Name: Bezpośrednia synteza widocznych dla EM-widocznych nanocząstek złota w komórkach do analizy lokalizacji białek z dobrze zachowaną ultrastrukturą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-28T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj nową technologię etykietowania EM do detekcji białek z tagami metalotioneinowymi w komórkach. Metoda umożliwia wizualizację pojedynczych cząsteczek przy zachowanej ultrastrukturze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisany tutaj protokół pochodzi z artykułu opublikowanego przez Jiang et al. (2020). Prace te były wspierane przez granty z MOST (973 programy nr 2011CB812502 i 2014CB849902) oraz przez wsparcie finansowe ze strony władz miejskich Pekinu.

Wszystkie materiały użyte w tym eksperymencie są wymienione w Tabeli Materiałów. Przebieg pracy krok po kroku bieżącego protokołu jest pokazany w Rysunek 1.
1. Hodowla komórkowa na szafirowych krążkach
<ol>
	<li>Przenieś krążki szafirowe o wymiarach 3 mm x 0,16 mm do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml etanolu i poddaj sonifikacji w myjce ultradźwiękowej przez 10 minut.</li>
	<li>Spal każdy dysk szafiru w płomieniu lampy alkoholowej, aż na powierzchni nie będzie widocznych osadów. 
	UWAGA: Dzięki powyższej metodzie szafirowe krążki można wielokrotnie poddawać recyklingowi.</li>
	<li>Oznacz jedną stronę każdej szafirowej tarczy numerem za pomocą długopisu odpornego na rozpuszczalniki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Używany marker musi zostać wcześniej przetestowany w celu ustalenia, czy jest odporny na rozpuszczalniki acetonowe i metanolowe, aby zapobiec utracie śladów.</li>
	<li>Umieść oznaczone krążki szafirowe na dnie naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm oznaczoną stroną do góry.</li>
	<li>Sterylizuj naczynie do hodowli komórkowych z szafirowymi krążkami w świetle UV przez 30 minut.</li>
	<li>Odwróć szafirowe krążki pęsetą (oznaczoną stroną skierowaną w dół) i sterylizuj w świetle UV przez dodatkowe 30 minut. Teraz szalka hodowlana zawierająca szafirowe krążki jest gotowa do hodowli komórkowej. 
	UWAGA: Szafirowe krążki można również sterylizować w autoklawie.</li>
	<li>Zasiej komórki na przygotowanych powyżej szafirowych krążkach i osiągnij 80%-90% zbiegu w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5% CO2 (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1B). 
	UWAGA: Stabilne linie komórkowe HeLa wyrażające znaczniki MTn zostały wygenerowane zgodnie z opisem w Jiang et al.26.</li>
</ol>
2. Zamrażanie wysokociśnieniowe (HPF)
UWAGA: W tym eksperymencie używany jest ciekły azot. Podczas pracy z ciekłym azotem należy stosować odpowiednie procedury bezpieczeństwa i środki ochrony osobistej, aby zapobiec odmrożeniom i uduszeniu.
<ol>
	<li>Maszynę do zamrażania wysokociśnieniowego należy przygotować co najmniej 2 godziny przed eksperymentem zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przenieś aluminiowe nośniki HPF typu A (wgłębienie: 0,025/0,275 mm) do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml etanolu i poddaj sonikacji w myjce ultradźwiękowej przez 10 min.</li>
	<li>Wysuszyć nośniki na szalce Petriego pokrytej jakościową bibułą filtracyjną (średnia prędkość).</li>
	<li>Namocz wstępnie oczyszczone nośniki w 1-heksadecenie. 
	UWAGA: BSA nie jest zalecany jako krioprotektant w obecnym eksperymencie, ponieważ będzie to zakłócać późniejszą syntezę nanocząstek złota.</li>
	<li>Użyj cienkiej pęsety, aby podnieść szafirowy krążek z komórkami z naczynia hodowlanego; dotknij oznaczonej powierzchni jakościową bibułą filtracyjną (średnia prędkość), aby usunąć nadmiar pożywki. 
	UWAGA: Przewodność cieplna wody jest bardzo niska, a zbyt duża ilość wody resztkowej wpłynie na efekt zamarzania. Zatrzymaj minimalną ilość wody, aby zapobiec wysychaniu komórek.</li>
	<li>Zamontuj szafirowy krążek w uchwycie na próbki HPF i szybko przykryj dysk aluminiowym nośnikiem o głębokości 0,025 mm zawierającym 1-heksadecen (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Odessać nadmiar roztworu za pomocą jakościowej bibuły filtracyjnej (średnia prędkość).</li>
	<li>Załaduj uchwyt próbki do zamrażania pod wysokim ciśnieniem (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 1D). 
	UWAGA: Proces ładowania próbki musi być tak szybki, jak to możliwe (w ciągu 1 minuty), aby zminimalizować zmiany fizjologiczne spowodowane zmianami temperatury, wilgotności, pH i zawartości tlenu.</li>
	<li>Rozładuj zespół nośnika dysku szafirowego pod ciekłym azotem w krioboxie piankowym i przechowuj zespół w kriowiale w ciekłym azocie przed użyciem. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. Próbki w kriowialach mogą być przechowywane w ciekłym azocie Dewara przez lata.</li>
</ol>
3. Utrwalanie przez zamrożenie (FSF) i ponowne nawodnienie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E)
<ol>
	<li>Napełnij automatyczną maszynę do zamrażania i substytucji (AFS) ciekłym azotem i schłodzić komorę do temperatury −90 °C. 
	UWAGA: W tym eksperymencie używany jest ciekły azot. Podczas pracy z ciekłym azotem należy stosować odpowiednie procedury bezpieczeństwa i środki ochrony osobistej, aby zapobiec odmrożeniom i uduszeniu.</li>
	<li>Przygotuj 2 ml 0,01% kwasu garbnikowego (w/v) w acetonie (roztwór FSF 1) w okrągłym pojemniku polipropylenowym o średnicy 20 mm (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1E) w dygestoriach i zamroź je w ciekłym azocie.</li>
	<li>Załaduj próbki (szafirowe zespoły nośnika dysku) do pojemnika z zamrożonym roztworem FSF 1 pod LN2 za pomocą pary wstępnie schłodzonych pęset.</li>
	<li>Przenieść pojemnik do wstępnie schłodzonej komory AFS w celu przetwarzania FSF w temperaturze -90 °C.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze -90 °C przez 1 godzinę, a następnie oddzielić krążki szafiru od nośników za pomocą wstępnie schłodzonej pęsety i upewnić się, że zaznaczone boki krążków szafirowych są skierowane w dół. 
	UWAGA: Pęseta musi być odpowiednio wstępnie schłodzona, aby zapobiec zmianom temperatury. Szafirowe krążki powinny być łatwe do oddzielenia.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze -90 °C przez kolejne 8-10 godzin, a następnie ogrzać do -60 °C w ciągu 3 godzin.</li>
	<li>Zastąp roztwór FSF 1 w pojemniku wstępnie schłodzonym acetonem i inkubuj przez 1 godzinę. Powtórz to płukanie acetonem 2x.</li>
	<li>Ogrzać do -30 °C w ciągu 3 godzin. W tym okresie należy przygotować i schłodzić 2 ml 0,01% octanu uranylu w acetonie (roztwór FSF 2, rozcieńczony z 10% octanu uranylu w metanolu) w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. 
	UWAGA: Octan uranylu, użyty w obecnym eksperymencie, jest radioaktywny i wysoce toksyczny; Należy obchodzić się z nim zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa i utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.</li>
	<li>Zastąpić aceton roztworem FSF 2 i inkubować w temperaturze -30 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Zastąpić roztwór FSF 2 w pojemniku wstępnie schłodzonym acetonem i inkubować przez 30 minut w temperaturze -30 °C. Powtórzyć to płukanie acetonem 2x.</li>
	<li>Ciepło od -30 °C do 4 °C w ciągu 2 godzin.</li>
	<li>Zastąp aceton 2 ml 0,2 M buforu HEPES zawierającego 1 mM CaCl2 i 1 mM MgCl2 przy pH 5,5.</li>
	<li>Zmienić bufor jeden raz i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc. 
	UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany w tym miejscu na jedną noc lub kontynuowany przez co najmniej 6 godzin, aż próbki zostaną ponownie zamrożone w kroku 5.</li>
</ol>
4. Synteza AuNP oparta na ANSM dla komórek ssaków (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F)
<ol>
	<li>Myć buforem PBS-A 3x przez 5 min za każdym razem.</li>
	<li>Przenieść krążki szafirowe do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm zawierającego 1 ml buforu PBS-A w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Zawsze trzymaj zaznaczone boki szafirowych krążków skierowanymi w dół i unikaj zachodzenia na szafirowe krążki i ścierania komórek.</li>
	<li>Przygotować roztwór redukujący, dodając 4,28 μl 2-merkaptoetanolu do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml buforu PBS-A i dobrze mieszając w dygestorium. 
	UWAGA: 2-merkaptoetanol jest toksyczny i ma ostry zapach; Należy obchodzić się z nim zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa.</li>
	<li>Zastąp bufor PBS-A w naczyniu hodowlanym 1 ml roztworu redukującego i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj prekursor złota przed użyciem.
	<ol>
		<li>Dodać 80 μl 10 mM HAuCl4 w ddH2O do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml roztworu redukującego i natychmiast zawirować. 
		UWAGA: Roztwór może stać się mętny.</li>
		<li>Dodać 80 μl 500 mM D-penicylaminy w ddH2O do powyższego roztworu i natychmiast wirować. 
		UWAGA: Roztwór może stać się ponownie klarowny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastąpić roztwór w naczyniu hodowlanym 1 ml roztworu prekursora złota przygotowanego w kroku 4.5 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Jeden mililitr prekursora złota wystarcza do reakcji z około 1 × 106 komórkami (zlewającymi się na szalce o średnicy 35 mm). Większe ilości prekursora są potrzebne, gdy AuNP stają się znacznie mniejsze.</li>
	<li>Odważyć 0,0038 g NaBH4 do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, dodać 1 ml lodowatego ddH2O i przemieszać, aby uzyskać świeże 100 mM NaBH4 tuż przed użyciem.</li>
	<li>Dodać 20-100 μl 100 mM NaBH4 do roztworu z kroku 4.6, natychmiast wstrząsnąć do dobrego wymieszania i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Przygotuj 100 mM NaBH4 świeżo do natychmiastowego użycia. Po dodaniu NaBH4 kolor roztworu będzie stopniowo zmieniał kolor na czerwony, a następnie pogłębiał się. Jeśli nie zaobserwuje się żadnej zmiany koloru, w dużej mierze oznacza to, że eksperyment się nie powiódł.</li>
	<li>Zastąp roztwór 2 ml buforu PBS-A, aby zatrzymać reakcję. 
	UWAGA: Zatrzymanie reakcji w ciągu 30 minut ma kluczowe znaczenie, ponieważ przedłużająca się reakcja stopniowo rozkłada AuNPs.</li>
</ol>
5. Zamrażanie wysokociśnieniowe i fiksacja przez zamrożenie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C-F)
UWAGA: Próbki to ponownie HPF i FSF, a procedura jest prawie taka sama, jak poprzednio opisana w sekcji 2 i sekcji 3, z kilkoma modyfikacjami.
<ol>
	<li>Przygotować 1% tetratlenku osmu i 0,1% octanu uranylu w acetonie (roztwór FSF 3, rozcieńczony z 4% tetratlenku osmu w acetonie i 10% octanu uranylu w metanolu). 
	UWAGA: Tetroksynek osmu i octan uranylu są wysoce toksycznymi chemikaliami; Należy z nimi obchodzić się zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa i utylizować je jako niebezpieczne odpady chemiczne.</li>
	<li>Załaduj próbki (szafirowe zespoły nośnika dysku) do pojemnika z zamrożonym roztworem FSF 3 pod LN2 za pomocą pary wstępnie schłodzonej pęsety.</li>
	<li>Przenieść pojemnik do wstępnie schłodzonej komory AFS w celu przetwarzania FSF w temperaturze -90 °C i uruchomić program FSF w następujący sposób: przechowywać w temperaturze -90 °C przez 8-10 godzin; następnie ogrzać do -60 °C w ciągu 3 godzin; utrzymywać w temperaturze -60 °C przez 3 godziny; następnie ogrzać do -30 °C w ciągu 3 godzin; utrzymywać w temperaturze -30 °C przez 3 godziny; następnie rozgrzać do 4 °C w ciągu 2 godzin.</li>
	<li>Gdy temperatura osiągnie 4 °C, przenieść próbki do dygestorium i utrzymywać w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Myć acetonem 3x przez 15 min za każdym razem.</li>
	<li>Przechowywać w acetonie w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny.</li>
</ol>
6. Infiltracja, zatapianie i polimeryzacja żywicy
<ol>
	<li>Przed użyciem przygotować mieszaninę żywicy epoksydowej zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Żywica epoksydowa użyta w obecnym eksperymencie jest toksyczna przed polimeryzacją; Należy obchodzić się z nim zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa. Niespolimeryzowaną żywicę należy zutylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne lub spolimeryzować przed utylizacją.</li>
	<li>Przenieś krążki szafirowe do kapsułek z płaskim dnem i infiltruj żywicą przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Trzymaj zaznaczone boki szafirowych krążków skierowanymi w dół.</li>
	<li>Próbkę polimeryzować w temperaturze 60 °C w piecu przez co najmniej 18 h. 
	UWAGA: Protokół można tutaj wstrzymać po polimeryzacji. Spolimeryzowane bloki próbek można przechowywać w suchym pojemniku przez lata.</li>
</ol>
7. Ultracienkie przekroje
<ol>
	<li>Ostrożnie przytnij spolimeryzowane bloki próbki za pomocą brzytwy, aby odsłonić krążki szafiru.</li>
	<li>Zanurz końcówki bloków z szafirowymi krążkami w ciekłym azocie na kilka sekund i rozmroź w temperaturze pokojowej. Powtórz czynność zamrażania i rozmrażania kilka razy, aby odłączyć krążki od bloków. 
	UWAGA: Unikaj długotrwałego zamrażania, ponieważ może to spowodować pęknięcie bloków próbki. Delikatnie odczep szafirowe krążki za pomocą ostrza, unikając nadmiernej siły, która może uszkodzić próbki.</li>
	<li>Przytnij powierzchnię bloku do kształtu trapezu w celu ultracienkiego przekroju (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G).</li>
	<li>Uzyskaj ultracienkie przekroje 70-100 nm za pomocą ultramikrotomu (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1H).</li>
	<li>Wybierz sekcje na sześciokątnych siatkach miedzianych o siatkach 200. 
	UWAGA: Protokół można w tym miejscu wstrzymać po przeprowadzeniu sekcji. Sekcje na pasach mogą być przechowywane w suchym pojemniku przez lata. W razie potrzeby skrawki na siatkach można zabarwić 2% acetonem uranylowym, aby uzyskać lepszy kontrast membrany. Należy unikać barwienia ołowiem, ponieważ zamaskuje to sygnały cząstek nanozłota.</li>
</ol>
8. Obrazowanie TEM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I)
<ol>
	<li>Zbadaj ultracienkie przekroje na miedzianych siatkach za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Zazwyczaj zakres powiększenia od 11 kX do 30 kX jest odpowiedni do wizualizacji AuNP w komórkach i potrzebna jest odpowiednia wartość rozmycia, aby zapewnić widoczność AuNP 2-3 nm.</li>
</ol>

Direct Synthesis of Gold Nanoparticles for Protein Localization Analysis

<ol><li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annual Review of Biochemistry. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> Journal of Cell Science. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Masters, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+the+electron+microscope+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Encylopedia+of+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">History of the electron microscope in cell biology.</a> Encylopedia of Life Sciences. , (2009).</li>
<li>Griffiths, G., Hoppeler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+immunocytochemistry%3A+Correlation+of+immunogold+labeling+to+absolute+number+of+membrane+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitation in immunocytochemistry: Correlation of immunogold labeling to absolute number of membrane antigens.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 34 (11), 1389-1398 (1986).</li>
<li>Tokuyasu, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+ultracryotomy+of+cell+suspensions+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues.</a> Journal of Cell Biology. 57 (2), 551-565 (1973).</li>
<li>Connolly, C. N., Futter, C. E., Gibson, A., Hopkins, C. R., Cutler, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+into+and+out+of+the+Golgi+complex+studied+by+transfecting+cells+with+cDNAs+encoding+horseradish+peroxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Transport into and out of the Golgi complex studied by transfecting cells with cDNAs encoding horseradish peroxidase.</a> Journal of Cell Biology. 127 (3), 641-652 (1994).</li>
<li>Grabenbauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy+and+electron+tomography+of+GFP+through+photooxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy and electron tomography of GFP through photooxidation.</a> Nature Methods. 2 (11), 857-862 (2005).</li>
<li>Gaietta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296 (5567), 503-507 (2002).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells%2C+tissues%2C+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS Biology. 9 (4), e1001041(2011).</li>
<li>Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+ascorbate+peroxidase+as+a+genetically+encoded+reporter+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered ascorbate peroxidase as a genetically encoded reporter for electron microscopy.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1143-1148 (2012).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature Methods. 12 (1), 51-54 (2015).</li>
<li>Mavlyutov, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APEX2-enhanced+electron+microscopy+distinguishes+sigma-1+receptor+localization+in+the+nucleoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">APEX2-enhanced electron microscopy distinguishes sigma-1 receptor localization in the nucleoplasmic reticulum.</a> Oncotarget. 8 (31), 51317-51330 (2017).</li>
<li>Wang, Q., Mercogliano, C. P., Lowe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ferritin-based+label+for+cellular+electron+cryotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A ferritin-based label for cellular electron cryotomography.</a> Structure. 19 (2), 147-154 (2011).</li>
<li>Sano, T., Glazer, A. N., Cantor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streptavidin-metallothionein+chimera+that+allows+specific+labeling+of+biological+materials+with+many+different+heavy+metal+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A streptavidin-metallothionein chimera that allows specific labeling of biological materials with many different heavy metal ions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (5), 1534-1538 (1992).</li>
<li>Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanocluster+formation+using+metallothionein%3A+Mass+spectrometry+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gold nanocluster formation using metallothionein: Mass spectrometry and electron microscopy.</a> Journal of Molecular Biology. 355 (2), 211-223 (2006).</li>
<li>Mercogliano, C. P., DeRosier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concatenated+metallothionein+as+a+clonable+gold+label+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Concatenated metallothionein as a clonable gold label for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 160 (1), 70-82 (2007).</li>
<li>Morphew, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metallothionein+as+a+clonable+tag+for+protein+localization+by+electron+microscopy+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Metallothionein as a clonable tag for protein localization by electron microscopy of cells.</a> Journal of Microscopy. 260 (1), 20-29 (2015).</li>
<li>Nishino, Y., Yasunaga, T., Miyazawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+metallothionein+tag+enabling+efficient+protein+detection+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded metallothionein tag enabling efficient protein detection by electron microscopy.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (3), 93-101 (2007).</li>
<li>Bouchet-Marquis, C., Pagratis, M., Kirmse, R., Hoenger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metallothionein+as+a+clonable+high-density+marker+for+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Metallothionein as a clonable high-density marker for cryo-electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 119-127 (2012).</li>
<li>Fukunaga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+analysis+of+a+fusion+protein+of+postsynaptic+density-95+and+metallothionein+in+cultured+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic analysis of a fusion protein of postsynaptic density-95 and metallothionein in cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Electron Microscopy. 56 (4), 119-129 (2007).</li>
<li>Diestra, E., Fontana, J., Guichard, P., Marco, S., Risco, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+proteins+in+intact+cells+with+a+clonable+tag+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of proteins in intact cells with a clonable tag for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 165 (3), 157-168 (2009).</li>
<li>Risco, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sensitive%2C+high-resolution+detection+of+protein+molecules+in+eukaryotic+cells+using+metal-tagging+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">sensitive, high-resolution detection of protein molecules in eukaryotic cells using metal-tagging transmission electron microscopy.</a> Structure. 20 (5), 759-766 (2012).</li>
<li>Ding, S. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+role+for+the+host+Vps4+AAA%2B+ATPase+ESCRT+protein+in+the+formation+of+tomato+bushy+stunt+virus+replicase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Noncanonical role for the host Vps4 AAA+ ATPase ESCRT protein in the formation of tomato bushy stunt virus replicase.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004087(2014).</li>
<li>Jiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+synthesis+of+gold+nanoparticles+on+cysteine-rich+tags+in+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in yeast cells.</a> Protocol Exchange. , (2020).</li>
<li>Jiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+synthesis+of+gold+nanoparticles+on+cysteine-rich+tags+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protocol+Exchange%22%5BJournal%5D)">Direct synthesis of gold nanoparticles on cysteine-rich tags in mammalian cells.</a> Protocol Exchange. , (2020).</li>
<li>Jiang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tags+for+direct+synthesis+of+EM-visible+gold+nanoparticles+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tags for direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles in cells.</a> Nature Methods. 17 (9), 937-946 (2020).</li>
<li>Brust, M., Walker, M., Bethell, D., Schiffrin, D. J., Whyman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+thiol-derivatised+gold+nanoparticles+in+a+two-phase+liquid-liquid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Chemical+Society%2C+Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase liquid-liquid system.</a> Journal of the Chemical Society, Chemical Communications. 7, 801-802 (1994).</li>
</ol>

Autor deklaruje brak konfliktu interesów.

W badaniu przedstawiono solidną technologię klonowalnego znakowania EM do wizualizacji pojedynczych cząsteczek białka w środowisku komórkowym z rozdzielczością ultrastrukturalną. AuNP bezpośrednio syntetyzowane na genetycznie kodowanych znacznikach bogatych w cysteinę zapewniają jednoznaczną i precyzyjną lokalizację docelowych białek. Technika zamrażania pod wysokim ciśnieniem i zamrażania przez substytucję doskonale zachowuje ultrastrukturę próbek biologicznych. Podsumowując, przedstawiona tutaj technologia znakowania k...

W erze postgenomicznej, rozwój białka zielonej fluorescencji (GFP) jako pojedynczego reportera do mikroskopii świetlnej zrewolucjonizował dziedzinę nowoczesnych badań nad naukami przyrodniczymi1,2. Przez dziesięciolecia mikroskopia elektronowa (EM) była potężnym narzędziem do intuicyjnej obserwacji ultrastruktury komórkowej z rozdzielczością nanoskalową3; Jednak precyzyjna identyfikacja i lokalizacja cząsteczek białka pozostaje wyzwaniem.
Najczęściej używaną techniką znakowania EM jest technika znakowania za pomocą mikroskopii immunoelektronowej (IEM), która opiera się na reakcji antygen-przeciwciało. Jednakże, chociaż w dziedzinie znakowania IEM opracowano wiele technik, w tym wstępne zatapianie IEM i końcowe zatapianie IEM (na sekcjach żywicy lub uwodnionych kriosekcjach), nadal cierpi z powodu niskiej skuteczności znakowania (<10%)4,5, co jest związane z przygotowaniem próbki i jakością przeciwciał. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowanie znaczników kodowanych genetycznie ma ogromny potencjał zastosowań.
Dwa główne typy znaczników EM zostały dokładnie zbadane w ostatnich latach. Jednym z typów jest metoda barwienia DAB, która wykorzystuje znaczniki takie jak APEX2 do utleniania 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) do polimerów osmiofilowych w celu wizualizacji EM6,7,8,9,10,11,12. Umożliwia znakowanie białek o wysokiej obfitości w regionach subkomórkowych, ale nie nadaje się do zliczania pojedynczych cząsteczek. Drugi typ wykorzystuje białka wiążące metale, takie jak ferrytyna13 i metalotioneina (MT)14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, do generowania gęstych elektronowo osadów metali in situ do wizualizacji EM. Tylko ten ostatni ma realny potencjał do wizualizacji i liczenia pojedynczych cząsteczek. Rozmiar cząsteczkowy ferrytyny jest zbyt duży (~450 kD), aby można go było wykorzystać jako obiecujący znacznik, podczas gdy mały rozmiar (~5 kD) MT i jego zdolność do wiązania różnych jonów przez 20 cystein przyciągnęły dużą uwagę. Kilka laboratoriów próbowało oznaczyć oczyszczone białka fuzyjne MT lub komórki wykazujące ekspresję MT poprzez inkubację bezpośrednio z Au +. Próby te początkowo dowiodły, że znaczniki MT mogą wiązać jony złota, tworząc sygnały o wysokim kontraście, ale żadna z nich nie osiągnęła skutecznej identyfikacji pojedynczych białek w komórkach i nie mają one powszechnego zastosowania14,15,16,17,18,19,20,21,22,23.
Technika syntezy AuNP oparta na ANSM, która polega na syntezie AuNP o rozmiarach 2-6 nm bezpośrednio na znacznikach bogatych w cysteinę (np. MT, warianty MT MTn i MTα, AFP) jako etykiety o dużej gęstości elektronów do wizualizacji EM, jest pierwszym niezawodnym i możliwym do zastosowania podejściem do znakowania białek i wykrywania pojedynczych cząsteczek w komórkach24,25,26. Pozwala to na specyficzną syntezę AuNP na izolowanych białkach fuzyjnych znaczników i osiągnęło bezprecedensową skuteczność znakowania w nieutrwalonych lub chemicznie utrwalonych komórkach prokariotycznych (E. coli) i eukariotycznych (S. pombe). Jednak wdrożenie tego samego protokołu w bardziej zaawansowanych systemach, takich jak komórki ssaków, a nawet tkanki, wiąże się z dodatkowymi wyzwaniami, takimi jak bardziej złożona wewnątrzkomórkowa homeostaza redoks i bardziej delikatna struktura komórkowa.
To badanie przedstawia technologię znakowania EM opartą na klonowaniu, która łączy nowatorską technikę syntezy AuNP opartą na ANSM do znakowania genetycznie kodowanych znaczników bogatych w cysteinę (MT) z metodą przygotowania próbki HPF/FSF-rehydration-HPF/FSF, umożliwia jednoznaczną identyfikację pojedynczych cząsteczek oznakowanych białek w błonie ER, świetle ER i macierzy mitochondrialnej w komórkach HeLa. Obecna metoda łączy w sobie cechy wysokiej wydajności znakowania, wysokiego stosunku sygnału do szumu, znakowania pojedynczych cząsteczek i silnej uniwersalności, a metoda ta ma szerokie perspektywy zastosowania w badaniach z zakresu nauk przyrodniczych.

<table><tbody><tr><td>0,025 mm/0,275 mm Aluminiowy nośnik</td><td>Beijing Wulundes Biotech Ltd., lub Biuro Inżynieryjne M. Wohlwend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M bufor</td><td></td><td></td> HEPES <td>Rozpuść HEPES (0,2 M) w 980 ml ddH2O, a następnie dodaj 10 ml 100 mM MgCl2 i 10 ml 100 mM CaCl2 (stężenie końcowe 1 mM), odpowiednio dostosuj pH do 5,5</td></tr><tr><td>1,5 ml MaxyClear mikroprobówka zatrzaskowa</td><td>Axygen Scientific MCT150C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml mikroprobówki z polipropylenową nakrętką</td><td>Biologix</td><td>81-0204</td><td></td></tr><tr><td>Sześciokątna siatka miedziana o oczkach 200</td><td>Tedpella inc</td><td>G200HEX</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Amresco</td><td>0482-250ML</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalki do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td></td><td></td>430165</tr><tr><td>Probówki wirówkowe z polipropylenu o pojemności 50 ml</td><td>Corning</td><td>430928</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company</td><td>31025</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczna maszyna do substytucji zamrażania</td><td>Leica</td><td>AFS2</td><td></td></tr><tr><td>Dostosowane uchwyty na próbki 3,05 mm x 0,66 mm do HPF</td><td>Beijing Wulundes Biotech Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-penicylamina</td><td>TCI</td><td>P0147</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco" s zmodyfikowany Eagle medium</td><td>GBICO</td><td>C11965500BT</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>GBICO</td><td>10099-141C</td><td></td></tr><tr><td>Kapsułka do zatapiania z płaskim dnem</td><td>Tedpella inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foam cryobox</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żywica Formvar 15/95</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>HAuCl4</td><td>Sigma</td><td>4022-1G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>sigma&nbsp;</td><td>Maszyna H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>HPF</td><td>Wohlwend&nbsp;</td><td>HPF compact01</td><td></td></tr><tr><td>Methonal&nbsp;</td><td>Beiijng Tong Guang Fine Chemicals Company</td><td>12397</td><td></td></tr><tr><td>NaBH4</td><td>Sigma</td><td>480886-25G</td><td></td></tr><tr><td>OsO4</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>19110</td><td></td></tr><tr><td>Bufor</td><td></td><td></td> PBS-A <td>Rozpuszczanie NaH2PO4 (1,125 mM), Na2HPO4 (3,867 mM), NaCl (100 mM) w 1 l ddH2O, dostosować do pH 7,4</td></tr><tr><td>Jakościowa bibuła filtracyjna (średnia prędkość)</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>FFT08</td><td></td></tr><tr><td>Dyski szafirowe</td><td>Pekin Wulundes Biotech Ltd. lub Biuro Inżynieryjne M. Wohlwenda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pióro odporne na rozpuszczalniki</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>62053-B</td><td></td></tr><tr><td>Żywica SPI-Pon 812</td><td>SPI Inc</td><td>02659-AB</td><td></td></tr><tr><td>Elektron transmisyjny mikroskopia</td><td>FEI</td><td>Tecnai G2 duch</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>GBICO</td><td>C25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramictotome</td><td>Leica</td><td>FC7</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednia synteza widocznych dla em-widocznych nanocząstek złota w komórkach do analizy lokalizacji białek z dobrze zachowaną ultrastrukturą

Direct Synthesis of EM-Visible Gold Nanoparticles in Cells for Protein Localization Analysis with Well-Preserved Ultrastructure

Analiza precyzyjnej lokalizacji cząsteczek białek w komórkach o ultrastrukturalnej rozdzielczości ma ogromne znaczenie dla badania różnych procesów fizjologicznych lub patologicznych we wszystkich żywych organizmach. Dlatego opracowanie klonowalnych znaczników, które mogą być używane jako sondy mikroskopii elektronowej, ma ogromną wartość, podobnie jak białka fluorescencyjne odegrały kluczową rolę w dziedzinie obrazowania optycznego. Niedawno odkryto mechanizm supresji autonukleacji (ANSM), który pozwala na specyficzną syntezę nanocząstek złota (AuNPs) na znacznikach bogatych w cysteinę, takich jak metalotioneina (MT) i białko zapobiegające zamarzaniu (AFP).
Na podstawie ANSM opracowano technologię znakowania mikroskopią elektronową, która umożliwia specyficzne wykrywanie oznaczonych białek w komórkach prokariotycznych i eukariotycznych z niespotykaną dotąd skutecznością znakowania. Badanie to ilustruje protokół wykrywania białek fuzyjnych MTn (zmodyfikowany wariant MT pozbawiony reszt reaktywnych aldehydowo) w komórkach ssaków o dobrze zachowanej ultrastrukturze. W tym protokole zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i utrwalanie przez wymrażanie i substytucję przez wymrażanie przeprowadzono przy użyciu utrwalaczy niealdehydowych (takich jak kwas garbnikowy, octan uranylu) w celu zachowania prawie natywnej ultrastruktury i uniknięcia uszkodzenia aktywności znacznika spowodowanego sieciowaniem aldehydowym.
Prosty, jednoetapowy system nawadniania został zastosowany przed syntezą AuNP opartą na ANSM. Wyniki pokazały, że znakowane białka celowały w różne organelle, w tym błony i światło retikulum endoplazmatycznego (ER), a matryce mitochondrialne wykryto z wysoką wydajnością i swoistością. Badania te zapewniają biologom solidny protokół do rozwiązywania ogromnego zakresu problemów biologicznych na poziomie pojedynczej cząsteczki w kontekstach ultrastrukturalnych komórek.

Technika syntezy AuNP oparta na ANSM jest niezwykle użytecznym narzędziem do znakowania i wykrywania białek z etykietą MT za pomocą TEM26. Aby potwierdzić jej skuteczność w komórkach ssaków, wygenerowano trzy stabilne linie komórkowe Hela wykazujące ekspresję EGFP-MTn-KDEL, Ost4-EGFP-MTn lub Mito-acGFP-MTn. KDEL jest kanoniczną C-terminalną sekwencją retencji/odzyskiwania w siateczce śródplazmatycznej (ER), która utrzymuje białko fuzyjne EGFP-MTn-KDEL wewnątrz lumeny ER lub w przestrzeni perinukle...

Obecny protokół opisuje technologię znakowania za pomocą klonowalnego mikroskopu elektronowego do wykrywania białek znakowanych metalotioneiną w komórkach za pomocą nowatorskiej techniki syntezy nanocząstek złota opartej na mechanizmie tłumienia autonukleacji.

Bezpośrednia synteza widocznych dla EM-widocznych nanocząstek złota w komórkach do analizy lokalizacji białek z dobrze zachowaną ultrastrukturą

Analyzing the precise localization of protein molecules in cells with ultrastructural resolution is of great significance for the study of various ...

Wykrywanie i lokalizacja białek są niezbędne w badaniach biologicznych. Nasz protokół opisuje nowatorską technologię znakowania EM przy użyciu genetycznie kodowanych znaczników, która umożliwia wizualizację pojedynczej cząsteczki in situ z dobrze zachowaną ultrastrukturą. Bardzo ważne jest, aby unikać nadmiernej fiksacji.Metoda znakowania opiera się na aktywności cystein w znacznikach, które są bardzo wrażliwe na sieciowanie aldehydów. Nasz protokół unika stosowania utrwalaczy aldehydowych, a jednocześnie zachowuje aktywność znacznika i ultrastrukturę. Znakowanie EM zawsze było wyzwaniem, cierpiało z powodu złej morfologii lub nieefektywnego etykietowania.Nasz protokół syntetyzuje resztkowe nanocząstki bezpośrednio na pojedynczych białkach, aby zapewnić jasną i precyzyjną lokalizację docelowych białek z wysokim stosunkiem sygnału do szumu, wysoką wydajnością i swoistością. Do tej pory udało nam się osiągnąć doskonałe znakowanie w izolowanych białkach, komórkach E. coli, komórkach wielkanocnych i komórkach HeLa. Zbadamy i zoptymalizujemy metodę aplikacji do próbek tkanek.Połączenie dominujących technologii cryo-FIB i cryo-EM pozwoli nam odpowiedzieć na ważne pytania biologiczne. Przenieś krążki szafirowe o wymiarach trzy milimetry na 0,16 milimetra do dwumililitrowej probówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr etanolu i poddaj ją sonikacji w myjce ultradźwiękowej przez 10 minut. Spal każdy krążek szafiru w płomieniu lampy alkoholowej, aż na powierzchni nie będzie widocznych osadów.Oznacz jedną stronę każdej szafirowej tarczy numerem za pomocą pisaka odpornego na rozpuszczalniki. Umieść oznakowane szafirowe krążki na dnie 35-milimetrowej naczynia hodowlanego oznaczoną stroną do góry. Sterylizuj naczynie do hodowli komórkowych za pomocą szafirowych krążków w świetle ultrafioletowym przez 30 minut.Odwróć szafirowe krążki pęsetą, upewniając się, że oznaczona strona jest skierowana w dół i sterylizuj w świetle ultrafioletowym przez dodatkowe 30 minut. Zasiej stabilne linie komórkowe HeLa wyrażające znaczniki MTN na przygotowanych krążkach szafirowych. I rosną do 80 do 90% zbieżności w inkubatorze komórkowym.Przygotuj wysokociśnieniową maszynę do zamrażania lub HPF co najmniej dwie godziny przed rozpoczęciem eksperymentu zgodnie z instrukcjami producenta. Przenieś aluminiowe nośniki HPF typu A do dwumililitrowej probówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr etanolu i poddaj je sonikacji w myjce ultradźwiękowej przez 10 minut. Wysuszyć nośniki na szalce Petriego pokrytej wysokiej jakości bibułą filtracyjną.Namocz wstępnie oczyszczone nośniki w 1-heksadecenie. Użyj cienkiej pęsety, aby podnieść wstępnie przygotowany dysk szafirowy z naczynia do hodowli komórkowych HeLa. Dotknij oznaczonej powierzchni wysokiej jakości bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar pożywki.Zamontuj szafirowy krążek w uchwycie na próbki HPF i szybko przykryj dysk aluminiowym nośnikiem o głębokości 0,025 milimetra zawierającym 1-heksadecen. Odessać nadmiar roztworu za pomocą wysokiej jakości bibuły filtracyjnej. Załaduj uchwyt próbki do zamrażania pod wysokim ciśnieniem.Rozładuj zespół nośnika dysku szafirowego pod ciekłym azotem w piankowym pudełku kriogenicznym. Przygotować dwa mililitry wolnego utrwalacza podstawiającego lub roztworu FSF 1 w 20-milimetrowym okrągłym pojemniku z polipropylenu w dygestoriach i zamrozić go za pomocą ciekłego azotu. Użyj pary wstępnie schłodzonych pęset, aby załadować szafirowe krążki i zespoły nośne do pojemnika z zamrożonym roztworem FSF 1 w ciekłym azocie.Przenieść ten pojemnik do wstępnie schłodzonej, zautomatyzowanej, wolnej komory maszyny do substytucji w celu przetwarzania FSF w temperaturze minus 90 stopni Celsjusza. Przechowuj próbki w temperaturze minus 90 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie oddziel szafirowe krążki od nośników za pomocą wstępnie schłodzonej pęsety, upewniając się, że zaznaczone boki szafirowych krążków są skierowane w dół.Trzymaj próbki w temperaturze minus 90 stopni Celsjusza przez dodatkowe osiem do 10 godzin, zanim ogrzejesz się do minus 60 stopni Celsjusza w ciągu trzech godzin. Zastąp roztwór FSF 1 w pojemniku wstępnie schłodzonym acetonem i inkubuj w temperaturze minus 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Powtórz to pranie acetonem dwukrotnie.Rozgrzej się do minus 30 stopni Celsjusza w ciągu trzech godzin. W międzyczasie przygotuj i wstępnie schłodź dwa mililitry roztworu FSF 2 w dwumililitrowej probówce wirówkowej w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza. Zastąp aceton roztworem FSF 2 i inkubuj w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza przez trzy godziny.Następnie zastąp roztwór FSF 2 w pojemniku wstępnie schłodzonym acetonem i inkubuj przez 30 minut w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza. Powtórz to pranie acetonem dwukrotnie. Ogrzej się od minus 30 do czterech stopni Celsjusza w ciągu dwóch godzin.Zastąp aceton dwoma mililitrami buforu o pojemności 0,2 mola. Zmień bufor raz i inkubuj w temperaturze pokojowej lub czterech stopniach Celsjusza przez noc. Weź wstępnie przygotowany dysk szafirowy poddany działaniu HPF i FSF zawierający stabilne komórki HeLA, przemyj go buforem PBSA przez pięć minut i powtórz ten proces trzy razy.Przenieś krążki szafirowe do 35-milimetrowej naczynia hodowlanej zawierającej jeden mililitr buforu PBSA w temperaturze pokojowej. Zastąp bufor PBSA w naczyniu hodowlanym jednym mililitrem roztworu redukującego i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Przygotuj prekursor złota w jednym mililitrze roztworu redukującego i natychmiast wymieszaj przez wirowanie.Dodaj 80 mikrolitrów 500-milimolowej depenicylaminy w podwójnie destylowanej wodzie do roztworu prekursora złota i natychmiast wiruj. Zastąp roztwór w naczyniu hodowlanym jednym mililitrem roztworu prekursora złota i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodać od 20 do 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu borowodorku sodu do roztworu prekursora złota.Natychmiast wstrząśnij, aby dobrze wymieszać i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zastąp roztwór dwoma mililitrami buforu PBSA, aby zatrzymać reakcję. Następnie przygotuj mieszaninę żywicy epoksydowej zgodnie z instrukcjami producenta.Przenieś szafirowe krążki do kapsułek z płaskim dnem i infiltruj żywicą przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Polimeryzować próbkę w temperaturze 60 stopni Celsjusza w piekarniku przez co najmniej 18 godzin. Przygotuj ultracienkie sekcje spolimeryzowanej próbki, ostrożnie przycinając bloki próbki za pomocą brzytwy, aby odsłonić krążki szafiru.Zanurz końcówki bloków z szafirowymi krążkami w ciekłym azocie na kilka sekund i rozmroź w temperaturze pokojowej. Powtórz czynność zamrażania i rozmrażania kilka razy, aby odłączyć dyski od bloków. Białko EGFP-Mtn-KDEL pojawiło się jako nanocząstki złota o rozmiarach od dwóch do pięciu nanometrów, rozmieszczone wyłącznie w obwodowym świetle ER i w przestrzeni okołojądrowej otoczki jądrowej.Dobrze zachowana ultrastruktura umożliwiła identyfikację pojedynczych cząsteczek znakowanych białek i ułatwiła analizę interakcji organelli, takich jak interakcje mitochondriów ER. Nanocząstki białka Ost4-EGFP-MTn wyznaczyły błonę ER w zewnętrznej błonie otoczki jądrowej. Podobnie, komórki eksprymujące Mito-acGFP-MTn wykazywały specyficzne znakowanie w macierzy mitochondrialnej.

direct-synthesis-em-visible-gold-nanoparticles-cells-for-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie na mikrografiach elektronowych. Najpierw lokalizacja fluorescencji odbywa się przy użyciu mikroskopii lokalizacyjnej aktywowanej foto-indukcyjnie na ultracienkich przekrojach. Następnie obrazy te są dopasowywane do mikrografii elektronowych tego samego przekroju.

Nano-fEM: Lokalizacja białek z wykorzystaniem mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej i mikroskopii elektronowej

Ten film opisuje BiFC-PALM ― połączenie fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej i dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji ― do oceny interakcji białko-białko. BiFC polega na fuzji dwóch fluorescencyjnych fragmentów białek z dwoma oddziałującymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, fragmenty są zbliżane do siebie, co pozwala obu częściom połączyć się i odtworzyć funkcjonalne białko fluorescencyjne. Fluorescencja pojedynczego fluoroforu...

Mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej sprzężona z fluorescencją fluorescencji bimolekularnej

Drożdże, Saccharomyces cerevisiae, były kluczowym organizmem modelowym do identyfikacji i badania genów regulujących biogenezę i funkcje układu endosomalnego. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół specyficznego znakowania przedziałów endosomalnych do badań ultrastrukturalnych.

Znakowanie nanozłotem układu endosomalnego drożdży do analiz ultrastrukturalnych

Obrazowanie spektroskopowe elektronów może obrazować i odróżniać kwas nukleinowy od białka z rozdzielczością nanometrów. Można go połączyć z systemem miniSOG, który jest w stanie specyficznie znakować znakowane białka w próbkach z transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Zastosowanie tych technologii ilustrujemy na przykładzie dwuniciowych ognisk naprawy pęknięć.

Wizualizacja białek naprawczych DNA oznaczonych tagami miniSOG w połączeniu z obrazowaniem spektroskopowym elektronów (ESI)

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Metoda postembed immunogold jest jednym z najskuteczniejszych sposobów dostarczania wysokorozdzielczych analiz subkomórkowej lokalizacji określonych molekuł. Tutaj opisujemy protokół ilościowej analizy receptorów glutaminianu w synapsach wstęgowych siatkówki.

Ilościowa analiza immunozłota o wysokiej rozdzielczości receptorów błonowych w synapsach wstęgowych siatkówki

Opisujemy metodę syntezy biokompatybilnych nanocząsteczek złota 10 nm, funkcjonalizowanych przez powlekanie powierzchni glikolu polietylenowego. Cząstki te mogą być wykorzystywane in vitro i in vivo do dostarczania środków terapeutycznych do nanoskalowych przestrzeni komórkowych i zewnątrzkomórkowych, które są trudno dostępne przy konwencjonalnych rozmiarach nanocząstek.

Synteza funkcjonalizowanych cząstek złota pokrytych polimerem 10 nm do celowania w śródbłonek i dostarczania leków

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Opisana jest niezawodna i łatwo odtwarzalna metoda przygotowania funkcjonalnych, emitujących światło podczerwone fotoluminescencyjnych nanoklastrów złota i ich bezpośredniego wykrywania wewnątrz komórek HeLa za pomocą cytometrii przepływowej i konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Synteza nanoklastrów złota emitujących promieniowanie bliskiej podczerwieni do zastosowań biologicznych

Ten protokół opisuje metodę cryoAPEX, w której białko błonowe oznaczone znacznikiem APEX2 może być zlokalizowane za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej w optymalnie zachowanej ultrastrukturze komórki.

Metoda CryoAPEX do analizy mikroskopii elektronowej lokalizacji białek błonowych w komórkach zachowanych ultrastrukturalnie

Ten protokół prezentuje technikę mapowania miejsc replikacji w strukturalnie zachowanej chromatynie in situ, która wykorzystuje kombinację wstępnego znakowania EdU-streptawidyny-Nanogold i ChromEMT.

Obrazowanie domen replikacyjnych w ultrastrukturalnie zachowanej chromatynie za pomocą tomografii elektronowej

Poznaj nową technologię etykietowania EM do detekcji białek z tagami metalotioneinowymi w komórkach. Metoda umożliwia wizualizację pojedynczych cząsteczek przy zachowanej ultrastrukturze.

Bezpośrednia synteza widocznych dla EM-widocznych nanocząstek złota w komórkach do analizy lokalizacji białek z dobrze zachowaną ultrastrukturą (Wideo) | JoVE Journal

Bezpośrednia synteza widocznych dla EM-widocznych nanocząstek złota w komórkach do analizy lokalizacji białek z dobrze zachowaną ultrastrukturą

Przeglądaj więcej filmów