Name: Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj metody obrazowania transportu błonowego w komórkach linii szparkowej Arabidopsis thaliana. Techniki te pozwalają badać kluczowe procesy rozwoju aparatów szparkowych i odpowiedzi roślin na stres abiotyczny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation (IOS-2217757) (X.Q.) oraz University of Arkansas for Medical Sciences (UAMS) Bronson Foundation Award (H.Z.).

1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór do sterylizacji nasion, mieszając 15 mL wybielacza z 35 mL wody destylowanej i 50 µL Triton X-100.</li>
	<li>Przygotuj roztwór brefeldyny A (BFA), rozpuszczając proszek BFA w etanolu do stężenia końcowego 10 mM (roztwór zapasowy). Przygotuj roztwór wortmanniny (Wm), rozpuszczając proszek Wm w DMSO do stężenia końcowego 10 mM (roztwór zapasowy).</li>
</ol>
2. Sianie nasion
<ol>
	<li>Odmierz 10-50 nasion z każdej z wymaganych roślin transgenicznych do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Do każdej probówki dodaj 1 mL roztworu do sterylizacji nasion i dokładnie wymieszaj, delikatnie odwracając probówkę przez 10 min na wytrząsarce.</li>
	<li>Wylej roztwór do sterylizacji nasion i pięciokrotnie przemyj nasiona 1 mL autoklawowanej wody destylowanej.</li>
	<li>Do każdej probówki dodaj 300 µL autoklawowanej wody destylowanej, a następnie wysiej nasiona na pożywkę MS o połowicznym stężeniu, zawierającą 1% (w/v) sacharozy i 0,75% (w/v) agaru. W razie potrzeby uzupełnij pożywkę odpowiednimi antybiotykami.</li>
	<li>Przechowuj płytkę odwróconą do góry dnem w temperaturze 4 °C w ciemności przez 2 dni w celu synchronizacji kiełkowania.</li>
	<li>Po 2 dniach przenieś płytkę do pomieszczenia wzrostowego z cyklem 16 h światła / 8 h ciemności (80 µmol/m2/s1) w temperaturze 22 °C. Jest to uznawane za pierwszy dzień po kiełkowaniu (1 dpg).</li>
	<li>W 10 dpg przesadź siewki do gleby w celu dalszego wzrostu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie dwukolorowych roślin transgenicznych F1
<ol>
	<li>Uprawiaj obok siebie homozygotyczne rośliny transgeniczne niosące ERL1-YFP (roślina A) oraz homozygotyczne rośliny transgeniczne niosące białko markerowe znakowane RFP RFP-Ara7 (roślina B)20 aż do kwitnienia, w pomieszczeniu wzrostowym z cyklem 16 h światła/8 h ciemności (80 µmol/m2/s1) w temperaturze 22 °C.</li>
	<li>Wybierz młody kwiatostan z rośliny A. Dla krzyżówek genetycznych pozostaw na kwiatostanie jeden kwiat, który właśnie zaczyna się otwierać. Usuń wszystkie starsze kwiaty i strąki. Dodatkowo ostrożnie usuń młodsze kwiaty oraz merystemy kwiatowe, aby uniknąć późniejszej pomyłki.</li>
	<li>Delikatnie przeprowadź wiwisekcję nieotwartego kwiatu, usuwając kielichy, płatki i pręciki za pomocą ostrych pęset. Na kwiatostanie pozostaw jedynie słupek.</li>
	<li>Pobierz dojrzały pręcik z otwartego kwiatu rośliny B i przenieś ziarna pyłku na zniewlecenie zdissekowanego słupka rośliny A.</li>
	<li>Oznacz ten kwiat skrzyżowany ręcznie, wskazując rodzica męskiego, rodzica żeńskiego oraz datę krzyżówki genetycznej. Pozostaw kwiat do dojrzałości i zbierz nasiona F1, gdy strąk zmieni kolor na żółto-brązowy (~20 dni po krzyżówce). Sprawdź, czy uzyskano udaną roślinę F1 wykazującą sygnały zarówno YFP, jak i RFP.</li>
</ol>
4. Leczenie farmakologiczne
<ol>
	<li>W przypadku traktowania BFA należy usunąć liścienie z 7-dniowych siewek, zanurzyć pozostałą część siewek w roztworze kontrolnym (0,3% etanolu) lub w 30 µM roztworze BFA, zastosować próżnię przez 1 min, a następnie pozostawić próbkę w roztworze przez 30 min przed obrazowaniem.</li>
	<li>W przypadku traktowania wortmanniną należy usunąć liścienie z 7-dniowych siewek, zanurzyć pozostałą część siewek w 0,25% roztworze DMSO lub w 25 mM wortmanninie, zastosować próżnię przez 1 min, a następnie pozostawić próbkę w roztworze przez 30 min przed obrazowaniem.</li>
	<li>W celu poddania próbek działaniu próżni, do probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 mL należy dodać 500 µL odpowiedniego roztworu leku i zanurzyć w nim wypreparowane siewki. Należy szczelnie przymocować strzykawkę o pojemności 10 mL do probówki mikrocentryfugowej i zastosować próżnię przez 1 min (Rysunek 1). Po usunięciu strzykawki próbkę należy pozostawić w roztworze przez wymagany czas. Następnie siewki należy ostrożnie wyjąć w celu przygotowania do obrazowania.</li>
</ol>
<img alt="Strzykawka, sprzęt laboratoryjny do precyzyjnego pomiaru cieczy, stosowany w układach chromatograficznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Proste urządzenie próżniowe. Strzykawka 10 mL jest przymocowana do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL w celu przeprowadzenia obróbki próżniowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
5. Przygotowanie próbek do obrazowania
<ol>
	<li>Wyciąć liść właściwy z traktowanej próbki, używając ostrego ostrza brzytwy. Delikatnie umieścić liść właściwy w kropli wody na szkiełku przedmiotowym, stroną abaksjalną do góry. Powoli przykryć liść właściwy szkiełkiem nakrywkowym, unikając uwięzienia pęcherzyków powietrza.</li>
</ol>
6. Obrazowanie konfokalne
UWAGA: Do obrazowania sygnału fluorescencji próbek w niniejszej pracy wykorzystano odwrócony skaningowy mikroskop konfokalny Leica SP8.
<ol>
	<li>Konfiguracja ścieżki wiązki
	<ol>
		<li>Wybierz laser 514 nm do wzbudzenia YFP. Użyj wysokiej mocy lasera, aby zwiększyć intensywność sygnału i tym samym uzyskać wysoką jakość obrazu. Należy jednak pamiętać, że moc lasera powyżej 5% wiąże się z ryzykiem fotoblaknięcia i może negatywnie wpłynąć na stan próbki. Jeśli sygnał z próbki nie jest zbyt słaby, rozpocznij od niskiej intensywności lasera.</li>
		<li>Włącz PMT/HyD do detekcji i zdefiniuj górne oraz dolne progi pasma emisji na podstawie widma fluoroforu YFP. Ustaw okno detekcji 530-570 nm, aby zebrać sygnał YFP.</li>
		<li>Obrazowanie sekwencyjne dla drugiego koloru: Kliknij przycisk Seq i dodaj nowy kanał. Domyślnie wcześniej zaprojektowana ścieżka wiązki YFP będzie stanowiła Seq 1. W Seq 2 wybierz laser 561 nm do wzbudzenia RFP i ustaw okno detekcji 570-630 nm, aby zebrać sygnał RFP.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja warunków skanowania (Rysunek 2)
	<ol>
		<li>Aby obrazować aktywność transportu błonowego w obrębie subkomórkowym w komórkach prekursorowych szparek, do obrazowania wybierz w systemie obiektyw 63x/1.2 W Corr.</li>
		<li>Parametr format odnosi się do rozmiaru obrazu w pikselach. Rozpocznij od 1 024 pikseli x 1 024 pikseli, a następnie zoptymalizuj tę wartość w zależności od współczynnika powiększenia i ustawień obiektywu, aby uzyskać dobrą rozdzielczość o jakości publikacyjnej.</li>
		<li>Parametr speed odnosi się do prędkości głowicy skanującej podczas przechodzenia lasera przez każdy piksel. Chociaż wolne prędkości skanowania często skutkują lepszym stosunkiem sygnału do szumu, mogą one nie rejestrować efektywnie szybko zmieniających się zdarzeń transportu błonowego. Rozpocznij od prędkości 400 Hz i zoptymalizuj ją w zależności od specyfiki próbek.</li>
		<li>Współczynnik powiększenia zoom factor służy do powiększania obszaru zainteresowania bez zmiany obiektywu. Rozpocznij od współczynnika powiększenia 1 i zoptymalizuj go zgodnie z konkretnymi potrzebami eksperymentu.</li>
		<li>Parametr line average odnosi się do liczby razy, w których każda linia X zostanie zeskanowana w celu uzyskania wyniku uśrednionego. Większa średnia linii redukuje szum w powstałym obrazie, ale zwiększa czas skanowania i czas ekspozycji na światło laserowe. Aby obrazować zdarzenia transportu błonowego, nie należy stosować wysokiej średniej linii. Rozpocznij od średniej linii 2x i optymalizuj w razie potrzeby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie serii czasowej 
	UWAGA: Podczas badania zdarzeń transportu błonowego często wymagana jest seria czasowa, aby zarejestrować szybki ruch subkomórkowych endosomów.
	<ol>
		<li>W Trybie akwizycji (Acquisition Mode) wybierz tryb skanowania xyt, aby włączyć funkcję serii czasowej.</li>
		<li>Ustal czas oczekiwania między punktami czasowymi w sekcji Interwał czasowy (Time Interval). Alternatywnie kliknij Minimize , aby wykonywać zdjęcia bezpośrednio jedno po drugim. W poniższym eksperymencie z serią czasową zastosowano interwał czasowy 7 s.</li>
		<li>Wybierz Czas trwania (Duration) i wprowadź całkowity czas trwania eksperymentu. Alternatywnie zdefiniuj liczbę klatek do zebrania, wybierając Klatki (Frames) (Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zebrać trójwymiarowe informacje dotyczące zdarzenia transportu błonowego w obrębie całej komórki, użyj trybu skanowania Z-stack. Do analizy często wykorzystuje się maksymalną projekcję intensywności obrazów Z-stack.
	<ol>
		<li>Wybierz tryb skanowania xyz w Trybie akwizycji (Acquisition Mode), a następnie dostępna stanie się funkcja Z-Stack.</li>
		<li>Wybierz opcję Z-wide. W sekcji Tryb skanowania (Scan Mode) zdefiniuj górny i dolny obraz stosu Z, korzystając z przycisków Begin oraz End .</li>
		<li>Zdefiniuj grubość kroku z, klikając rozmiar kroku z (z-step size). Alternatywnie określ, ile obrazów należy wykonać, aby pokryć cały zakres stosu Z. Aby zapewnić spójność między próbkami, zdefiniuj rozmiar kroku z (Rysunek 4).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetwarzanie obrazów
	<ol>
		<li>Maksymalna projekcja intensywności obrazów z-stack jest generowana przez oprogramowanie konfokalne (http://www.leica-microsystems.com). W głównej karcie Proces (Process) wybierz najpierw interesujący plik z-stack w karcie Otwarte projekty (Open Projects) po lewej stronie. Następnie przejdź do środkowej karty o nazwie Narzędzia procesowe (Process Tools), wybierz funkcję Projekcja (Projection), wybierz opcję Maksymalna (Maximum) w panelu rozwijanym Metoda (Method) i kliknij przycisk Zastosuj (Apply). Obraz projekcji z-stack zostanie wygenerowany w karcie Otwarte projekty.</li>
		<li>Wideo z obrazów serii czasowej jest generowane przez program Fiji (https://imagej.net/Fiji). W karcie Plik (File) użyj funkcji Otwórz (Open), aby otworzyć wszystkie obrazy serii czasowej w odpowiedniej kolejności. W karcie Obraz (Image) znajdź funkcję Stos (Stack) i wybierz Obrazy do stosu (Images to stack), aby wygenerować wideo. Zapisz plik w formacie .avi z pożądaną częstliwością klatek (5 klatek/s dla Wideo 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Panel ustawień mikroskopii konfokalnej; akwizycja XYZ, format 1024x1024, przekrój optyczny 18,646 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Panel trybu skanowania w wymiarze XY. Panel trybu skanowania służy do konfiguracji warunków skanowania obrazu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Ustawienia nagrywania poklatkowego, interfejs konfiguracji odstępów czasowych w oprogramowaniu do przechwytywania wideo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Narzędzie szeregów czasowych w trybie skanowania xyt. Narzędzie szeregów czasowych służy do konfiguracji warunków obrazowania w celu sekwencyjnego zbierania serii obrazów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Interfejs stosu Z dla mikroskopii, ilustrujący sterowanie pozycją Z i ustawienia optymalizacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65257/65257fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Narzędzie stosu Z w trybie skanowania xyz. Narzędzie stosu Z służy do konfiguracji warunków obrazowania w celu zgromadzenia serii obrazów wzdłuż osi z. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65257/65257fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Spatiotemporal Investigation of ERL1 Dynamics via Confocal Imaging

<ol><li>Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+endomembrane+trafficking+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants.</a> Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).</li>
<li>Sigismund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+and+signaling%3A+Cell+logistics+shape+the+eukaryotic+cell+plan%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Endocytosis and signaling: Cell logistics shape the eukaryotic cell plan.</a> Physiological Reviews. 92 (1), 273-366 (2012).</li>
<li>Lyu, Z., Genereux, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+measuring+protein+trafficking+across+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemPlusChem%22%5BJournal%5D)">Methodologies for measuring protein trafficking across cellular membranes.</a> ChemPlusChem. 86 (10), 1397-1415 (2021).</li>
<li>Rodriguez-Furlan, C., Raikhel, N. V., Hicks, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+roads%3A+Chemical+tools+and+cell+biology+to+study+unconventional+protein+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Merging roads: Chemical tools and cell biology to study unconventional protein secretion.</a> Journal of Experimental Botany. 69 (1), 39-46 (2017).</li>
<li>Foissner, I., Sommer, A., Hoeftberger, M., Hoepflinger, M. C., Absolonova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+wortmannin-induced+reorganization+of+the+trans-Golgi+network+the+key+to+explain+charasome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Is wortmannin-induced reorganization of the trans-Golgi network the key to explain charasome formation.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 756(2016).</li>
<li>Qi, X., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+and+environmental+signals+guiding+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal and environmental signals guiding stomatal development.</a> BMC Biology. 16 (1), 21(2018).</li>
<li>Han, S. K., Kwak, J. M., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+lineage+control+by+developmental+program+and+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal lineage control by developmental program and environmental cues.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 751852(2021).</li>
<li>Bharath, P., Gahir, S., Raghavendra, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid-induced+stomatal+closure%3A+An+important+component+of+plant+defense+against+abiotic+and+biotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid-induced stomatal closure: An important component of plant defense against abiotic and biotic stress.</a> Frontiers in Plant Science. 12, 615114(2021).</li>
<li>Becklin, K. M., Ward, J. K., Way, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBecklin%2C+KM+%22Photosynthesis%2C+Respiration%2C+and+Climate+Change.%2C+1st+edition%22">Photosynthesis, Respiration, and Climate Change., 1st edition</a>. , Springer. Cham, Switzerland. (2021).</li>
<li>Yang, M., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+too+many+mouths+and+four+lips+mutations+affect+stomatal+production+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).</li>
<li>Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+peptide+gene+EPF1+enforces+the+stomatal+one-cell-spacing+rule%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule.</a> Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).</li>
<li>Hara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cell+density+is+autoregulated+via+a+secretory+peptide%2C+EPIDERMAL+PATTERNING+FACTOR+2+in+Arabidopsis+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves.</a> Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).</li>
<li>Hunt, L., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+peptide+EPF2+controls+asymmetric+cell+divisions+during+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development.</a> Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).</li>
<li>Sugano, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomagen+positively+regulates+stomatal+density+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis.</a> Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).</li>
<li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+density+is+controlled+by+a+mesophyll-derived+signaling+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule.</a> Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).</li>
<li>Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signalling+peptide+EPFL9+is+a+positive+regulator+of+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development.</a> New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).</li>
<li>Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+patterning+and+differentiation+by+synergistic+interactions+of+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases.</a> Science. 309 (5732), 290-293 (2005).</li>
<li>Lin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+receptor-like+protein+acts+as+a+specificity+switch+for+the+regulation+of+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A receptor-like protein acts as a specificity switch for the regulation of stomatal development.</a> Genes & Development. 31 (9), 927-938 (2017).</li>
<li>Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+of+ligand-receptor+pairs+specifying+stomatal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning.</a> Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+manifold+actions+of+signaling+peptides+on+subcellular+dynamics+of+a+receptor+specify+stomatal+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate.</a> Elife. 9, e58097(2020).</li>
<li>MacAlister, C. A., Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+control+of+asymmetric+cell+divisions+that+establish+the+stomatal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage.</a> Nature. 445 (7127), 537-540 (2007).</li>
<li>Pillitteri, L. J., Sloan, D. B., Bogenschutz, N. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+asymmetric+cell+division+and+differentiation+of+stomata%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata.</a> Nature. 445 (7127), 501-505 (2007).</li>
<li>Ohashi-Ito, K., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+FAMA+controls+the+final+proliferation%2Fdifferentiation+switch+during+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis FAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development.</a> Plant Cell. 18 (10), 2493-2505 (2006).</li>
<li>Kanaoka, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCREAM%2FICE1+and+SCREAM2+specify+three+cell-state+transitional+steps+leading+to+Arabidopsis+stomatal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">SCREAM/ICE1 and SCREAM2 specify three cell-state transitional steps leading to Arabidopsis stomatal differentiation.</a> Plant Cell. 20 (7), 1775-1785 (2008).</li>
<li>Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+development+and+pattern+controlled+by+a+MAPKK+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase.</a> Science. 304 (5676), 1494-1497 (2004).</li>
<li>Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+development+and+patterning+are+regulated+by+environmentally+responsive+mitogen-activated+protein+kinases+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 19 (1), 63-73 (2007).</li>
<li>Ho, C. M., Paciorek, T., Abrash, E., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulators+of+stomatal+lineage+signal+transduction+alter+membrane+contact+sites+and+reveal+specialization+among+ERECTA+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Modulators of stomatal lineage signal transduction alter membrane contact sites and reveal specialization among ERECTA kinases.</a> Developmental Cell. 38 (4), 345-357 (2016).</li>
<li>Le, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxin+transport+and+activity+regulate+stomatal+patterning+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Auxin transport and activity regulate stomatal patterning and development.</a> Nature Communications. 5, 3090(2014).</li>
<li>Geldner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+GNOM+ARF-GEF+mediates+endosomal+recycling%2C+auxin+transport%2C+and+auxin-dependent+plant+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis GNOM ARF-GEF mediates endosomal recycling, auxin transport, and auxin-dependent plant growth.</a> Cell. 112 (2), 219-230 (2003).</li>
<li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+regulation+of+stomatal+differentiation+potential+by+EPF1+and+ERECTA-LIKE1+ligand-receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Autocrine regulation of stomatal differentiation potential by EPF1 and ERECTA-LIKE1 ligand-receptor signaling.</a> Elife. 6, 24102(2017).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), 6172-6176 (2008).</li>
<li>Leighton, R. E., Alperstein, A. M., Frontiera, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+super-resolution+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free super-resolution imaging techniques.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 15 (1), 37-55 (2022).</li>
<li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy%3A+Present+technology+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy: Present technology and future trends.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+column+and+whole-brain+imaging+with+molecular+contrast+and+nanoscale+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical column and whole-brain imaging with molecular contrast and nanoscale resolution.</a> Science. 363 (6424), (2019).</li>
<li>Nwaneshiudu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Introduction to confocal microscopy.</a> Journal of Investigative Dermatology. 132 (12), (2012).</li>
<li>Sanderson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy.</a> Current Protocols. 3 (1), 634(2023).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

System endomembranowy rozdziela cytoplazmę komórki eukariotycznej na różne przedziały, co umożliwia wyspecjalizowaną funkcję biologiczną tych organelli. Aby dostarczyć białka ładunkowe i makrocząsteczki do miejsca docelowego we właściwym czasie, liczne pęcherzyki są kierowane do przemieszczania się między tymi organellami. Wysoce regulowane zdarzenia transportu błonowego odgrywają fundamentalną rolę w żywotności, rozwoju i wzroście komórek. Mechanizm regulujący ten kluczowy i skomplikowany proces jest wciąż słabo poznany...

Ruch błonowy to konserwatywny proces komórkowy, który rozdziela składniki błony (znane również jako ładunki), w tym białka, lipidy i inne produkty biologiczne, między różnymi organellami w komórce eukariotycznej lub przez błonę plazmatyczną do i z przestrzeni zewnątrzkomórkowej1. Proces ten jest ułatwiony przez zbiór błon i organelli zwanych systemem endomembranowym, który składa się z błony jądrowej, retikulum endoplazmatycznego, aparatu Golgiego, wakuoli/lizosomów, błony plazmatycznej i wielu endosomów1. System endomembranowy umożliwia modyfikację, pakowanie i transport elementów błony za pomocą dynamicznych pęcherzyków, które przemieszczają się między tymi organellami. Zdarzenia związane z transportem błonowym mają kluczowe znaczenie dla rozwoju, wzrostu i adaptacji do środowiska, a zatem podlegają rygorystycznym i złożonym regulacjom2. Obecnie opracowano i zastosowano wiele podejść w biologii molekularnej, biologii chemicznej, mikroskopii i spektrometrii mas w dziedzinie transportu błonowego i znacznie poszerzyły zrozumienie czasoprzestrzennej regulacji systemu endomembranowego3,4. Biologia molekularna jest wykorzystywana do klasycznych manipulacji genetycznych domniemanych graczy zaangażowanych w transport błonowy, takich jak zmiana ekspresji genu białka będącego przedmiotem zainteresowania lub oznaczanie białka będącego przedmiotem zainteresowania pewnymi znacznikami. Narzędzia w biologii chemicznej obejmują wykorzystanie molekuł, które specyficznie zakłócają ruch na określonych trasach4,5. Spektrometria mas jest skuteczna w identyfikacji składników organelli, która została mechanicznie wyizolowana za pomocą metod biochemicznych3,4. Jednak ruch błonowy jest dynamicznym, zróżnicowanym i złożonym procesem biologicznym1. Aby zobrazować proces transportu błonowego w żywych komórkach w różnych warunkach, niezbędnym narzędziem jest mikroskopia świetlna. Ciągły postęp został osiągnięty w zaawansowanych technikach mikroskopowych, aby sprostać wyzwaniom związanym z pomiarem wydajności, kinetyki i różnorodności zdarzeń4. W tym miejscu badanie to koncentruje się na szeroko stosowanych metodologiach w biologii chemicznej/farmakologicznej, biologii molekularnej i mikroskopii w celu zbadania zdarzeń transportu błonowego w naturalnie uproszczonym i eksperymentalnie dostępnym systemie, procesie rozwoju aparatów szparkowych.
Aparaty szparkowe to mikropory na powierzchniach roślin, które otwierają się i zamykają, aby ułatwić wymianę gazową między wewnętrznymi komórkami a środowiskiem6,7,8. W związku z tym aparaty szparkowe są niezbędne do fotosyntezy i transpiracji, dwóch zdarzeń, które mają kluczowe znaczenie dla przetrwania i wzrostu roślin. Rozwój aparatów szparkowych jest dynamicznie dostosowywany przez sygnały środowiskowe w celu optymalizacji adaptacji rośliny do otoczenia9. Począwszy od badań z 2002 roku, identyfikacja białka receptorowego Too Many Mouths (TMM) otworzyła drzwi do nowej ery badania molekularnych mechanizmów rozwoju aparatów szparkowych w modelowej roślinie Arabidopsis thaliana10. Już po kilku dekadach zidentyfikowano klasyczny szlak sygnałowy. Od góry do dalszej części szlak ten obejmuje grupę ligandów peptydów wydzielniczych z rodziny czynników wzorcowania naskórka (EFP), kilka kinaz receptorowych bogatych w powtórzenia leucyny (LRR) na powierzchni komórki w rodzinie EREECTA (ER), białko receptora LRR TMM, kaskadę MAPK i kilka czynników transkrypcyjnych bHLH, w tym SPEECHLESS (SPCH), MUTE, FAMA i SCREAM (SCRM)11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26. Wcześniejsze prace wskazują, że jedna z kinaz receptorowych, ER-LIKE 1 (ERL1), wykazuje aktywne zachowania subkomórkowe po percepcji EPF20. ERL2 również dynamicznie przemieszcza się między błoną plazmatyczną a niektórymi organellami wewnątrzkomórkowymi27. Zablokowanie etapów transportu błony powoduje nieprawidłowy wzór aparatów szparkowych, co skutkuje skupiskami aparatów szparkowych na powierzchni liścia28. Wyniki te sugerują, że ruch błonowy odgrywa istotną rolę w rozwoju aparatów szparkowych. W badaniu tym opisano protokół czasowo-przestrzennego badania dynamiki ERL1 za pomocą analizy kolokalizacji subkomórkowej białko-białko w połączeniu z leczeniem farmakologicznym przy użyciu niektórych inhibitorów transportu błonowego.

<table><tbody><tr><td>Strzykawki 10 ml</td><td>VWR</td><td>BD309695</td><td>Próbki próżniowe</td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>konfokalny</td><td>Leica</td><td>Lecia SP8 TCS z pakietem oprogramowania LAS-X</td><td>Kleszcze</td></tr><tr><td>prosektoryjne</td> do obrazowania <td>VWR</td><td>82027-402</td><td>Krzyżówka genetyczna</td></tr><tr><td>Fidżi</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>Przetwarzanie obrazu</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Leica LAS AF</td><td>Leica</td><td>http://www.leica-microsystems.com</td><td>Przetwarzanie obrazów</td></tr><tr><td>transgeniczne nasiona ERL1-YFP</td><td></td><td></td><td>Qi, X. et al. Wielorakie działanie peptydów sygnałowych na subkomórkową dynamikę receptora określa los komórek szparkowych. Życie w Egipcie. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).</td></tr><tr><td>transgeniczne nasiona RFP-Ara7</td><td></td><td></td><td>Ebine, K. i wsp. Szlak transportu błonowego regulowany przez specyficzną dla roślin GTPazę RAB ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).</td></tr><tr><td>Wortmannin (Wm)</td><td>Sigma</td><td>W1628</td><td>membranowy narkotyk do handlu</td></tr></tbody></table>

oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

W komórkach eukariotycznych składniki błony, w tym białka i lipidy, są czasoprzestrzennie transportowane do miejsca przeznaczenia w systemie endomembranowym. Obejmuje to transport wydzielniczy nowo zsyntetyzowanych białek na powierzchnię komórki lub na zewnątrz komórki, transport endocytarny ładunków zewnątrzkomórkowych lub składników błony plazmatycznej do komórki oraz recykling lub transport transportowy ładunków między organellami subkomórkowymi itp. Zdarzenia związane z transportem błonowym mają kluczowe znaczenie dla rozwoju, wzrostu i adaptacji środowiskowej wszystkich komórek eukariotycznych, a zatem podlegają ścisłej regulacji. Kinazy receptorowe na powierzchni komórki, które odbierają sygnały ligandowe z przestrzeni zewnątrzkomórkowej, przechodzą zarówno transport wydzielniczy, jak i endocytarny. Opisano tutaj powszechnie stosowane podejścia do badania zdarzeń transportu błonowego przy użyciu kinazy receptorowej bogatej w powtórzenia leucyny zlokalizowanej w błonie plazmatycznej, ERL1. Podejścia obejmują przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalne obrazowanie konfokalne. Aby monitorować czasoprzestrzenną regulację ERL1, w badaniu tym opisano analizę kolokalizacji między ERL1 a wielopęcherzykowym białkiem markerowym ciała, RFP-Ara7, analizę szeregów czasowych tych dwóch białek oraz analizę z-stack ERL1-YFP traktowaną inhibitorami transportu błonowego brefeldyną A i wortmanniną.

Poprzednie badanie wykazało, że ERL1 jest aktywną kinazą receptorową, która ulega dynamicznym procesom transportu błonowego20. ERL1 jest transbłonową kinazą receptorową LRR zlokalizowaną na błonie plazmatycznej. Nowo syntetyzowane białko ERL1 w retikulum endoplazmatycznym jest przetwarzane w aparatach Golgiego, a następnie transportowane do błony plazmatycznej. Cząsteczki ERL1 na błonie plazmatycznej mogą rozpoznawać ligandy EPF za pomocą swojej zewnątrzkomórkowej domeny LRR18</s...

Kilka powszechnie stosowanych metod jest tutaj wprowadzanych do badania zdarzeń transportu błonowego kinazy receptora błony komórkowej. Manuskrypt ten opisuje szczegółowe protokoły, w tym przygotowanie materiału roślinnego, leczenie farmakologiczne i konfokalną.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

Technika ta bada zdarzenia transportu błonowego w rozwoju aparatów szparkowych, mikropory na powierzchni roślin w celu ułatwienia fotosyntezy i transpiracji. Do badania rozwoju aparatów szparkowych roślin stosuje się różne techniki. Obejmuje to biologię molekularną, biologię komórki lub mikroskopię, biologię chemiczną, spektrometrię mas, biochemię i biologię strukturalną.Poszczególne aparaty szparkowe tworzą się asynchronicznie. Każda stomia jest tworzona przez trzy przejścia losu komórki. Tak więc zebranie wystarczającej liczby komórek linii aparatów szparkowych przy określonym losie komórki jest jednym z dużych wyzwań.Transport błonowy jest niezbędny do przetrwania i wzrostu komórek. Komórka rodowo-szparkowa nie jest wyjątkiem. Protokół ten odnosi się do powszechnie stosowanego podejścia do badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii aparatów szparkowych.Rośliny muszą stawić czoła wyzwaniom środowiskowym w obliczu zmian klimatycznych. Aparaty szparkowe są przejściami do wymiany gazowej w roślinie i są bardzo elastyczne na stres środowiskowy w celu adaptacji. Jesteśmy zainteresowani badaniem, w jaki sposób stres abiotyczny wpływa na rozwój aparatów szparkowych, koncentrując się na transporcie błonowym niektórych białek w komórkach linii aparatów szparkowych.Aby rozpocząć analizę farmakologiczną dwukolorowego rzodkiewnika pospolitego F1 thaliana, należy wypreparować i usunąć liścienie siedmiodniowych siewek transgenicznych. Dodaj 500 mikrolitrów 30-mikromolowego roztworu brefeldyny A lub BFA do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Zanurz w nim wypreparowane sadzonki.Szczelnie przymocuj 10-mililitrową strzykawkę do probówki mikrowirówki i zastosuj próżnię przez jedną minutę. Wyjąć strzykawkę przed inkubacją próbki w roztworze przez 30 minut przed obrazowaniem. Następnie zanurz wypreparowaną siedmiodniową sadzonkę w 25-milimolowym wortmanninie.Stosować próżnię przez jedną minutę przed inkubacją zanurzonej próbki przez 30 minut. Badanie szlaków przemytu ERL1 w roślinach transgenicznych wykazało, że 30 minut ekspozycji na roztwór brefeldyny A spowodowało wykrycie ERL1-YFP w dużych komorach znanych jako ciała BFA. Wskazano, że brefeldyna A może blokować transport ERL1, co sugeruje recykling lub endocytozę ERL1.Kiedy transgenicy byli traktowani wortmanninem przez 30 minut, struktury przypominające pierścienie zwane ciałami Wm zostały podświetlone przez ERL1-YFP. Okazało się, że ERL1-YFP były transportowane do ciał wielopęcherzykowych, co wskazuje, że ERL1 podążał za korzeniem do wakuoli w celu degradacji. Aby rozpocząć analizę farmakologiczną dwukolorowego rzodkiewnika pospolitego F1 thaliana, należy wypreparować i usunąć liścienie siedmiodniowych siewek transgenicznych.Dodaj 500 mikrolitrów 30-mikromolowego roztworu brefeldyny A lub BFA do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Zanurz w nim wypreparowane sadzonki. Szczelnie przymocuj 10-mililitrową strzykawkę do probówki mikrowirówki i zastosuj próżnię przez jedną minutę.Wyjąć strzykawkę przed inkubacją próbki w roztworze przez 30 minut przed obrazowaniem. Następnie zanurz wypreparowaną siedmiodniową sadzonkę w 25-milimolowym wortmanninie. Stosować próżnię przez jedną minutę przed inkubacją zanurzonej próbki przez 30 minut.Badanie szlaków przemytu ERL1 w roślinach transgenicznych wykazało, że 30 minut ekspozycji na roztwór brefeldyny A spowodowało wykrycie ERL1-YFP w dużych komorach znanych jako ciała BFA. Wskazano, że brefeldyna A może blokować transport ERL1, co sugeruje recykling lub endocytozę ERL1. Kiedy transgenicy byli traktowani wortmanninem przez 30 minut, struktury przypominające pierścienie zwane ciałami Wm zostały podświetlone przez ERL1-YFP.Okazało się, że ERL1-YFP były transportowane do ciał wielopęcherzykowych, co wskazuje, że ERL1 podążał za korzeniem do wakuoli w celu degradacji. Aby rozpocząć przygotowanie próbki, należy wyciąć prawdziwy liść z farmakologicznie potraktowanej próbki transgenicznej Arabidopsis thaliana za pomocą ostrej żyletki. Umieść prawdziwy liść na szkiełku podstawowym w kropli wody stroną z aosiem do góry.Powoli przykryj prawdziwy liść szkiełkiem nakrywkowym bez pęcherzyków powietrza. W przypadku obrazowania ustaw ścieżkę wiązki, wybierając laser 514-nanometrowy do cytowania żółtego białka fluorescencyjnego lub YFPX. Uzyskaj wysoką jakość obrazu dzięki zastosowaniu dużej mocy lasera.Włącz PMT lub HyD i zdefiniuj górne i dolne progi pasma emisji w oparciu o widmo dla fluoroforu YFP. Ustaw okno wykrywania od 530 do 570 nanometrów, aby zebrać sygnał YFP. Aby uzyskać sekwencyjny obraz drugiego koloru, kliknij przycisk Seq i dodaj nowy kanał.W Seq 2 wybierz laser o długości fali 555 nanometrów dla wzbudzenia czerwonego białka fluorescencyjnego lub zapytania ofertowego i ustaw okno wykrywania od 570 do 630 nanometrów, aby zebrać sygnał RFP. Wybierz soczewkę Corr 63x/1,2 W w systemie, aby obrazować aktywność ruchu błony subkomórkowej w komórkach prekursorowych aparatów szparkowych. Rozpocznij format od rozmiaru obrazu 1024 na 1024 piksele.Następnie zoptymalizuj go w oparciu o współczynnik powiększenia i ustawienia obiektywu, aby uzyskać dobrą rozdzielczość. Następnie ustaw szybkość głowicy skanującej. Zaczynając od prędkości 400 Hz i optymalizując ją w oparciu o konkretną sytuację próbek.Aby powiększyć obszar zainteresowania bez zmiany soczewki obiektywu, wprowadź współczynnik powiększenia równy jeden i zoptymalizuj go w oparciu o konkretne potrzeby eksperymentu. Średnia liniowa odnosi się do tego, ile razy każda linia X zostanie zeskanowana w celu uzyskania uśrednionego wyniku. Zacznij od średniej z dwóch linii X, aby zobrazować zdarzenia transportu membranowego i optymalizuj w razie potrzeby.Wybierz tryb skanowania xyt w trybie akwizycji, aby włączyć narzędzie szeregów czasowych. Następnie wybierz okres oczekiwania między punktami czasu w obszarze Interwał czasu. Określ liczbę ramek do zebrania, wybierając opcję Ramki.Użyj trybu skanowania Z-Stack z projekcją maksymalnej intensywności, aby zebrać trójwymiarowe informacje dotyczące zdarzenia transportu błonowego w całej komórce. Następnie wybierz tryb skanowania xyz w trybie akwizycji, a narzędzie Z-Stack stanie się dostępne. Wybierz opcję Z-Wide.W trybie skanowania zdefiniuj górny i dolny obraz Z-Stack za pomocą przycisków Początek i Koniec. Następnie zdefiniuj grubość kroku Z, klikając rozmiar kroku Z. Aby przetworzyć obraz, kliknij główną kartę Proces w oprogramowaniu konfokalnym.Na karcie Otwórz projekty po lewej stronie wybierz interesujący Cię plik Z-Stack. Następnie w środkowej zakładce o nazwie ProcessTools wybierz funkcję Projection. Wybierz Maksimum z rozwijanego panelu metody i kliknij przycisk Zastosuj.Obraz projekcji Z-Stack zostanie wygenerowany w zakładce Otwarte projekty. Aby wygenerować wideo z obrazów szeregów czasowych, kliknij kartę Plik w oprogramowaniu Fiji i funkcję Otwórz, aby otworzyć wszystkie obrazy szeregów czasowych jeden po drugim we właściwej kolejności. Możesz też przeciągnąć obrazy na obraz J, aby otworzyć dane we właściwej kolejności.Następnie znajdź funkcję Stos na karcie Obraz i wybierz Obrazy do ułożenia w stos, aby wygenerować wideo. Po zakończeniu zapisz plik w formacie avi z żądaną liczbą klatek na sekundę. W prawdziwym liściu siedmiodniowych roślin transgenicznych zawierających promotor ERL1 ERL1-YFP, rozproszone komórki zostały podkreślone sygnałem YFP, w którym ERL1-YFP znakował błonę plazmatyczną.Zaobserwowano również wiele sygnałów punktowych, co sugeruje, że ERL1 był również zlokalizowany w endosomach. RFP-Ara7 uwypuklił wiele sygnałów punktowych w prawie wszystkich komórkach, wskazując na ciała wielopęcherzykowe lub MVB w tych komórkach. Kiedy RFP-Ara7 połączył się z sygnałem ERL1-YFP, większość punktów punktowych nałożyła się na siebie, co sugeruje, że niektóre cząsteczki ERL1-YFP zostały przetransportowane do MVB.Szereg czasowy prawdziwych liści zawierających białko markerowe ERL1-YFP i MVB, RFP-Ara7 wykazał, że endosomy znakowane YFP przemieszczały się razem z RFP-Ara7 w komórkach linii szparkowej. Potwierdziło to, że ERL1-YFP jest zlokalizowany w ciałach wielopęcherzykowych.

image-based-methods-to-study-membrane-trafficking-events-stomatal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy prosty i powtarzalny protokół badania odpowiedzi aparatów szparkowych na żywe bakterie. Metoda ta minimalizuje uszkadzanie i manipulację liściem w porównaniu do wcześniej opisanego zastosowania preparatów z naskórka liści.

Ocena reakcji aparatów szparkowych na żywe komórki bakteryjne z wykorzystaniem obrazowania całych liści

Opisujemy protokół z wykorzystaniem szkiełek z komorami oraz pośrodków do unieruchamiania liści zasadniczych roślin w celu obrazowania konfokalnego epidermy przez kilka dni rozwoju, co pozwala na dokumentowanie różnicowania szparek. Białka znakowane fluoroforami mogą być śledzone dynamicznie poprzez analizę ich ekspresji i lokalizacji subkomórkowej, co zwiększa zrozumienie ich potencjalnych ról podczas podziału komórek i różnicowania typów komórek.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe wysokiej rozdzielczości konfokalne epidermy zawilżnych liści przeciwstawnych Arabidopsis podczas kiełkowania

Źródło: Wagner, K.  i inni., Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP. J. Vis. Exp. (2022). Ten film przedstawia wizualizację transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorów Drosophila przy użyciu białek TRPL znakowanych eGFP. Szczegółowo opisano w nim przygotowanie transgenicznych muszek do obrazowania, przechwytywanie obrazów fluorescencyjnych komórek fotoreceptorowych oraz ilościowe określenie transportu TRPL...

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila

Mikroskopia fluorescencyjna z pełnym wewnętrznym odbiciem (pTIRFM) oparta na polaryzacji umożliwia wykrywanie dynamiki błony komórkowej w czasie rzeczywistym. W artykule opisano implementację pTIRFM do badania przebudowy błony podczas regulowanej egzocytozy. Technikę tę można uogólnić na inne procesy w biologii komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się ze zmianami kształtu błony.

Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak monitorować dynamikę białek znakowanych fluorescencyjnie na powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie, pokazując kropki PATROL1 oznaczonej GFP, białka transportującego błonę, w korze komórkowej kompleksu szparkowego u Arabidopsis thaliana.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamiki powierzchni komórek roślinnych za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej o zmiennym kącie

Na poziomie subkomórkowym, zdarzenia sygnalizacyjne są dynamicznie modulowane przez sygnały rozwojowe i środowiskowe. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje system przejściowej ekspresji tytoniu do monitorowania dynamicznej interakcji białko-białko i ujawniania przestrzennej organizacji transdukcji sygnału w komórkach roślinnych.

Obrazowanie przestrzennej reorganizacji szlaku sygnałowego MAPK przy użyciu systemu przejściowej ekspresji tytoniu

Ten protokół opisuje metodę przygotowania wzbogaconych komórek ochronnych aparatów szparkowych, która jest przydatna do badań fizjologicznych i innych badań biologicznych.

Taśma szparkowa Tape-Peel: ulepszona metoda przygotowania próbki komórek ochronnych

Makropinocytoza to wysoce konserwatywny proces endocytarny, zainicjowany przez tworzenie bogatych w F-aktynę warstwowych wypustek błonowych, znanych również jako falbany błonowe. Zwiększona szybkość internalizacji substancji rozpuszczonej makropinocytozy jest związana z różnymi stanami patologicznymi. W protokole tym przedstawiono metodę ilościowego określania powstawania falban błonowych in vitro przy użyciu skaningowej mikroskopii elektronowej.

Wizualizacja powstawania falban błony za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Ten artykuł opisuje dwie metody fenotypowania bez użycia peelingów naskórka do scharakteryzowania genów kontrolujących rozwój aparatów szparkowych. Pierwsza metoda pokazuje, jak analizować fenotyp aparatów szparkowych przy użyciu naskórka roślinnego barwionego błękitem O-toluidyny. Druga metoda opisuje, w jaki sposób identyfikować ligandy szparkowe i monitorować ich aktywność biologiczną.

Identyfikacja genów zaangażowanych w rozwój aparatów szparkowych poprzez ocenę fenotypu naskórka

Protokół ten przedstawia porównawczą metodę oceny cech szparkowych i naskórkowych u dwóch odrębnych gatunków za pomocą peelingów naskórnych, technik oczyszczania oraz analizy obrazowej wspomaganej przez AI. Celem jest umożliwienie wysokoprzepustowej, powtarzalnej ilościowej identyfikacji struktur komórkowych leżących u podstaw funkcji szparków szparkowych dla zastosowań rolniczych oraz szerokich badań roślinnych.

Charakteryzacja cech szparków szparkowych i naskórka za pomocą peelingów, oczyszczania oraz analizy obrazów opartej na AI

Poznaj metody obrazowania transportu błonowego w komórkach linii szparkowej Arabidopsis thaliana. Techniki te pozwalają badać kluczowe procesy rozwoju aparatów szparkowych i odpowiedzi roślin na stres abiotyczny.

Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Przeglądaj więcej filmów