Name: Nowatorska metoda wstrzykiwania komórek z minimalną inwazją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:25:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: Poznaj nową metodę wszczepiania biegunów kardiomiocytów w badaniach regeneracyjnych serca przy użyciu komórek iPSC. Technika ta minimalizuje inwazyjność, poprawiająca integrację z tkanką gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant od JSPS KAKENHI (Grant nr 23390072 i 19K07335) oraz AMED (Grant nr A-149).

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi etycznymi Uniwersytetu Medycznego Kansai-Medical dla eksperymentów na zwierzętach i zostały zatwierdzone przez komisje etyczne (numer zatwierdzenia: 23-104). Wszystkie zwierzęta były hodowane w stałym cyklu światło-ciemność w specyficznym środowisku wolnym od patogenów. Wszystkie wysterylizowane narzędzia chirurgiczne, takie jak nożyczki, kleszcze i retraktory, zostały autoklawizowane i dokładnie wysuszone.
1. Przygotowanie kulek kardiomiocytów noworodków szczurów
<ol>
	<li>Kolekcja serca noworodka szczura
	<ol>
		<li>W przypadku kolekcji serca postępuj zgodnie z procedurą podobną do opisanej w poprzednim raporcie7.</li>
		<li>Zanurz noworodki (0-2 dni po urodzeniu) szczurów Sprague-Dawley (SD) w sekwencyjnych roztworach jodu powidonu i 70% etanolu, a następnie przenieś je do hermetycznego etui wypełnionego odparowanym izofluranem (stężenie powinno wynosić ponad 10% v/v) w celu głębokiego znieczulenia.</li>
		<li>Po stwierdzeniu utraty przytomności przez utratę aktywności ruchowej należy odciąć głowę szczurowi, trzymając ciało od tyłu ręką, a następnie przeciąć 2-4 mm tkanki od czołowego środka klatki piersiowej do ogona, a następnie w kierunku rostralnym za pomocą ostrych nożyczek.</li>
		<li>Chwyć tylną skórę, aby rozciągnąć nacięcie i wypchnąć serce z klatki piersiowej. Przeciąć komory nożyczkami i zanurzyć je w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez wapnia lub magnezu (PBS(−)).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dyspersja kardiomiocytów nowonarodzonych szczurów
	<ol>
		<li>Zebrane komory rozdrobnić rozproszone w minimalnej ilości buforu Ads (bufor Ads: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12,5 mM NaH2PO4, 5,6 mM glukozy, 5,4 mM KCl, 0,8 mMMgSO4, pH 7,35) w autoklawowanym wklęsłym szkle szklanym na małe kawałki (1 mm x 1 mm) za pomocą zakrzywionych nożyczek.</li>
		<li>Przenieść zmielone tkanki i mieszadło mikromagnetyczne do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i rozproszyć tkanki na pojedyncze komórki z 0,1% kolagenazą, 0,1% trypsyną, 20 μg/ml DNazy I i estrem metylowym tetrametylodaminy 50 nM w buforze Ads w temperaturze 37 °C, mieszając przez 30 minut.</li>
		<li>Oddzielić agregaty i rozproszone komórki przez naturalną sedymentację, zebrać tylko rozproszone komórki do probówki i ponownie strawić pozostałe agregaty komórkowe za pomocą tego samego podłoża trawiącego.</li>
		<li>Kontynuuj tę procedurę, aż wszystkie komórki zostaną całkowicie zdysocjowane. Aby potwierdzić całkowite rozproszenie komórek, obserwuj rurki pod mikroskopem (soczewka obiektywu 4x).</li>
		<li>Zebrać rozproszone komórki za pomocą wirowania przy 150 x g przez 5 minut i zdysocjować je w 1-2 ml buforu ADS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywowane fluorescencją sortowanie komórek kardiomiocytów
	<ol>
		<li>Analizuj komórki za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) przy użyciu filtrów pasmowoprzepustowych 556-601 nm w celu wykrycia sygnałów czerwonej fluorescencji.</li>
		<li>Ostrożnie wykonaj wstępne bramkowanie, aby wyeliminować frakcje dubletowe14. Ustawienia bramki do eliminacji dubletów powinny być zgodne z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Ustaw rozproszenie do przodu na osi x i czerwony sygnał fluorescencji na osi y. Zaobserwowano trzy populacje: najniższą populację zawierającą erytrocyty i martwe komórki, środkową populację zawierającą niekardiomiocyty, w tym fibroblasty i komórki śródbłonka, oraz górną populację zawierającą czyste kardiomiocyty komorowe7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kulek kardiomiocytów znakowanych czerwoną fluorescencją
	<ol>
		<li>Selektywnie posortuj kardiomiocyty i odwiruj przez 5 minut przy 150 x g. Całkowicie rozpuść granulki komórkowe w 1 ml minimalnej pożywki egzogennej modyfikowanej alfa (alpha-MEM) zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
		<li>Zmierz stężenie komórek za pomocą hemocytometru i rozcieńcz roztwór zawiesiny komórek do 3,000 komórek/ml za pomocą alpha-MEM 10% FBS.</li>
		<li>Rozprowadzić je na 96-dołkowych płytkach bez przywierania komórek (100 μl na studzienkę), odwirować przez 5 minut przy 100 x g i hodować przez 2-3 dni w inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przed eksperymentami iniekcyjnymi należy pobrać kulkę kardiomiocytów z każdej studzienki poprzez aspirację za pomocą pożywki hodowlanej za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i zebrać je w probówce o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Wybarwić PKH26 zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi śledzenia po wszczepieniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowania do metody powolnej iniekcji
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu podstawowego żelatyny
	<ol>
		<li>Zważ żelatynę, rozpuść ją w buforze ADS, aby uzyskać 10% roztwór w/v i przelej ją w autoklawie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Produkcja urządzenia do wstrzykiwania komórek
	<ol>
		<li>Ogólny projekt urządzenia: Przygotuj aparaturę pokazaną na <silna klasa="xfig">Rysunek 1. System ten jest połączony z aparatem chłodzącym strzykawkę i głównym aparatem iniekcyjnym.</li>
		<li>Przygotować główny aparat iniekcyjny opisany poniżej:
		<ol>
			<li>Do wstrzyknięcia kulki do kardiomiocytów noworodka należy użyć igły o długości 29 g i długości 50 mm wyposażonej w strzykawkę.</li>
			<li>Podłączyć strzykawkę do przenoszenia mocy (18 G, 1 ml) tyłem do siebie za pomocą strzykawki do wstrzykiwania komórek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Podłączyć igłę strzykawki do przenoszenia mocy do cienkiej rurki polipropylenowej o niskiej rozszerzalności prześwitu.</li>
			<li>Następnie podłącz drugą stronę rurki do przenoszenia mocy do igły tej samej strzykawki (18 G, 1 ml) i umieść ją w pompie strzykawkowej. Napełnij dwie strzykawki i rurki do przenoszenia mocy wodą bez pęcherzyków powietrza. 
			UWAGA: Po wciśnięciu jednego tłoka strzykawki do przenoszenia mocy, ciśnienie jest bezpośrednio przenoszone na drugą strzykawkę, a tłok wystaje.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Skonfigurować system chłodzenia strzykawki iniekcyjnej zgodnie z poniższym opisem.
		<ol>
			<li>Nawiń miedzianą rurkę (średnica zewnętrzna = 1 mm; średnica wewnętrzna = 0,3 mm; grubość = 0,35 mm) ciasno wokół zawierającej komórkę części strzykawki do wstrzykiwania komórek, pozostawiając 10 mm nadmiaru rurki na obu końcach.</li>
			<li>Podłącz rurkę miedzianą do elastycznej rurki z tworzywa sztucznego. Następnie podłącz drugie końce plastikowej rurki do zewnętrznej pompy, napełnij przewód wodą chłodzącą i schłodzić wodę, zanurzając nadmiar miedzianej rurki w kruszonym lodzie (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
			UWAGA: Ten układ chłodzenia utrzymuje roztwór zawiesiny ogniw w cylindrze w temperaturze około 2 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Opracowanie modelu zawału mięśnia sercowego u szczura poprzez niejawne zamknięcie tętnicy wieńcowej
<ol>
	<li>Samce nagich szczurów z niedoborem odporności należy znieczulić powietrzem zawierającym 3% izofluranu. Włóż kaniulę do tchawicy i podłącz ją do respiratora.</li>
	<li>Podłącz kaniulę do parownika izofluranu za pomocą kontrolera, aby utrzymać 3% stężenie izofluranu, a tym samym utrzymać wystarczające znieczulenie. Potwierdź brak reakcji na bodźce bólowe. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Przymocuj kończyny za pomocą przeciętych taśm chirurgicznych na płytce chirurgicznej podgrzanej w temperaturze 40 °C. Przekręć ciało szczura w prawo od osi ciała i użyj lewej pachy jako pola operacyjnego.</li>
	<li>Usuń włosy w polu operacyjnym za pomocą kremu do depilacji i przetrzyj skórę jodowidonem. Za pomocą ostrych nożyczek wytnij 1,5 cm nacięcie w skórze i mięśniu piersiowym większym.</li>
	<li>Potwierdź trzecią przestrzeń międzyżebrową i rozerwij mięśnie międzyżebrowe i opłucną żebrową za pomocą mikrokleszczyków z końcówkami. Utrzymuj klatkę piersiową otwartą za pomocą retraktora. Delikatnie usuń cienkie osierdzie za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Aby skonstruować model zawału bocznej ściany serca, znajdź pozycję 1 mm ogonową do końca lewego przedsionka, aby zidentyfikować rozwartą tętnicę wieńcową, przełóż jedwabny szew 7-0, zgarnij tkankę o szerokości 2,5 mm i głębokości 2,5 mm od grzbietu do brzusznej i mocno podwiąż tkankę.</li>
	<li>Potwierdź udane podwiązanie przez słaby skurcz dystalny od ligatury. Po delikatnym wyjęciu retraktora umieść jedwabny szew 5-0 między drugą a czwartą przestrzenią międzyżebrową i zamknij torakotomię.</li>
	<li>Zmniejszyć stężenie izofluranu do 1%. Delikatnie zszyj mięśnie i skórę jedwabiem 5-0. Zmniejszyć stężenie izofluranu do 0% i odczekać około 5 minut, aż rozpocznie się spontaniczne oddychanie.</li>
	<li>Stosować miejscowo 2 mg/ml lidokainy w soli fizjologicznej do nacięcia. Podawać 1 ml soli fizjologicznej we wstrzyknięciu podskórnym. Stosować miejscowo maść weterynaryjną, aby zapobiec infekcjom.</li>
	<li>Wyjmij szczura z rurki intubacyjnej i wróć do klatki dla zwierząt, a następnie hoduj szczury w oddzielnych klatkach przez 1 tydzień.</li>
	<li>Analizuj zmiany w funkcjonowaniu pompy skurczowej serca za pomocą echokardiografii. 
	UWAGA: Czynność serca zostanie zmniejszona z powodu bocznego zawału mięśnia sercowego.</li>
</ol>
4. Przezskórne przeszczepienie komórek pod kontrolą echa metodą powolnej iniekcji
<ol>
	<li>Podgrzej 10% bulion żelatynowy w temperaturze 37 °C, aż stanie się płynny.</li>
	<li>Rozcieńczyć 10% bulionu żelatynowego z podgrzanym buforem ADS, aby uzyskać ostateczny 5% roztwór żelatyny do wstrzykiwań (wymagane jest 100 μl na zwierzę).</li>
	<li>Zawiesić 96 kulek kardiomiocytów (łącznie: 28 800 kardiomiocytów/zwierzę) w 100 μl wstępnie podgrzanego roztworu do wstrzykiwań.</li>
	<li>Zawiesinę przygotowaną w kroku 4.3 należy załadować do strzykawki do wstrzykiwania komórek, unikając zasysania nadmiaru powietrza.</li>
	<li>Aby usunąć pęcherzyki w strzykawce, należy trzymać ją pionowo z igłą skierowaną do góry, postukać w strzykawkę i zebrać pęcherzyki na górnym grzbiecie strzykawki. 
	UWAGA: Podczas tego kroku obserwuj, jak kulki kardiomiocytów stopniowo osiadają na gumowej uszczelce tłoka.</li>
	<li>Utrzymać pionową pozycję strzykawki, powoli popychać tłok do góry i wyrzucić pęcherzyki oraz nadmiar roztworu zawiesiny komórkowej do momentu, gdy w strzykawce pozostanie 20 μl zawiesiny komórek. Ostrożnie naciskać tłok ze stałą prędkością, tak aby kulka kardiomiocytów pozostała spoczywająca na gumowej uszczelce tłoka.</li>
	<li>Zanurzyć strzykawkę z nakrętką bezpośrednio w łaźni lodowej na 5 minut.</li>
	<li>Umieścić schłodzoną strzykawkę w aparacie do wstrzykiwań. Mocno zamocuj strzykawkę do wstrzykiwań osadzoną na urządzeniu do precyzyjnych ruchów na etapie zwierzęcym za pomocą ręcznie wykonanego zacisku X-Y-Z z regulacją pozycji. Urządzenie do precyzyjnego ruchu może przesuwać pozycję igły za pomocą suwaka 20 mm w kierunku x, wychylania w kierunku y i ruchów kłaniania w kierunku z.</li>
	<li>Znieczulenie szczurów należy umieścić w szczelnie zamkniętym pudełku wypełnionym powietrzem zawierającym 3% izofluranu. Potwierdź znieczulenie brakiem reakcji na bodźce bólowe. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Przymocuj kończyny za pomocą przeciętych taśm chirurgicznych na podgrzanej płytce echa o temperaturze 40 °C. Aby utrzymać wystarczające znieczulenie, upewnij się, że wdychane powietrze zawiera około 3% stężenia izofluranu.</li>
	<li>Usuń włosy w polu iniekcji (2 cm średnicy) i na klatce piersiowej kremem do depilacji i przetrzyj skórę jodowidonem.</li>
	<li>Nałóż echo-żel na klatkę piersiową i sondę echo. Umieść echosondę blisko klatki piersiowej wzdłuż osi czaszki i ogona i zacznij wykonywać echokardiografię w trybie B zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Wsuń końcówkę igły do wstrzykiwania do mięśnia sercowego w widoku z przodu (Rycina 2 i Dodatkowe wideo 1).</li>
	<li>Aby aktywować główną pompę strzykawkową, naciśnij przycisk Start i obróć pokrętło, aby ustawić się na wstępnie określoną liczbę dla prędkości wstrzykiwania około 0,02 μL/s. Nałożyć maść weterynaryjną miejscowo wokół miejsca igłowania, aby zapobiec infekcjom. 
	UWAGA: Konieczne jest określenie odpowiedniego numeru wybierania dla zamierzonej szybkości wstrzykiwania za pomocą roztworu do wstrzykiwań. Po wykonaniu wstrzyknięcia należy wyjąć igłę iniekcji za pomocą przykładowego systemu ruchu.</li>
	<li>Zmniejszyć stężenie izofluranu do 0% i odczekać około 5 minut, aż zwierzę odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.</li>
</ol>
5. Ocena czynności serca
<ol>
	<li>Znieczulenie szczurów należy umieścić w szczelnie zamkniętym pudełku wypełnionym powietrzem zawierającym 3% izofluranu. Potwierdź znieczulenie brakiem reakcji na bodźce bólowe. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Nałóż krem elektryzujący do akwizycji EKG na końcówki kończyn. Przymocuj kończyny za pomocą przeciętych taśm chirurgicznych na podgrzanej płytce echa o temperaturze 40 °C. Użyj systemu monitorowania fizjologicznego, aby wykryć EKG i tętno w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>Zgodnie z instrukcjami producenta, najpierw określ kąt długiej osi za pomocą obrazu echa w trybie B pokazującego wierzchołek lewej komory do drogi odpływu, a następnie obróć echosondę o 90°, aby przejść do widoku krótkiej osi.</li>
	<li>Używając tylko systemu precyzyjnych ruchów osi ogonowej do rostralnej stadium zwierzęcego, dostosuj widok krótkiej osi do poziomu mięśni brodawkowatych. Następnie zmień tryb obrazu na tryb M, naciskając przycisk M-mode i nagrywaj wideo przez 5 sekund, naciskając przycisk Cine-loop.</li>
	<li>Aby przeanalizować i obliczyć skrócenie frakcji za pomocą oprogramowania, naciśnij przycisk Zmierz i narzędzie do linii pionowej, aby zdefiniować końcowe skurczowe i końcoworozkurczowe wymiary wewnętrzne lewej komory. Oprogramowanie automatycznie oblicza procentowe skrócenie frakcji (FS).</li>
	<li>Zmniejszyć stężenie izofluranu do 0% i odczekać około 5 minut, aż zwierzę odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.</li>
</ol>
6. Immunohistochemia
<ol>
	<li>Umocuj ciało poddane eutanazji (wykonaj eutanazję jak w kroku 1.1.3) na stole za pomocą przeciętych taśm chirurgicznych, wytnij serca, umyj PBS i zanurz serce w 4% paraformaldehydzie/PBS.</li>
	<li>Rozbić serca na trzy części, zanurzyć je w 40% sacharozie w celu krioprotekcji, zatopić w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Tkanki poddane kriosekcji (o grubości 8 μm) należy przymocować do szkiełek pokrytych aminozelanem. Po wystarczającym wysuszeniu przy użyciu nieogrzewanego wiatru generowanego przez ogólną suszarkę do włosów, zanurz szkiełka w soli fizjologicznej buforowanej trisem zawierającej 0,2% Tween-20 (TBS-T).</li>
	<li>Zanurzyć je w roztworze blokującym na 30 minut w temperaturze 25 °C. Wlać 100 μl pierwszorzędowego roztworu blokującego zawierającego przeciwciała na szkiełko i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z uszczelnieniem parafinowym, aby roztwór przeciwciała rozprowadził się na tkance. 
	UWAGA: Stężenie przeciwciał jest pokazane w Tabeli Materiałów.</li>
	<li>Połóż szkiełka poziomo w ręcznie robionym pudełku o wysokiej wilgotności, wykorzystując naturalną parę z mokrego papieru, aby zapobiec parowaniu. Umyj szkiełka trzykrotnie za pomocą TBS-T.</li>
	<li>Stosować drugorzędowy środek blokujący zawierający przeciwciała przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C w taki sam sposób, jak przeciwciało pierwszorzędowe. Po trzech praniach obserwuj sygnały fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i konfokalnego mikroskopu laserowego. 
	UWAGA: Stężenie przeciwciał jest pokazane w Tabeli Materiałów.</li>
	<li>Analiza statystyczna: W celu porównania objętości komórek, jak pokazano na rysunku <silna klasa="xfig">Rysunek 3A, wykonaj niesparowany test t; aby ocenić regenerację czynnościową serca po podaniu kardiomiocytów metodą powolnego wstrzykiwania, jak pokazano na Rysunek 4A, użyj sparowanego testu t. W niniejszej pracy różnice uznano za statystycznie istotne przy P < 0,01. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe.</li>
</ol>

A Novel Minimally Invasive Slow Injection Method for Reducing Tissue Injury

<ol><li>Chavkin, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+surface+receptors+Ror1%2F2+control+cardiac+myofibroblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">The cell surface receptors Ror1/2 control cardiac myofibroblast differentiation.</a> Journal of the American Heart Association. 10 (13), e019904(2021).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+membrane+repair+protein+MG53+modulates+transcription+factor+NF-%CE%BAB+signaling+to+control+kidney+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The cell membrane repair protein MG53 modulates transcription factor NF-κB signaling to control kidney fibrosis.</a> Kidney International. 101 (1), 119-130 (2022).</li>
<li>Liu, X., Liu, Y., Khodeiry, M. M., Lee, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+monocytes+in+optic+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">The role of monocytes in optic nerve injury.</a> Neural Regeneration Research. 18 (8), 1666-1671 (2023).</li>
<li>Weber, F., Treeck, O., Mester, P., Buechler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+BMP+and+activin+membrane-bound+inhibitor+%28BAMBI%29+in+chronic+liver+diseases+and+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Expression and function of BMP and activin membrane-bound inhibitor (BAMBI) in chronic liver diseases and hepatocellular carcinoma.</a> International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 3473(2023).</li>
<li>Tohyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+metabolic+flow+enables+large-scale+purification+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).</li>
<li>Hattori, F., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+replacing+myocytes+with+induced+pluripotent+stem+in+clinical+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Reviews%22%5BJournal%5D)">Strategies for replacing myocytes with induced pluripotent stem in clinical protocols.</a> Transplantation Reviews. 26 (3), 223-232 (2012).</li>
<li>Hattori, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 7 (1), 61-66 (2010).</li>
<li>Fernandes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes+engraft+but+do+not+alter+cardiac+remodeling+after+chronic+infarction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes engraft but do not alter cardiac remodeling after chronic infarction in rats.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (6), 941-949 (2010).</li>
<li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+transplantation+of+iPS+cell-derived+cardiomyocytes+regenerates+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts.</a> Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).</li>
<li>Wendel, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+effects+of+a+tissue-engineered+cardiac+patch+from+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+a+rat+infarct+model%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional effects of a tissue-engineered cardiac patch from human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in a rat infarct model.</a> Stem Cells Translational Medicine. 4 (11), 1324-1332 (2015).</li>
<li>Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+Platforms+for+Heart+Regenerative+Therapy+Using+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Cancer+Stem+Cells%2C+Volume+7%3A+Therapeutic+Applications+in+Disease+and+Injury%22%5BJournal%5D)">Technology Platforms for Heart Regenerative Therapy Using Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cells and Cancer Stem Cells, Volume 7: Therapeutic Applications in Disease and Injury. , 33-45 (2012).</li>
<li>Tao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+lesion+characterization+in+scarred+substrate+assessed+using+cardiac+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Clinical+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Ablation lesion characterization in scarred substrate assessed using cardiac magnetic resonance.</a> JACC: Clinical Electrophysiology. 5 (1), 91-100 (2019).</li>
<li>Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+driving+force+for+change%3A+interstitial+flow+as+a+morphoregulator%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator.</a> Trends in Cell Biology. 17 (1), 44-50 (2007).</li>
<li>Hattori, F. How to purify cardiomyocytes for research and therapeutic purposes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHattori%2C+F+%22Cardiac+Regeneration+using+Stem+Cells%22">Cardiac Regeneration using Stem Cells</a>. Fukuda, K., Yuasa, S. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).</li>
<li>Li, M., Tian, X., Zhu, N., Schreyer, D. J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+process-induced+cell+damage+in+the+biodispensing+process%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Modeling process-induced cell damage in the biodispensing process.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (3), 533-542 (2010).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Jednym z krytycznych punktów w pomyślnym wykonaniu metody powolnej iniekcji jest przygotowanie skutecznego systemu iniekcyjnego za pomocą wydajnej pompy strzykawkowej i silnej rurki przenoszącej ciśnienie. Do wypchnięcia żelu z końcówki cienkiej igły wymagany jest system wysokociśnieniowy. Drugim krytycznym punktem jest stabilizacja pracy serca. Bicie serca przez igłę do wstrzykiwań wstrzykniętych do mięśnia sercowego może uszkodzić tkankę. W tym badaniu przeprowadzono wstrzyknięcie pod kontrolą echa, aby uniknąć drugiego otwartego urazu klatki piersiowej u zwierząt i podać wstrzyknięcie komórki w ustabilizowane serce z napompowanymi płucami. Ponadto w niektórych zastosowaniach dla większych zwierząt lub ludzi niektóre urządzenia do wstrzykiwań umieszczane na sercu powinny być traktowane jako część strategicznego projektu aplikacji. W przypadku wstrzyknięć do serca małych zwierząt na otwartej klatce piersiowej zaleca się użycie długiej, elastycznej igły ze względu na ich wyższe tętno.
W tej pracy metoda powolnej iniekcji znacznie zwiększyła objętość kardiomiocytów, które przeżyły, w porównaniu z normalną metodą iniekcji. Normalne wstrzyknięcie powoduje uszkodzenie komórki poprzez naprężenie ścinające15. W przeciwieństwie do tego, metoda powolnej iniekcji teoretycznie nie powoduje takiego stresu, ponieważ oprócz powolnego wstrzykiwania wykorzystuje rozwiązanie nienewtonowskie.
Jeśli chodzi o miejscowe zwłóknienie, przestrzeń śródmiąższowa wokół normalnie wstrzykiwanych kardiomiocytów, które przeżyły, wykazywała silne i rozległe odkładanie się kolagenu typu I. Natomiast sygnały kolagenu typu I wokół wszczepionych kardiomiocytów przeszczepionych metodą powolnej iniekcji były znacznie słabsze i bardziej ograniczone. Sugeruje to, że metoda powolnej iniekcji spowodowała znacznie mniej szkód. Powolne wstrzykiwanie kardiomiocytów noworodków do mięśnia sercowego dorosłego znacznie poprawiło funkcję skurczową serca po zawale. Analizy histologiczne sugerowały, że przeszczepienie kardiomiocytów metodą powolnej iniekcji skutkowało bezpośrednimi połączeniami i funkcjonalnym sprzężeniem z kardiomiocytami gospodarza. Zjawisko to wyjaśnia mechanizm funkcjonalnego odzyskiwania mięśnia sercowego gospodarza. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jest to pierwsze doniesienie o wszczepionych kardiomiocytach noworodków z bezszwowymi połączeniami na dużą skalę z dorosłymi kardiomiocytami gospodarza. Funkcjonalne połączenia z mięśniem sercowym gospodarza poprzez sprzężenie elektryczne i mechaniczne mogą sprawić, że wszczepione kardiomiocyty dojrzeją i pozwolą im działać jako funkcjonalne miocyty, które przyczyniają się do funkcji serca gospodarza. Długotrwałe interakcje siły fizycznej między gospodarzem a kardiomiocytami przeszczepu mają kluczowe znaczenie dla pełnej dojrzałości. Dlatego może być wymagane 2 miesiące po wstrzyknięciu w celu funkcjonalnego powrotu do zdrowia serca po zawale. Zależne od czasu przywrócenie funkcji serca pacjenta może być oczekiwanym zjawiskiem w zastosowaniach terapeutycznych, co może być cechą charakterystyczną udanego ustanowienia funkcjonalnego sprzężenia de novo i integracji między gospodarzem a przeszczepionymi kardiomiocytami.
Metoda powolnego wstrzykiwania może być wykonywana podczas operacji otwartej klatki piersiowej. Ponadto tę metodę można zastosować u myszy. W przypadku przyszłych zastosowań w terapii u ludzi musimy jeszcze rozwiązać kilka problemów. Szybkość wstrzykiwania powinna być zoptymalizowana, biorąc pod uwagę pojemność buforową przepływu płynu śródmiąższowego w każdym narządzie docelowym u człowieka. Należy stosować materiały wolne od kseno, takie jak żelatyna ludzka lub biodegradowalne materiały syntetyczne. Należy opracować kliniczne aparaty do powolnego wstrzykiwania klasy GMP, takie jak kompaktowe narzędzia jednorazowego użytku specyficzne dla narządów lub aparaty wielokrotnego użytku do stosowania w szerokim narządzie.

Podawanie i zastępowanie komórek to obiecujące nowe strategie terapeutyczne dla ciężko uszkodzonych narządów. Wśród tych nowatorskich strategii terapeutycznych dużym zainteresowaniem cieszy się medycyna regeneracyjna serca. Jednak stan zapalny spowodowany urazami pośredniczy w tworzeniu blizn w kilku narządach1,2,3,4. Ludzkie serce składa się z około10-10 kardiomiocytów; Dlatego teoretycznie5,6, musi być leczony więcej niż 109 kardiomiocytami. Podawanie dużej liczby kardiomiocytów tradycyjnymi metodami iniekcji może prowadzić do poważnych uszkodzeń tkanek7. Ta metoda zapewnia nowatorską metodę wstrzykiwania komórek przy minimalnej inwazji tkanek.
Podanie komórek do miąższu narządu wymaga wstrzyknięcia. Istnieje jednak rozbieżność polegająca na tym, że samo wstrzyknięcie może prowadzić do uszkodzenia tkanek. Uszkodzenie tkanek powoduje miejscowy stan zapalny i nieuleczalne blizny w narządach i tkankach, a także upośledzenie zdolności regeneracyjnych8,9,10. Serce ssaków ma niezwykle wysoką skłonność do powstawania blizn zamiast regeneracji, ponieważ wymaga natychmiastowej naprawy urazów, aby wytrzymać wysokie ciśnienie krwi spowodowane jego ciągłą funkcją pompowania11. Terapia ablacyjna wykorzystuje tę wysoką skłonność do tworzenia blizn i blokuje obwód, w którym prawdopodobnie powstaną blizny, za pomocą arytmii12. W poprzednim badaniu zaobserwowano, że tkanka bliznowata izolowała wstrzyknięte kardiomiocyty w mięśniu sercowym gospodarza. Jest to zatem kolejny problem docelowy, który należy przezwyciężyć, aby uzyskać lepszą skuteczność terapeutyczną w medycynie regeneracyjnej serca.
Przepływ płynu śródmiąższowego w tkankach odgrywa istotną rolę w dostarczaniu tlenu i składników odżywczych do komórek oraz usuwaniu wydalanych odpadów z komórek. Fizjologiczna prędkość przepływu płynu śródmiąższowego w każdej tkance/narządzie jest inna (zakres wynosi 0,01-10 μm/s)13. Zgodnie z najlepszą wiedzą autora nie ma danych dotyczących zdolności poszczególnych tkanek/narządów do utrzymywania dodatkowych ilości płynu bez patologicznego obrzęku; Jednak w tym eksperymencie próbuje się użyć niskiej prędkości wstrzykiwania, aby ewentualnie zmniejszyć uszkodzenie tkanki, a wyniki można wykorzystać do określenia praktyczności tej koncepcji.

<table><tbody><tr><td>Igła 18 G i tuberkulina, 1 ml</td><td>Terumo&nbsp;</td><td>NN1838R, SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>igła o długości 50 mm w rozmiarze 29 mm</td><td>Ito Corporation, Tokio, Japonia</td><td>14903 Typ-A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rura miedziana</td><td>General Suppliers</td><td></td><td>średnica zewnętrzna, 1 mm; średnica wewnętrzna, 0,3 mm; grubość, 0,35 mm</td></tr><tr><td>Bufor reklamowy</td><td>Każdy składnik został zakupiony od Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japonia</td><td></td><td>Ręcznie robione, Skład: 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 12,5 mM NaH2PO4, 5,6 mM glukozy, 5,4 mM KCl, 0,8 mM MgSO4, pH 7,35</td></tr><tr><td>alpha-MEM</td><td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japonia</td><td>051-07615</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne królika antykolagenowego typu I (H + L)</td><td>Proteintech</td><td>14695-1-AP</td><td>przy użyciu rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne królika anty-Connexin-43 (H+L)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6219</td><td>przy użyciu rozcieńczenia 1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne anty-królicze IgG (H+L) donley-AlexaFluo488&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21206</td> przy użyciu roztworu blokującego <td>w rozcieńczeniu 1:300</td></tr><tr><td>(Blocking One)</td><td>Nacalai Tesque, Kioto, Japonia</td><td>03953-95&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>kolagenaza</td><td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japonia</td><td>034-22363</td><td></td></tr><tr><td>konfokalny mikroskop laserowy</td><td>Carl Zeiss Inc., Oberkochen, Niemcy</td><td>LSM510 META</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria III</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>BioWest, FL, USA</td><td>S1820-500</td><td></td></tr><tr><td>urządzenie do precyzyjnego ruchu (mikromanipulator)</td><td>Narishige Co., Ltd., Tokio, Japonia</td> Mikroskop fluorescencyjny <td>M-44</td><td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; Nikon Instruments, Tokio, Japonia</td><td>Żelatyna Eclipse Ti2</td><td></td></tr><tr><td>ze skóry bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9382</td><td>rozpuszcza się w PBS (-) do 10% i autoklawuje ją</td></tr><tr><td>Noworodki Sprague-Dawley (SD) szczury</td><td>Japonia SLC Inc., Shizuoka, Japonia</td><td></td><td>0&ndash; 2 d po urodzeniu</td></tr><tr><td>nieprzywiejne płytki 96-dołkowe (płytka sferoidalna)</td><td>Sumitomo Bakelite, Tokio, Japonia</td><td>MS-0096S</td><td></td></tr><tr><td>Optymalna temperatura cięcia (OCT) Związek&nbsp;</td><td>Sakura Finetek USA, Inc., CA, USA</td> Pompa perystaltyczna <td>Tissue-Tek OCT (</td><td></td></tr><tr><td>do układu chłodzenia)</td><td>As One Co., Osaka, Japonia</td><td>SMP-23AS</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH26GL</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło Bar, Mikro, Magnetyczne, PTFE, Długość x Średnica w mm: 5 x 2</td> Strzykawka <td>Chemglass life sciences LLC, NJ, USA</td><td>CG-2003-120</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ito Corporation, Tokio, Japonia</td> Pompa strzykawkowa <td>MS-N25</td><td></td></tr><tr><td>z pilotem</td><td>zdalnego sterowania As One Co., Osaka, Japonia</td><td>MR-1, CT-10</td><td></td></tr><tr><td>ester metylowy tetrametylorodaminy</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna</td><td>DIFCO, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td><td>215240</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japonia</td><td>167-11515</td><td></td></tr><tr><td>maść weterynaryjna</td><td>&nbsp; Fujita Pharmaceutical Co., Sp. z o.o.</td><td>Maść Hibikusu&nbsp; #WAK-95832</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania Vevo 2100</td><td>Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Kanada</td><td>Vevo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 Oprogramowanie systemu obrazowania w wersji 1.0.0</td><td>Fujifilm VisualSonics, Inc., Toronto, Kanada</td><td>Vevo 2100</td><td></td></tr><tr><td>Słabo zakrzywiona igła z gwintem okulistycznym</td><td>Natsume Seisakusho Co., Ltd., Tokio, Japonia</td><td>C7-70</td><td></td></tr></tbody></table>

nowatorska metoda wstrzykiwania komórek z minimalną inwazją

A Novel Cell Injection Method with Minimum Invasion

Bezpośrednie wstrzykiwanie komórek do tkanek jest niezbędnym procesem w podawaniu komórek i/lub terapii zastępczej. Wstrzyknięcie komórki wymaga wystarczającej ilości roztworu zawiesiny, aby komórki mogły dostać się do tkanki. Objętość roztworu zawiesiny wpływa na tkankę, co może spowodować poważne obrażenia inwazyjne w wyniku wstrzyknięcia komórki. W tym artykule opisano nowatorską metodę wstrzykiwania komórek, zwaną powolną iniekcją, która ma na celu uniknięcie tego urazu. Jednak wypchnięcie komórek z końcówki igły wymaga wystarczająco dużej prędkości wstrzykiwania zgodnie z prawem siły ścinającej Newtona. Aby rozwiązać powyższą sprzeczność, płyn nienewtonowski, taki jak roztwór żelatyny, został użyty jako roztwór zawiesiny komórkowej w tej pracy. Roztwór żelatyny jest wrażliwy na temperaturę, ponieważ ich postać zmienia się z żelu w zol w temperaturze około 20 °C. Dlatego, aby utrzymać roztwór zawiesiny komórkowej w postaci żelu, strzykawka była utrzymywana w chłodzie w tym protokole; Jednak po wstrzyknięciu roztworu do organizmu, temperatura ciała przekształciła go w zol. Przepływ płynu tkankowego śródmiąższowego może wchłonąć nadmiar roztworu. W tej pracy technika powolnego wstrzykiwania pozwoliła kulkom kardiomiocytów dostać się do mięśnia sercowego gospodarza i wszczepić się bez otaczającego zwłóknienia. W badaniu tym zastosowano metodę powolnego wstrzykiwania w celu wstrzyknięcia oczyszczonych i kulistych kardiomiocytów noworodków szczurów do odległego obszaru zawału mięśnia sercowego w sercu dorosłego szczura. Po 2 miesiącach od wstrzyknięcia serca grup przeszczepionych wykazały znaczną poprawę funkcji skurczowej. Co więcej, analizy histologiczne serc, którym podawano powolne wstrzykiwania, ujawniły bezproblemowe połączenia między kardiomiocytami gospodarza a przeszczepem za pośrednictwem interkalowanych dysków zawierających połączenia szczelinowe. Metoda ta może przyczynić się do opracowania terapii komórkowych nowej generacji, w szczególności w medycynie regeneracyjnej serca.

Wpływ powolnej iniekcji na przeżywalność komórek i odkładanie kolagenu 
Kule kardiomiocytów szczura noworodkowego oznakowane PKH26 zostały wstrzyknięte do mięśnia sercowego normalnych szczurów nago za pomocą standardowej lub powolnej metody iniekcji. Wyniki wykazały, że metoda powolnej iniekcji znacząco zwiększyła objętość wszczepionych komórek (Rysunek 3A) oraz znacząco zmniejszyła miejscowe odkładanie kolagenu typu I (Rysunek 3B).
Wpływ powolnego wstrzykiwania na skuteczność leczenia w szczurzym modelu zawału 
Metodę powolnego wstrzykiwania pod kontrolą echokardiografu zastosowano do podania kulek kardiomiocytów noworodka szczura lub PBS(−) do zawałowych obszarów serca szczurów modelowych. Wyłącznie w grupie z wstrzykniętymi komórkami odnotowano znaczną poprawę funkcji skurczowej serca po 2 miesiącach (Rycina 4A). Analizy immunohistochemiczne wykazały trwałe połączenie między przeszczepionymi komórkami a miocytami gospodarza via dyski międzykomórkowe zawierające połączenia szczelinowe (Rycina 4B).
<img alt="Aparatura do iniekcji, schemat systemu chłodzenia strzykawki; sprzęt do kontrolowanego przenoszenia substancji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat całego systemu iniekcyjnego. (A) Główna aparatura do iniekcji. (B) System chłodzenia strzykawki iniekcyjnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ do operacji zwierzęcej oraz odpowiadające mu obrazy ultrasonograficzne dla badań eksperymentalnych w badaniu fizjologicznym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Perkutaniczna wolna injekcja pod kontrolą echokardiografii. (A) Ustawienie zwierzęcia, głowicy echo oraz aparatury do iniekcji. (B) Obraz echokardiograficzny strzykawki iniekcyjnej i serca. Należy zauważyć, że zdjęcia po lewej i prawej stronie są identyczne, ale dodano żółtą linię, aby wskazać położenie igły. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie objętości komórek, wyniki barwienia Coll-I DAPI; obrazy mikroskopowe metod iniekcji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wpływ metody powolnej iniekcji na objętość przeszczepionych komórek i odkładanie kolagenu. (A) Objętości przeszczepionych komórek (N = 3) obliczono na podstawie seryjnych przekrojów. Słupki błędów oznaczają odchylenia standardowe. *P &lt; 0,01 w nieparzystym teście t. (B) Barwienie immunohistochemiczne na kolagen typu I. Pasek skali wskazuje 200 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres skrócenia frakcji i mikroskopia laserowa Cx43 i PKH26, eksperyment analizy kardiologicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65260/65260fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Poprawa funkcji serca i integracja histologiczna kulek kardiomiocytów przeszczepionych metodą powolnej iniekcji. (A) Reprezentatywne obrazy echokardiograficzne w trybie M. Wykres przedstawia zmiany skrócenia frakcji w grupie z przeszczepem kulek kardiomiocytów (ciągła czerwona linia; N = 4) oraz w grupie kontrolnej (roztwór zawiesiny komórek stosowany w metodzie powolnej iniekcji) (przerywana niebieska linia; N = 3). Skróty: MI = zawał mięśnia sercowego; Cx43 = koneksyna 43; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol; PKH26 = czerwony fluorescencyjny marker błony komórkowej. Słupki błędu oznaczają odchylenia standardowe. *P &lt; 0,01 w sparowanym teście t. (B) Analizy immunohistochemiczne relacji między przeszczepionymi kulkami kardiomiocytów a kardiomiocytami gospodarza. W lewej kolumnie przedstawiono konwencjonalne obserwacje mikroskopii laserowej z użyciem obiektywu 2x. Poniżej znajdują się powiększone wersje (z użyciem obiektywu 20x) dwóch obszarów zaznaczonych ramką, oznaczonych symbolami * i #. Paski skali: górny obraz = 300 µm; * i # = 30 µm. Dla porównania przedstawiono obrazy z konfokalnej mikroskopii laserowej z użyciem obiektywu 20x. Pokazano trzy pozycje. Na obrazach scalonych groty strzałek wskazują obecność połączeń szczelinowych (Cx43) bezpośrednio łączących kardiomiocyty przeszczepu i gospodarza. Pasek skali wskazuje 30 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/65260fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wideo uzupełniające 1: Metoda wolnego wstrzykiwania pod kontrolą echokardiografii. Echokardiogram w trybie B w rzucie czołowym pokazuje grot igły iniekcyjnej wprowadzony do mięśnia sercowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65260/Supplementary%20video.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ta metoda eliminuje wszelkie większe zakłócenia podczas iniekcji komórkowych spowodowane przez roztwór zawiesiny komórek.

Nowatorska metoda wstrzykiwania komórek z minimalną inwazją

Directly injecting cells into tissues is a necessary process in cell administration and/or replacement therapy. The cell injection requires a sufficient ...

Celem niniejszej pracy jest poprawa skuteczności leków regeneracyjnych, zwłaszcza medycyny regeneracyjnej serca wykorzystującej indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste. Medycyna regeneracyjna serca jest naszą najbardziej zaangażowaną dziedziną badań. Do moich istotnych ustaleń należy selekcja metaboliczna kardiomiocytów, czyli prosty i masowy sposób oczyszczania kardiomiocytów z warunkiem posiewu pobranej glukozy i dodanego mleczanu. Innym odkryciem jest skuteczna metoda wszczepiania kardiomiocytów poprzez publikację biegunów kardiomiocytów. Ta metoda przeszczepu z biegunami kardiomiocytów potwierdziła zwiększone wszczepienia biegunów kardiomiocytów.Stwierdzono jednak brak bezpośredniej interakcji między gospodarzem a kardiomiocytami przeszczepu. Ta technika zapewnia mniej inwazji na tkanki, do których otrzymują zastrzyki komórkowe. W rezultacie ułatwiona została bezpośrednia interakcja między gospodarzem a kardiomiocytami przeszczepu.Technologia ta może zmniejszyć urazy, reakcje zapalne, a ostatecznie zwłóknienie, czyli tworzenie się blizn. Miejmy nadzieję, że technologia ta zostanie zastosowana w medycynie regeneracyjnej nowej generacji, w tym w medycynie regeneracyjnej serca wykorzystującej pluripotencjalne komórki macierzyste.Znaleźliśmy już kilka sposobów, aby wnieść znaczące zasługi do medycyny regeneracyjnej serca. Badania te będą kontynuowane w przyszłości.

a-novel-cell-injection-method-with-minimum-invasion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Bezpośrednia injekcja cDNA do jądra komórkowego jest skuteczną techniką transfekcji komórek pomitotycznych. Metoda ta zapewnia wysoki poziom ekspresji białek heterologicznych z pojedynczych lub wielu konstruktów cDNA i umożliwia badanie funkcji białek w fizjologicznie istotnym środowisku z wykorzystaniem różnych testów na pojedynczych komórkach.

Wewnątrzjądrowa mikroiniekcja DNA do rozdzielonych neuronów dorosłych ssaków

Za pomocą mikropipet z cienkimi końcówkami wstrzykujemy plazmidowe DNA do poddomen somitów lub cewek nerwowych kurczaka. Stężenie plazmidu jest tak dostosowane, aby uzyskać pojedyncze transfekowane komórki. Następnie pozwalamy komórkom przekształcić się w populacje klonalne.

Transfekcja pojedynczych komórek w zarodkach kurczęt

W niniejszej pracy opisujemy test wykorzystujący mikroiniekcję w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ w celu dokładnego pomiaru kinetyki eksportu mRNA z jądra w somatycznych komórkach ssaków.

Analiza kinetyki eksportu jądrowego mRNA w komórkach ssaków za pomocą mikroiniekcji

Ze względu na ich duży rozmiar i stosunkowo prostą organizację, komórki pielęgniarskie Drosophila idealnie nadają się do badań obrazowania żywych komórek. Ten film opisuje metodę mikroiniekcji do dostarczania związków egzogennych do komórek, a przedstawiony protokół demonstruje procedurę z fluorescencyjnymi sondami oligonukleotydowymi zwanymi latarniami molekularnymi (MB) używanymi do wizualizacji endogennych transkryptów mRNA.

Mikroiniekcja komórek pielęgniarskich Drosophila: metoda dostarczania wewnątrzkomórkowego

Ten film demonstruje procedurę dożylnego wstrzykiwania komórek rakowych do naczyń krwionośnych błony kosmówkowo-omoczniowej kurczaka w celu wygenerowania modelu przerzutów raka CAM. Wstrzyknięte komórki ostatecznie tworzą rozproszone kolonie pojedynczych komórek nowotworowych, co pozwala na badanie inwazji raka i przerzutów.

Dożylne wstrzyknięcie komórek rakowych do naczyń błony moczowo-omoczniowej kurczaka: procedura mająca na celu ustalenie modelu raka błony moczowo-omoczniowej w celu zbadania inwazji raka i przerzutów

Opisujemy tutaj, jak wykonać mikroiniekcję pojedynczej komórki Lucyfera Żółtego, aby zobrazować komunikację komórkową poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach, i podajemy kilka przydatnych wskazówek. Oczekujemy, że ten artykuł pomoże każdemu ocenić stopień sprzężenia komórkowego z powodu funkcjonalnych połączeń szczelinowych. Wszystko, co tu opisano, można by w zasadzie zaadaptować do innych barwników fluorescencyjnych o masie cząsteczkowej poniżej 1000 daltonów.

Mikroiniekcja jednokomórkowa do analizy komunikacji komórkowej

Ten raport opisuje prostą i szybką technikę dokanałowego nakłuwania igły w celu miejscowej transfekcji siRNA w odcinku lędźwiowym rdzenia kręgowego u myszy w krótkotrwałym znieczuleniu światłem.

In vivo (in vivo) Transfekcja SiRNA i knockdown genu w rdzeniu kręgowym poprzez szybkie nieinwazyjne wstrzyknięcia dooponowe w odcinek lędźwiowy u myszy

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Opisujemy, jak techniki mikro- i fotomanipulacji, takie jak FRAP i fotoaktywacja, umożliwiają określenie parametrów ruchliwości i czasoprzestrzennej dynamiki białek w migrujących komórkach. Odczyty eksperymentalne obejmują dynamikę subkomórkową i obrót regulatorów ruchliwości lub leżącego u podstaw cytoszkieletu aktynowego.

Techniki mikromanipulacji pozwalające na analizę dynamiki morfogenetycznej i obrotu regulatorów cytoszkieletu

Ten protokół demonstruje użycie platformy robotycznej do mikroiniekcji do pojedynczych nerwowych komórek macierzystych i neuronów w wycinkach mózgu. Technika ta jest wszechstronna i oferuje metodę śledzenia komórek w tkance z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Manipulacja pojedynczymi neuronalnymi komórkami macierzystymi i neuronami w wycinkach mózgu za pomocą mikroiniekcji robotycznej

Obecny protokół opisuje procedurę radiologii interwencyjnej ustaloną dla iniekcji dograsiczych u myszy, aby uniknąć ryzyka otwartej operacji i poprawić dokładność ślepych iniekcji przezskórnych.

Minimalnie inwazyjna, dokładna i wydajna technika wstrzykiwania dograsiczego u myszy

Poznaj nową metodę wszczepiania biegunów kardiomiocytów w badaniach regeneracyjnych serca przy użyciu komórek iPSC. Technika ta minimalizuje inwazyjność, poprawiająca integrację z tkanką gospodarza.

Nowatorska metoda wstrzykiwania komórek z minimalną inwazją

Przeglądaj więcej filmów