Nieinwazyjne uszkodzenie więzadła krzyżowego przedniego (ACL) wywołane kompresją i obrazowanie in vivo aktywności proteazy u myszy

Nasze laboratorium wykorzystuje mysie modele pourazowej choroby zwyrodnieniowej stawów do zbadania wczesnych procesów po urazach stawów, takich jak zerwanie więzadła krzyżowego przedniego lub ACL, oraz tego, jak te wczesne zdarzenia mogą prowadzić do zwyrodnienia tkanek i progresji choroby zwyrodnieniowej stawów. W szczególności jesteśmy zainteresowani dowiedzeniem się, jak ćwiczenia lub odpoczynek po kontuzji mogą wpłynąć na długoterminowe zdrowie stawów. Dostępnych jest wiele zwierzęcych modeli choroby zwyrodnieniowej stawów i wszystkie z nich są przydatne do badania niektórych pytań badawczych.

Niektóre z wyzwań eksperymentalnych w tej dziedzinie to wybór odpowiednich modeli badania, określenie, jakich technik użyć do oceny progresji choroby zwyrodnieniowej stawów oraz w jakim momencie przeprowadzisz tę analizę. Ta metoda kontuzji kolana jest bardzo szybka i łatwa do wykonania. Zastosowanie nieinwazyjnego urazu wywołanego kompresją pozwala nam również na badanie reakcji stawu we wczesnych punktach czasowych.

A ponieważ nie ma zabiegu chirurgicznego, możemy użyć obrazowania optycznego in vivo, aby śledzić aktywność proteusza w ich stawie. W przyszłości planujemy wykorzystać różne szczepy genetyczne myszy, niektóre z nich są podatne na chorobę zwyrodnieniową stawów, a niektóre są odporne na chorobę zwyrodnieniową stawów, aby określić, w jaki sposób pewne aspekty reakcji zapalnej przyczyniają się do gojenia się stawów lub ich zwyrodnienia po urazie. Aby rozpocząć, otwórz oprogramowanie kompatybilne z instrumentem ramy obciążeniowej i wybierz istniejący plik kontrolny do analizy.

Włącz siłownik. W menu Kalibracja zmierz odczyt siły ogniwa obciążnikowego i ustaw przemieszczenie siłownika na 0. Po upewnieniu się, że mysz jest w pełni znieczulona przez uszczypnięcie palca u nogi lub ogona, umieść ją w pozycji leżącej na platformie.

Ustaw dolną nogę pionowo między dwoma urządzeniami załadowczymi. Dopasuj stopę do wycięcia w górnym mocowaniu, a kolano w miseczkę dolnego uchwytu. Ręcznie wyreguluj wysokość dolnego uchwytu, aby zastosować napięcie wstępne 1-2 niutonów, i dokręć ustalającą, aby utrzymać mysz na miejscu.

Następnie przyłóż pojedyncze obciążenie ściskające do siły docelowej 12-15 niutonów. Ustawić szybkość obciążenia w pliku kontrolnym i zatwierdzić, korzystając z danych dotyczących przemieszczenia siły. W przypadku zastosowania wolniejszego obciążenia należy zatrzymać obciążenie ściskające natychmiast po urazie, aby uniknąć uszkodzenia innych tkanek stawowych.

Przygotuj strzykawkę insulinową o rozmiarze 29 do wstrzykiwania roztworu sondy aktywowanej fluorescencją. Umieść znieczuloną mysz na boku z pyskiem w stożku nosowym. Ręką bez iniekcji delikatnie cofnij skórę wokół oka, aby ustabilizować głowę i wysunąć oko.

Używając ręki do wstrzykiwania, ustawić kąt nachylenia strzykawki w kierunku oka. Ustawić strzykawkę pod kątem równolegle do ciała myszy i ostrożnie przesuwać strzykawkę poza oko, aż do napotkania sztywnego oporu. Powoli wstrzyknąć roztwór sondy do zatoki zadoczodołowej i wyciągnąć igłę z oczodołu.

Na koniec nałóż maść na wstrzyknięte oko. Na początek umieść znieczuloną mysz na wznak w systemie obrazowania z pyskiem w stożku nosowym. Ustaw mysz tak, aby dolne części nóg były wyprostowane, a kolana lekko skierowane w powietrze.

Otwórz kompatybilne oprogramowanie na komputerze systemu obrazowania. W panelu sterowania akwizycji kliknij Zainicjuj, aby rozgrzać system i poczekaj, aż kontrolka temperatury zmieni kolor na zielony, a następnie kliknij Kreator obrazowania. Po kliknięciu Filter Pair upewnij się, że ustawienie jest skonfigurowane dla oświetlenia epi.

Następnie naciśnij Dalej. Z listy rozwijanej znajdź interesującą Cię sondę, aby wybrać prawidłowe ustawienia wzbudzenia i emisji, a następnie kliknij przycisk Dalej. Wybierz Mysz dla obrazowania obiektu.

W obszarze Exposure Parameters (Parametry ekspozycji) upewnij się, że opcja Auto Settings (Ustawienia automatyczne) jest zaznaczona i wybrane są opcje Fluorescence (Fluorescencja) i Photograph (Zdjęcie). Na liście kontrolnej pola widzenia wybierz od D do 22,6 centymetra i naciśnij Dalej. Po upewnieniu się, że wszystkie ustawienia są poprawne, naciśnij przycisk Uzyskaj sekwencję i upewnij się, że obraz ma odpowiednią ekspozycję.

Aby przeanalizować obraz, umieść okrąg obszaru zainteresowania o stałej wielkości nad każdym stawem kolanowym na czarno-białym obrazie. Oblicz całkowity niedobór promieniowania i średni niedobór promieniowania dla każdego stawu kolanowego. Jeśli niedobór promieniowania jest obliczany również na nogach przeciwległych, znormalizuj dane, dzieląc pomiar niedoboru promieniowania dla uszkodzonej nogi przez pomiar nogi przeciwległej.

Obrazowanie fluorescencyjne wykazało znacznie większą aktywność proteazy w uszkodzonych stawach myszy w porównaniu z myszami zdrowymi. Uszkodzone stawy wykazywały o 43% większy średni niedobór promieniowania w porównaniu ze stawami przeciwległymi i stawami u nieuszkodzonych myszy. O 30-80% większy niedobór promieniowania zaobserwowano w uszkodzonych stawach w porównaniu ze stawami przeciwległymi po dwóch tygodniach od urazu.

W przeciwieństwie do tego, stawy chirurgicznie operowane wykazywały o 300% większą skuteczność promieniowania w czwartym tygodniu w porównaniu ze stawami przeciwstawnymi, co sugeruje zauważalny efekt mylący operacji.