Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA
4 sierpnia 2023
Ten protokół opisuje procedurę edycji genomu w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy przy użyciu kompleksów rybonukleoprotein Cas9-sgRNA składanych in vitro i dostarczanych przez elektroporację.
Nasze badania laboratoryjne, interakcja między prątkami gruźlicy a układem odpornościowym gospodarza, z naciskiem na początkową interakcję między bakterią a makrofagami. Istnieje wiele technik rozrywania genów stosowanych w makrofagach, w tym technologie RNAi i technologie CRISPR. Jednym z głównych wyzwań jest niska skuteczność rozrywania genów w makrofagach.
Protokół ten umożliwia szybką i wysoce efektywną manipulację genetyczną pierwotnych makrofagów bez konieczności klonowania i budowy plazmidu. Metody te powinny mieć szerokie zastosowanie w immunologii, umożliwiając naukowcom zakłócanie genów w pierwotnych makrofagach w szerokim zakresie badań. Aby rozpocząć, ustaw parametry stacji pipetowej umieszczonej w okapie o przepływie laminarnym na 1 900 woltów, 20 milisekund w jednym impulsie.
Ostrożnie wyjmij probówkę do transfekcji z opakowania, aby była sterylna i napełnij ją 3 mililitrami buforu E. Aby przygotować komórki do elektroporacji, usuń pożywkę wzrostową z komórek i umyj je za pomocą PBS w celu usunięcia surowicy i kationów dwuwartościowych, które sprzyjają adhezji. Następnie dodaj mieszaninę PBS i 1 milimolowego EDTA do komórek i inkubuj w temperaturze pokojowej przez około pięć minut, aż komórki zaczną się odłączać.
Delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby odłączyć komórki i przenieść je do 15-mililitrowej probówki o niskiej zawartości białka. Osadzać komórki w masie 500 G przez pięć minut. Po odwirowaniu szybko usuń większość supernatantu, pozostawiając około 1 mililitra supernatantu w probówce.
Ponownie zawiesić komórki w pozostałym supernatancie i przenieść go do 1,5-mililitrowej probówki do mikrofuge o niskiej wiązalności białka. Usuń małą porcję komórek, aby policzyć i zagnieździć pozostałe komórki, wirując w temperaturze 500 G w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Policz komórki podczas wirowania.
Weź 1x sgRNA i 20 milimolowy roztwór Cas9 i ogrzej probówki do temperatury pokojowej. Po odwirowaniu usunąć cały supernatant z osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w PBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu w stężeniu 40 milionów komórek na mililitr. W przypadku złożenia kompleksu rybonukleoproteinowego sgRNA Cas9 dodaj 2,5 mikrolitra sgRNA do 1 mikrolitra rozcieńczonego Cas9 w wysterylizowanych probówkach PCR i powoli dozuj sgRNA, mieszając przez około 15 sekund, aby zapobiec wytrącaniu się.
Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksu rybonukleoproteinowego. Aby dostarczyć kompleks rybonukleoproteinowy za pomocą elektroporacji, przygotuj końcówkę elektroporacji, naciskając tłok, aby przedłużyć trzpień. Następnie włóż łodygę do końcówki.
Ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół. Załaduj końcówkę elektroporacyjną ogniwami i wyjmij pełną objętość końcówki wynoszącą 10 mikrolitrów. Zaczynając od kontroli ujemnej sgRNA, przenieś 10 mikrolitrów komórek w końcówce do elektroporacji do probówki z próbką zawierającej 3,5 mikrolitra rybonukleoproteiny.
Pipetuj trzy razy w górę i w dół, aby dobrze wymieszać i nabrać 10 mikrolitrów mieszaniny z powrotem do końcówki. Umieść końcówkę w stacji elektroporacji, opuszczając ją do bufora i naciśnij Start na wyświetlaczu ekranu dotykowego. Po zakończeniu wyświetlacz wskaże udany impuls.
Wyjmij pipetę z urządzenia i umieść komórki w suchym dołku na niepowlekanej płytce 12-dołkowej. Przepłukać końcówkę, pipetując dwukrotnie w górę i w dół w 15 mililitrach PBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu. Odłóż pipetę na bok z nadal założoną końcówką.
Natychmiast dodać 1 mililitr pożywki wolnej od antybiotyków podzielonej wcześniej na komórki i delikatnie wstrząsnąć płytką, aby wymieszać. Reprezentatywny chromatogram sekwencjonowania Sangera locus Rosa 26 z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego poddany elektroporacji kontrolowanej, niedocelowej rybonukleoproteiny sgRNA Cas9 specyficznej dla sgRNA 26 oraz genów Src i Cblb w edytowanych makrofagach pokazano tutaj. Analiza docelowych genów za pomocą PCR i sekwencjonowania Sangera pokazuje wiele nukleotydów w każdej pozycji poniżej miejsca cięcia Cas9.
Wyniki te potwierdzają osiągnięcie wysokiej wydajności edycji dla wielu docelowych genów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Overview
Ten protokół opisuje metodę edycji genomu w makrofagach pochodzących z szpiku kostnego myszy z wykorzystaniem kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9-sgRNA. Podejście to zwiększa wydajność manipulacji genetycznych w makrofagach pierwotnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Immunologia
- Inżynieria genetyczna
- Biologia makrofagów
Tło
- Makrofagi odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej.
- Techniki dezaktywacji genów są niezbędne do badania funkcji makrofagów.
- Tradycyjne metody często charakteryzują się niską wydajnością.
- Ten protokół rozwiązuje te wyzwania, umożliwiając wysokowydajną manipulację genetyczną.
Cel badania
- Poprawa wydajności dezaktywacji genów w makrofagach pierwotnych.
- Umożliwienie szybkiej manipulacji genetycznej bez klonowania.
- Dostarczenie metody, która może być zastosowana w różnych badaniach immunologicznych.
Wykorzystane metody
- Złożenie kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9-sgRNA in vitro.
- Dostarczenie tych kompleksów za pomocą elektroporacji.
- Ustalanie konkretnych parametrów dla elektroporacji (np. 1900 woltów, 20 milisekund).
- Zastosowanie w makrofagach pochodzących z szpiku kostnego myszy.
Główne wyniki
- Wyłoniono wysoką wydajność dezaktywacji genów w makrofagach.
- Umożliwiło to szybką manipulację genetyczną bez potrzeby stosowania plazmidów.
- Wykaono szerokie zastosowanie w różnych badaniach immunologicznych.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia niezawodną metodę manipulacji genetycznej w makrofagach.
- Rozwiązuje wcześniejsze problemy związane z wydajnością dezaktywacji genów.
- Naukowcy mogą wykorzystać tę metodę do różnorodnych badań w immunologii.
Najczęściej zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient gene disruption in primary bone marrow-derived macrophages (BMDMs) addresses a critical bottleneck in immunology-focused drug discovery by enabling rapid, high-confidence functional genomics in disease-relevant primary cells. This protocol's high editing efficiency and streamlined workflow support robust target validation and mechanistic de-risking at early discovery inflection points. The approach enhances predictive confidence for portfolio triage and accelerates the translation of genetic insights into actionable therapeutic hypotheses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in primary macrophages, supporting mechanistic de-risking.
- Facilitates rapid validation of therapeutic targets in a physiologically relevant system.
- Supports high-confidence loss-of-function studies for pathway clarification.
- Improves predictive value for downstream portfolio decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated primary cell systems for downstream phenotypic screening.
- Delivers reproducible, quantitative gene disruption outputs for assay standardization.
- Enables scalable, plasmid-free workflows suitable for iterative screening campaigns.
- Supports reliable evaluation of compound effects in edited macrophages.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic manipulation with disease-relevant macrophage biology for translational continuity.
- Facilitates preclinical model development using primary cells with defined genetic edits.
- Reduces biological risk by bridging discovery and preclinical validation in primary systems.
- Supports biomarker discovery and mechanistic studies in immunology pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This electroporation-based CRISPR workflow integrates at the early discovery and target validation stages, enabling seamless progression to lead identification and preclinical research in immunology-focused pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway analysis in primary macrophages.
- Screening: Provides reproducible, quantitative gene disruption for assay readiness.
- Analytics: Enables Sanger sequencing-based measurement of editing efficiency for condition comparison.
- Translational Research: Maintains disease relevance by using primary cells for genetic studies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, broadly applicable protocol for genetic manipulation across immunology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows with high efficiency, reproducibility, and no plasmid construction.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunology assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell handling and CRISPR RNP assembly.
- Needs access to electroporation instrumentation and Sanger sequencing infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in multi-site studies.
- Adaptation may be needed for other primary cell types or species.
- Editing efficiency and viability should be empirically validated for each gene target.
