Wielokanałowy zapis zewnątrzkomórkowy w swobodnie poruszających się myszach
26 maja 2023
Protokół opisuje metodologię zewnątrzkomórkowego zapisu w korze ruchowej (MC) w celu ujawnienia zewnątrzkomórkowych właściwości elektrofizjologicznych u swobodnie poruszających się świadomych myszy, a także analizę danych lokalnych potencjałów pola (LFP) i skoków, co jest przydatne do oceny aktywności neuronalnej sieci leżącej u podstaw interesujących zachowań.
Naszym celem jest odkrycie właściwości neuronalnych odpalania i sieciowych potencjałów pola lokalnego u zachowujących się myszy, wykonujących określone zadania poprzez korelację sygnału elektrofizjologicznego z zachowaniami. Wykazano, że wielokanałowy zapis zewnątrzkomórkowy za pomocą systemu microdrive jest odpowiednią i wydajną technologią dla średniej aktywności neuronalnej podczas testów behawioralnych. Nagrywanie wielokanałowe u swobodnie poruszających się myszy zostało uznane za przydatną technologię w badaniach neurobiologicznych, ale nadal jest dość trudne dla początkujących, aby uzyskać i przeanalizować te sygnały.
Przedstawiliśmy, jak wykonać wielokanałowy zapis zewnątrzkomórkowy u swobodnie poruszających się myszy z bardziej stabilnym i lekkim systemem mikronapędów oraz zoptymalizować procesy nagrywania i analizy danych dla początkujących. W nowej wersji zamierzamy zwiększyć liczbę kanałów i zmniejszyć głośność systemu mikrosterowników. Zacznij od montażu systemu mikronapędu.
Połącz dwie zaprojektowane komputerowo płytki za pomocą dwóch czaszek i przytrzymującej ruchomy mikrodysk i przymocuj złącze do jednej płytki. Upewnij się, że mikronapęd może przenosić dwa zestawy po osiem rurek prowadzących z każdej strony kory ruchowej lub obszaru MC. Przytnij rurki prowadzące na tę samą długość.
Wytnij 16 drutów nichromowych, z których każdy ma około pięciu centymetrów długości i 35 mikrometrów średnicy. Załaduj przewody do rurek prowadzących i nałóż klej, aby je zamocować. Zdejmij izolację przewodu i zwiń każdy odsłonięty przewód do każdego styku ze złącza, postępując zgodnie z mapą kanałów oraz elektrodami odniesienia i uziemiającymi.
Następnie powoli pokryj przewodzącą farbę na każdym szpilce. Przykryj kołki żywicą epoksydową, a następnie wykonaj złocenie za pomocą testera impedancji, aby zmniejszyć impedancję końcówek elektrod do około 350 kiloomów. W celu wszczepienia matrycy elektrod zamocuj znieczuloną mysz w aparacie stereotaktycznym i użyj regulatora temperatury, aby utrzymać temperaturę w odbycie na poziomie 37 stopni Celsjusza.
Następnie wykonaj małe nacięcie w linii środkowej, aby odsłonić czaszkę. Usuń resztki tkanki za pomocą nożyczek i oczyść czaszkę sterylnymi patyczkami kosmetycznymi nasączonymi solą fizjologiczną. Za pomocą szklanej mikroelektrody wypełnionej tuszem zaznacz żądane miejsca obustronnego MC do implantacji.
Następnie, za pomocą wiertła do czaszki, ostrożnie wywierć dwa małe otwory po lewej i prawej stronie skoordynowanej czaszki w obszarach MC. Delikatnie wyjmij oponę twardą z otworów za pomocą drobnych kleszczyków. Następnie włóż system mikronapędu do środka otworów za pomocą mikromanipulatora z prędkością 10 mikrometrów na sekundę.
Po zakończeniu wkładania wlej wazelinę do ścianek cementu dentystycznego i połącz dolną płytę systemu mikronapędu oraz ściany cementu dentystycznego z mieszanym cementem dentystycznym. W przypadku nagrywania wielokanałowego należy przesunąć w dół matryce elektrod, przekręcając na ruchomej części systemu microdrive z jednodniowym wyprzedzeniem. Przytrzymaj głowę obudzonej myszy lekko i ostrożnie, a następnie połącz środek stopnia głowicy i balon z helem za pomocą gwintu, aby zrównoważyć ciężar stopnia głowicy i układu mikronapędu.
Przechwytywanie surowych sygnałów za pomocą elektrod rejestrujących i systemów wielokanałowych poprzez próbkowanie z częstotliwością 30 kiloherców w oprogramowaniu do nagrywania, a następnie digitalizacja za pomocą cyfrowego przetwornika analogowego z systemów wielokanałowych. Wyodrębnij potencjał pola lokalnego lub sygnały LFP z surowych danych, ponownie próbkując z częstotliwością 10 kiloherców, a następnie za pomocą filtra wycinającego usuń szum linii 50 Hz. W celu sortowania i analizy wartości szczytowych, w oprogramowaniu do sortowania wartości szczytowych kliknij plik, a następnie otwórz pliki i NEV, aby otworzyć dane spajków próbkowane w 30 kilohercach.
Kliknij na informacje, aby wybrać nieposortowany kanał, a następnie wybierz sortuj, zmień metodę sortowania i użyj K średnich. Naciśnij przycisk doliny szukając sortowania, a następnie K oznacza sortowanie, aby uzyskać posortowane jednostki. Następnie w oprogramowaniu do analizy danych neurofizjologicznych otwórz posortowany plik spaja, klikając plik, importuj dane i plik Blackrock.
Aby uzyskać autokorelogram dla wybranej jednostki, kliknij analizę, a następnie autokorylogramy i ustaw parametry. Załaduj posortowane dane spajków, a następnie kliknij analizę i histogramy interwałów międzyszczytowych, aby uzyskać histogram interwału międzyskokowego, a następnie ustaw żądane parametry. Kliknij analizę, a następnie korellogramy krzyżowe, aby uzyskać korellogram krzyżowy między dwoma posortowanymi zdarzeniami jednostkowymi, a następnie ustaw zdarzenia referencyjne i parametry.
Aby przeprowadzić analizę LFP, kliknij plik, importuj dane i plik Blackrock, aby otworzyć ciągłe dane sygnału próbkowane w 10 kilohercach. Następnie, klikając analiza i widmo dla ciągłego, przeanalizuj widmo mocy dla LFP z wybranego kanału. Następnie kliknij analizę, a następnie koherencję dla ciągłej, aby przeanalizować spójność dla dwóch LFP z lewej i prawej strony MC.Następnie kliknij analizę, a następnie korelację ze zmiennymi ciągłymi, aby przeanalizować korelację między dwoma LFP z lewej i prawej strony MC.Po zakończeniu kliknij wyniki, a następnie wyniki numeryczne, aby zapisać gęstość widma mocy, spójność i korelacja z rozszerzeniem nazwy pliku XLS z kropką.
Aby przeanalizować korelacje między skojkiem a LFP, kliknij plik, a następnie zaimportuj dane i plik Blackrock, aby otworzyć ciągłe dane sygnału i dane szczytu. Następnie kliknij na analiza i analiza koherencji, aby przeanalizować spójność między skokami a LFP z wybranego kanału. Na koniec kliknij wyniki, a następnie wyniki numeryczne, aby zapisać wyniki spójności pola spajka z rozszerzeniem nazwy pliku XLS z kropką.
Szerokość doliny i czas trwania fali jednostek w MC myszy wykazały, że zarówno szerokość doliny, jak i czas trwania fali domniemanych neuronów piramidowych MC u myszy są wyższe niż w przypadku przypuszczalnych neuronów wewnętrznych. Krzyż korellogramu między domniemanymi neuronami piramidalnymi a interneuronami wskazał, że przypuszczalny impuls neuronów piramidowych występuje przed domniemanymi neuronami wewnętrznymi z oknem 18 milisekund. W analizie LFP LFP lewego i prawego MC u normalnych myszy były podobne w spektrum mocy, co sugeruje zsynchronizowane działania między lewym i prawym MC. Ponadto obliczono spójność i korelację między lewym i prawym MC.
Krzywa koherencji pola kolca w MC normalnej myszy wykazała silniejszą niską koherencję gamma dla domniemanych interneuronów w porównaniu z neuronami piramidowymi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół wielokanałowego zapisu pozakomórkowego w korze ruchowej (MC) u swobodnie poruszających się, świadomych myszy. Głównym celem jest analiza lokalnych potencjałów polowych (LFPs) oraz impulsów (spikes), aby zrozumieć aktywność sieci neuronalnej powiązaną z konkretnymi zachowaniami. Metodologia kładzie nacisk na opracowanie lekkiego systemu mikronapędu (microdrive), który ułatwia przeprowadzanie tych pomiarów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- elektrofizjologia
- analiza behawioralna
Wstęp
- Rejestracje wielokanałowe mogą wyjaśnić mechanizmy neuronalne leżące u podstaw zachowania.
- Tradycyjne techniki mogą być trudne dla osób początkujących.
- Lekki system mikronapędu zwiększa skuteczność rejestracji.
- Celem badania jest skorelowanie sygnałów elektrofizjologicznych z konkretnymi zadaniami wykonywanymi przez zwierzęta.
Cel badania
- Opracowanie zoptymalizowanego protokołu rejestracji LFP oraz aktywności impulsowej w MC u swobodnie poruszających się myszy.
- Wsparcie osób początkujących w pozyskiwaniu i analizie sygnałów neuronalnych.
- Ułatwienie zrozumienia dynamiki sieci związanej z konkretnymi zadaniami behawioralnymi.
Zastosowane metody
- Wielokanałowe rejestrowanie sygnałów zewnątrzkomórkowych przy użyciu systemu mikronapędu u myszy w warunkach swobodnego zachowania.
- Badanie koncentruje się na korze ruchowej (MC) jako modelu biologicznym.
- Nie wspomniano o żadnych procesach multiomicznych.
- Kroki obejmują montaż systemu, implantację elektrod oraz szczegóły protokołu rejestracji.
- Techniki analizy obejmują sortowanie impulsów (spike sorting) i korelację z danymi LFP.
Główne wyniki
- Właściwości neuronalne neuronów piramidalnych kory ruchowej (MC) charakteryzowały się większą szerokością dolin oraz dłuższym czasem trwania przebiegów falowych w porównaniu z interneuronami.
- Korelogram wzajemny wskazał, że neurony piramidalne generowały potencjały czynnościowe przed interneuronami, co sugeruje istnienie zależności czasowej w aktywności neuronalnej.
- Podobne wyniki widma mocy odnotowano dla potencjałów polowych (LFP) z obu stron MC u normalnych myszy.
Wnioski
- Badanie demonstruje skuteczne podejście do badania dynamiki neuronalnej w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszających się myszy.
- Uzyskane informacje mogą pogłębić zrozumienie neuronalnych podstaw zachowania.
- Potencjalne zastosowania obejmują zrozumienie mechanizmów neuronalnych istotnych dla różnych zachowań i stanów chorobowych.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Wielokanałowe rejestrowanie sygnałów zewnątrzkomórkowych u swobodnie poruszających się myszy umożliwia wysokorozdzielcze mapowanie aktywności sieci neuronalnych podczas naturalnych zachowań, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka we wczesnej fazie odkrywania leków na OUN. Podejście to dostarcza ilościowych, powiązanych z zachowaniem danych elektrofizjologicznych, które są kluczowe dla walidacji punktów uchwytu oraz pewności prognostycznej w procesach neurofarmakologicznych. Integracja tych pomiarów z przepływami pracy w procesie odkrywania leków zwiększa ciągłość translacyjną z modeli przedklinicznych do punktów końcowych istotnych dla ludzi.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią korelację wzorców wyładowań neuronalnych z konkretnymi efektami behawioralnymi w celu walidacji funkcjonalnej celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozróżnianie podtypów neuronów i ich relacji czasowych in vivo.
- Zapewnia ilościowe punkty końcowe elektrofizjologiczne, które służą do oceny pewności predykcyjnej i selekcji projektów w portfolio.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych, behawioralnie istotnych układów neuronalnych do późniejszego przesiewu farmakologicznego.
- Dostarcza powtarzalne, wielokanałowe strumienie danych odpowiednie do standaryzacji testów i porównań międzybadawczych.
- Umożliwia skalowalną ocenę wpływu związków na aktywność na poziomie sieci oraz pojedynczych jednostek u zwierząt świadomych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje przedkliniczne odczyty neuronalne z fenotypami behawioralnymi istotnymi dla przebiegu choroby, co usprawnia opracowywanie translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość procesu od wczesnego etapu odkrywania po walidację przedkliniczną poprzez powiązanie punktów końcowych elektrofizjologicznych i behawioralnych.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne, dostarczając wglądu w mechanizmy funkcjonowania obwodów neuronalnych w warunkach istotnych fizjologicznie.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta łączy wczesne etapy odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając analizę obwodów neuronalnych w modelach zwierzęcych w oparciu o sformułowane hipotezy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie ścieżek sygnałowych poprzez mapowanie aktywności neuronalnej w czasie rzeczywistym podczas zachowania.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, ilościowe wyniki do oceny modulacji farmakologicznej sieci neuronalnych.
- Analityka: Generuje gęste dane dotyczące potencjałów czynnościowych (spike) i LFP dla rzetelnego porównania statystycznego w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie przedklinicznych sygnatur neuronalnych do punktów końcowych badań klinicznych przy wsparciu korelacji behawioralnej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku, którą można dostosować do różnych obszarów mózgu i paradygmatów behawioralnych w badaniach nad OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w OUN.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje akwizycję i analizę danych neuronalnych w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Uzasadnia decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostarczenie solidnych, ilościowych punktów końcowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację zasobów w obszarze OUN z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o funkcjonalne odczyty neuronalne.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu chirurgii stereotaksycznej, implantacji elektrod oraz analizy danych neuronalnych.
- Wymagany jest dostęp do wielokanałowych systemów rejestracji oraz zaawansowanego oprogramowania analitycznego do przetwarzania impulsów (spike) i LFP.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów behawioralnych i kryteriów interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji do różnych obszarów mózgu i zadań behawioralnych poprzez optymalizację protokołu.
- Złożoność analizy sygnałów oraz obsługa zwierząt mogą stanowić praktyczne ograniczenia w badaniach o wysokiej przepustowości.
