Bezpośrednia synteza widocznych dla EM-widocznych nanocząstek złota w komórkach do analizy lokalizacji białek z dobrze zachowaną ultrastrukturą
April 28th, 2023
Obecny protokół opisuje technologię znakowania za pomocą klonowalnego mikroskopu elektronowego do wykrywania białek znakowanych metalotioneiną w komórkach za pomocą nowatorskiej techniki syntezy nanocząstek złota opartej na mechanizmie tłumienia autonukleacji.
Wykrywanie i lokalizacja białek są niezbędne w badaniach biologicznych. Nasz protokół opisuje nowatorską technologię znakowania EM przy użyciu genetycznie kodowanych znaczników, która umożliwia wizualizację pojedynczej cząsteczki in situ z dobrze zachowaną ultrastrukturą. Bardzo ważne jest, aby unikać nadmiernej fiksacji.
Metoda znakowania opiera się na aktywności cystein w znacznikach, które są bardzo wrażliwe na sieciowanie aldehydów. Nasz protokół unika stosowania utrwalaczy aldehydowych, a jednocześnie zachowuje aktywność znacznika i ultrastrukturę. Znakowanie EM zawsze było wyzwaniem, cierpiało z powodu złej morfologii lub nieefektywnego etykietowania.
Nasz protokół syntetyzuje resztkowe nanocząstki bezpośrednio na pojedynczych białkach, aby zapewnić jasną i precyzyjną lokalizację docelowych białek z wysokim stosunkiem sygnału do szumu, wysoką wydajnością i swoistością. Do tej pory udało nam się osiągnąć doskonałe znakowanie w izolowanych białkach, komórkach E. coli, komórkach wielkanocnych i komórkach HeLa. Zbadamy i zoptymalizujemy metodę aplikacji do próbek tkanek.
Połączenie dominujących technologii cryo-FIB i cryo-EM pozwoli nam odpowiedzieć na ważne pytania biologiczne. Przenieś krążki szafirowe o wymiarach trzy milimetry na 0,16 milimetra do dwumililitrowej probówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr etanolu i poddaj ją sonikacji w myjce ultradźwiękowej przez 10 minut. Spal każdy krążek szafiru w płomieniu lampy alkoholowej, aż na powierzchni nie będzie widocznych osadów.
Oznacz jedną stronę każdej szafirowej tarczy numerem za pomocą pisaka odpornego na rozpuszczalniki. Umieść oznakowane szafirowe krążki na dnie 35-milimetrowej naczynia hodowlanego oznaczoną stroną do góry. Sterylizuj naczynie do hodowli komórkowych za pomocą szafirowych krążków w świetle ultrafioletowym przez 30 minut.
Odwróć szafirowe krążki pęsetą, upewniając się, że oznaczona strona jest skierowana w dół i sterylizuj w świetle ultrafioletowym przez dodatkowe 30 minut. Zasiej stabilne linie komórkowe HeLa wyrażające znaczniki MTN na przygotowanych krążkach szafirowych. I rosną do 80 do 90% zbieżności w inkubatorze komórkowym.
Przygotuj wysokociśnieniową maszynę do zamrażania lub HPF co najmniej dwie godziny przed rozpoczęciem eksperymentu zgodnie z instrukcjami producenta. Przenieś aluminiowe nośniki HPF typu A do dwumililitrowej probówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr etanolu i poddaj je sonikacji w myjce ultradźwiękowej przez 10 minut. Wysuszyć nośniki na szalce Petriego pokrytej wysokiej jakości bibułą filtracyjną.
Namocz wstępnie oczyszczone nośniki w 1-heksadecenie. Użyj cienkiej pęsety, aby podnieść wstępnie przygotowany dysk szafirowy z naczynia do hodowli komórkowych HeLa. Dotknij oznaczonej powierzchni wysokiej jakości bibułą filtracyjną, aby usunąć nadmiar pożywki.
Zamontuj szafirowy krążek w uchwycie na próbki HPF i szybko przykryj dysk aluminiowym nośnikiem o głębokości 0,025 milimetra zawierającym 1-heksadecen. Odessać nadmiar roztworu za pomocą wysokiej jakości bibuły filtracyjnej. Załaduj uchwyt próbki do zamrażania pod wysokim ciśnieniem.
Rozładuj zespół nośnika dysku szafirowego pod ciekłym azotem w piankowym pudełku kriogenicznym. Przygotować dwa mililitry wolnego utrwalacza podstawiającego lub roztworu FSF 1 w 20-milimetrowym okrągłym pojemniku z polipropylenu w dygestoriach i zamrozić go za pomocą ciekłego azotu. Użyj pary wstępnie schłodzonych pęset, aby załadować szafirowe krążki i zespoły nośne do pojemnika z zamrożonym roztworem FSF 1 w ciekłym azocie.
Przenieść ten pojemnik do wstępnie schłodzonej, zautomatyzowanej, wolnej komory maszyny do substytucji w celu przetwarzania FSF w temperaturze minus 90 stopni Celsjusza. Przechowuj próbki w temperaturze minus 90 stopni Celsjusza przez godzinę. Następnie oddziel szafirowe krążki od nośników za pomocą wstępnie schłodzonej pęsety, upewniając się, że zaznaczone boki szafirowych krążków są skierowane w dół.
Trzymaj próbki w temperaturze minus 90 stopni Celsjusza przez dodatkowe osiem do 10 godzin, zanim ogrzejesz się do minus 60 stopni Celsjusza w ciągu trzech godzin. Zastąp roztwór FSF 1 w pojemniku wstępnie schłodzonym acetonem i inkubuj w temperaturze minus 60 stopni Celsjusza przez godzinę. Powtórz to pranie acetonem dwukrotnie.
Rozgrzej się do minus 30 stopni Celsjusza w ciągu trzech godzin. W międzyczasie przygotuj i wstępnie schłodź dwa mililitry roztworu FSF 2 w dwumililitrowej probówce wirówkowej w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza. Zastąp aceton roztworem FSF 2 i inkubuj w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza przez trzy godziny.
Następnie zastąp roztwór FSF 2 w pojemniku wstępnie schłodzonym acetonem i inkubuj przez 30 minut w temperaturze minus 30 stopni Celsjusza. Powtórz to pranie acetonem dwukrotnie. Ogrzej się od minus 30 do czterech stopni Celsjusza w ciągu dwóch godzin.
Zastąp aceton dwoma mililitrami buforu o pojemności 0,2 mola. Zmień bufor raz i inkubuj w temperaturze pokojowej lub czterech stopniach Celsjusza przez noc. Weź wstępnie przygotowany dysk szafirowy poddany działaniu HPF i FSF zawierający stabilne komórki HeLA, przemyj go buforem PBSA przez pięć minut i powtórz ten proces trzy razy.
Przenieś krążki szafirowe do 35-milimetrowej naczynia hodowlanej zawierającej jeden mililitr buforu PBSA w temperaturze pokojowej. Zastąp bufor PBSA w naczyniu hodowlanym jednym mililitrem roztworu redukującego i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Przygotuj prekursor złota w jednym mililitrze roztworu redukującego i natychmiast wymieszaj przez wirowanie.
Dodaj 80 mikrolitrów 500-milimolowej depenicylaminy w podwójnie destylowanej wodzie do roztworu prekursora złota i natychmiast wiruj. Zastąp roztwór w naczyniu hodowlanym jednym mililitrem roztworu prekursora złota i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dodać od 20 do 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu borowodorku sodu do roztworu prekursora złota.
Natychmiast wstrząśnij, aby dobrze wymieszać i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zastąp roztwór dwoma mililitrami buforu PBSA, aby zatrzymać reakcję. Następnie przygotuj mieszaninę żywicy epoksydowej zgodnie z instrukcjami producenta.
Przenieś szafirowe krążki do kapsułek z płaskim dnem i infiltruj żywicą przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Polimeryzować próbkę w temperaturze 60 stopni Celsjusza w piekarniku przez co najmniej 18 godzin. Przygotuj ultracienkie sekcje spolimeryzowanej próbki, ostrożnie przycinając bloki próbki za pomocą brzytwy, aby odsłonić krążki szafiru.
Zanurz końcówki bloków z szafirowymi krążkami w ciekłym azocie na kilka sekund i rozmroź w temperaturze pokojowej. Powtórz czynność zamrażania i rozmrażania kilka razy, aby odłączyć dyski od bloków. Białko EGFP-Mtn-KDEL pojawiło się jako nanocząstki złota o rozmiarach od dwóch do pięciu nanometrów, rozmieszczone wyłącznie w obwodowym świetle ER i w przestrzeni okołojądrowej otoczki jądrowej.
Dobrze zachowana ultrastruktura umożliwiła identyfikację pojedynczych cząsteczek znakowanych białek i ułatwiła analizę interakcji organelli, takich jak interakcje mitochondriów ER. Nanocząstki białka Ost4-EGFP-MTn wyznaczyły błonę ER w zewnętrznej błonie otoczki jądrowej. Podobnie, komórki eksprymujące Mito-acGFP-MTn wykazywały specyficzne znakowanie w macierzy mitochondrialnej.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia nową technologię znakowaniu za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) zaprojektowaną do wykrywania białek z metkowane metallothionein w komórkach. Wykorzystując mechanizm do tłumienia autonukleacji, metoda umożliwia precyzyjne wizualizowanie pojedynczych cząsteczek przy zachowaniu ultrastruktury komórkowej.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Mikroskopia
- Lokalizacja i wykrywanie białek
Tło
- Wykrywanie i lokalizowanie białek jest kluczowe dla różnych zastosowań w badaniach biologicznych.
- Tradycyjne metody znakowaniu EM często kompromituje morfologię i wydajność.
- Genetycznie kodowane metki mogą zwiększyć czułość i swoistość wykrywania białek.
Stosowane metody
- Nowa technologia znakowaniu EM, która unika utleniaczy aldehydowych, aby zachować aktywność białek.
- Zastosowanie na izolowanych białkach, E. coli, komórkach Easter i komórkach HeLa.
- Łączenie technologii cryo-FIB i cryo-EM dla ulepszonych obrazów.
Główne wyniki
- Udana synteza nanocząstek złota bezpośrednio na pojedynczych białkach.
- Osiągnięto jasną i precyzyjną lokalizację z wysoką wartością stosunku sygnał-szum.
- Zweryfikowano wydajność i swoistość metody na różnych próbkach biologicznych.
Wnioski
- To badanie pokazuje znaczący postęp w technologiach wykrywania białek.
- Metoda daje nadzieję na rozwiązanie kluczowych pytań biologicznych na poziomie molekularnym.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Precise protein localization at ultrastructural resolution is a critical inflection point for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The direct synthesis of EM-visible gold nanoparticles on genetically encoded tags enables single-molecule visualization in situ, supporting predictive confidence for target engagement and pathway mapping. This capability strengthens translational continuity from discovery through preclinical research by preserving native cellular architecture.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution mapping of protein localization to clarify target biology.
- Supports functional validation of engineered tags in both prokaryotic and eukaryotic systems.
- Facilitates mechanistic de-risking by preserving ultrastructure during detection.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway assignment.
Screening & Assay Development
- Provides robust, reproducible labeling for quantitative protein detection in cell-based assays.
- Standardizes EM probe generation using clonable tags for scalable workflows.
- Delivers high signal-to-noise outputs, enabling reliable compound evaluation in screening campaigns.
- Prepares validated biological systems for downstream EM-based analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns protein localization data with disease-relevant ultrastructural contexts.
- Supports continuity from single-cell discovery to tissue-level preclinical validation.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by providing ultrastructural evidence of target engagement.
- Facilitates biomarker alignment through precise subcellular mapping.
Pipeline & Workflow Integration
This EM labeling technology integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and mechanistic validation.
- Discovery Biology: Advances hypothesis-driven interrogation of protein function and localization in native cellular environments.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative EM readouts for assay development and compound triage.
- Analytics: Provides high-efficiency, high-specificity nanoparticle labeling for comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges single-molecule detection with ultrastructural disease models for biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform for standardized EM probe generation across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of EM-based protein detection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing ultrastructural evidence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM sample preparation and genetically encoded tag design.
- Needs access to high-pressure freezing, freeze-substitution, and advanced EM instrumentation.
- Demands cross-team standardization of fixation and labeling protocols for reproducibility.
- Adaptation to tissue samples and diverse model systems may require further optimization.
- Tag sensitivity to aldehyde fixatives necessitates careful protocol adherence to preserve activity.
