Name: Montaż i eksploatacja etapu chłodzącego w celu unieruchomienia C. elegans na ich płytkach hodowlanych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj metodę unieruchamiania Caenorhabditis elegans na płytkach hodowlanych przy użyciu etapu chłodzącego. Technika ta eliminuje 98% czasu przetwarzania i pozwala uzyskać obrazy wysokiej rozdzielczości bez stosowania chemicznych środków znieczulających.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Noah Josephowi (Północno-Wschodni Wydział Bioinżynierii) za obróbkę blach miedzianych.

1. Produkcja i przygotowanie każdego składnika etapu chłodzenia
UWAGA: Etap chłodzenia składa się z kilku elementów (patrz Tabela Materiałów). Większość komponentów jest dostępna od ręki. Szafirowe okno wymaga niestandardowego zamówienia, podczas gdy miedziana płyta, wspornik mocujący i płyta izolacyjna mogą być produkowane na miejscu za pomocą komputerowego młyna sterowanego numerycznie lub drukarki 3D. Po wstępnej produkcji, późniejszy proces montażu trwa około 2-3 godzin.
<ol>
	<li>Użyj komputerowej frezarki sterowanej numerycznie, aby obrobić blachę miedzianą z blachy miedzianej o wymiarach 170 mm x 120 mm x 3 mm, 99,9% czystej miedzi (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A). Rysunek 2D dla tej produkcji znajduje się w pliku uzupełniającym 1. Użyj drobnoziarnistego papieru ściernego, aby usunąć wszelkie ostre krawędzie i brudne pozostałości.</li>
	<li>Do produkcji wspornika mocującego i płyty izolacyjnej należy użyć drukarki 3D i filamentu z kwasu polimlekowego (PLA) o średnicy 1,75 mm (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2B, C). Aby uzyskać lepszą jakość, drukarka 3D powinna zapewniać wysokość warstwy drobniejszą niż 0,2 mm. 3D modele są dostępne w pliku uzupełniającym 2 i pliku uzupełniającym 3.</li>
</ol>
2. Konstruowanie zestawu wodno-chłodzącego
<ol>
	<li>Przygotuj silikonową rurkę utwardzaną platyną, zbiornik pompy, miedziany blok chłodzący i chłodnicę (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A) do budowy zespołu chłodzenia wodnego. Przygotuj żyletkę, nożyczki i klucz imbusowy gotowe do użycia. Należy pamiętać o zagrożeniach elektrycznych spowodowanych użyciem wody podczas montażu.</li>
	<li>Pokrój silikonową rurkę na trzy sekcje o sugerowanych długościach 40 cm, 50 cm i 80 cm. W razie potrzeby dostosuj długość.</li>
	<li>Podłącz odcinki rurki silikonowej z kroku 2.2 do portów chłodnicy, zbiornika pompy i miedzianego bloku chłodzącego, jak pokazano na rysunku Rysunek 3B. Upewnij się, że wszystkie połączenia są wodoszczelne. Zespół chłodzenia wodnego jest już zbudowany.</li>
	<li>Przygotuj zestaw chłodzenia wodą, zasilacz 12 V, trzy czerwone i trzy czarne przewody połączeniowe, płytkę stykową i 500 ml oczyszczonej wody.</li>
	<li>Upewnij się, że stół warsztatowy jest wolny od płynów ze względów bezpieczeństwa elektrycznego.</li>
	<li>Podłącz zbiorniki pompy i przewody chłodnicy do zasilania 12 V za pomocą płytki stykowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Płytka stykowa jest używana dla wygody. 
	UWAGA: Aby uzyskać bardziej trwałe i bezpieczne połączenie, badacze mogą zastąpić płytkę stykową drutami lutowniczymi.</li>
	<li>Otwórz korek zbiornika pompy za pomocą płaskiego śrubokręta. Użyj lejka, aby dolać wody, aż zbiornik pompy będzie wypełniony w około 80% (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D). Nie zakrywaj zbiornika pompy po tym napełnieniu.</li>
	<li>Włącz zespół chłodzenia wodą, podłączając zasilacz 12 V lub włączając go (jeśli jest obecny). Po włączeniu zasilania woda spłynie do wnętrza zespołu i powinny przedmuchać wentylatory na chłodnicy.</li>
	<li>Ze względu na przepływ wody ze zbiornika pompy, poziom cieczy w zbiorniku spadnie. Dodaj więcej wody do zbiornika pompy, aż ustabilizuje się na prawie 2/3 napełnienia (<silna klasa="xfig">Rysunek 3E).</li>
	<li>Potrząśnij chłodnicą, aby pozbyć się pęcherzyków powietrza, a następnie zakręć zbiornik chłodzący.</li>
	<li>Wyłącz zasilanie przed przejściem do następnego kroku.</li>
</ol>
3. Testowanie zimnych i gorących powierzchni Peltiera
UWAGA: Peltier, kluczowy element etapu chłodzenia, to aktywna pompa ciepła na poziomie stałym, która przenosi ciepło z jednej strony na drugą21. Jedna powierzchnia Peltiera nagrzewa się, a druga staje się zimna podczas dostarczania energii elektrycznej. Domyślnie producenci Peltiera oznaczają zimną powierzchnię przed sprzedażą, ale nadal pomocne jest ręczne przetestowanie jej przed montażem.
<ol>
	<li>Przygotuj przestrajalny zasilacz i ogniwo Peltiera, jak pokazano na rysunku Rysunek 4A.</li>
	<li>Upewnij się, że przestrajalne zasilanie jest wyłączone, aby zapobiec możliwym zagrożeniom elektrycznym.</li>
	<li>Podłącz czerwony przewód Peltiera do wyjścia dodatniego, a przewód do ujemnego wyjścia przestrajalnego zasilacza z zaciskami krokodylkowymi, które są dostarczane z zasilaczem (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
	<li>Włącz przestrajalny zasilacz i ustaw go na około 2 V, modulując zarówno pokrętła napięcia, jak i prądu w górnym rzędzie zasilacza. Natychmiast użyj gołego palca, aby wyczuć dwie powierzchnie Peltiera. Jedna powierzchnia staje się zimna w ciągu kilku sekund.</li>
	<li>Po ustaleniu, która powierzchnia jest zimna, natychmiast wyłącz zasilanie i odłącz ogniwo Peltiera.</li>
	<li>Użyj markera, aby wskazać zimną powierzchnię do przyszłego montażu.</li>
</ol>
4. Konstruowanie zespołu do chłodzenia Peltiera za pomocą zespołu chłodzącego wodą
<ol>
	<li>Jak pokazano na Rysunek 4A, przygotuj wyłączony zespół chłodzenia wodnego, Peltiera (oznaczona zimną powierzchnią) i pastę termiczną (dla lepszego przewodzenia ciepła).</li>
	<li>Oczyść wszystkie powierzchnie miedzianego bloku chłodzącego 70% etanolem (lub innym czystszym roztworem) w zespole chłodzącym wodę.</li>
	<li>Nałóż około 0,4 g pasty termicznej na jedną powierzchnię miedzianego bloku chłodzącego wodę i upewnij się, że taka orientacja powierzchni zapobiegnie krzyżowaniu się lub zginaniu rurek skierowanych w dół. Użyj rękawicy, aby chronić skórę i spróbuj rozprowadzić pastę termiczną cienko i równomiernie (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</li>
	<li>Podobnie, oczyść gorącą powierzchnię Peltiera, a następnie nałóż pastę termiczną na powierzchnię (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4D).</li>
	<li>Połącz gorącą powierzchnię Peltiera z miedzianą powierzchnią bloku chłodzącego za pomocą pasty termicznej. Zastosuj nacisk, aby upewnić się, że jest bezpieczny. Postępuj zgodnie z orientacją przewodów na ogniwie Peltiera i rurkach miedzianego bloku chłodzącego, jak pokazano na rysunku <silna klasa="xfig">Rysunek 4E. Wyczyść nadmiar pasty termicznej.</li>
	<li>Wyłącz zarówno zasilanie 12 V, jak i zasilacz przestrajalny. Podłącz ogniwo Peltiera do przestrajalnego zasilacza, jak w rozdziale 3.</li>
	<li>Ponownie sprawdź połączenia zespołu elektrycznego i chłodzenia wodą, a następnie kolejno włączaj zasilanie 12 V i zasilacz przestrajalny.</li>
	<li>Stopniowo włączaj przestrajalny zasilacz na 12 V. Przy sugerowanym Peltierze prąd powinien wynosić około 7,3 A.</li>
	<li>Odczekaj 2 minuty; temperatura zimnej powierzchni Peltiera powinna być niższa niż -35 °C. Zmierz tę temperaturę za pomocą termometru na podczerwień (<silna klasa="xfig">Rysunek 4F). Nie dotykaj zimnej powierzchni, aby zapobiec obrażeniom rąk.</li>
	<li>Sprawdź wszystkie połączenia i komponenty, jeśli temperatura nie może osiągnąć poniżej -30 °C. Pęcherzyki powietrza wewnątrz zespołu chłodzenia wodą są możliwą przyczyną nieoptymalnej wydajności chłodzenia.</li>
	<li>Aby zapewnić bezpieczeństwo w późniejszych krokach, wyłącz przestrajalne zasilanie, odczekaj 1 minutę, a następnie wyłącz zasilanie 12 V.</li>
</ol>
5. Konstruowanie zespołu miedzianej płyty i szafirowego okna
<ol>
	<li>Przygotuj miedzianą płytkę, szafirowe okienko o średnicy 80 mm, pastę termiczną, taśmę o szerokości 4 cali i ostre ostrze do cięcia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5A).</li>
	<li>Ostrożnie wyczyść miedzianą płytkę i szafirowe okienko 70% etanolem i użyj drobnoziarnistego papieru ściernego, aby wygładzić szorstkie powierzchnie.</li>
	<li>Nałóż pastę termiczną na trzy wewnętrzne powierzchnie, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 5B. Upewnij się, że pasta termiczna pokrywa wszystkie trzy powierzchnie, ale nie jest zbyt gruba, około 0.5 mm.</li>
	<li>Połóż miedzianą płytkę na blacie zabezpieczoną papierem do drukarki. Papier ułatwia późniejsze czyszczenie.</li>
	<li>Włóż szafirowe okienko do otworu w miedzianej płycie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5C). Upewnij się, że szafir nie obraca się podczas wkładania, aby zapobiec przesuwaniu się pasty termicznej do innych obszarów. Usuń nadmiar pasty termicznej.</li>
	<li>Przyklej taśmę o szerokości 4 cali do górnej powierzchni zespołu okna z płytą miedzianą i szafirem (powierzchnia, która ma kwadratowy obszar wgłębienia, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" >Rysunek 5D). Unikaj pęcherzyków powietrza między taśmą a powierzchniami miedzianymi podczas wklejania, powoli prowadząc przyczepność z jednej strony na drugą.</li>
	<li>Wytnij określone niebieskie przerywane obszary taśmy za pomocą ostrego ostrza, postępując zgodnie z Rysunek 5E. Cięcie odsłania dwa otwory na gwint, kwadratowe wgłębienie i obszar o średnicy 70 mm szafirowego okienka.</li>
	<li>Przyklej dolną powierzchnię zespołu okna z płytą miedzianą i szafirem, a następnie powtórz procedurę cięcia (tylko obszar szafiru) na tej powierzchni, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" >Rysunek 5F. 
	UWAGA: Teraz szafirowe okno jest przymocowane do miedzianej płyty, a miedziane powierzchnie są chronione przed rdzą.</li>
</ol>
6. Końcowy montaż etapu chłodzenia
<ol>
	<li>Upewnij się, że wszystkie niezbędne podzespoły i komponenty są gotowe.</li>
	<li>Nałóż około 0,4 g pasty termicznej na kwadratowe wgłębienie miedzianej płytki (<silna klasa="xfig">Rysunek 6A).</li>
	<li>Nałóż około 0,4 g pasty termicznej na zimną powierzchnię Peltiera. Zauważ, że ogniwo Peltiera jest już przymocowane do miedzianego bloku chłodzącego (<silna klasa="xfig">Rysunek 6B).</li>
	<li>Podłącz zimną powierzchnię Peltiera do wgłębienia w miedzianej płytce z naciskiem skierowanym w dół. Wyczyść nadmiar pasty termicznej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6C).</li>
	<li>Zamontuj wspornik wydrukowany w 3D na górze miedzianego bloku chłodzącego, a następnie użyj klucza imbusowego, aby dokręcić dwie o długości 8-32, 0,5 cala, aby przymocować wspornik do miedzianej płytki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6D). Użyj dokręcania z niskim momentem obrotowym, aby wydrukowany wspornik nie pękł ani nie odkształcił się, aby zapewnić prawidłowe przewodzenie ciepła od Peltiera do miedzi.</li>
	<li>Umieść miedzianą płytkę w wydrukowanej w 3D podstawie izolacyjnej w celu izolacji termicznej od blatu stołowego lub podstawy mikroskopu podczas pracy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 6D).</li>
	<li>Etap chłodzenia jest zmontowany i gotowy do użycia (<silna klasa="xfig">Rysunek 6E).</li>
	<li>W przypadku mikroskopii umieść ukończony etap chłodzenia na pionowej platformie mikroskopu (<silna klasa="xfig">Rysunek 7A).</li>
	<li>Montaż stopnia chłodzenia został zakończony. Więcej szczegółów można znaleźć w publikacji towarzyszącej Laboratorium Chung, która w pełni opisuje szczegółowe strategie i ruchy zwierząt20.</li>
</ol>
UWAGA: W poniższych sekcjach omówiono protokoły powolnego, szybkiego i nagłego chłodzenia. Hermafrodyty N2 w wieku L4 lub młodej osoby dorosłej wykorzystano do uzyskania następujących danych. Strategia powolnego schładzania jest przydatna do unieruchamiania zwierząt hodowanych w temperaturze 20 °C w temperaturze 6 °C; Zwierzęta N2 hodowane w temperaturze 15 °C są najsilniej unieruchomione w temperaturze 1 °C20. Krótkie porównanie tych trzech protokołów chłodzenia przedstawiono w tabeli 1.
7. Protokół unieruchomienia powolnego chłodzenia
<ol>
	<li>Przenieś talerz uprawowy z pokrywką do lodówki o temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po przeniesieniu płyty uprawowej do lodówki włącz zasilanie 12 V stopnia chłodzenia i ustaw napięcie przestrajalnego zasilacza na 5,5 V.</li>
	<li>Po tym, jak płyta uprawowa z pokrywką pozostanie w lodówce o temperaturze 4 °C przez 1 godzinę, natychmiast przenieś płytkę do etapu chłodzenia i zdejmij pokrywkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 7A). Takie talerze uprawowe mają zwykle temperaturę około 6 °C. Wstępnie schłodzony etap jest stabilny i wystarczająco zimny, aby utrzymać powierzchnię agaru w temperaturze 6 °C.</li>
	<li>Jeśli temperatura powierzchni agaru zmieni się, mierzona lub odnotowywana przez zauważenie ruchu zwierzęcia, należy nieznacznie wyregulować napięcie, aż ustabilizuje się na poziomie 6 °C.</li>
	<li>Zwierzęta są odpowiednio unieruchomione w momencie transferu.</li>
</ol>
8. Protokół unieruchomienia szybkiego chłodzenia
UWAGA: Strategia szybkiego chłodzenia jest najbardziej podstawową metodą unieruchamiania (zobacz Film 1); jednak płytki agarowe bezczynnie zajmują scenę przez dłuższy czas, osiągajączestaw T. Ponadto, gdy potrzebne jest silne unieruchomienie, austawienie T wynosi 6 °C, czas bezczynności wydłuża się do około 1 h20.
<ol>
	<li>Włącz chłodzenie stage zasilanie 12 V i ustaw napięcie przestrajalnego zasilacza na około 12 V. Odczekaj 10 minut.</li>
	<li>Przenieś płytę uprawową z inkubatora bezpośrednio do etapu chłodzenia i zdejmij pokrywę.</li>
	<li>Gdy temperatura powierzchni agaru spadnie do (T set + ΔT) °C, ustaw przestrajalne zasilanie naustawienie V i poczekaj, aż agar osiągnieustawienie T.Zestaw V to odpowiednie napięcie do ustabilizowania agaru wustawieniu T. ΔT jest zmienną, która zapobiega przechłodzeniu. Patrz tabela 2, aby zapoznać się z kombinacjązestawu T, ΔTi zestawu V. 
	UWAGA: Dane przedstawione w Tabeli 2 odnoszą się konkretnie do Laboratorium Chung, dlatego należy zauważyć, że parametry eksperymentalne mogą się różnić w zależności od unikalnych warunków środowiskowych i użytkowych każdego indywidualnego eksperymentu.</li>
	<li>Zwierzęta są unieruchomione, gdy agar osiągniezestaw T. Unieruchomienie poprawia się z czasem, aż do ~50 min po rozpoczęciu chłodzenia.</li>
</ol>
9. Protokół nagłego unieruchomienia chłodzenia
UWAGA: Strategia nagłego schładzania pochłania najwięcej czasu użytkownika, ale najszybciej unieruchamia zwierzęta od temperatury ich uprawy.
<ol>
	<li>Włącz chłodzenie stage zasilanie 12 V i zmniejsz napięcie przestrajalnego zasilacza do około 12 V. Trzymaj przez 10 minut.</li>
	<li>Przynieś wolną płytkę agarową do etapu chłodzenia. Wykonaj krok 8.3 w protokole immobilizacji szybkiego chłodzenia, aby ustabilizować temperaturę powierzchni agaru przyustawieniu T.</li>
	<li>Przenieś zwierzęta z ich pierwotnej płyty uprawowej na schłodzoną płytę znajdującą się na stoliku chłodzącym.</li>
	<li>W zależności od wielkości małego zwierzęcia oczekuje się, że zwierzęta ostygną dostanu T w ciągu kilku sekund i zostaną unieruchomione. Unieruchomienie poprawia się z czasem, aż do ~50 min po rozpoczęciu chłodzenia.</li>
</ol>
10. Ożywienie zwierząt po unieruchomieniu chłodzącym
<ol>
	<li>Przenieść schłodzoną płytkę hodowlaną z powrotem do oryginalnego inkubatora lub do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Odczekaj od 20 minut do 1 godziny, aż wszystkie robaki na talerzu powrócą do normalnego pełzania i żerowania.</li>
</ol>

Constructing and Operating a Cooling Stage to Immobilize C. elegans En Masse

<ol><li>Wearne, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+techniques+for+imaging%2C+digitization+and+analysis+of+three-dimensional+neural+morphology+on+multiple+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New techniques for imaging, digitization and analysis of three-dimensional neural morphology on multiple scales.</a> Neuroscience. 136 (3), 661-680 (2005).</li>
<li>Zhou, Z., Sorensen, S., Zeng, H., Hawrylycz, M., Peng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+image+enhancement+for+tracing+3D+morphologies+of+neurons+and+brain+vasculatures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Adaptive image enhancement for tracing 3D morphologies of neurons and brain vasculatures.</a> Neuroinformatics. 13 (2), 153-166 (2015).</li>
<li>Parthasarathy, R., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+techniques+for+imaging+membrane+topography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Optical techniques for imaging membrane topography.</a> Cell Biochemistry and Biophysics. 41 (3), 391-414 (2004).</li>
<li>Chan, C. Y., Faragalla, Y., Wu, L. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+membrane+structural+dynamics+of+fusion+and+endocytosis+with+advanced+light+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Illuminating membrane structural dynamics of fusion and endocytosis with advanced light imaging techniques.</a> Biochemical Society Transactions. 50 (4), 1157-1167 (2022).</li>
<li>Chen, Y., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+two-photon+excitation+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+for+protein+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Characterization of two-photon excitation fluorescence lifetime imaging microscopy for protein localization.</a> Microscopy Research and Technique. 63 (1), 72-80 (2004).</li>
<li>Chen, Y., Mills, J. D., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+localization+in+living+cells+and+tissues+using+FRET+and+FLIM%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Protein localization in living cells and tissues using FRET and FLIM.</a> Differentiation. 71 (9-10), 528-541 (2003).</li>
<li>Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+microscopy-tips+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell microscopy-tips and tools.</a> Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).</li>
<li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+exposure+and+cell+viability+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 245 (3), 311-318 (2012).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Hobert, O., Loria, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uses+of+GFP+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Fluorescent+Protein%3A+Properties%2C+Applications%2C+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Uses of GFP in Caenorhabditis elegans.</a> Green Fluorescent Protein: Properties, Applications, and Protocols. 47, 203-226 (2005).</li>
<li>Emmons, S. W., Yemini, E., Zimmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+analyzing+neuronal+structure+and+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Methods for analyzing neuronal structure and activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 218 (4), (2021).</li>
<li>Chung, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+DLK-independent+neuronal+regeneration+in+Caenorhabditis+elegans+shares+links+with+activity-dependent+ectopic+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Novel DLK-independent neuronal regeneration in Caenorhabditis elegans shares links with activity-dependent ectopic outgrowth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), E2852-E2860 (2016).</li>
<li>Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models & Mechanisms. 13 (10), (2020).</li>
<li>Pintard, L., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+cell+division+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitotic cell division in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 211 (1), 35-73 (2019).</li>
<li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Cell Biology. 48, 225-250 (1995).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li>
<li>Chung, K. H., Crane, M. M., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+on-chip+rapid+microscopy%2C+phenotyping+and+sorting+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans.</a> Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).</li>
<li>Rohde, C. B., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+in+vivo+time-lapse+imaging+and+optical+manipulation+of+Caenorhabditis+elegans+in+standard+multiwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates.</a> Nature Communications. 2, 271(2011).</li>
<li>Guo, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+lab-on-a-chip+for+in+vivo+nerve+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies.</a> Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).</li>
<li>Wang, Y. L., Grooms, N. W. F., Jaklitsch, E. L., Schulting, L. G., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+submicron-resolution+microscopy+of+Caenorhabditis+elegans+populations+under+strong+immobilization+by+cooling+cultivation+plates%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">High-throughput submicron-resolution microscopy of Caenorhabditis elegans populations under strong immobilization by cooling cultivation plates.</a> iScience. 26 (2), 105999(2023).</li>
<li>Zhao, D., Tan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+thermoelectric+cooling%3A+Materials%2C+modeling+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Thermal+Engineering%22%5BJournal%5D)">A review of thermoelectric cooling: Materials, modeling and applications.</a> Applied Thermal Engineering. 66 (1-2), 15-24 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Etap chłodzenia, produkcja, montaż i użytkowanie są pokazane w tym manuskrypcie. Większość komponentów to produkty z półki, które można kupić online. Niektóre elementy, takie jak miedziana płyta i szafirowe okienko, wymagają niestandardowego zamówienia, a ich wyprodukowanie może zająć do 1 miesiąca. Inne komponenty, które można wydrukować w 3D, można łatwo wyprodukować w większości instytucji badawczych (tabela uzupełniająca 1). Proces montażu wymaga tylko kilku narzędzi i może być szybko wykonany przez laika w ciągu kilku godzin. Stąd wiekszosc laboratoriów biologicznych powinna byc w stanie z latwo zaimplementowac to urządzenie.
Faza chłodzenia i podejście do unieruchomienia chłodzenia mają kilka istotnych ulepszeń w stosunku do istniejących metod unieruchomienia, starannie szczegółowo opisanych w oryginalnej publikacji20. Krótko mówiąc, etap chłodzenia umożliwia silne unieruchomienie dużych populacji C. elegans w każdym wieku, w tym zarodków i dauerów, na ich typowych płytkach hodowlanych w standardowych przepływach pracy mikroskopowej. Eliminuje to potrzebę stosowania skomplikowanych konfiguracji sprzętowych, takich jak mikrofluidyka, zapewniając jednocześnie silniejszy efekt unieruchomienia. Dodatkowo minimalizuje możliwe narażenie zwierząt i badaczy na toksyczne chemikalia, ponieważ nie stosuje się żadnych chemikaliów, zapewniając jednocześnie podobny efekt unieruchomienia. Te możliwości techniczne umożliwiają szerokie zastosowanie tego urządzenia i podejście do wielu eksperymentów, które wymagają mikroskopii in vivo o wysokiej rozdzielczości na dużej liczbie zwierząt.
Podczas budowy urządzenia należy wykonać kilka krytycznych kroków, w tym nałożenie pasty termicznej i szeroką taśmę do przymocowania szafirowego okienka do miedzianej płyty. Pasta termiczna zapewnia wysoką przewodność cieplną poprzez zastąpienie szczelin materiałem o niskim oporze cieplnym. Aby osiągnąć pożądaną wydajność chłodzenia, pasta musi być odpowiednio wprowadzona między wszystkie przylegające/stykające się powierzchnie, w tym zimną powierzchnię Peltiera do miedzianej płytki, gorącą powierzchnię Peltiera do miedzianego bloku chłodzącego i miedzianą płytkę do szafirowego okienka. Szeroka taśma nałożona na scenę izoluje miedzianą płytę, aby zapobiec nagrzewaniu się powietrza i kondensacji, co prowadzi do rdzy. Wzmacnia również połączenie między szafirowym oknem a miedzianą płytą. Dlatego zarówno nakładanie pasty termicznej, jak i szeroka taśma wymagają szczególnej ostrożności.
W rzeczywistym eksperymencie z unieruchomieniem chłodzenia parametry podane w tym manuskrypcie, takie jak napięcia i czasy, zależą od specyficznych właściwości płytek uprawowych i etapu, takich jak ilość agaru w płytkach, wydajność etapu oraz temperatura i wilgotność otoczenia. W przyszłych modyfikacjach można zainstalować regulator sprzężenia zwrotnego, taki jak pochodna proporcjonalno-całkująca (PID), aby aktywnie dostosować napięcie wejściowe do etapu chłodzenia w celu osiągnięcia żądanej temperatury i ustabilizowania jej.
Istnieje kilka ograniczeń tego unieruchomienia w fazie chłodzenia, dokładnie szczegółowo opisanych w oryginalnej publikacji20. Krótko mówiąc, zwierzęta hodowane w różnych temperaturach są unieruchomione w różnym stopniu, co może wymagać dodatkowego dostrojenia. Ponadto ten obecny stopień chłodzenia nie jest przeznaczony dla mikroskopu odwróconego. Co więcej, obrazowanie lub przesiewanie bezpośrednio na płytce uprawowej może spowodować zanieczyszczenie płytki.
Projektujemy nowe wersje stopnia chłodzącego, odpowiednie dla różnych platform obrazowania, w tym złożonych mikroskopów pionowych i mikroskopów odwróconych. Te nowe konstrukcje umożliwią bezpośrednie unieruchomienie chłodzenia zwierząt na płytkach hodowlanych podczas obrazowania na tych platformach. Obrazowanie na tych stopniach chłodzenia będzie wykorzystywać obiektywy zanurzające w powietrzu na duże odległości robocze, podobnie jak w konfiguracji pionowej. Obecnie obiektywy zanurzeniowe mogą mieć aperturę numeryczną do 0,9, co zapewnia rozdzielczość około 300 nm do obrazowania białek zielonej fluorescencji. W ten sposób połączenie nowego stopnia chłodzenia z mikroskopem może umożliwić rutynowe obrazowanie fluorescencyjne w rozdzielczości submikronowej.
Podajemy również kilka pomocnych wskazówek dotyczących korzystania ze stopnia chłodzenia zgodnie z naszym doświadczeniem. Na przykład osoby powinny sprawdzić, czy wewnątrz zespołu chłodzącego wodę nie ma pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza degradują chłodzenie do gorącej powierzchni Peltiera, a tym samym pogarszają skuteczność chłodzenia etapu chłodzenia. W przypadku obecności pęcherzyków powietrza należy włączyć zasilanie 12 V, aby woda mogła płynąć i wstrząsnąć wszystkimi elementami przepływu wody. Pęcherzyki powietrza mogą być wypłukiwane z uwięzionych obszarów i odprowadzane przez zbiornik pompy. Naukowcy powinni upewnić się, że rurka przepływu wody nie jest wygięta ani skrzyżowana podczas montażu zespołu chłodzenia wodą. Wygięcie lub skrzyżowanie rur może uniemożliwić odpowiedni przepływ wody i zmniejszyć skuteczność chłodzenia. Połączenia rurowe powinny być odpowiednio dopasowane i szczelne. W razie potrzeby można zamiast tego użyć miękkiej rurki o innej średnicy, aby zapewnić szczelność. Nie należy nakładać pasty, nawet jeśli połączenie nie jest wystarczająco szczelne, ponieważ pasta może spowodować zatkanie podczas przyszłego użytkowania. Wilgotność w pomieszczeniu wpływa na wydajność chłodzenia i wprowadza kondensację i lód na etapie chłodzenia. Przed umieszczeniem płyty uprawowej na etapie chłodzenia zaleca się użycie chusteczki papierowej do usunięcia kondensatu lub użycie radiatora do szybkiego usunięcia lodu, który utworzył się na szafirowym okienku. Zbiornik pompy i wentylatory chłodnicy mogą powodować niewielkie wibracje w mikroskopie, jeśli pracują na tym samym stole. Drgania mikroskopu rozmywają uzyskany obraz i dlatego należy ich unikać. Poduszka może służyć do mechanicznego ocieplenia zbiornika i chłodnicy lub można je położyć na osobnym pobliskim stole. Etap chłodzenia może stać się etapem ogrzewania poprzez odwrócenie połączenia elektrycznego z ogniwem Peltiera.

Mikroskopia optyczna o wysokiej rozdzielczości stanowi niezbędne narzędzie do badania struktur biologicznych in vivo na poziomie subkomórkowym. Wiele badań biologicznych wymaga obrazowania w rozdzielczości submikronowej w celu wyjaśnienia subtelnych szczegółów anatomicznych, w tym morfologii neuronów1,2, membrane structure3,4 i lokalizacja białka5,6. Obraz o wysokiej rozdzielczości wymaga czasu naświetlania od kilku milisekund do sekund, w zależności od metody obrazowania i sondy7,8. Aby osiągnąć optymalne wyniki, konieczne jest staranne zaplanowanie i przeprowadzenie eksperymentów mikroskopowych. Kluczowe znaczenie dla tych wysiłków ma skuteczna metoda przygotowania zwierząt, która ułatwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości.
Nicień C. elegans jest powszechnie wykorzystywanym organizmem modelowym do badania wielu procesów biologicznych9. To małe zwierzę jest zwykle hodowane na płytkach agarowych z pożywką wzrostową nicieni (NGM) i szybko się rozmnaża przez samozapłodnienie, dzięki czemu dobrze nadaje się do badań na dużą skalę. Ich przezroczystość i szeroki wachlarz technik etykietowania pozwalają na prostą wizualizację ich wewnętrznej anatomii10,11. Drobne struktury C. elegans są idealne do badania procesów biologicznych na poziomie subkomórkowym, takich jak regeneracja neuronów12, degeneracja neuronów13 i podział komórek14. Takie badania wymagają obrazowania w rozdzielczości submikronowej i unieruchomienia zwierząt wystarczająco silnego, aby zapobiec rozmyciu obrazu. Silne unieruchomienie jest szczególnie ważne w przypadku technik obejmujących wiele obrazów w przestrzeni lub czasie, takich jak stosy obrazów 3D (tj. stosy obrazów) i obrazowanie poklatkowe. Każdy ruch zwierzęcia między ekspozycjami może zaciemnić wynik. W przypadku C. elegans silne unieruchomienie zazwyczaj polega na ręcznym manipulowaniu pojedynczymi zwierzętami i montowaniu ich na szkiełkach za pomocą środka znieczulającego15,16. Te czasochłonne i pracochłonne procedury bardzo utrudniają eksperymenty na dużą skalę. Strategia unieruchomienia, w której zwierzęta są bezpośrednio i odwracalnie unieruchamiane na swoich pierwotnych płytach hodowlanych, może umożliwić obrazowanie o wysokiej przepustowości i wysokiej rozdzielczości.
Unieruchomienie C. elegans zostało wykazane w kilku badaniach, ale nie jest powszechnie stosowane. Zazwyczaj łączy się go z urządzeniem mikroprzepływowym, aby jeszcze bardziej unieruchomić zwierzęta17,18,19. Jednak urządzenia mikroprzepływowe są złożone, wymagają znacznego szkolenia operacyjnego i nie można ich łatwo zintegrować z typowymi procesami uprawy ciał stałych w eksperymentach z C. elegans. W związku z tym mikrofluidyka nie jest szeroko stosowana do unieruchamiania C. elegans. Przedstawiona tutaj, w połączeniu z niedawną publikacją Laboratorium Chunga20, przedstawia wprowadzenie nowego podejścia do unieruchamiania chłodzenia przy użyciu termoelektrycznego stopnia chłodzenia (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) w celu rozwiązania tych niedociągnięć. Na etapie chłodzenia typowa płyta uprawowa z polistyrenu o grubości 60 mm może być schłodzona do dowolnej temperatury docelowej (ustawionej T) w zakresie -8 °C do temperatury pokojowej. To podejście do etapu chłodzenia może łatwo i odwracalnie unieruchomić całą populację zwierząt przy minimalnym wysiłku użytkownika, eliminując 98% czasu przetwarzania zwierząt20.
Poniżej opisane są procedury budowania etapu chłodzenia od podstaw. Z wyjątkiem obróbki części i druku 3D, cała procedura ma zająć 4 godziny bez konieczności stosowania specjalnych narzędzi lub specjalistycznej wiedzy. Następnie opisano trzy różne strategie chłodzenia z różnymi szybkościami chłodzenia i wysiłkami użytkownika w celu unieruchomienia C. elegans na typowym mikroskopie pionowym. Preferowana strategia może zależeć od aplikacji użytkownika. Szczegółowo opisano protokoły dla tych trzech strategii unieruchamiania chłodzenia.

<table><tbody><tr><td>Zasilanie 12-V</td><td>ANYTITI</td><td>ledpower00</td><td>wyjście DC 12V +/- 0,5V, 5A moc 60W</td></tr><tr><td>8-32 śruba</td><td>dowolna</td><td></td><td>do</td></tr><tr><td>wspornika</td> mocującego <td>N/A</td><td>N/A</td><td>wydrukowana w 3D przy użyciu filamentu PLA 1,75 mm. Zobacz uzupełnienie dla modelu 3D.</td></tr><tr><td>płytka stykowa</td><td>DEYUE</td><td>7545924028</td><td>400-pinowy zestaw płytek bez do samodzielnego podłączania elektrycznego</td></tr><tr><td>miedziany blok chłodzący</td><td>Kalolary</td><td>Kalolary-Radiator001</td><td>40 * 40 mm wewnętrzna grubość żeber 0,5 mm</td></tr><tr><td>dowolna</td><td>płyta miedziana</td><td>nie dotyczy</td><td>Wykonane z blachy miedzianej 170x120x3 mm 99,9%. &nbsp; Zobacz dodatkowe rysunki 2D do produkcji.</td></tr><tr><td>cyfrowy termometr termoparowy</td><td>Proster</td><td>4333090752</td><td>dwukanałowy termometr z dwiema sondami termopary typu K zakres pomiarowy -50-300&deg; Dokładność C &plusmn; 1,5% rozdzielczość 0,1 i stopnie; C /&deg; F < 1000&stopni;</td></tr><tr><td>podstawa izolacyjna</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>wydrukowana w 3D przy użyciu filamentu PLA 1,75 mm. Zobacz uzupełnienie dla modelu 3D.</td></tr><tr><td>przewody połączeniowe</td><td>dowolne</td><td></td><td>do podłączenia elektronicznego</td></tr><tr><td>wielostopniowe urządzenie chłodzące termoelektryczne peltiera</td><td>DigiKey</td><td>TEC1-12706</td><td> rozmiar 40*40*7,05 mm Umax 16,1 V&nbsp; Imax 8.5 A & Delta; Tmax @ Th 85&deg; C @ 27&deg; C Qmax @ Th 51,6W @ 27&deg; Odporność na C 1,65 &Omega;</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa utwardzana platyną Nalgene 50</td><td>ThermoScientific</td><td>14-176-332E</td><td>ultramiękka rurka twardość twardości Shore A, średnica wewnętrzna 50 średnica zewnętrzna 1/4 cala średnica zewnętrzna 9,5 mm</td></tr><tr><td>taśma pakowa</td><td>o</td><td></td><td>szerokości 4 cali do zakrycia zbiornika pompy z blachą miedzianą</td></tr><tr><td></td><td>Yosoo</td><td>SC-300T moc</td><td>wejściowa DC 12V natężenie przepływu 300L/h max</td></tr><tr><td>grzejnik</td><td>DIYhzWater</td><td>10463</td><td>12-rurowy aluminiowy wymiennik ciepła rząd odpływu wody chłodzącej z dwoma wentylatorami 120 mm</td></tr><tr><td>szafirowe okno</td><td>Altos Photonics, Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td>Altos kontaktowy na zamówienie rozmiar i Oslash; 80mm, grubość 3 mm jakość powierzchni 60-40s/d niepowlekana</td></tr><tr><td>pasta termiczna</td><td>Corsair</td><td>XTM50</td><td>zmniejsza impedancję termiczną między powierzchniami przewodność cieplna 5,0 W/mK</td></tr><tr><td>przestrajalny zasilacz</td><td>Kungber</td><td>DY-SPS3010B</td><td>zakres napięcia 0 &ndash; Zakres prądu 30V 0 &ndash; Zasilacz liniowy 10A z 4-cyfrowymi zgrubną i precyzyjną regulacją z przewodami krokodylkowymi</td></tr></tbody></table>

montaż i eksploatacja etapu chłodzącego w celu unieruchomienia c. elegans na ich płytkach hodowlanych

Assembly and Operation of a Cooling Stage to Immobilize C. elegans on Their Culture Plates

Wysokorozdzielcze metody mikroskopii in vivo mogą ujawnić subtelne informacje i drobne szczegóły wewnątrz modelowego zwierzęcia Caenorhabditis elegans (C. elegans), ale wymagają silnego unieruchomienia zwierzęcia, aby zapobiec rozmyciu ruchu na obrazach. Niestety, większość obecnych technik unieruchamiania wymaga znacznego wysiłku ręcznego, co sprawia, że obrazowanie w wysokiej rozdzielczości jest mało przepustowe. Immobilizacja C. elegans jest znacznie uproszczona dzięki zastosowaniu metody chłodzenia, która może z łatwością unieruchomić całe populacje bezpośrednio na ich płytach uprawowych. Etap chłodzenia może wytworzyć i utrzymać szeroki zakres temperatur z równomiernym rozprowadzeniem na płycie uprawowej. W tym artykule udokumentowany jest cały proces budowy etapu chłodzenia. Celem jest, aby typowy badacz mógł bez trudu zbudować działający stopień chłodzenia w swoim laboratorium zgodnie z tym protokołem. Pokazano wykorzystanie etapu chłodzenia zgodnie z trzema protokołami, a każdy protokół ma zalety dla różnych eksperymentów. Pokazany jest również przykładowy profil chłodzenia stolika w miarę zbliżania się do temperatury końcowej oraz kilka pomocnych wskazówek dotyczących korzystania z unieruchomienia chłodzenia.

Pomiar temperatury chłodzenia 
W przypadku wstępnych eksperymentów z unieruchomieniem poprzez chłodzenie ważne jest monitorowanie temperatury powierzchni agaru, aby upewnić się, że zwierzęta zostały prawidłowo unieruchomione. W przyszłych eksperymentach powielających ten protokół można stosować te same parametry, zazwyczaj bez konieczności częstego monitorowania temperatury. W celu pomiaru temperatury końcówkę termometru z termoparą sterylizuje się za pomocą 70% roztworu etanolu, odczekując do całkowitego odparowania etanolu przed użyciem. Następnie końcówkę termopary wprowadza się na 1 mm do agaru NGM, aby zapewnić dokładny odczyt temperatury. Końcówkę termometru utrzymuje się za pomocą uchwytu zaciskowego lub innych stabilizatorów (Rysunek 7B).
Pomiar temperatury za pomocą kamery podczerwieni 
Stopień chłodzący został zaprojektowany tak, aby zapewnić jednorodność rozkładu temperatury w centralnym obszarze płytki o średnicy 40 mm. Do obrazowania rozkładu temperatury na powierzchni agaru wykorzystuje się kamerę podczerwieni FLIR. Maksymalna różnica temperatur wynosi około 1 °C przy Tset wynoszącej 1, 3 lub 6 °C (Rysunek 8A).
Ocena szybkości chłodzenia przy zastosowaniu strategii szybkiego chłodzenia 
Strategia szybkiego chłodzenia jest wykorzystywana do charakterystyki szybkości chłodzenia platformy przy napięciu 12 V. Na platformie chłodzącej umieszcza się płytkę o temperaturze 20 °C, a do monitorowania temperatury powierzchni wykorzystuje się termometr z termoparą. Platforma chłodzi płytki z 20 °C do 6 °C w czasie 6 min, do 1 °C w 10 min, a ostatecznie stabilizuje temperaturę poniżej -7 °C w ciągu około 40 min (Rycina 8B).
Stosowanie stolika chłodzącego na platformie mikroskopu pionowego 
Mikroskop pionowy składa się zazwyczaj z obiektywu do obrazowania, stolika do utrzymywania próbki oraz układu oświetlenia. Ten stolik chłodzący został zaprojektowany do użytku na typowym stoliku mikroskopu pionowego z możliwością łatwego wkładania i wyjmowania (Rysunek 8C). Gdy do obrazowania lub przesiewania wymagana jest immobilizacja poprzez chłodzenie, stolik chłodzący należy po prostu umieścić na stoliku mikroskopu, aby zakończyć instalację, i analogicznie w przypadku jego usuwania.
Unieruchomienie nicieni na płytce chłodzącej pokazano w Filmie 1.
<img alt="Schemat układu chłodzenia, pokazujący przepływ cieczy w konfiguracji chłodnica-pompa na potrzeby analizy rozpraszania ciepła." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Model 3D aparatury stopnia chłodzącego. Dla przejrzystości nie przedstawiono połączeń elektronicznych. Zbiornik pompuje wodę przez blok chłodzący w celu odprowadzenia ciepła przekazanego przez element Peltiera wbudowany w stopień. Typowa 60 mm polistyrenowa płytka hodowlana może być umieszczona na przezroczystym szafirowym oknie i chłodzona przez stopień. Model wygenerowany w programie Solidworks. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat komponentów układu wzbudzenia optycznego; części A, B, C przedstawiają szczegóły montażu i funkcjonalności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Modele 3D komponentów do wykonania. (A) Płyta miedziana. (B) Wydrukowany w technologii 3D uchwyt mocujący. (C) Wydrukowana w technologii 3D płyta izolacyjna. Modele wygenerowane w programie Solidworks. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat systemu chłodzenia z przekazywaniem ciepła; chłodnica, zbiornik pompy, rurki, miedziany blok, zestaw zasilacza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Zestaw chłodzenia wodnego. (A) Poszczególne komponenty. Rurki przycięte do określonych długości. (B) Połączone komponenty chłodzenia wodnego. (C) Przewody łączące zbiornik pompy i chłodnicę z zasilaczem 12 V. Zazwyczaj czerwone przewody łączą się z biegunem dodatnim, a czarne z biegunem ujemnym. (D) Oczyszczona woda wlana do pompy. (E) Zbiornik wypełniony w ponad dwóch trzecich dla optymalnej wydajności pompy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Układ regulowanego zasilacza z modułem Peltiera, pastą termoprzewodzącą i zestawem chłodzenia wodnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Podłączenie elementu Peltiera i zestawu chłodzenia wodnego. (A) Komponenty do obsługi elementu Peltiera. (B) Wykorzystanie regulowanego zasilacza do określenia strony gorącej i zimnej elementu Peltiera. Ze względów bezpieczeństwa stosuje się napięcie nieprzekraczające 2 V. (C) Równomierne nałożenie pasty termoprzewodzącej na powierzchnię miedzianego bloku. (D) Równomierne nałożenie pasty termoprzewodzącej na gorącą powierzchnię elementu Peltiera. (E) Strona gorąca elementu Peltiera dociśnięta do miedzianego bloku z pastą termoprzewodzącą. (F) Termometr na podczerwień użyty do pomiaru temperatury zimnej powierzchni elementu Peltiera. W idealnych warunkach temperatura zimnej strony może osiągnąć wartość bliską -35 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig04large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat układu przewodzenia cieplnego z miedzią, szafirem i pastą; etapy montażu i wycinania dla transferu ciepła." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Montaż płyty miedzianej i okna szafirowego. (A) Wymagane komponenty. (B) Pasta termiczna nałożona na trzy wewnętrzne powierzchnie płyty miedzianej, z którymi będzie stykać się okno szafirowe. Dwa widoki płyty miedzianej z góry, pokazujące położenie trzech powierzchni. (C) Okno szafirowe w otworze płyty miedzianej. (D) Taśma nałożona na górną powierzchnię zestawu. (E) Strona górna: Niebieskie przerywane linie wskazują miejsca wycięcia i usunięcia taśmy: kwadratowe wgłębienie, dwa otwory oraz obszar szafirowy o średnicy 70 mm. (F) Strona dolna: Taśma jest wycinana i usuwana zgodnie z rysunkiem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ systemu zarządzania termicznego z elementem chłodzącym, zbiornikiem pompy, chłodnicą i zasilaczem." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Końcowy montaż elementu chłodzącego. (A) Pasta termoprzewodząca nałożona na wgłębienie miedzianej płytki. (B) Pasta termoprzewodząca nałożona na zimną stronę ogniwa Peltiera. (C) Zimna powierzchnia ogniwa Peltiera połączona z wgłębieniem. (D) Miedziany blok chłodzący przymocowany do miedzianej płytki za pomocą śrub. Element chłodzący w podstawie izolacyjnej. (E) Gotowy element chłodzący. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ mikroskopowy z obiektywem, podstawą, termometrem i termoparą do analizy termicznej i obserwacji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Stoły chłodzący na mikroskopie i pomiar termoparą. (A) Stół chłodzący umieszczony na podstawie mikroskopu do obrazowania. Szafirowe okno jest przezroczyste, co umożliwia prześwietlenie. (B) Termometr termoparowy używany do pomiaru temperatury powierzchni agaru NGM. Końcówka wprowadzona na około 1 mm w agar NGM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazowanie termiczne chłodzonej płytki agarowej, wykres temperatury, mikroskop z eksperymentem na stoliku chłodzącym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65267/65267fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Charakterystyka i zastosowanie stolika chłodzącego. (A) Obrazy termiczne przedstawiające powierzchnię agaru schłodzoną do 1, 3 i 6 °C. Równomierny rozkład temperatury w centralnym obszarze o średnicy 40 mm (białe przerywane koło). (B) Temperatura powierzchni agaru NGM w czasie na stoliku chłodzącym przy 12 V. Powierzchnię agaru NGM można schłodzić poniżej -7 °C. Temperaturę zmierzono metodą przedstawioną na Rysunku 7B. (C) Stolik chłodzący w użyciu na typowym mikroskopie odwróconym. Stolik chłodzący można łatwo zainstalować lub zdemontować. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/65267fig08large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>powolne chłodzenie</td>
			<td>szybkie chłodzenie</td>
			<td>gwałtowne chłodzenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>obłożenie etapu</td>
			<td>minimum</td>
			<td>długi</td>
			<td>pożywka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>czas do unieruchomienia zwierząt</td>
			<td>długi</td>
			<td>podłoże</td>
			<td>bardzo krótki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wytrzymałość unieruchomienia</td>
			<td>strong</td>
			<td>pożywka</td>
			<td>pożywka</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wysiłek użytkownika</td>
			<td>minimum</td>
			<td>nieznacznie więcej niż minimum</td>
			<td>maksymalny</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Porównanie strategii chłodzenia.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tzestaw (°C)</td>
			<td>ΔT (°C)</td>
			<td>Vzestaw (V)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>4.5</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>5.5</td>
			<td>6.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>5.9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>5.5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Parametry służące do uzyskania pożądanej temperatury w strategii szybkiego chłodzenia.
Plik uzupełniający 1: Płyta miedziana w systemie metrycznym. Rysunek 2D do obróbki płyty miedzianej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/Copper%20plate%20in%20Metric.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Uchwyt mocujący. Rysunek 3D uchwytu mocującego, który można otwierać lub modyfikować w programie Solidworks i eksportować do oprogramowania do druku 3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/holding%20bracket.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Płyta izolacyjna. Rysunek 3D płyty izolacyjnej, który można otwierać lub modyfikować w programie Solidworks i eksportować do oprogramowania do druku 3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/isolation%20plate.zip" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Film 1: Film przedstawiający chłodzenie. Unieruchomienie nicieni na płytce agarowej NGM w 2 °CPłytkę schłodzono z temperatury pokojowej do 2 °Ci przebywał w 2 °C przez kilka minut. Następnie wyłączono etap chłodzenia, a płytki zaczęły naturalnie ogrzewać się do temperatury pokojowej. Nagranie wideo zostało przyspieszone dziesięciokrotnie, aby skompresować godzinowy materiał do 6 minut. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/Cooling%20video.mp4" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.</a>
Tabela uzupełniająca 1: Szacunkowe koszty <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65267/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten artykuł opisuje protokoły budowy i obsługi etapu chłodzenia w celu masowego unieruchomienia C. elegans na ich oryginalnych płytach uprawowych.

Montaż i eksploatacja etapu chłodzącego w celu unieruchomienia C. elegans na ich płytkach hodowlanych

High-resolution in vivo microscopy approaches can reveal subtle information and fine details inside the model animal Caenorhabditis elegans (C. elegans), ...

Opracowujemy proste podejście, które może unieruchomić całą populację Caenorhabditis elegans bezpośrednio na płytach uprawnych. Strategia ta znacznie przyspiesza eksperymenty związane z obrazowaniem. Immobilizacja azydku sodu, zwykle stosowana do obrazowania populacji C. elegans w wysokiej rozdzielczości, jest niezwykle pracochłonna, wymaga indywidualnego montażu i obsługi zwierzęcia.Metoda ta może również skrócić długość życia i żywotność zwierząt, co może zafałszować dane. Tradycyjna metoda chłodzenia wykorzystuje stosunkowo niskie temperatury od dwóch do czterech stopni Celsjusza zastosowanego mikropłynu, co wymaga intensywnego szkolenia użytkownika. Odkryliśmy, że wraz z ochłodzeniem, wysokie temperatury, takie jak sześć stopni Celsjusza, najsilniej unieruchamiają zwierzęta do obrazowania wysokoobrotowego.Unieruchomienie chłodzenia C.elegans nie jest szeroko stosowane, ale gdy jest stosowane, zwykle łączy się je ze złożonymi mikroprzepływami, które wymagają znacznego przeszkolenia użytkowników. Ze względu na niedociągnięcia typowej metodologii unieruchomienia, nasze ulepszenie unieruchomienia chłodzenia i dostępności umożliwia badaczom obrazowanie o wysokiej przepustowości i wysokiej rozdzielczości. W porównaniu z pracochłonnym montażem i znieczulaniem pojedynczych zwierząt, nasze podejście do chłodzenia może odwracalnie unieruchomić duże populacje C. elegans, eliminując 98% czasu przetwarzania.Brak chemicznych środków znieczulających minimalizuje również szkodliwe narażenie zwierząt i badaczy. Etap chłodzenia pozwala na obrazowanie o wysokiej przepustowości i wysokiej rozdzielczości bezpośrednio na płytach uprawowych. Prostota tej konstrukcji umożliwia innym badaczom łatwe budowanie własnych urządzeń i integrowanie ich z istniejącymi konfiguracjami, aby zrewolucjonizować zakres i tempo ich badań biologicznych.Nasze laboratorium dostosuje stopień chłodzenia do różnych konfiguracji mikroskopów. Różne konstrukcje będą działać z mikroskopami odwróconymi, złożonymi mikroskopami pionowymi, a także z różnymi platformami obrazowania. Aby rozpocząć, wyprodukuj blachę miedzianą z blachy miedzianej o wymiarach 170 na 120 na 3 milimetry, 99,9% czystej miedzi, za pomocą komputerowego młyna sterowanego numerycznie.Za pomocą drobnego papieru ściernego usuń ostre krawędzie i brudne pozostałości. Aby zbudować zespół chłodzący wodę, pokrój silikonową rurkę na trzy sekcje po 40, 50 i 80 centymetrów. Podłącz wycięte odcinki rurki silikonowej do portów chłodnicy, zbiornika pompy i miedzianego bloku chłodzącego, zapewniając wodoszczelne połączenia, aby zakończyć zespół chłodzenia wodą.Następnie podłącz zbiorniki pompy i przewody chłodnicy do zasilania 12 V za pomocą płytki stykowej. Otwórz korek zbiornika pompy za pomocą płaskiego śrubokręta i dolaj wody, aż zbiornik pompy będzie napełniony w około 80%. Nie zakrywaj zbiornika pompy.Włącz zespół chłodzenia wodą za pomocą zasilacza 12 V, aby ułatwić przepływ wody wewnątrz zespołu i przedmuchiwanie wentylatorów na chłodnicy. Gdy woda wypływa ze zbiornika pompy, poziom cieczy w zbiorniku spada. Dodaj wodę do zbiornika pompy, aż ustabilizuje się na poziomie napełnienia w prawie dwóch trzecich.Potrząśnij chłodnicą, aby usunąć pęcherzyki powietrza przed założeniem korka na zbiornik chłodzący. Na początek wyczyść wszystkie powierzchnie miedzianego bloku chłodzącego 70% etanolem w zespole chłodzenia wodą. Załóż rękawice i nałóż cienką i równą warstwę około 0,4 grama pasty termicznej na jedną powierzchnię miedzianego bloku chłodzącego wodę.Upewnij się, że orientacja powierzchni zapobiega krzyżowaniu się lub zginaniu rur. Podobnie oczyść gorącą powierzchnię Peltiera za pomocą 70% etanolu i nałóż pastę termiczną na powierzchnię. Połącz gorącą powierzchnię Peltiera z miedzianą powierzchnią bloku chłodzącego za pomocą pasty termicznej, zgodnie z orientacją drutu.Zastosuj nacisk, aby go zabezpieczyć i wyczyść nadmiar pasty termicznej. Następnie upewnij się, że zasilacz 12 V i przestrajalny zasilacz są wyłączone. Podłącz czerwony przewód Peltiera do wyjścia dodatniego, a przewód do ujemnego wyjścia przestrajalnego zasilacza za pomocą zacisku krokodylkowego.Po ponownym sprawdzeniu połączeń zespołu elektrycznego i chłodzenia wodnego należy kolejno włączać zasilanie 12 V i zasilacz przestrajalny. Stopniowo przekręcaj przestrajalny zasilacz na 12 woltów, tak aby prąd wynosił około sześciu amperów z sugerowanym Peltierem. Po dwóch minutach zmierz temperaturę termometrem na podczerwień, nie dotykając zimnej powierzchni, która powinna być zimniejsza niż minus 35 stopni Celsjusza.Zacznij od dokładnego oczyszczenia miedzianej płytki i szafirowego okienka 70% etanolem. Użyj papieru ściernego o drobnej ziarnistości, aby wygładzić szorstkie powierzchnie blach miedzianych. Nałóż około 0,5 milimetra cienkiej i równej warstwy pasty termicznej na trzy wewnętrzne powierzchnie miedzianej płytki, w miejscu, w którym połączy się szafirowe okienko, i równomiernie rozprowadz.Następnie połóż miedzianą płytkę, jednocześnie chroniąc blat stołu papierem. Włóż szafirowe okienko do otworu w miedzianej płycie, upewniając się, że szafir nie obraca się podczas wkładania. Usuń nadmiar pasty termicznej.Przyklej taśmę o szerokości czterech cali do górnej powierzchni zespołu okna z płytą miedzianą i szafirem, mając kwadratowy obszar wgłębienia. Prowadź przyczepność powoli z jednej strony na drugą, aby uniknąć pęcherzyków powietrza podczas wklejania. Za pomocą ostrego ostrza wytnij obszar taśmy oznaczony niebieskimi kreskami z zespołu, odsłaniając dwa otwory na gwint, kwadratowe wgłębienie i obszar o średnicy 70 milimetrów szafirowego okna.Wytnij obszar przylegający do zespołu okna z miedzianą płytą i szafirem. Po zakończeniu przyklej dolną powierzchnię zespołu okna z płytą miedzianą i szafirem i powtórz procedurę cięcia, odsłaniając dwa otwory gwintu i szafirowe okienko o średnicy 70 milimetrów. Nałóż około 0,4 grama pasty termicznej na kwadratowe wgłębienie miedzianej płytki i na zimną powierzchnię Peltiera już przymocowanego do miedzianego bloku chłodzącego.Podłącz zimną powierzchnię Peltiera do wgłębienia w miedzianej płytce z naciskiem skierowanym w dół. Następnie wyczyść nadmiar pasty termicznej. Zamontuj wspornik wydrukowany w 3D na górze miedzianego bloku chłodzącego, a następnie użyj klucza imbusowego, aby dokręcić dwie o długości 8-32 0.5 cala, aby przymocować wspornik do miedzianej płyty.Umieść miedzianą płytkę w wydrukowanej w 3D podstawie izolacyjnej, aby odizolować ją termicznie od blatu stołowego lub podstawy mikroskopu podczas pracy. Etap chłodzenia jest zmontowany i gotowy do użycia. Stolik chłodzący jest przeznaczony do typowego pionowego stolika mikroskopowego z łatwym wkładaniem i wyjmowaniem.Gdy do obrazowania lub badań przesiewowych potrzebne jest unieruchomienie chłodzenia, stopień chłodzenia umieszcza się na stoliku mikroskopu, aby zakończyć ratę i odwrotnie. Termometr termiczny parowy, używany do śledzenia temperatury powierzchni płyty umieszczonej na etapie chłodzenia, wykazał, że stopień schłodził płytę z 20 stopni do sześciu stopni Celsjusza w ciągu sześciu minut, do jednego stopnia Celsjusza w ciągu 10 minut i ostatecznie ustabilizował się poniżej minus siedmiu stopni Celsjusza w ciągu około 40 minut.

assembly-operation-cooling-stage-to-immobilize-c-elegans-on-their

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Ten film przedstawia metodę izolacji i sterylnego hodowania embrionalnych komórek C. elegans  in vitro.

Trawienie enzymatyczne i dysocjacja ręczna: metoda przygotowania zarodków C. elegans do hodowli komórkowej

Opisujemy tutaj poprawiony protokół dla hodowli na dużą skalę embrionalnych komórek C. elegans. Embrionalne komórki C. elegans hodowane in vitro przy użyciu tej metody wydają się różnicować i rekapitulować ekspresję genów w sposób specyficzny dla komórki. Techniki, które wymagają bezpośredniego dostępu do komórek lub izolacji określonych typów komórek z innych tkanek, mogą być stosowane na komórkach hodowanych przez C. elegans.

Metoda hodowli embrionalnych komórek C. elegans

Ustanowiono szereg metod unieruchamiania, aby umożliwić celowe napromienianie żywych osób Caenorhabditis elegans za pomocą niedawno opracowanego ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody. To nowatorskie unieruchomienie na chipie jest również odpowiednie do obserwacji obrazowych. Wyjaśniono szczegółowe przykłady obróbki i zastosowania chipa.

Unieruchomienie żywych osobników Caenorhabditis elegans przy użyciu ultracienkiego mikroprzepływowego chipa polidimetylosiloksanowego z retencją wody

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Ta praca opisuje protokół o średniej przepustowości, który umożliwia jednoczesne obrazowanie 3D poklatkowe embriogenezy u zarodków 80-100 C. elegans w ciągu jednej nocy. Dodatkowo dołączone są narzędzia do przetwarzania i wizualizacji obrazu, które usprawniają analizę danych. Połączenie tych metod z niestandardowymi szczepami reporterowymi umożliwia szczegółowe monitorowanie embriogenezy.

Metoda obrazowania półwysokoprzepustowego i zestaw narzędzi do wizualizacji danych do analizy rozwoju embrionalnego C. elegans

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Aby wykorzystać Caenorhabditis elegans (C. elegans) w badaniach omiki, potrzebna jest metoda generowania dużych populacji robaków, gdzie pojedyncza próbka może być mierzona na różnych platformach do analiz porównawczych. Przedstawiono tutaj metodę hodowli populacji C. elegans na płytkach hodowlowych na dużą skalę (LSCP) oraz dokumentowania wzrostu populacji.

Kultura i analiza populacji dużoskalowych o mieszanym stadium Caenorhabditis elegans

To jest powszechnie stosowana metoda do sekcji gonad C. elegans, po której następuje pęknięcie zamrażające, która wytwarza próbki linii zarodkowej do immunofluorescencji poprzez barwienie przeciwciał, lub do prostego barwienia DAPI w celu wizualizacji DNA. Protokół ten okazał się skuteczny w przypadku studentów studiów licencjackich w laboratorium badawczym i w ramach badań licencjackich opartych na kursach.

C. elegans (C. elegans) Rozwarstwienie gonad i pęknięcie zamrażające do barwienia immunofluorescencyjnego i DAPI

Ten protokół opisuje obrazowanie poklatkowe C. elegans oparte na mikroprzepływach w całym rozwoju postembrionalnym.

Obrazowanie C. elegans w wysokiej rozdzielczości we wszystkich stadiach larwalnych

Poznaj metodę unieruchamiania Caenorhabditis elegans na płytkach hodowlanych przy użyciu etapu chłodzącego. Technika ta eliminuje 98% czasu przetwarzania i pozwala uzyskać obrazy wysokiej rozdzielczości bez stosowania chemicznych środków znieczulających.

Montaż i eksploatacja etapu chłodzącego w celu unieruchomienia C. elegans na ich płytkach hodowlanych

Przeglądaj więcej filmów