Bezpośrednia synteza widocznych dla EM-widocznych nanocząstek złota w komórkach do analizy lokalizacji białek z dobrze zachowaną ultrastrukturą

Wykrywanie i lokalizacja białek są niezbędne w badaniach biologicznych. Nasz protokół opisuje nowatorską technologię znakowania EM przy użyciu genetycznie kodowanych znaczników, która umożliwia wizualizację pojedynczej cząsteczki in situ z dobrze zachowaną ultrastrukturą. Bardzo ważne jest, aby unikać nadmiernej fiksacji.

Metoda znakowania opiera się na aktywności cystein w znacznikach, które są bardzo wrażliwe na sieciowanie aldehydów. Nasz protokół unika stosowania utrwalaczy aldehydowych, a jednocześnie zachowuje aktywność znacznika i ultrastrukturę. Znakowanie EM zawsze było wyzwaniem, cierpiało z powodu złej morfologii lub nieefektywnego etykietowania.

Nasz protokół syntetyzuje resztkowe nanocząstki bezpośrednio na pojedynczych białkach, aby zapewnić jasną i precyzyjną lokalizację docelowych białek z wysokim stosunkiem sygnału do szumu, wysoką wydajnością i swoistością. Do tej pory udało nam się osiągnąć doskonałe znakowanie w izolowanych białkach, komórkach E. coli, komórkach wielkanocnych i komórkach HeLa. Zbadamy i zoptymalizujemy metodę aplikacji do próbek tkanek.

Połączenie dominujących technologii cryo-FIB i cryo-EM pozwoli nam odpowiedzieć na ważne pytania biologiczne. Przenieś krążki szafirowe o wymiarach trzy milimetry na 0,16 milimetra do dwumililitrowej probówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr etanolu i poddaj ją sonikacji w myjce ultradźwiękowej przez 10 minut. Spal każdy krążek szafiru w płomieniu lampy alkoholowej, aż na powierzchni nie będzie widocznych osadów.

Oznacz jedną stronę każdej szafirowej tarczy numerem za pomocą pisaka odpornego na rozpuszczalniki. Umieść oznakowane szafirowe krążki na dnie 35-milimetrowej naczynia hodowlanego oznaczoną stroną do góry. Sterylizuj naczynie do hodowli komórkowych za pomocą szafirowych krążków w świetle ultrafioletowym przez 30 minut.

Odwróć szafirowe krążki pęsetą, upewniając się, że oznaczona strona jest skierowana w dół i sterylizuj w świetle ultrafioletowym przez dodatkowe 30 minut. Zasiej stabilne linie komórkowe HeLa wyrażające znaczniki MTN na przygotowanych krążkach szafirowych. I rosną do 80 do 90% zbieżności w inkubatorze komórkowym.

Przygotuj wysokociśnieniową maszynę do zamrażania lub HPF co najmniej dwie godziny przed rozpoczęciem eksperymentu zgodnie z instrukcjami producenta. Przenieś aluminiowe nośniki HPF typu A do dwumililitrowej probówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr etanolu i poddaj je sonikacji w myjce ultradźwiękowej przez 10 minut. Wysuszyć nośniki na szalce Petriego pokrytej wysokiej jakości bibułą filtracyjną.

Namocz wstępnie oczyszczone nośniki w 1-heksadecenie. Użyj cienkiej pęsety, aby podnieść wstępnie przygotowany dysk szafirowy z naczynia do hodowli komórkowych HeLa. Dotknij oznaczonej powierzchni wysokiej jakości bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar pożywki.

Zamontuj szafirowy krążek w uchwycie na próbki HPF i szybko przykryj dysk aluminiowym nośnikiem o głębokości 0,025 milimetra zawierającym 1-heksadecen. Odessać nadmiar roztworu za pomocą wysokiej jakości bibuły filtracyjnej. Załaduj uchwyt próbki do zamrażania pod wysokim ciśnieniem.

Rozładuj zespół nośnika dysku szafirowego pod ciekłym azotem w piankowym pudełku kriogenicznym. Przygotować dwa mililitry wolnego utrwalacza podstawiającego lub roztworu FSF 1 w 20-milimetrowym okrągłym pojemniku z polipropylenu w dygestoriach i zamrozić go za pomocą ciekłego azotu. Użyj pary wstępnie schłodzonych pęset, aby załadować szafirowe krążki i zespoły nośne do pojemnika z zamrożonym roztworem FSF 1 w ciekłym azocie.

Przenieść ten pojemnik do wstępnie schłodzonej, zautomatyzowanej, wolnej komory maszyny do substytucji w celu przetwarzania FSF w temperaturze minus 90 stopni Celsjusza. Przechowuj próbki w temperaturze minus 90 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie oddziel szafirowe krążki od nośników za pomocą wstępnie schłodzonej pęsety, upewniając się, że zaznaczone boki szafirowych krążków są skierowane w dół.

Trzymaj próbki w temperaturze minus 90 stopni Celsjusza przez dodatkowe osiem do 10 godzin, zanim ogrzejesz się do minus 60 stopni Celsjusza w ciągu trzech godzin. Zastąp roztwór FSF 1 w pojemniku wstępnie schłodzonym acetonem i inkubuj w temperaturze minus 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Powtórz to pranie acetonem dwukrotnie.

Rozgrzej się do minus 30 stopni Celsjusza w ciągu trzech godzin. W międzyczasie przygotuj i wstępnie schłodź dwa mililitry roztworu FSF 2 w dwumililitrowej probówce wirówkowej w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza. Zastąp aceton roztworem FSF 2 i inkubuj w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza przez trzy godziny.

Następnie zastąp roztwór FSF 2 w pojemniku wstępnie schłodzonym acetonem i inkubuj przez 30 minut w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza. Powtórz to pranie acetonem dwukrotnie. Ogrzej się od minus 30 do czterech stopni Celsjusza w ciągu dwóch godzin.

Zastąp aceton dwoma mililitrami buforu o pojemności 0,2 mola. Zmień bufor raz i inkubuj w temperaturze pokojowej lub czterech stopniach Celsjusza przez noc. Weź wstępnie przygotowany dysk szafirowy poddany działaniu HPF i FSF zawierający stabilne komórki HeLA, przemyj go buforem PBSA przez pięć minut i powtórz ten proces trzy razy.

Przenieś krążki szafirowe do 35-milimetrowej naczynia hodowlanej zawierającej jeden mililitr buforu PBSA w temperaturze pokojowej. Zastąp bufor PBSA w naczyniu hodowlanym jednym mililitrem roztworu redukującego i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Przygotuj prekursor złota w jednym mililitrze roztworu redukującego i natychmiast wymieszaj przez wirowanie.

Dodaj 80 mikrolitrów 500-milimolowej depenicylaminy w podwójnie destylowanej wodzie do roztworu prekursora złota i natychmiast wiruj. Zastąp roztwór w naczyniu hodowlanym jednym mililitrem roztworu prekursora złota i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodać od 20 do 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu borowodorku sodu do roztworu prekursora złota.

Natychmiast wstrząśnij, aby dobrze wymieszać i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zastąp roztwór dwoma mililitrami buforu PBSA, aby zatrzymać reakcję. Następnie przygotuj mieszaninę żywicy epoksydowej zgodnie z instrukcjami producenta.

Przenieś szafirowe krążki do kapsułek z płaskim dnem i infiltruj żywicą przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Polimeryzować próbkę w temperaturze 60 stopni Celsjusza w piekarniku przez co najmniej 18 godzin. Przygotuj ultracienkie sekcje spolimeryzowanej próbki, ostrożnie przycinając bloki próbki za pomocą brzytwy, aby odsłonić krążki szafiru.

Zanurz końcówki bloków z szafirowymi krążkami w ciekłym azocie na kilka sekund i rozmroź w temperaturze pokojowej. Powtórz czynność zamrażania i rozmrażania kilka razy, aby odłączyć dyski od bloków. Białko EGFP-Mtn-KDEL pojawiło się jako nanocząstki złota o rozmiarach od dwóch do pięciu nanometrów, rozmieszczone wyłącznie w obwodowym świetle ER i w przestrzeni okołojądrowej otoczki jądrowej.

Dobrze zachowana ultrastruktura umożliwiła identyfikację pojedynczych cząsteczek znakowanych białek i ułatwiła analizę interakcji organelli, takich jak interakcje mitochondriów ER. Nanocząstki białka Ost4-EGFP-MTn wyznaczyły błonę ER w zewnętrznej błonie otoczki jądrowej. Podobnie, komórki eksprymujące Mito-acGFP-MTn wykazywały specyficzne znakowanie w macierzy mitochondrialnej.