Name: Ex vivo Multimodalne obrazowanie oczu ludzkiego dawcy oparte na OCT do badań nad zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Poznaj multimodalne obrazowanie OCT oczu dawców w badaniach nad zwyrodnieniem plamki żółtej. Ta metoda pozwala szczegółowo analizować zmiany patologiczne siatkówki i poprawiać wyniki leczenia AMD.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy firmie Heidelberg Engineering za oprzyrządowanie i projekt oryginalnego uchwytu na oko, dr Richardowi F. Spaide za wprowadzenie do obrazowania multimodalnego opartego na OCT, Christopherowi Girkinowi za ułatwienie dostępu do urządzeń do obrazowania klinicznego oraz Davidowi Fisherowi za rysunek 1. Odzyskanie ludzkich oczu dawcy do badań było wspierane przez granty National Institutes of Health (NIH) R01EY06019 (C.A.C.), P30 EY003039 (Pittler), R01EY015520 (Smith), R01EY027948 (C.A.C., T.A.) R01EY030192 (Li), R01EY031209 (Stambolian) i U54EY032442 (Spraggins), IZKF Würzburg (N-304, T.A.), EyeSight Foundation of Alabama, International Retinal Research Foundation (C.A.C.), Arnold and Mabel Beckman Initiative for Macular Research (C.A.C.) oraz Research to Prevent Blindness AMD Catalyst (Schey).

OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for AMD Research

C.A.C. otrzymuje wsparcie badawcze od Heidelberg Engineering i jest konsultantem dla firm Apellis, Astellas, Boehringer Ingelheim, Character Bioscience i Osanni. T.A. otrzymuje wsparcie badawcze od Novartis i konsultuje się z firmami Roche, Novartis, Bayer, Nidek i Apellis. K.B.F. jest konsultantem firm Genentech, Zeiss, Heidelberg Engineering, Allergan, Bayer i Novartis.

Stosując populacyjne badania przesiewowe w okresie 16 miesięcy w erze przed COVID, udało się pozyskać 75 oczu dawców z AMD. Wszystkie zostały odzyskane za pomocą krótkiego DtoP i zainscenizowane przy użyciu MMI zakotwiczonego w OCT. Kryterium wieku (>80 lat) wykracza poza typowy przedział wiekowy dla odzyskiwania tkanek przeznaczonych do przeszczepiania rogówki. Pomimo zaawansowanego wieku, nasze kryteria zaowocowały oczami we wszystkich stadiach AMD. Wiele fenotypów RPE jest wspólnych dla wszystkich stadiów AMD, a niekt...

Piętnaście lat leczenia neowaskularnego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD) za pomocą terapii anty-VEGF pod kierunkiem optycznej koherentnej tomografii (OCT) dostarczyło nowych informacji na temat sekwencji progresji i mikroarchitektury tej powszechnej przyczyny utraty wzroku. Kluczowym odkryciem jest to, że AMD jest trójwymiarową chorobą obejmującą siatkówkę neurosensoryczną, nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) i naczyniówkę. W wyniku obrazowania OCT pacjentów biorących udział w badaniu i innych oczu leczonych pacjentów klinicznych, cechy patologii wykraczające poza te widoczne na kolorowej fotografii dna oka, która jest standardem klinicznym od dziesięcioleci, są obecnie rozpoznawane. Należą do nich neowaskularyzacja śródsiatkówkowa (neowaskularyzacja plamki żółtej typu 31, dawniej proliferacja naczynioruchowa), podsiatkówkowe złogi druzenoidowe (SDD, zwane również siatkowatymi pseudodruzami)2, wiele ścieżek losu RPE3,4, oraz intensywnie glejowe komórki Müllera w atrofii5,6.
Modelowe systemy pozbawione plamek żółtych (komórek i zwierząt) odtwarzają niektóre wycinki tej złożonej choroby7,8,9. Dalsze sukcesy w łagodzeniu obciążenia AMD mogą wynikać z odkrycia i zbadania pierwotnej patologii w ludzkich oczach, zrozumienia unikalnego składu komórkowego plamki żółtej, a następnie translacji do systemów modelowych. Niniejszy raport przedstawia trwającą trzy dekady współpracę między akademickim laboratorium badawczym a bankiem oczu. Cele opisanych w niniejszym dokumencie metod charakterystyki tkanek są dwojakie: 1) informowanie o rozwijającej się technologii diagnostycznej poprzez zademonstrowanie podstaw wyglądu dna oka i źródeł sygnału obrazowania za pomocą mikroskopii oraz 2) klasyfikacja próbek AMD do celowanych (immunohistochemia) i niecelowanych technik odkrywania molekularnego (obrazowanie spektrometrii mas, IMS i transkryptomika przestrzenna), które zachowują dołek tylko stożek oraz bogatą w pręciki para- i peryfoveę. Takie badania mogą przyspieszyć translację na kliniczny OCT, w przypadku którego możliwa jest sekwencja progresji i obserwacja podłużna dzięki śledzeniu wzroku. Ta technologia, która została zaprojektowana do monitorowania efektów leczenia, rejestruje skany z jednej wizyty klinicznej na drugą za pomocą naczyń siatkówki. Powiązanie OCT śledzonego ruchem gałek ocznych z wynikami laboratoryjnymi uzyskanymi za pomocą technik destrukcyjnych może zapewnić nowy poziom wartości prognostycznej dla wyników badań molekularnych.
W 1993 roku laboratorium badawcze wykonało kolorowe zdjęcia pośmiertnego dna oka na kliszy10. Wysiłek ten został zainspirowany znakomitą fotomikroskopią i histologią ludzkiej siatkówki obwodowej przeprowadzoną przez Foosa i współpracowników11,12,13 oraz rozległe korelacje kliniczno-patologiczne AMD przeprowadzone przez Sarks et al.14,15. Począwszy od 2009 r., przyjęto obrazowanie multimodalne ex vivo (MMI) zakotwiczone w domenie spektralnej OCT. To przejście zostało zainspirowane podobnymi wysiłkami innych16,17, a zwłaszcza uświadomieniem sobie, że tak wiele ultrastruktury opisanej przez Sarków było z czasem dostępne w trzech wymiarach w clinic18,19. Celem było pozyskanie oczu z przyczepioną plamką żółtą w rozsądnym czasie w celu przeprowadzenia dobrze zasilanych badań fenotypów na poziomie komórkowym w siatkówce, RPE i naczyniówce. Intencją było wyjście poza statystyki "na oko" do "typu zmiany", standardu, na który wpływ miały koncepcje "wrażliwej płytki nazębnej" z chorób sercowo-naczyniowych20,21.
Protokół w tym raporcie odzwierciedla doświadczenia z prawie 400 parami oczu dawcy pobranych w kilku strumieniach. W latach 2011-2014 powstała strona internetowa projektu MACULA poświęcona histopatologii AMD, która zawiera grubości warstw i adnotacje ze 142 archiwalnych próbek. Oczy te zachowały się w latach 1996-2012 w utrwalaczu aldehydu glutarowego i paraformaldehydu do wysokorozdzielczej histologii żywicy epoksydowej i mikroskopii elektronowej. Wszystkie dno zostało sfotografowane w kolorze po otrzymaniu i zostało ponownie zobrazowane przez OCT tuż przed histologią. Uchwyt na oko pierwotnie zaprojektowany do badań nerwu wzrokowego22 został użyty do umieszczenia stempla tkankowego o pełnej grubości o średnicy 8 mm wyśrodkowanego na dołku środkowym. Skany OCT B przez centrum dołka i miejsce o 2 mm wyższe, odpowiadające histologii na tych samych poziomach, zostały przesłane na stronę internetową, wraz z kolorowym zdjęciem dna oka. Wybór płaszczyzn OCT był podyktowany rozpowszechnieniem patologii AMD w klasie fovea<sup="xref">23 oraz widocznością SDD w obszarach bogatych w pręciki, wyższych niż fovea24,25.
Począwszy od 2013 roku, oczy obrazowane za pomocą MMI zakotwiczonego w OCT za życia były dostępne dla bezpośrednich korelacji kliniczno-patologicznych. Większość (7 z 10 dawców) dotyczyła pacjentów w przychodni skierowanej do siatkówki (autor: K.B.F.), która oferowała zaawansowany rejestr dyrektyw dla pacjentów zainteresowanych oddaniem swoich oczu po śmierci do celów badawczych. Oczy zostały odzyskane i zakonserwowane przez lokalny bank oczu, przeniesione do laboratorium i przygotowane w taki sam sposób, jak oczy w ramach Projektu MACULA. Przedśmiertne kliniczne tomy OCT zostały bezproblemowo odczytane w laboratorium, dopasowując w ten sposób cechy patologiczne obserwowane za życia do cech widocznych pod mikroskopem26.
Począwszy od 2014 roku, prospektywne pobieranie oczu rozpoczęło się od badań przesiewowych w kierunku AMD w oczach dawców bez historii klinicznej, ale zachowanych przez określony limit czasu (6 godzin). W tym celu uchwyt na oko został zmodyfikowany tak, aby pomieścić cały globus. Zmniejszyło to szansę na odklejenie się wokół przyciętych krawędzi wcześniej używanego stempla 8 mm. Oczy zakonserwowano w 4% buforowanym paraformaldehydzie do celów immunohistochemicznych i przeniesiono do 1% następnego dnia w celu długotrwałego przechowywania. W latach 2016-2017 (przed pandemią) odzyskano 184 oczy od 90 dawców. Statystyki i obrazy w tym raporcie są generowane na podstawie tej serii. W erze pandemii (lockdowny w 2020 r. i ich następstwa) prospektywne gromadzenie danych na potrzeby transkryptomiki i współpracy IMS było kontynuowane w ograniczonym tempie, zasadniczo przy użyciu metod z 2014 r.
Dostępne są inne metody oceny oka dawcy. System oceniania stanu Minnesota (MGS)27,28 jest oparty na systemie klinicznym AREDS do kolorowej fotografii dna oka29. Do ograniczeń tej metody należy połączenie atroficznego i neowaskularnego AMD w jedno stadium "późnego AMD". Ponadto MGS pociąga za sobą usunięcie siatkówki neurosensorycznej przed fotodokumentacją naczyniówki RPE. Ten krok usuwa SDD w różnym stopniu30,31 i usuwa przestrzenną korespondencję zewnętrznej siatkówki i jej systemu nośnego. W związku z tym wysiłki zmierzające do powiązania zapotrzebowania metabolicznego i sygnalizacji z siatkówki z patologią w naczyniówce RPE mogą być utrudnione. System Utah wdrożył MMI przy użyciu kolorowej fotografii ex vivo i OCT do kategoryzacji oczu przeznaczonych do sekcji na regiony do ekstrakcji RNA i białek32. Chociaż jest to preferowane w przypadku ekstrakcji całej muszli ocznej, obszar o średnicy 3 mm jest najbardziej narażony na progresję AMD33,34 reprezentuje tylko 25% stempla o średnicy 6 mm wyśrodkowanego na dołku. W związku z tym korzystne są techniki, które mogą lokalizować wyniki w odniesieniu do dołka centralnego, takie jak seryjne sekcje immunohistochemiczne.

<table><tbody><tr><td>Zlewki, butelki 250 ml</td><td>Fisher</td><td># 02-540K</td><td></td></tr><tr><td>, 1 l, Pyrex&nbsp;</td><td>Fisher</td><td># 10-462-719</td><td>schowek na konserwant</td></tr><tr><td>Palnik Bunsena lub źródło ciepła</td><td>Eisco</td><td># 17-12-818</td><td>Do topienia wosku</td></tr><tr><td>Aparat, cyfrowy</td><td>Nikon D7200</td><td>D7200</td><td></td></tr><tr><td>Komputer i pamięć masowa</td><td>Apple</td><td>iMac Pro; Zewnętrzny dysk twardy 14 TB</td><td>Przechowywanie obrazów</td></tr><tr><td>Pojemnik, izolowany</td><td>Fisher</td><td># 02-591-45</td><td>Do mokrego lodu</td></tr><tr><td>Pojemniki, 2 na dawcę, 40 ml</td><td>Fisher</td><td>Sameco Bio-Tite&nbsp; 40 ml # 13-711-86</td><td>Do konserwantu</td></tr><tr><td>Tygiel, kwarcowy 30 ml</td><td>Fisher</td><td># 08-072D</td><td>Trzymaj globus do fotografii</td></tr><tr><td>Butla, podziałka, 250 ml</td><td>Fisher</td><td># 08-549G</td><td></td></tr><tr><td>Środki czyszczące do dezynfekcji&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>https://www.cardinalhealth.com/en/product-solutions/medical/infection-control/antiseptics.html</td></tr><tr><td>Uchwyt na oko z soczewką i uchwytem montażowym</td><td>kontakt J. Messinger</td><td>jeffreymessinger@uabmc.edu</td><td>niestandardową modyfikacją oryginalnego projektu Heidelberg Engineering</td></tr><tr><td>Maski ochronne</td><td>na twarz Fisher</td><td># 19-910-667</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze, Harmon Fix</td><td>Roboz&nbsp;</td><td># RS-8247</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze, Micro Adson</td><td>Roboz&nbsp;</td><td># RS-5232</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze, Tissue</td><td>Roboz</td><td># RS-5172</td><td></td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego, Kimax</td><td>Fisher</td># <td>23064</td><td></td></tr><tr><td>Rękawice Diamond Grip</td><td>Fisher</td><td># MF-300</td><td></td></tr><tr><td>Fartuchy GenPro</td><td>Fisher</td><td># 19-166-116</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do edycji obrazów</td><td>Adobe</td><td>Photoshop 2021, Creative Suite</td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Fisher</td><td># 06-666</td><td></td></tr><tr><td>Lampy, 3 gęsia szyja</td><td>Schott Imaging</td><td># A20800</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop, stereo</td><td>Nikon</td><td>SMZ 1000</td><td>do mikroskopu preparacyjnego</td></tr><tr><td>, stereo</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>SZX9</td><td>kolorowa fotografia dna oka</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 20%&nbsp;</td><td>EMS</td><td># 15713-S</td><td>dla środka konserwującego; rozcieńczony do przechowywania</td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Fisher&nbsp;</td><td># 01-913-806</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy, Sorenson' s, 0,2 M pH 7,2&nbsp;</td><td>EMS#</td> <td>11600-10</td><td></td></tr><tr><td>Lampa pierścieniowa</td><td>B & H Zdjęcie Wideo</td><td>Sigma EM-140 DG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Koralik rubinowy, średnica 1 mm</td><td>Meller Optics</td><td># MRB10MD</td><td></td></tr><tr><td>Okulary ochronne 3M</td><td>Fisher</td><td># 19-070-940</td><td></td></tr><tr><td>Skanujący oftalmoskop laserowy</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>HRA2</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki, zakrzywiona sprężyna</td><td>Roboz</td><td># RS-5681</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik na ostre przedmioty</td><td>Fisher</td><td># 1482763</td><td></td></tr><tr><td>Przewód migawkowy, zdalne</td> urządzenie <td>Nikon</td><td>MC-DC2</td><td></td></tr><tr><td>Spectral Domain OCT</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis HRA& OCT</td><td>https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf</td></tr><tr><td>Łożysko kulkowe ze stali nierdzewnej, średnica 25,4 mm</td><td>McMaster-Carr</td><td># 9529K31</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik do znakowania tkanek,</td><td>Cancer Diagnostics Inc</td><td># 0727-1</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza do krajalnicy tkanek</td><td>Thomas Scientific</td><td># 6767C18</td><td></td></tr><tr><td>Trephine, </td><td>Monitor telewizyjny Stratis Healthcare</td><td># 6718L</td><td></td>o średnicy 18 mm</tr><tr><td>(HDMI) i przewód do aparatu cyfrowego</td><td>B& H Photo Video</td><td>BH # COHD18G6PROB</td><td>do podglądu na żywo i zdalnego wyświetlania kamer</td></tr><tr><td>Wosk, różowy stomatologiczny</td><td>EMS&nbsp;</td><td># 72670</td><td></td></tr><tr><td>Aplikatory drewniane</td><td>Puritan</td><td># 807-12</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo multimodalne obrazowanie oczu ludzkiego dawcy oparte na oct do badań nad zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

Sekwencja progresji zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD) wyuczona na podstawie optycznej koherentnej tomografii (OCT) multimodalnego obrazowania klinicznego (MMI) może dodać wartość prognostyczną do wyników laboratoryjnych. W niniejszej pracy OCT i MMI ex vivo zastosowano do ludzkich oczu dawcy przed sekcją tkanki siatkówki. Oczy pobrano od białych dawców bez cukrzycy w wieku ≥80 lat, z czasem od śmierci do zachowania (DtoP) wynoszącym ≤6 godzin. Kule zostały odzyskane na miejscu, nacięte trepanacją o średnicy 18 mm w celu ułatwienia usunięcia rogówki i zanurzone w buforowanym 4% paraformaldehydzie. Kolorowe obrazy dna oka uzyskano po usunięciu przedniego odcinka za pomocą lunety sekcyjnej i lustrzanki jednoobiektywowej przy użyciu oświetlenia trans-, epi i flash przy trzech powiększeniach. Kule umieszczono w buforze w specjalnie zaprojektowanej komorze z soczewką o średnicy 60 dioptrii. Zostały one zobrazowane za pomocą OCT w domenie widmowej (sześcian plamki żółtej 30°, odstęp 30 μm, uśrednienie = 25), współczynnika odbicia w bliskiej podczerwieni, autofluorescencji 488 nm i autofluorescencji 787 nm. Oczy AMD wykazały zmianę w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE), z druzami lub podsiatkówkowymi złogami druzenoidowymi (SDD), z neowaskularyzacją lub bez niej i bez dowodów na inne przyczyny. Między czerwcem 2016 r. a wrześniem 2017 r. odzyskano 94 prawe oko i 90 lewe oko (DtoP: 3,9 ± 1,0 h). Spośród 184 oczu 40,2% miało AMD, w tym wczesne pośrednie (22,8%), zanikowe (7,6%) i neowaskularne (9,8%) AMD, a 39,7% miało niewyróżniające się plamki żółte. Druzy, SDD, ogniska hiperrefleksyjne, atrofia i blizny włóknisto-naczyniowe zostały zidentyfikowane za pomocą OCT. Artefakty obejmowały zmętnienie tkanek, odwarstwienia (bakcylarne, siatkówkowe, RPE, naczyniówkowe), torbielowate zmiany dołka, pofałdowane RPE i uszkodzenia mechaniczne. Aby pokierować kriosekcją, wykorzystano objętości OCT w celu znalezienia punktów orientacyjnych dołka środkowego i głowy nerwu wzrokowego oraz określonych patologii. Objętości ex vivo zarejestrowano z objętościami in vivo poprzez wybór funkcji referencyjnej do śledzenia ruchu gałek ocznych. Widoczność ex vivo patologii obserwowanej in vivo zależy od jakości zachowania. W ciągu 16 miesięcy 75 szybkich oczu dawcy DtoP we wszystkich stadiach AMD zostało odzyskanych i sklasyfikowanych pod kątem zaawansowania przy użyciu klinicznych metod MMI.

Tabela 1 pokazuje, że w latach 2016-2017 pobrano 184 gałki oczne od 94 białych dawców bez cukrzycy w wieku &gt;80 lat. Średni czas od śmierci do konserwacji wynosił 3,9 h (zakres: 2,0-6,4 h). Z 184 ocenionych oczu 75 (40,2%) wykazywało pewne AMD. Zidentyfikowano następujące kategorie: bez zmian (39,7%), wątpliwe (11,4%), wczesne-pośrednie AMD (22,8%), zanikowe (7,6%), naczyniowe (9,8%), inne (8,7%) oraz nieznane/niezarejestrowane/niemożliwe do oceny (&lt;1%). Rysunek 2, <str...

Testy laboratoryjne mogą wykorzystać wartość prognostyczną z multimodalnego obrazowania zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (AMD) opartego na podłużnej optycznej tomografii koherentnej (OCT). Ludzkie oczy dawcy z AMD i bez AMD są obrazowane za pomocą OCT, koloru, skaningowej oftalmoskopii laserowej w bliskiej podczerwieni i autofluorescencji na dwóch długościach fal wzbudzenia przed sekcją tkanki.

Ex vivo Multimodalne obrazowanie oczu ludzkiego dawcy oparte na OCT do badań nad zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...

Protokół ten umożliwia nowe metody leczenia i zapobiegania zwyrodnieniu plamki żółtej związanemu z wiekiem lub AMD. Jest to największa choroba z centralną neurodegeneracją, a mimo to uważamy, że jest najbardziej przystępna ze względu na precyzyjną strukturę oka i dostępność obrazowania klinicznego siatkówki na poziomie komórkowym. Powikłania neowaskularne choroby podstawowej AMD są skutecznie leczone od 15 lat u 15% pacjentów, którzy na nią cierpią.Niedawno FDA zatwierdziła pierwszy lek stosowany w końcowym stadium choroby podstawowej. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki ujawniło repertuar molekularny ponad 100 typów komórek w siatkówce i wspierających naczyniówce. Śledzone przeze mnie optyczne tomografie koherentne (OCT) umożliwiły nam wgląd w szczegółową sekwencję progresji na poziomie komórkowym w klinice.Istniejące systemy modeli komórkowych i zwierzęcych do badań nad AMD nie są w stanie przewidzieć patologii u ludzi i ryzyka progresji. Utrudnia to opracowywanie nowych metod leczenia i profilaktyki. Nasze laboratorium przyczyniło się do wielu najważniejszych ustaleń dotyczących AMD, w tym wczesnej utraty szerokich fotoreceptorów wymaganych do widzenia w nocy.Zaobserwowano również, że lepiej zachowana plamka żółta z przyczepionymi siatkówkami neurosensorycznymi ma bezpośrednie znaczenie dla klinicznego obrazowania OCT. Wiele części patologii AMD stało się widocznych w klinicznym OCT, który pokazuje przekrojowe widoki siatkówki i naczyniówki. Wyniki OCT ludzkich oczu dawcy można bezpośrednio porównać z wynikami obrazowania klinicznego.Gdyby laboratoria mogły naśladować standardy obrazowania klinicznego, wykorzystując OCT do charakteryzowania oczu lub testów oraz wyników laboratoryjnych, takich jak ekspresja genów lub proteomika, a także wykorzystywać podłużną oś czasu obrazowania klinicznego, aby skupić się na najbardziej informacyjnych wskaźnikach ryzyka. Na początek umieść całe kule odzyskane od dawcy oka na szalce Petriego wypełnionej woskiem. Po zminimalizowaniu zaburzeń pierścienia grubego ciała szklistego przyczepionego do ciała rzęskowego, należy usunąć resztki przedniego segmentu.Po zaznaczeniu górnego bieguna w celu orientacji umieść kulę ziemską przednią stroną skierowaną w dół w naczyniu. Po znalezieniu przyczepów ścięgnistych dla mięśnia prostego górnego i mięśni skośnych górnych. Nałóż tusz do znakowania w linii 10 milimetrów w kierunku od przodu do tyłu za pomocą drewnianego aplikatora.Napełnij grzyba zimnym buforem fosforanowym Sorensena przed fotografią. Włóż jednomilimetrowy rubinowy koralik do dna oka jako wewnętrzną podziałkę. Włóż tylny biegun gałki ocznej do 30-mililitrowego tygla kwarcowego za pomocą kleszczy.Za pomocą lustrzanki jednoobiektywowej zamontowanej na mikroskopie stereoskopowym można uzyskiwać kolorowe obrazy za pomocą Trans-Epi i oświetlenia błyskowego przy trzech standardowych powiększeniach, aby uchwycić obrazy podkreślające określone obszary. Aby rozpocząć kolorową fotografię dna oka ex vivo, ustaw aparat z interfejsem multimedialnym o wysokiej rozdzielczości na ręczną funkcję ISO. Ustaw dwa źródła światła prostopadle do siebie i ustaw źródła światła epi-illumination na pełną moc.W mikroskopie preparacyjnym włóż jednomilimetrowy koralik rubinowy do tylnego bieguna. Następnie włóż tylny biegun gałki ocznej do 30-mililitrowego tygla kwarcowego wypełnionego buforem. Gdy tkanka opadnie, należy umieścić usztywnienie między okiem a ścianą tygla.Umieść kulę ziemską w tyglu na stoliku mikroskopu stereoskopowego, aby obserwować wewnętrzne dno oka przez mikroskop. Używając najmniejszego powiększenia, zorientuj oko, identyfikując znak tkankowy w pozycji 12:00, głowę nerwu wzrokowego i dołek pięć stopni poniżej głowy nerwu wzrokowego. Aby rozpocząć, włącz laserowy przyrząd do oftalmoskopii.Ustaw głowicę OCT, przesuwając całe urządzenie i podnosząc jego wysokość. Ustaw ostrość obrazu, obracając pokrętło. Następnie zablokuj pozycję głowicy, przekręcając skrzydełkową.Włóż próbkę oka do uchwytu. Ręcznie wyreguluj pozycję oka w uchwycie i ustabilizuj ją za pomocą przekładek bez wciskania twardówki. Ustaw uchwyt tak, aby był skierowany w stronę górnego mięśnia prostego do góry.Po otwarciu autorskiego oprogramowania do wizualizacji i analizy dla urządzenia OCT, w lewej kolumnie pojawi się lista pacjentów indeksowana według wewnętrznego numeru kodu. Wybierz ikonę nowego pacjenta i uzupełnij informacje o pacjencie przed kliknięciem przycisku OK. Po zakończeniu wybierz operatora i badanie z menu rozwijanego. Po wyświetleniu pustego ekranu naciśnij żółty przycisk na panelu sterowania, aby rozpocząć akwizycję obrazu.Wybierz IR OCT w module sterującym. Pozwól laserowi uzyskać obraz SLO na żywo dna oka i skan OCTB. Manipuluj głowicą lasera OCT, aby uzyskać względną pozycję i ustawić ostrość za pomocą czarnego pokrętła na urządzeniu.Obróć okrągłą czarną tarczę na panelu sterowania, aby wyregulować intensywność. Użyj czarnego dysku, aby uzyskać średnią 100 klatek. Gdy dno oka jest już ostre, skan OCTB pojawia się w górnej 1/3 wyświetlacza.Użyj kursora, aby przesunąć niebieską linię znajdującą się na obrazie dna oka, aby wyśrodkować dołek przed naciśnięciem przycisku Nabierz. Wybierz IR i ustawienie głośności w module sterującym, aby uzyskać woluminy OCT. Dostosuj wszystkie ustawienia sterowania OCT i skanowania.Gdy widok dna oka odbicia w bliskiej podczerwieni zostanie pokryty niebieskimi liniami B-scan, ponownie sprawdź pozycję OCT w prawym górnym oknie i kliknij Acquire na module sterującym, aby zakończyć skanowanie woluminu. Po zakończeniu akwizycji obrazu wybierz opcję Zakończ, aby zapisać obraz. Po przetworzeniu obraz pojawi się na ekranie.Aby rozpocząć skaningową oftalmoskopię laserową, należy przyłożyć gałkę oczną umieszczoną w uchwycie do skanującego oftalmoskopu laserowego. Na oftalmoskopie wybierz pozycję R. Następnie wybierz tryb IR, aby wyrównać i zorientować kulę ziemską.Ustaw głowicę aparatu. Ustaw ostrość obrazu, obracając pokrętło. Obróć i zablokuj pozycję głowicy za pomocą skrzydełkowej.Następnie ustaw czarną dźwignię w pozycji R. Po ustawieniu ostrości obrazu przesuń pokrętło wyboru z R na A.Wybierz ICGA, 100% intensywność, 30-stopniowe pole widzenia i obrazowanie jednofazowe. Po naciśnięciu czarnego dysku w celu uśrednienia wybierz opcję Pobierz. Obrazowanie ex vivo niepozornej plamki żółtej uzyskanej od dawcy ujawniło się w niepozornej plamce żółtej i hiporefleksyjnych dużych naczyniach naczyniówkowych.Pomiędzy nimi znajduje się odblaskowy zespół RPE BBL Brooks Band. Multimodalne obrazowanie ex vivo plamki żółtej z wczesnym, pośrednim zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD) ujawniło zbliżenie dołka środkowego wykazujące przebarwienia odpowiadające zmianie witelowatej. We wczesnym, pośrednim AMD widoczne cechy obejmowały miękkie druzy z hiporefleksyjną linią u podstawy, hiporefleksyjne ognisko, podsiatkówkowe złogi druzenoidowe i zmiany w kształcie szklistości.Podobnie badano plamkę żółtą z zanikowym AMD i plamkę żółtą z zanikiem plamki wtórnej do neowaskularnej AMD. Ponadto obrazowanie OCT ex vivo oczu dawcy ułatwiło badanie typowych artefaktów w tkankach pośmiertnych.

ex-vivo-oct-based-multimodal-imaging-human-donor-eyes-for-research

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Angiografia z zieleni indocyjaninowej (lub ICGA) wykonywana przez wstrzyknięcie żyły ogonowej dostarcza wysokiej jakości obrazów przebiegu czasu ICGA do scharakteryzowania nieprawidłowości w naczyniówce myszy.

Wykrywanie nieprawidłowości w unaczynieniu naczyniówki w mysim modelu zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem za pomocą zielonej angiografii indocyjaniny w czasie

Identyfikacja białek specyficznie związanych z błoną Brucha w ludzkich oczach jest ważnym krokiem w zrozumieniu biochemicznych mechanizmów stojących za chorobami oczu, takimi jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wzbogacić ten arkusz macierzy zewnątrzkomórkowej do dalszej analizy biochemicznej.

Wzbogacenie błony Brucha z ludzkich oczu dawcy

Tutaj demonstrujemy nowatorskie podejście do wykorzystania wysokiej rozdzielczości optycznej koherentnej tomografii spektralnej (HR-SD-OCT) do wspomagania dostarczania środków terapii genowej do przestrzeni podsiatkówkowej, oceny jej zasięgu powierzchniowego i charakteryzowania żywotności fotoreceptorów.

Optyczna koherentna tomografia myszy o ultrawysokiej rozdzielczości wspomagająca wstrzyknięcie do gałki ocznej w badaniach nad terapią genową siatkówki

Celem tego badania jest ocena, czy nadnaczyniówkowy przeszczep komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej zawartych we frakcji naczyniowej zrębu i płytek krwi pochodzących z osocza bogatopłytkowego za pomocą Techniki Odbudowy Siatkówki Limoli może poprawić ostrość wzroku i wrażliwość siatkówki w oczach dotkniętych suchym, związanym z wiekiem zwyrodnieniem plamki żółtej.

Terapia regeneracyjna za pomocą autoprzeszczepu komórek nadnaczyniówkowych w suchym zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem: wstępny raport in vivo

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Celem tego protokołu jest pokazanie hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) na starzejącej się i/lub chorej ludzkiej błonie Brucha. Ta metoda jest odpowiednia do badania zachowania komórek RPE na uszkodzonej macierzy zewnątrzkomórkowej.

Hodowla komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na modelu ex vivo starzejącej się błony błony mięśniowej człowieka

Tutaj opisujemy użycie optycznej koherentnej tomografii spektralnej (SD-OCT) do wizualizacji struktur siatkówki i oka in vivo w modelach zwyrodnienia siatkówki, jaskry, retinopatii cukrzycowej i krótkowzroczności.

Strukturalne oceny in vivo chorób oczu w modelach gryzoni przy użyciu optycznej koherentnej tomografii

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Niniejszy artykuł opisuje metodę, za pomocą której można naśladować in vivo opracowanie Muszka owocówka ciało grzybowate w ex vivo system...

Hodowla ex vivo całych, rozwijających się mózgów Drosophila

W niniejszej pracy opracowujemy narzędzia niezbędne do obrazowania żywych komórek ex vivo w celu śledzenia podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy w stadium...

Ex vivo obrazowanie na żywo podziałów pojedynczych komórek w neuroepitelium myszy

Poznaj multimodalne obrazowanie OCT oczu dawców w badaniach nad zwyrodnieniem plamki żółtej. Ta metoda pozwala szczegółowo analizować zmiany patologiczne siatkówki i poprawiać wyniki leczenia AMD.

Ex vivo Multimodalne obrazowanie oczu ludzkiego dawcy oparte na OCT do badań nad zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem (Wideo) | JoVE Journal

Ex vivo Multimodalne obrazowanie oczu ludzkiego dawcy oparte na OCT do badań nad zwyrodnieniem plamki żółtej związanym z wiekiem

Przeglądaj więcej filmów