Montaż i eksploatacja etapu chłodzącego w celu unieruchomienia C. elegans na ich płytkach hodowlanych

Opracowujemy proste podejście, które może unieruchomić całą populację Caenorhabditis elegans bezpośrednio na płytach uprawnych. Strategia ta znacznie przyspiesza eksperymenty związane z obrazowaniem. Immobilizacja azydku sodu, zwykle stosowana do obrazowania populacji C. elegans w wysokiej rozdzielczości, jest niezwykle pracochłonna, wymaga indywidualnego montażu i obsługi zwierzęcia.

Metoda ta może również skrócić długość życia i żywotność zwierząt, co może zafałszować dane. Tradycyjna metoda chłodzenia wykorzystuje stosunkowo niskie temperatury od dwóch do czterech stopni Celsjusza zastosowanego mikropłynu, co wymaga intensywnego szkolenia użytkownika. Odkryliśmy, że wraz z ochłodzeniem, wysokie temperatury, takie jak sześć stopni Celsjusza, najsilniej unieruchamiają zwierzęta do obrazowania wysokoobrotowego.

Unieruchomienie chłodzenia C.elegans nie jest szeroko stosowane, ale gdy jest stosowane, zwykle łączy się je ze złożonymi mikroprzepływami, które wymagają znacznego przeszkolenia użytkowników. Ze względu na niedociągnięcia typowej metodologii unieruchomienia, nasze ulepszenie unieruchomienia chłodzenia i dostępności umożliwia badaczom obrazowanie o wysokiej przepustowości i wysokiej rozdzielczości. W porównaniu z pracochłonnym montażem i znieczulaniem pojedynczych zwierząt, nasze podejście do chłodzenia może odwracalnie unieruchomić duże populacje C. elegans, eliminując 98% czasu przetwarzania.

Brak chemicznych środków znieczulających minimalizuje również szkodliwe narażenie zwierząt i badaczy. Etap chłodzenia pozwala na obrazowanie o wysokiej przepustowości i wysokiej rozdzielczości bezpośrednio na płytach uprawowych. Prostota tej konstrukcji umożliwia innym badaczom łatwe budowanie własnych urządzeń i integrowanie ich z istniejącymi konfiguracjami, aby zrewolucjonizować zakres i tempo ich badań biologicznych.

Nasze laboratorium dostosuje stopień chłodzenia do różnych konfiguracji mikroskopów. Różne konstrukcje będą działać z mikroskopami odwróconymi, złożonymi mikroskopami pionowymi, a także z różnymi platformami obrazowania. Aby rozpocząć, wyprodukuj blachę miedzianą z blachy miedzianej o wymiarach 170 na 120 na 3 milimetry, 99,9% czystej miedzi, za pomocą komputerowego młyna sterowanego numerycznie.

Za pomocą drobnego papieru ściernego usuń ostre krawędzie i brudne pozostałości. Aby zbudować zespół chłodzący wodę, pokrój silikonową rurkę na trzy sekcje po 40, 50 i 80 centymetrów. Podłącz wycięte odcinki rurki silikonowej do portów chłodnicy, zbiornika pompy i miedzianego bloku chłodzącego, zapewniając wodoszczelne połączenia, aby zakończyć zespół chłodzenia wodą.

Następnie podłącz zbiorniki pompy i przewody chłodnicy do zasilania 12 V za pomocą płytki stykowej. Otwórz korek zbiornika pompy za pomocą płaskiego śrubokręta i dolaj wody, aż zbiornik pompy będzie napełniony w około 80%. Nie zakrywaj zbiornika pompy.

Włącz zespół chłodzenia wodą za pomocą zasilacza 12 V, aby ułatwić przepływ wody wewnątrz zespołu i przedmuchiwanie wentylatorów na chłodnicy. Gdy woda wypływa ze zbiornika pompy, poziom cieczy w zbiorniku spada. Dodaj wodę do zbiornika pompy, aż ustabilizuje się na poziomie napełnienia w prawie dwóch trzecich.

Potrząśnij chłodnicą, aby usunąć pęcherzyki powietrza przed założeniem korka na zbiornik chłodzący. Na początek wyczyść wszystkie powierzchnie miedzianego bloku chłodzącego 70% etanolem w zespole chłodzenia wodą. Załóż rękawice i nałóż cienką i równą warstwę około 0,4 grama pasty termicznej na jedną powierzchnię miedzianego bloku chłodzącego wodę.

Upewnij się, że orientacja powierzchni zapobiega krzyżowaniu się lub zginaniu rur. Podobnie oczyść gorącą powierzchnię Peltiera za pomocą 70% etanolu i nałóż pastę termiczną na powierzchnię. Połącz gorącą powierzchnię Peltiera z miedzianą powierzchnią bloku chłodzącego za pomocą pasty termicznej, zgodnie z orientacją drutu.

Zastosuj nacisk, aby go zabezpieczyć i wyczyść nadmiar pasty termicznej. Następnie upewnij się, że zasilacz 12 V i przestrajalny zasilacz są wyłączone. Podłącz czerwony przewód Peltiera do wyjścia dodatniego, a przewód do ujemnego wyjścia przestrajalnego zasilacza za pomocą zacisku krokodylkowego.

Po ponownym sprawdzeniu połączeń zespołu elektrycznego i chłodzenia wodnego należy kolejno włączać zasilanie 12 V i zasilacz przestrajalny. Stopniowo przekręcaj przestrajalny zasilacz na 12 woltów, tak aby prąd wynosił około sześciu amperów z sugerowanym Peltierem. Po dwóch minutach zmierz temperaturę termometrem na podczerwień, nie dotykając zimnej powierzchni, która powinna być zimniejsza niż minus 35 stopni Celsjusza.

Zacznij od dokładnego oczyszczenia miedzianej płytki i szafirowego okienka 70% etanolem. Użyj papieru ściernego o drobnej ziarnistości, aby wygładzić szorstkie powierzchnie blach miedzianych. Nałóż około 0,5 milimetra cienkiej i równej warstwy pasty termicznej na trzy wewnętrzne powierzchnie miedzianej płytki, w miejscu, w którym połączy się szafirowe okienko, i równomiernie rozprowadz.

Następnie połóż miedzianą płytkę, jednocześnie chroniąc blat stołu papierem. Włóż szafirowe okienko do otworu w miedzianej płycie, upewniając się, że szafir nie obraca się podczas wkładania. Usuń nadmiar pasty termicznej.

Przyklej taśmę o szerokości czterech cali do górnej powierzchni zespołu okna z płytą miedzianą i szafirem, mając kwadratowy obszar wgłębienia. Prowadź przyczepność powoli z jednej strony na drugą, aby uniknąć pęcherzyków powietrza podczas wklejania. Za pomocą ostrego ostrza wytnij obszar taśmy oznaczony niebieskimi kreskami z zespołu, odsłaniając dwa otwory na gwint, kwadratowe wgłębienie i obszar o średnicy 70 milimetrów szafirowego okna.

Wytnij obszar przylegający do zespołu okna z miedzianą płytą i szafirem. Po zakończeniu przyklej dolną powierzchnię zespołu okna z płytą miedzianą i szafirem i powtórz procedurę cięcia, odsłaniając dwa otwory gwintu i szafirowe okienko o średnicy 70 milimetrów. Nałóż około 0,4 grama pasty termicznej na kwadratowe wgłębienie miedzianej płytki i na zimną powierzchnię Peltiera już przymocowanego do miedzianego bloku chłodzącego.

Podłącz zimną powierzchnię Peltiera do wgłębienia w miedzianej płytce z naciskiem skierowanym w dół. Następnie wyczyść nadmiar pasty termicznej. Zamontuj wspornik wydrukowany w 3D na górze miedzianego bloku chłodzącego, a następnie użyj klucza imbusowego, aby dokręcić dwie o długości 8-32 0.5 cala, aby przymocować wspornik do miedzianej płyty.

Umieść miedzianą płytkę w wydrukowanej w 3D podstawie izolacyjnej, aby odizolować ją termicznie od blatu stołowego lub podstawy mikroskopu podczas pracy. Etap chłodzenia jest zmontowany i gotowy do użycia. Stolik chłodzący jest przeznaczony do typowego pionowego stolika mikroskopowego z łatwym wkładaniem i wyjmowaniem.

Gdy do obrazowania lub badań przesiewowych potrzebne jest unieruchomienie chłodzenia, stopień chłodzenia umieszcza się na stoliku mikroskopu, aby zakończyć ratę i odwrotnie. Termometr termiczny parowy, używany do śledzenia temperatury powierzchni płyty umieszczonej na etapie chłodzenia, wykazał, że stopień schłodził płytę z 20 stopni do sześciu stopni Celsjusza w ciągu sześciu minut, do jednego stopnia Celsjusza w ciągu 10 minut i ostatecznie ustabilizował się poniżej minus siedmiu stopni Celsjusza w ciągu około 40 minut.