Oparte na obrazie metody badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii szparkowej

Technika ta bada zdarzenia transportu błonowego w rozwoju aparatów szparkowych, mikropory na powierzchni roślin w celu ułatwienia fotosyntezy i transpiracji. Do badania rozwoju aparatów szparkowych roślin stosuje się różne techniki. Obejmuje to biologię molekularną, biologię komórki lub mikroskopię, biologię chemiczną, spektrometrię mas, biochemię i biologię strukturalną.

Poszczególne aparaty szparkowe tworzą się asynchronicznie. Każda stomia jest tworzona przez trzy przejścia losu komórki. Tak więc zebranie wystarczającej liczby komórek linii aparatów szparkowych przy określonym losie komórki jest jednym z dużych wyzwań.

Transport błonowy jest niezbędny do przetrwania i wzrostu komórek. Komórka rodowo-szparkowa nie jest wyjątkiem. Protokół ten odnosi się do powszechnie stosowanego podejścia do badania zdarzeń transportu błonowego w komórkach linii aparatów szparkowych.

Rośliny muszą stawić czoła wyzwaniom środowiskowym w obliczu zmian klimatycznych. Aparaty szparkowe są przejściami do wymiany gazowej w roślinie i są bardzo elastyczne na stres środowiskowy w celu adaptacji. Jesteśmy zainteresowani badaniem, w jaki sposób stres abiotyczny wpływa na rozwój aparatów szparkowych, koncentrując się na transporcie błonowym niektórych białek w komórkach linii aparatów szparkowych.

Aby rozpocząć analizę farmakologiczną dwukolorowego rzodkiewnika pospolitego F1 thaliana, należy wypreparować i usunąć liścienie siedmiodniowych siewek transgenicznych. Dodaj 500 mikrolitrów 30-mikromolowego roztworu brefeldyny A lub BFA do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Zanurz w nim wypreparowane sadzonki.

Szczelnie przymocuj 10-mililitrową strzykawkę do probówki mikrowirówki i zastosuj próżnię przez jedną minutę. Wyjąć strzykawkę przed inkubacją próbki w roztworze przez 30 minut przed obrazowaniem. Następnie zanurz wypreparowaną siedmiodniową sadzonkę w 25-milimolowym wortmanninie.

Stosować próżnię przez jedną minutę przed inkubacją zanurzonej próbki przez 30 minut. Badanie szlaków przemytu ERL1 w roślinach transgenicznych wykazało, że 30 minut ekspozycji na roztwór brefeldyny A spowodowało wykrycie ERL1-YFP w dużych komorach znanych jako ciała BFA. Wskazano, że brefeldyna A może blokować transport ERL1, co sugeruje recykling lub endocytozę ERL1.

Kiedy transgenicy byli traktowani wortmanninem przez 30 minut, struktury przypominające pierścienie zwane ciałami Wm zostały podświetlone przez ERL1-YFP. Okazało się, że ERL1-YFP były transportowane do ciał wielopęcherzykowych, co wskazuje, że ERL1 podążał za korzeniem do wakuoli w celu degradacji. Aby rozpocząć analizę farmakologiczną dwukolorowego rzodkiewnika pospolitego F1 thaliana, należy wypreparować i usunąć liścienie siedmiodniowych siewek transgenicznych.

Dodaj 500 mikrolitrów 30-mikromolowego roztworu brefeldyny A lub BFA do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Zanurz w nim wypreparowane sadzonki. Szczelnie przymocuj 10-mililitrową strzykawkę do probówki mikrowirówki i zastosuj próżnię przez jedną minutę.

Wyjąć strzykawkę przed inkubacją próbki w roztworze przez 30 minut przed obrazowaniem. Następnie zanurz wypreparowaną siedmiodniową sadzonkę w 25-milimolowym wortmanninie. Stosować próżnię przez jedną minutę przed inkubacją zanurzonej próbki przez 30 minut.

Badanie szlaków przemytu ERL1 w roślinach transgenicznych wykazało, że 30 minut ekspozycji na roztwór brefeldyny A spowodowało wykrycie ERL1-YFP w dużych komorach znanych jako ciała BFA. Wskazano, że brefeldyna A może blokować transport ERL1, co sugeruje recykling lub endocytozę ERL1. Kiedy transgenicy byli traktowani wortmanninem przez 30 minut, struktury przypominające pierścienie zwane ciałami Wm zostały podświetlone przez ERL1-YFP.

Okazało się, że ERL1-YFP były transportowane do ciał wielopęcherzykowych, co wskazuje, że ERL1 podążał za korzeniem do wakuoli w celu degradacji. Aby rozpocząć przygotowanie próbki, należy wyciąć prawdziwy liść z farmakologicznie potraktowanej próbki transgenicznej Arabidopsis thaliana za pomocą ostrej żyletki. Umieść prawdziwy liść na szkiełku podstawowym w kropli wody stroną z aosiem do góry.

Powoli przykryj prawdziwy liść szkiełkiem nakrywkowym bez pęcherzyków powietrza. W przypadku obrazowania ustaw ścieżkę wiązki, wybierając laser 514-nanometrowy do cytowania żółtego białka fluorescencyjnego lub YFPX. Uzyskaj wysoką jakość obrazu dzięki zastosowaniu dużej mocy lasera.

Włącz PMT lub HyD i zdefiniuj górne i dolne progi pasma emisji w oparciu o widmo dla fluoroforu YFP. Ustaw okno wykrywania od 530 do 570 nanometrów, aby zebrać sygnał YFP. Aby uzyskać sekwencyjny obraz drugiego koloru, kliknij przycisk Seq i dodaj nowy kanał.

W Seq 2 wybierz laser o długości fali 555 nanometrów dla wzbudzenia czerwonego białka fluorescencyjnego lub zapytania ofertowego i ustaw okno wykrywania od 570 do 630 nanometrów, aby zebrać sygnał RFP. Wybierz soczewkę Corr 63x/1,2 W w systemie, aby obrazować aktywność ruchu błony subkomórkowej w komórkach prekursorowych aparatów szparkowych. Rozpocznij format od rozmiaru obrazu 1024 na 1024 piksele.

Następnie zoptymalizuj go w oparciu o współczynnik powiększenia i ustawienia obiektywu, aby uzyskać dobrą rozdzielczość. Następnie ustaw szybkość głowicy skanującej. Zaczynając od prędkości 400 Hz i optymalizując ją w oparciu o konkretną sytuację próbek.

Aby powiększyć obszar zainteresowania bez zmiany soczewki obiektywu, wprowadź współczynnik powiększenia równy jeden i zoptymalizuj go w oparciu o konkretne potrzeby eksperymentu. Średnia liniowa odnosi się do tego, ile razy każda linia X zostanie zeskanowana w celu uzyskania uśrednionego wyniku. Zacznij od średniej z dwóch linii X, aby zobrazować zdarzenia transportu membranowego i optymalizuj w razie potrzeby.

Wybierz tryb skanowania xyt w trybie akwizycji, aby włączyć narzędzie szeregów czasowych. Następnie wybierz okres oczekiwania między punktami czasu w obszarze Interwał czasu. Określ liczbę ramek do zebrania, wybierając opcję Ramki.

Użyj trybu skanowania Z-Stack z projekcją maksymalnej intensywności, aby zebrać trójwymiarowe informacje dotyczące zdarzenia transportu błonowego w całej komórce. Następnie wybierz tryb skanowania xyz w trybie akwizycji, a narzędzie Z-Stack stanie się dostępne. Wybierz opcję Z-Wide.

W trybie skanowania zdefiniuj górny i dolny obraz Z-Stack za pomocą przycisków Początek i Koniec. Następnie zdefiniuj grubość kroku Z, klikając rozmiar kroku Z. Aby przetworzyć obraz, kliknij główną kartę Proces w oprogramowaniu konfokalnym.

Na karcie Otwórz projekty po lewej stronie wybierz interesujący Cię plik Z-Stack. Następnie w środkowej zakładce o nazwie ProcessTools wybierz funkcję Projection. Wybierz Maksimum z rozwijanego panelu metody i kliknij przycisk Zastosuj.

Obraz projekcji Z-Stack zostanie wygenerowany w zakładce Otwarte projekty. Aby wygenerować wideo z obrazów szeregów czasowych, kliknij kartę Plik w oprogramowaniu Fiji i funkcję Otwórz, aby otworzyć wszystkie obrazy szeregów czasowych jeden po drugim we właściwej kolejności. Możesz też przeciągnąć obrazy na obraz J, aby otworzyć dane we właściwej kolejności.

Następnie znajdź funkcję Stos na karcie Obraz i wybierz Obrazy do ułożenia w stos, aby wygenerować wideo. Po zakończeniu zapisz plik w formacie avi z żądaną liczbą klatek na sekundę. W prawdziwym liściu siedmiodniowych roślin transgenicznych zawierających promotor ERL1 ERL1-YFP, rozproszone komórki zostały podkreślone sygnałem YFP, w którym ERL1-YFP znakował błonę plazmatyczną.

Zaobserwowano również wiele sygnałów punktowych, co sugeruje, że ERL1 był również zlokalizowany w endosomach. RFP-Ara7 uwypuklił wiele sygnałów punktowych w prawie wszystkich komórkach, wskazując na ciała wielopęcherzykowe lub MVB w tych komórkach. Kiedy RFP-Ara7 połączył się z sygnałem ERL1-YFP, większość punktów punktowych nałożyła się na siebie, co sugeruje, że niektóre cząsteczki ERL1-YFP zostały przetransportowane do MVB.

Szereg czasowy prawdziwych liści zawierających białko markerowe ERL1-YFP i MVB, RFP-Ara7 wykazał, że endosomy znakowane YFP przemieszczały się razem z RFP-Ara7 w komórkach linii szparkowej. Potwierdziło to, że ERL1-YFP jest zlokalizowany w ciałach wielopęcherzykowych.