Name: Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Poznaj wysokowydajną edycję genów w pierwotnych makrofagach mysich przy użyciu elektroporacji kompleksów Cas9-sgRNA. Ta metoda umożliwia szybką manipulację genetyczną bez klonowania, z szerokim zastosowaniem w badaniach immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana z grantu NIH 5R01AI144149. Schematyczne rysunki zostały stworzone za pomocą BioRender.

1. projekt sgRNA
UWAGA: Ten krok opisuje wybór sekwencji docelowych i konstrukcję sgRNA. Pomocne jest zaprojektowanie przewodników, które znajdują się w pierwszym dużym eksonie kodującym, tak aby każde przetłumaczone białko zostało zakłócone na wczesnym etapie otwartej ramki odczytu. Pomocne jest również wybranie sekwencji docelowych, które leżą w obrębie tego samego eksonu, ponieważ usprawni to analizę wydajności edycji (krok 6). W przykładach edycji genomu dostarczonych za pomocą tego protokołu wykorzystano sgRNA ukierunkowane na pierwszy ekson genu Src i gen Cblb, a także w niekodującym locus Rosa26 genomu myszy.
<ol>
	<li>Zidentyfikuj 20 sekwencji genomowych nukleotydów, które mają być docelowe, korzystając z jednego z kilku bezpłatnych narzędzi do projektowania online (Tabela 1). Wybierz od czterech do pięciu przewodników, które nie nakładają się na siebie w obrębie każdego genu, ponieważ aktywność Cas9 różni się w zależności od wybranego konkretnego przewodnika, a przewidywanie a priori wysoce aktywnego przewodnika nie jest możliwe. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest zapewnienie właściwej orientacji przewodnika względem sekwencji docelowego locus. Narzędzia projektowe zazwyczaj zapewniają sekwencję prowadzącą w orientacji od 5 do 3 stóp, niezależnie od tego, która nić chromosomowa jest docelowa. Aby zweryfikować orientację nici, należy sprawdzić, czy istnieje sekwencja motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) dla S. pyogenes Cas9 (nGG) bezpośrednio 3' docelowej sekwencji genomowej. Sekwencja sgRNA nie zawiera PAM.</li>
</ol>
2. synteza sgRNA
UWAGA: Ten krok opisuje, jak syntetyzować sgRNA za pomocą PCR w celu wygenerowania matrycy do transkrypcji in vitro (IVT), a następnie oczyszczać sgRNA za pomocą kolumn spinowych (Rysunek 1A). Niestandardowe syntetyczne sgRNA są dostępne na rynku u kilku dostawców jako alternatywa dla PCR/IVT.
<ol>
	<li>Wykonaj PCR, aby wygenerować matrycę IVT dla polimerazy RNA T7. W reakcji PCR wykorzystuje się uniwersalne startery, które zawierają promotor polimerazy T7 RNA i transaktywującą sekwencję CRISPR RNA (tracrRNA) (Tabela 2), a także krótkie pojedyncze startery z sekwencją prowadzącą specyficzną dla genu.
	<ol>
		<li>Jest to krok rozszerzenia nakładania się bez wzmacniania. Rozcieńczyć bufor PCR do 1x i dodać dodatkowy 1 mM MgCl2. Następnie dodaj 0,25 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności, 0,5 mM trifosforanu deoksynukleotydu (dNTP), 0,02 mM startera specyficznego dla przewodnika i 0,02 mM odwróconego długiego uniwersalnego startera T7 (Tabela 2) do całkowitej objętości 46 μL. Następnie umieść probówkę w termocyklerze i uruchom dwa cykle: 95 °C przez 15 s, 37 °C przez 15 s i 72 °C przez 15 s. Ostudzić reakcje na lodzie.</li>
		<li>To jest etap amplifikacji PCR. Do każdej reakcji dodaj 2 μl 25 mM startera do amplifikacji do przodu i 2 μL 25 mM startera do amplifikacji wstecznej. Końcowa objętość reakcji wynosi 50 μl. Denaturacja przez 30 s w temperaturze 95 °C. Następnie uruchom 35 cykli: 95 °C przez 15 s, 65 °C przez 20 s i 72 °C przez 15 s. Wykonać dodatkowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 2 min.</li>
		<li>Sprawdź produkt reakcji PCR na 2% żelu agarozowym. PCR z nakładaniem się na siebie daje cząsteczkę dsDNA o długości 127 pz z promotorem T7 przed specyficznym dla genu przewodnikiem 20 nukleotydów i tracrRNA bezpośrednio za nim (<silna klasa = "xfig" >Figura 1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie szablonu IVT: Istnieje wiele protokołów i zestawów, które dobrze się do tego nadają. W protokole tym wykorzystuje się kulki odwracalnego unieruchomienia w fazie stałej (SPRI). Wymieszaj 50 μl produktu PCR z 90 μl kulek i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować DNA, dodając 40 μl buforu (5 mM Tris, 0,1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego [EDTA]) i ogrzewać w temperaturze 65 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie DNA w matrycy IVT za pomocą absorpcji na długości fali 260 nm. Do IVT potrzebne jest stężenie DNA wynoszące co najmniej 50 ng/μl. Szablon IVT można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Reakcja na IVT
	<ol>
		<li>Używaj komercyjnego zestawu przeznaczonego do uzyskiwania wysokich plonów IVT (patrz Tabela materiałów). Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta, aby przeprowadzić reakcję IVT. Używając 250 ng matrycy IVT w reakcji 20 μl, inkubować w temperaturze 37 °C przez 4-16 godzin.</li>
		<li>Sprawdź produkt sgRNA IVT, przeprowadzając 1 μl reakcji na 2% żelu agarozowym. Należy zaobserwować jasne pasmo RNA, biegnące podobnie do 70 pz dsDNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Chociaż nie jest to obowiązkowe, aby uzyskać ostre i bardziej rozdzielcze pasma, należy użyć buforu próbki RNA z mocznikiem i denaturować próbkę w temperaturze 65 °C przez 5 minut przed załadowaniem. 
		UWAGA: W przypadku niektórych przewodnikowych RNA można zaobserwować słabe pasma o większej masie cząsteczkowej i niewielkie różnice w migracji ze względu na różnice w drugorzędowej strukturze RNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Defosforylacja produktu sgRNA IVT, aby zminimalizować aktywację RIG-I (obcego czujnika RNA) i późniejszą śmierć komórki po elektroporacji. Na każde 20 μl reakcji IVT dodać 69 μl wody molekularnej i 15 U fosfatazy jelitowej cielęcia () w 1x bufor. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zdegraduj matrycę IVT, aby zminimalizować aktywację komórkowych czujników DNA, które wywołują śmierć komórki po elektroporacji. Do każdej reakcji IVT dodać 2 U DNazy wolnej od RNaz. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Produkt IVT może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez 1 dzień lub -80 °C przez kilka miesięcy.</li>
	<li>Oczyść produkt IVT za pomocą kolumn wirujących. Na tym etapie zestawy do oczyszczania kulek SPRI są gorsze.
	<ol>
		<li>Zwiąż RNA z kolumną, dodając 220 μl buforu wiążącego do produktu IVT, a następnie 1 ml 100% etanolu klasy biologii molekularnej. Dobrze wymieszaj i załaduj kolumnę. Następnie postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj końcowe płukanie w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia sgRNA.</li>
		<li>Przeprowadź elucję w okapie z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia. Eluować RNA za pomocą 30 μl sterylnego 10 mM buforu Tris (pH 8,0).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierzyć stężenie sgRNA, mierząc absorbancję przy długości fali 260 nm. 
	UWAGA: Typowa wydajność sgRNA wynosi co najmniej 100 μg.</li>
	<li>Przechowywać sgRNA w temperaturze -80 °C. Przygotować porcje, aby uniknąć więcej niż trzech cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do elektroporacji
UWAGA: Wszystkie kroki powinny być wykonywane w okapie z przepływem laminarnym, aby uniknąć zanieczyszczenia. W protokole tym wykorzystuje się dostępny na rynku system elektroporacji (patrz tabela materiałów) z końcówkami o pojemności 10 μl.
<ol>
	<li>Rozmrozić BMDM 48-72 h przed użyciem i rozwinąć je na płytkach niepoddanych hodowli tkankowej (TC). 
	UWAGA: Na reakcję potrzebne są 4 x 105 komórek.</li>
	<li>Wysterylizuj probówki PCR do montażu reakcji. Przygotować jedną probówkę do PCR na reakcję i podgrzewać je w termocyklerze przez 10 minut w temperaturze 98 °C. Przygotować probówki partiami i przechowywać je zamknięte. Umieść wysterylizowane probówki PCR na lodzie, gdy są gotowe do użycia.</li>
	<li>Wyczyść stację pipetową 70% etanolem i umieść ją w okapie z przepływem laminarnym. Ustaw parametry na 1,900 V, 20 ms i jeden impuls.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij probówkę do transfekcji z opakowania, aby zachować jej sterylność i napełnij ją 3 ml buforu "E". Upewnij się, że bufor E ma temperaturę pokojową przed elektroporacją. Włóż rurkę do stacji i popchnij ją w dół, aż usłyszysz kliknięcie.</li>
	<li>Dla każdej reakcji podwielokrotność 2,5 μl sgRNA w stężeniu 1,100 ng/μL. Rozcieńczyć sgRNA w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) 0,9 mM CaCl2 i 0,5 mM MgCl2 (PBS + Ca/Mg). Zostaw to na lodzie.</li>
	<li>Przygotować dwie płytki: 12-dołkową niepowlekaną płytkę na komórki i dodatkową 24-dołkową płytkę do przechowywania pożywki hodowlanej. Podaniec 1,5 ml pożywki wolnej od antybiotyków na reakcję do dołków płytki 24-dołkowej.</li>
	<li>Przygotuj białko Cas9. Istnieje kilku komercyjnych i akademickich dostawców sterylnie oczyszczonego białka Cas9. Rozcieńczyć Cas9 do końcowego stężenia 20 μM zimnym PBS + Ca/Mg. Dla każdej reakcji elektroporacji podamy 1 μL z 20 μM Cas9 do sterylnych probówek do PCR. Pozostaw na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj ogniwa do elektroporacji.
	<ol>
		<li>Usuń podłoże wzrostowe. Umyj komórki za pomocą PBS bez CaCl2 i MgCl2 (PBS-Ca/Mg) w celu usunięcia surowicy i kationów dwuwartościowych, które sprzyjają adhezji. Następnie dodaj PBS + 1 mM EDTA i inkubuj w temperaturze pokojowej przez około 5 minut, aż komórki zaczną się odłączać.</li>
		<li>Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby odłączyć komórki. Przenieś komórki do probówki o niskim poziomie wiązania białek 15 ml. Granulować komórki w temperaturze 500 x g przez 5 min. 
		UWAGA: Makrofagi przylegają do wyrobów z tworzyw sztucznych. Zastosowanie probówek wirówkowych o niskim stopniu wiązania białek znacznie poprawia wydajność komórek.</li>
		<li>Pracuj szybko, aby uniknąć długotrwałej inkubacji komórek w PBS + EDTA. Usunąć większość supernatantu, pozostawiając około 1 ml supernatantu w probówce. Ponownie zawiesić komórki w pozostałym supernatancie, a następnie przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml do mikronatchnienia, o niskiej zdolności wiązania białek.</li>
		<li>Usuń małą porcję komórek do policzenia. Pozostałe komórki osadzać przez odwirowanie w temperaturze 500 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Podczas wirowania policz komórki i ogrzej probówki Cas9 i sgRNA do temperatury pokojowej.</li>
		<li>Usunąć cały sklarat sklarowany z osadu komórkowego. Zawiesić komórki w PBS + Ca/Mg w stężeniu 4 x 107 komórek/ml (4 x 105 komórek na 10 μl reakcji). 
		UWAGA: Każdy zestaw jest dostarczany z ograniczoną ilością bufora elektroporacyjnego (Bufor R, Bufor T). Okazuje się jednak, że wydajność elektroporacji przy użyciu PBS + Ca/Mg jest równoważna z zastrzeżonymi.</li>
		<li>Podczas elektroporacji sgRNA dla różnych genów, należy podzielić komórki na różne rurki o niskim poziomie wiązania białka dla każdego genu, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między sgRNA. Utrzymuj ogniwa w temperaturze pokojowej, aż będą gotowe do elektroporacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Montaż RNP
<ol>
	<li>Utrzymuj sgRNA i Cas9 w temperaturze pokojowej, aby uniknąć wytrącania się. Dodaj 2,5 μl sgRNA do 1 μl rozcieńczonego Cas9 w wysterylizowanych probówkach PCR. Dozuj sgRNA powoli przez 15 s z mieszaniem, aby zapobiec wytrącaniu się.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksu RNP.</li>
</ol>
5. Dostarczanie RNP przez elektroporację
<ol>
	<li>Przygotuj końcówkę (kuwetę) do elektroporacji. Wciśnij tłok, aby wysunąć trzpień. Włóż trzpień do końcówki. 
	UWAGA: Upewnij się, że końcówka jest zabezpieczona, a tłok przesuwa się płynnie i wysuwa poza osłonę końcówki. Jeśli końcówka nie jest prawidłowo umieszczona, pęcherzyki powietrza mogą zostać wprowadzone do końcówki, powodując awarię końcówki.</li>
	<li>Zawieś ogniwa, pipetując w górę iw dół, a następnie załaduj końcówkę elektroporacyjną ogniwami. Wycofaj pełną objętość końcówki wynoszącą 10 μl, unikając powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Zaczynając od sgRNA kontroli ujemnej, przenieś 10 μl komórek w końcówce do elektroporacji do probówki zawierającej 3,5 μl RNP z kroku 4. Pipetuj trzy razy w górę i w dół, aby dobrze wymieszać. Narysuj 10 μl mieszaniny z powrotem do końcówki, upewniając się, że nie ma pęcherzyków.</li>
	<li>Umieść końcówkę w stacji elektroporacji, opuszczając ją do bufora. Unikaj kontaktu plastikowych powierzchni z końcówką, aby zachować sterylność. Naciśnij Start na ekranie dotykowym.</li>
	<li>Po zakończeniu wyświetlacz wskaże udany impuls. Wyjmij pipetę z urządzenia i umieść komórki w suchym dołku na oznakowanej, niepowlekanej płytce 12-dołkowej.</li>
	<li>Przepłukać końcówkę, pipetując dwukrotnie w górę i w dół w 15 ml PBS + Ca/Mg. Odłóż pipetę na bok z nadal założoną końcówką. Upewnij się, że końcówka niczego nie dotyka i pozostaje sterylna. 
	UWAGA: W wielu eksperymentach możliwe jest ponowne użycie końcówki do wielu próbek, na przykład po nieaktywnej próbce sgRNA kontroli ujemnej lub podczas wstępnych ocen aktywności przewodnika, gdy testuje się od czterech do pięciu sgRNA na gen, a jedynym odczytem jest wydajność edycji. Jednak podczas analizy funkcjonalnej na edytowanych komórkach zaleca się nową końcówkę dla każdego genu, ponieważ niewielkie ilości sgRNA lub przeniesienie komórki mogą mieć wpływ na wyniki eksperymentalne.</li>
	<li>Natychmiast dodać 1 ml pożywki wolnej od antybiotyków (podanej w kroku 3.6) do komórek i delikatnie wstrząsnąć płytką, aby wymieszać.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 5.2-5.6 dla pozostałych reakcji.</li>
	<li>Umieść komórki z powrotem w inkubatorze.</li>
	<li>Sprawdź żywotność ogniw 1-2 godziny po elektroporacji. Komórki powinny przylegać w >90%. Opcjonalnie: Dodaj gentamycynę (5 μg/ml) do komórek 1-2 godziny po elektroporacji, aby zapobiec zanieczyszczeniu, jeśli nie zakłóci to dalszych eksperymentów.</li>
</ol>
6. Ocena efektywności edycji
UWAGA: Większość edycji jest zakończona po 48 godzinach.
<ol>
	<li>Sprawdź monowarstwę ogniwa 48 godzin po elektroporacji. Jeśli komórki zlewają się w ponad 50%, przejdź dalej. Jeśli komórki są w <50% zlewne, odczekaj dodatkowe 1-2 dni. Analiza genomowego DNA w celu określenia wydajności edycji wymaga 1 x 105 komórek, oprócz komórek potrzebnych do dalszego eksperymentu.</li>
	<li>Przygotuj genomowe DNA (gDNA).
	<ol>
		<li>Umyj komórki PBS (-Ca/Mg). Dodać 1 ml PBS + 1 mM EDTA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez około 5 minut, aż komórki zaczną odłączać się od płytki.</li>
		<li>Odłączyć komórki przez pipetowanie. Przenieść do probówki do mikrofuge o niskiej ilości wiązania białek.</li>
		<li>Policz komórki i usuń podwielokrotność 1 x 105 komórek. Pozostałe ogniwa można ponownie posiać w celu wykorzystania w dalszych eksperymentach. Ogólnie rzecz biorąc, eksperymenty przeprowadza się 5 dni po elektroporacji, aby umożliwić rozpad białka.</li>
		<li>Osadzaj komórki do analizy gDNA przez 15 s z maksymalną prędkością w probówce do mikrofuge.</li>
		<li>Zawiesić osad w 50 μl buforu do lizy. Wirować, aby odłączyć wszelkie komórki przyklejone do ścianek probówki, i podgrzewać w temperaturze 98 °C przez 10 minut, aby zlizować komórki i dezaktywować endogenną DNazę.</li>
		<li>Umieść probówki na lodzie.</li>
		<li>Dodać 1 μl proteinazy K (20 mg/ml). Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C; Dla wygody można go zostawić na noc.</li>
		<li>Podgrzewać do 98 °C przez 10 minut, aby dezaktywować proteinazę K.</li>
		<li>Wirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut z maksymalną prędkością. Usunąć supernatant, który zawiera DNA. Ten surowy preparat bez dalszego oczyszczania sprawdza się dobrze w większości reakcji PCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń wydajność edycji za pomocą sekwencjonowania Sangera.
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery PCR 200-300 pz przed najbardziej 5' miejscami przewodników i 200-300 pz za najbardziej 3' miejscami przewodnikowymi. Typowy rozmiar amplikonu to ~500 pz. Zaprojektuj zagnieżdżony starter sekwencjonowania w odległości co najmniej 125 pz od najbliższego miejsca prowadzenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Wykonaj PCR przy użyciu 2 μl gDNA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować produkt PCR do sekwencjonowania. W protokole tym stosuje się leczenie egzonukleazą I/fosfatazą alkaliczną krewetek (ExoI/SAP). Komercyjne zestawy do oczyszczania DNA również działają, ale wymagają więcej czasu praktycznego.
	<ol>
		<li>Przygotować 15 μl produktu PCR. Dodaj 7,5 μl wody, 1 μl 10x buforu ExoI, 10 U ExoI i 1 U SAP, aby zdegradować dNTP i startery, które zakłócają sekwencjonowanie Sangera.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie w temperaturze 85 °C przez 20 minut w celu dezaktywacji enzymów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić sekwencjonowanie Sangera na produkcie PCR poddanym działaniu Exo/SAP; użyć znanej ilości markera wielkości DNA, aby oszacować wielkość produktu PCR obecnego w próbce. Reakcje sekwencjonowania mogą wymagać optymalizacji, ponieważ oprogramowanie TIDE wymaga wysokiej jakości chromatogramów sekwencyjnych, aby dokładnie oszacować wydajność edycji. Chromatogram sekwencyjny dla nieedytowanego locus powinien zapewniać wyraźne piki z minimalnym tłem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B, C).</li>
	<li>Aby oszacować wydajność edycji, użyj TIDE do analizy plików chromatogramu sekwencjonowania Sangera przy użyciu edytowanego gDNA i nieedytowanego gDNA kontrolnego. (Tabela 1, <silna klasa="xfig">Rysunek 2). Prześlij pliki sekwencjonowania Sanger i uruchom oprogramowanie z ustawieniami domyślnymi.</li>
</ol>

A Guide to Precise Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages

<ol><li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis, and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+suppression+of+gene+expression+by+RNAi+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).</li>
<li>Laugel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+isogenic+cells+deficient+for+MR1+with+a+CRISPR%2FCas9+lentiviral+system%3A+Tools+to+study+microbial+antigen+processing+and+presentation+to+human+MR1-restricted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells.</a> The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+macrophages+and+J774+cells+respond+differently+to+infection+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis.</a> Scientific Reports. 7, 42225(2017).</li>
<li>Roberts, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9%2B+conditionally-immortalized+macrophages+as+a+tool+for+bacterial+pathogenesis+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond.</a> eLife. 8, e45957(2019).</li>
<li>Oberdoerffer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+RNA+interference+in+the+mouse+hematopoietic+system+varies+between+cell+types+and+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YTHDF2+orchestrates+tumor-associated+macrophage+reprogramming+and+controls+antitumor+immunity+through+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+engineering+in+human+cells+with+the+Cas9+RNA-guided+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> eLife. 2, e00471(2013).</li>
<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li>
<li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR%2FCas9+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766(2014).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168(2014).</li>
<li>Craft, J. CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+California%2C+Davis%22">University of California, Davis</a>. , Master's thesis (2022).</li>
<li>Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+of+primary+macrophages+with+in+vitro+transcribed+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60143(2019).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+delivery+of+Cas9+protein%2FgRNA+complexes+using+lipofectamine+CRISPRMAX%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX.</a> Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Edycja genomu za pomocą elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA pozwala na skuteczne zakłócenie funkcji genów w BMDM. Wydajność edycji różni się w zależności od sekwencji docelowej i genu. Zazwyczaj od czterech do pięciu sgRNA jest zwykle poddawanych badaniom przesiewowym w celu zidentyfikowania jednego, który jest wysoce aktywny. Niektóre loci mają niższą wydajność edycji, najprawdopodobniej ze względu na strukturę chromatyny. W takich przypadkach można wprowadzić kilka modyfikacji, aby zwiększyć wydajność edycji. Jedno...

Makrofagi to wrodzone komórki odpornościowe, które odgrywają kluczową rolę w naprawie tkanek i odporności1,2. Unieśmiertelnione linie komórkowe makrofagów, takie jak mysie komórki RAW 264.7 lub ludzkie komórki THP-1, mają kilka korzystnych cech, w tym silny wzrost i łatwość rozrywania genów poprzez dostarczanie wektorów do interferencji RNA lub CRISPR/Cas93,4. Jednak transformacja onkogenna dramatycznie zmienia ich fizjologię, co skutkuje nieprawidłową aktywacją niektórych szlaków i wyciszonymi reakcjami innych5,6. Pierwotne makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) bardziej przypominają fizjologię makrofagów in vivo, ale pozostają trudne do genetycznego manipulowania ze względu na niską skuteczność zarówno transfekcji plazmidu, jak i transdukcji wirusa w tych pierwotnych komórkach odpornościowych7,8. W związku z tym potrzebne są bardziej efektywne metody zakłócania funkcji genów.
Edycja genomu CRISPR/Cas9 to potężne narzędzie do manipulacji genetycznej w wielu systemach biologicznych, w tym w komórkach ssaków9,10,11,12. Białko Streptococcus pyogenes Cas9 skutecznie i specyficznie rozszczepia dwuniciowe DNA, gdy jest skompleksowane ze specyficznym dla sekwencji przewodnikiem RNA. Naprawa DNA poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) rozszczepionego DNA powoduje małe insercje lub delecje (indele), które powodują mutacje przesunięcia ramki odczytu. We wczesnych badaniach Cas9 i sgRNA były dostarczane za pośrednictwem wektorów plazmidowych lub lentiwirusowych, które są skutecznymi metodami dostarczania dla wielu linii komórkowych9,10. Jednak komórki pierwotne, a w szczególności pierwotne komórki odpornościowe, są często oporne na te metody ze względu na niską skuteczność dostarczania wektora przez transfekcję lub transdukcję. Następnie opracowano metody generowania kompleksów sgRNA-Cas9 in vitro i dostarczania ich za pomocą elektroporacji, a metody te osiągnęły wysoką wydajność w różnych typach komórek13,14. Wyniki sugerują możliwość wykorzystania tego podejścia do przeprowadzenia edycji genomu w pierwotnych makrofagach.
Tutaj udostępniamy protokół do wykorzystania kompleksów rybonukleoproteinowych sgRNA-Cas9 (RNP) do przeprowadzenia edycji genomu w pierwotnych BMDM. Zawiera kroki mające na celu złagodzenie aktywacji czujników immunologicznych obecnych w pierwotnych komórkach odpornościowych i powoduje do 95% edycji w docelowych loci przy minimalnej toksyczności. Protokół ten obejmuje również przepływy pracy do oceny wydajności edycji przy użyciu rutynowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i sekwencjonowania Sangera, a następnie analizy in silico za pomocą Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, dobrze zweryfikowanego narzędzia programowego online.

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa 3T3-MCSF</td><td>Prezent od Russella Vance'a</td><td>nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R Cas9 Wzmacniacz elektroporacji</td><td>IDT</td><td>1075915</td><td></td></tr><tr><td>Kulki odczynnikowe Ampure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna jelitowa cielęcia</td><td>NEB</td><td>M0525S</td><td></td></tr><tr><td>DNaza</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DPBS + Ca/Mg (0,9 mM CaCl2 i 0,5 mM MgCl2)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS -Ca/Mg</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>ExoI</td><td>NEB</td><td>M0293S</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Corning</td><td>35-015-CV</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA i bufor Herculase</td><td>Agilent</td><td>600677</td><td></td></tr><tr><td>HiScribe T7 Zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajności</td><td>NEB</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe LoBind 15 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30122216</td><td></td></tr><tr><td>LoBind Probówki Eppendorf 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer r2.1 NEB</td><td></td><td>B6002S</td><td></td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej</td><td>Thermo Fisher</td><td>MPK5000, MPP100, MPS100</td><td></td></tr><tr><td>System transfekcji neonowej 10 uL Końcówki</td><td>Thermo Fisher</td><td>MPK1025 lub MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>PBS + 1mM EDTA</td><td>Lonza</td><td>BE02017F</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart Bufor do ExoI</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0384</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ładujący RNA</td><td>NEB</td><td>B0363S</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9-NLS</td><td>Uniwersytet Kalifornijski Macro Lab</td><td>nie dotyczy</td><td>Dostępne dla badaczy spoza UC przez&nbsp; https://qb3.berkeley.edu</td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9-NLS, zmodyfikowany</td><td>IDT</td> 3. generacji <td>1081059</td><td></td></tr><tr><td>SAP</td><td>NEB</td><td>M0371S</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów cas9-sgrna

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

Makrofagi pochodzące od myszy pochodzące ze szpiku kostnego są kluczowym narzędziem do badania złożonej biologii makrofagów tkankowych. Jako komórki pierwotne modelują fizjologię makrofagów in vivo dokładniej niż unieśmiertelnione linie komórkowe makrofagów i mogą pochodzić od myszy już noszących określone zmiany genetyczne. Jednak zakłócenie funkcji genów w BMDM pozostaje wyzwaniem technicznym. W tym miejscu udostępniamy protokół do wydajnej edycji genomu CRISPR/Cas9 w BMDM, który pozwala na wprowadzenie małych insercji i delecji (indeli), które skutkują mutacjami przesunięcia ramki odczytu, które zakłócają funkcję genu. Protokół opisuje, w jaki sposób syntetyzować RNA z pojedynczym przewodnikiem (sgRNA-Cas9) i tworzyć oczyszczone kompleksy rybonukleoproteinowe sgRNA-Cas9 (RNP), które mogą być dostarczane przez elektroporację. Zapewnia również wydajną metodę monitorowania wydajności edycji przy użyciu rutynowego sekwencjonowania Sangera i bezpłatnego programu do analizy online. Protokół można wykonać w ciągu 1 tygodnia i nie wymaga budowy plazmidu; Zwykle skutkuje to wydajnością edycji od 85% do 95%.

Matryca do IVT jest produktem PCR o długości 127 bp (Rysunek 1B). Pełnowymiarowy produkt IVT to RNA o długości 98 nt, który migruje podobnie do fragmentu dwuniciowego DNA o długości 70 bp (Rysunek 1C).
Po elektroporacji przeżywalność komórek powinna wynosić &gt;90%, a całkowita liczba komórek powinna stanowić &gt;70% początkowej liczby komórek. Powstała pula komórek mutantów powinna charakteryzować się zróżnicowanym zestawem indeli, r...

Ten protokół opisuje procedurę edycji genomu w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy przy użyciu kompleksów rybonukleoprotein Cas9-sgRNA składanych in vitro i dostarczanych przez elektroporację.

Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the ...

Nasze badania laboratoryjne, interakcja między prątkami gruźlicy a układem odpornościowym gospodarza, z naciskiem na początkową interakcję między bakterią a makrofagami. Istnieje wiele technik rozrywania genów stosowanych w makrofagach, w tym technologie RNAi i technologie CRISPR. Jednym z głównych wyzwań jest niska skuteczność rozrywania genów w makrofagach.Protokół ten umożliwia szybką i wysoce efektywną manipulację genetyczną pierwotnych makrofagów bez konieczności klonowania i budowy plazmidu. Metody te powinny mieć szerokie zastosowanie w immunologii, umożliwiając naukowcom zakłócanie genów w pierwotnych makrofagach w szerokim zakresie badań. Aby rozpocząć, ustaw parametry stacji pipetowej umieszczonej w okapie o przepływie laminarnym na 1 900 woltów, 20 milisekund w jednym impulsie.Ostrożnie wyjmij probówkę do transfekcji z opakowania, aby była sterylna i napełnij ją 3 mililitrami buforu E. Aby przygotować komórki do elektroporacji, usuń pożywkę wzrostową z komórek i umyj je za pomocą PBS w celu usunięcia surowicy i kationów dwuwartościowych, które sprzyjają adhezji. Następnie dodaj mieszaninę PBS i 1 milimolowego EDTA do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez około pięć minut, aż komórki zaczną się odłączać.Delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby odłączyć komórki i przenieść je do 15-mililitrowej probówki o niskiej zawartości białka. Osadzać komórki w masie 500 G przez pięć minut. Po odwirowaniu szybko usuń większość supernatantu, pozostawiając około 1 mililitra supernatantu w probówce.Ponownie zawiesić komórki w pozostałym supernatancie i przenieść go do 1,5-mililitrowej probówki do mikrofuge o niskiej wiązalności białka. Usuń małą porcję komórek, aby policzyć i zagnieździć pozostałe komórki, wirując w temperaturze 500 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Policz komórki podczas wirowania.Weź 1x sgRNA i 20 milimolowy roztwór Cas9 i ogrzej probówki do temperatury pokojowej. Po odwirowaniu usunąć cały supernatant z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w PBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu w stężeniu 40 milionów komórek na mililitr. W przypadku złożenia kompleksu rybonukleoproteinowego sgRNA Cas9 dodaj 2,5 mikrolitra sgRNA do 1 mikrolitra rozcieńczonego Cas9 w wysterylizowanych probówkach PCR i powoli dozuj sgRNA, mieszając przez około 15 sekund, aby zapobiec wytrącaniu się.Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksu rybonukleoproteinowego. Aby dostarczyć kompleks rybonukleoproteinowy za pomocą elektroporacji, przygotuj końcówkę elektroporacji, naciskając tłok, aby przedłużyć trzpień. Następnie włóż łodygę do końcówki.Ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół. Załaduj końcówkę elektroporacyjną ogniwami i wyjmij pełną objętość końcówki wynoszącą 10 mikrolitrów. Zaczynając od kontroli ujemnej sgRNA, przenieś 10 mikrolitrów komórek w końcówce do elektroporacji do probówki z próbką zawierającej 3,5 mikrolitra rybonukleoproteiny.Pipetuj trzy razy w górę i w dół, aby dobrze wymieszać i nabrać 10 mikrolitrów mieszaniny z powrotem do końcówki. Umieść końcówkę w stacji elektroporacji, opuszczając ją do bufora i naciśnij Start na wyświetlaczu ekranu dotykowego. Po zakończeniu wyświetlacz wskaże udany impuls.Wyjmij pipetę z urządzenia i umieść komórki w suchym dołku na niepowlekanej płytce 12-dołkowej. Przepłukać końcówkę, pipetując dwukrotnie w górę i w dół w 15 mililitrach PBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu. Odłóż pipetę na bok z nadal założoną końcówką.Natychmiast dodać 1 mililitr pożywki wolnej od antybiotyków podzielonej wcześniej na komórki i delikatnie wstrząsnąć płytką, aby wymieszać. Reprezentatywny chromatogram sekwencjonowania Sangera locus Rosa 26 z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego poddany elektroporacji kontrolowanej, niedocelowej rybonukleoproteiny sgRNA Cas9 specyficznej dla sgRNA 26 oraz genów Src i Cblb w edytowanych makrofagach pokazano tutaj. Analiza docelowych genów za pomocą PCR i sekwencjonowania Sangera pokazuje wiele nukleotydów w każdej pozycji poniżej miejsca cięcia Cas9.Wyniki te potwierdzają osiągnięcie wysokiej wydajności edycji dla wielu docelowych genów.

high-efficiency-gene-disruption-primary-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Tutaj prezentujemy protokół genetycznej modyfikacji pierwotnych lub rozszerzonych komórek NK (ang. human natural killer) za pomocą rybonukleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy ludzkie komórki NK z niedoborem receptora 2 czynnika wzrostu b (TGFBR2) i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1 (HPRT1).

Generowanie nokautujących pierwotnych i ekspandowanych ludzkich komórek NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9

Prezentowany tutaj jest protokół do przeprowadzenia ograniczonego czasowo i przestrzennie nokautowania genów w rdzeniu kręgowym aksolotla poprzez wstrzyknięcie kompleksu CAS9-gRNA do kanału centralnego rdzenia kręgowego, a następnie elektroporację.

Bezpośredni nokaut genów nerwowych komórek macierzystych rdzenia kręgowego aksolotla poprzez elektroporację kompleksów białko-gRNA CAS9

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery i sortowanie komórek, aby uprościć eksperymenty z wykorzystaniem fagów i linii komórek T. Do tych uproszczonych eksperymentów knock-in stosuje się dwa plazmidy, a mianowicie plazmid z ekspresją CRISPR/Cas9 i DsRed2 oraz plazmid dawcy z ekspresją rekombinacji homologicznej EBFP2, który jest trwale zintegrowany w locus Rosa26 w komórkach odpornościowych.

Knock-in genu przez CRISPR/Cas9 i sortowanie komórek w liniach makrofagów i limfocytów T

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Tutaj opisujemy ustawienia do równoległego monitorowania bioluminescencji okołodobowej i aktywności wydzielniczej ludzkich komórek wysp trzustkowych i pierwotnych miotub. W tym celu zastosowaliśmy dostarczanie genu lentiwirusowego za pomocą reportera zegara rdzeniowego lucyferazy, a następnie synchronizację in vitro i zbieranie pożywki odpływowej przez ciągłą peryfuzję komórek.

Równoległy pomiar ekspresji genów zegara okołodobowego i wydzielania hormonów w pierwotnych hodowlach komórkowych człowieka

Opisujemy użycie multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości, która określa ilościowo ekspresję genów poprzez kodowanie kreskowe i liczenie cząsteczek w substratach biologicznych bez potrzeby amplifikacji. Wykorzystaliśmy platformę do ilościowego określenia ekspresji mikroRNA (miRNA) we krwi pełnej u osób z zespołem jelita drażliwego i bez niego.

Zaburzenia krążących miRNA w zespole jelita drażliwego wykryte za pomocą multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości

Poznaj wysokowydajną edycję genów w pierwotnych makrofagach mysich przy użyciu elektroporacji kompleksów Cas9-sgRNA. Ta metoda umożliwia szybką manipulację genetyczną bez klonowania, z szerokim zastosowaniem w badaniach immunologicznych.

Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA (Wideo) | JoVE Journal

Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA

Przeglądaj więcej filmów