji AMD za pomocą podłużnego obrazowania.
- Udoskonalenie testów laboratoryjnych poprzez emulację klinicznych standardów obrazowania.
Zastosowane metody
- Do obrazowania siatkówki wykorzystano OCT, obrazowanie kolorowe, refleksję w bliskiej podczerwieni oraz autofluorescencję.
- Jako model biologiczny wykorzystano gałki oczne od ludzkich dawców.
- Zdjęcia pozyskano i porównano z wynikami OCT w celu charakterystyki AMD.
- Zastosowano szczegółowe protokoły obejmujące przygotowanie próbek oraz procedury obrazowania.
Główne wyniki
- Kliniczna tomografia OCT skutecznie zwizualizowała progresję patologii AMD.
- W wynikach odnotowano wczesną utratę fotoreceptorów krytycznych dla widzenia.
- Wyniki wskazały na silne korelacje między obrazami OCT a rzeczywistym stanem siatkówki.
- Lepsza zachowalność plamki była powiązana z określonymi wynikami obrazowania OCT.
Wnioski
- Badanie wykazuje użyteczność OCT w rozwoju badań nad AMD.
- Wykorzystanie danych z obrazowania klinicznego sprawia, że podejście to ma potencjał do poprawy wyników leczenia.
- Wyniki podkreślają znaczenie precyzyjnego obrazowania w zrozumieniu chorób siatkówki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wielomodalowe obrazowanie ex vivo oparte na OCT oczu ludzkich dawców umożliwia bezpośrednie powiązanie wyników laboratoryjnych ze standardami obrazowania klinicznego w badaniach nad zwyrodnieniem plamki związanym z wiekiem (AMD). Podejście to niweluje lukę translacyjną między modelami przedklinicznymi a patologią ludzką, zwiększając pewność prognostyczną w zakresie walidacji celów terapeutycznych i stratyfikacji ryzyka. Integracja obrazowania klasy klinicznej z procesami badawczymi usprawnia podejmowanie decyzji dotyczących portfela projektów w obszarze neurodegeneracyjnych chorób oczu.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę patologii ludzkiej siatkówki w celu mechanistycznej redukcji ryzyka w AMD.
- Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez korelację wyników molekularnych z fenotypami obrazowania klinicznego.
- Zwiększa pewność prognostyczną dzięki wykorzystaniu obrazowania ex vivo do wyjaśnienia markerów progresji choroby.
Przesiew i opracowanie testu
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów tkankowych człowieka do dalszych analiz molekularnych i obrazowych.
- Standaryzuje wyniki obrazowania zgodnie z normami klinicznymi, co zwiększa powtarzalność i porównywalność testów.
- Umożliwia ilościową ocenę cech siatkówki, takich jak druzy, zanik oraz złogi podsiatkówkowe.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie obrazowania laboratoryjnego z punktami końcowymi klinicznymi, wspierając translacyjny rozwój biomarkerów w AMD.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez rejestrację objętości obrazowania ex vivo i in vivo.
- Minimalizuje ryzyko przy podejmowaniu decyzji o dalszym rozwoju, potwierdzając cechy istotne dla choroby w tkance ludzkiej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół obrazowania pozycjonuje analizę ludzkiego oka ex vivo jako pomost między wczesnym etapem odkryć a badaniami translacyjnymi w AMD, umożliwiając bezpośrednie porównanie danych obrazowych z laboratorium i kliniki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wizualizację patologii ludzkiej siatkówki w rozdzielczości komórkowej.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowane, ilościowe wyniki obrazowania w celu zapewnienia gotowości i powtarzalności testów.
- Analityka: Zapewnia pomiary o wysokiej zawartości informacji (high-content) cech siatkówki, umożliwiając wiarygodne porównania statystyczne pomiędzy poszczególnymi stadiami choroby.
- Badania translacyjne: Umożliwia dopasowanie biomarkerów i zachowanie ciągłości między laboratoryjnymi a klinicznymi zbiorami danych obrazowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku proces obrazowania, który można zastosować w różnych modelach chorób oczu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad AMD.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły obrazowania i zwiększa odtwarzalność wyników pomiędzy zespołami badawczymi.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i poprawia efektywność kapitałową poprzez koncentrację na klinicznie istotnych punktach końcowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i modeli do dalszego rozwoju z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu okulistycznym oraz przygotowywaniu tkanek w celu zapewnienia optymalnej konserwacji i analizy.
- Wymaga dostępu do zaawansowanej aparatury OCT i obrazowania multimodalnego wraz z oprogramowaniem analitycznym.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów obrazowania i metod rejestracji danych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do różnych modeli chorób oczu może wymagać modyfikacji protokołu w zależności od rodzaju tkanki i patologii.
- Jakość konserwacji oraz zarządzanie artefaktami są kluczowe dla wiarygodnej wizualizacji patomorfologicznej.
