Name: Obrazowanie immunofluorescencyjne zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w tkankach ludzkich i mysich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Poznaj standaryzowany protokół immunofluorescencyjnego obrazowania pułapek neutrofilowych w tkankach ludzkich i mysich. Ta metoda poprawia niezawodność wizualizacji NET i ułatwia porównywanie wyników badań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało założone przez Niemieckie Towarzystwo Badawcze (BO5534). Dziękujemy Antonii Kiwitt, Moritzowi Lenzowi, Johannie Hagens, dr Annice Heuer i dr Ingo Königsowi za dostarczenie nam próbek. Dodatkowo autorzy dziękują zespołowi UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) za wsparcie w zakresie mikroskopii immunofluorescencyjnej.

To badanie obejmowało tkanki myszy pochodzące z eksperymentów zatwierdzonych przez Hamburską Administrację Państwową ds. Badań nad Zwierzętami, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, Niemcy (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). Użyto tkanek, płuc i okrężnicy myszy z modelu septycznego oraz poparzonej skóry. Użyliśmy 8-tygodniowych samców i samic myszy. We wszystkich eksperymentach przestrzegano Dyrektywy Europejskiej 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. Zanonimizowane próbki ludzkie obejmowały tkanki z noworodkowego zapalenia jelit, poparzonej skóry, atrezji dróg żółciowych, zapalenia stawów kręgosłupa i mięśnia sercowego. Według Komisji Etyki Badań Medycznych w Hamburgu próbki nie wymagały świadomej zgody, ale badanie zostało zatwierdzone przez komisję (WF-026/21).
1. Utrwalenie próbki
<ol>
	<li>Użyj następującego protokołu wywodzącego się od Abu Abeda i Brinkmanna do utrwalania próbki, odwadniania, zatapiania parafiny, cięcia i montażu3,15.
	<ol>
		<li>Przygotować 4% roztwór formaldehydu, rozpuszczając 40 g paraformaldehydu (PFA) w 800 ml soli fizjologicznej buforowanej tris, pH 7,4 (TBS).</li>
		<li>Mieszać mieszaninę w temperaturze 60 °C pod wyciągiem do momentu, aż PFA się rozpuści. Doprowadź roztwór do temperatury pokojowej (RT) i dostosuj objętość za pomocą TBS do 1,000 ml.</li>
		<li>Dostosować pH do 7,4. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 tygodnie lub w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu utrwalenia próbki umieść świeżą tkankę w buforze TBS i rozkrój na kawałki mniejsze niż 20 mm x 30 mm x 3 mm. Zanurz skrawki tkanki w 4% roztworze paraformaldehydu na 12-24 godziny 
	UWAGA: W pierwotnym protokole zastosowano 2% roztwór PFA i czas utrwalenia wynosił 8-20 godzin. Dzięki tej metodzie niektóre skrawki tkanek nie były całkowicie utrwalone po 20 godzinach, więc stężenie PFA zostało zwiększone do 4% PFA.</li>
	<li>Przenieś próbki do oznakowanych kaset do przetwarzania tkanek. Do etykietowania używaj markerów lub ołówków odpornych na rozpuszczalniki.</li>
	<li>Odwadnianie próbki należy rozpocząć od zanurzenia, a następnie kaset w 70% etanolu na 1 godzinę. Następnie zanurz w 80% etanolu, 90% etanolu, 96% etanolu i dwukrotnie w 100% etanolu, przy czym każdy krok trwa 1 godzinę.</li>
	<li>Zanurzyć dwukrotnie w 100% ksylenie (dimetylobenzenie), a następnie dwukrotnie w parafinie o temperaturze 60 °C na 1 godzinę za każdym razem.</li>
	<li>Do montażu użyj form do zatapiania i pozwól parafinie zastygnąć przed wyjęciem formy.</li>
	<li>Użyj mikrotomu do cięcia skrawków tkanek o grubości 3 μm.</li>
	<li>Za pomocą pęsety ułóż wycięte fragmenty w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i pozwól im unosić się na powierzchni, aby rozciągnąć nacięcia tkanki.</li>
	<li>Umieść sekcje na samoprzylepnych szkiełkach podstawowych (tabela materiałów) i pozostaw do wyschnięcia na noc w komorze grzewczej o temperaturze 40 °C.</li>
</ol>
2. Ponowne nawodnienie próbki
<ol>
	<li>W celu odparafinowania ułóż szkiełka w stojaku na szkiełka i zanurz dwukrotnie na 5 minut każde w podłożu zastępującym ksylen limonen (tabela materiałów) i raz na 5 minut w mieszaninie limonenu i etanolu w stosunku 1:1. 
	UWAGA: Limonen jest łatwopalny w temperaturze 50 °C i może powodować reakcje alergiczne. Stosować pod wyciągiem z okularami ochronnymi i rękawicami. Trzymać z dala od otwartego ognia.</li>
	<li>Ponownie uwodnić próbki w malejącej serii etanolu, zanurzając stojak na szkiełka dwukrotnie w 100% etanolu i raz w 96% etanolu, 90% etanolu, 80% etanolu i 70% etanolu na 5 minut każda.</li>
	<li>Zanurz stojak na szkiełka na 5 minut w wodzie dejonizowanej (woda dejonizowana), aby usunąć pozostały etanol.</li>
</ol>
3. Blokowanie autofluorescencji i pobieranie antygenu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do odzyskiwania docelowego cytrynianu pH 6 (TRS) (tabela materiałów) zgodnie z arkuszem danych. Ten TRS jest skoncentrowany 10 razy. Dlatego rozcieńczyć 1:10 wodą DI. Rozgrzej w plastikowym słoiku do barwienia do 96 °C. 
	UWAGA: TRS zrywa mostki metylenowe powstałe podczas utrwalania próbki, aby odsłonić epitopy antygenu. Dzięki temu przeciwciała pierwszorzędowe mogą związać swój docelowy antygen. Skoncentrowany TRS należy przechowywać w temperaturze 2-8 °C przez 8 miesięcy. Zawsze przygotowuj świeży TRS.</li>
	<li>Wyjmij szkiełka ze stojaka na szkiełka i umieść je w wilgotnej komorze. Pobrać pipetą jedną lub dwie krople środka redukującego autofluorescencję (tabela materiałów) na każdą próbkę. Inkubować przez 5 min. 
	UWAGA: Środek redukujący autofluorescencję blokuje naturalną autofluorescencję tkanek wywołaną przez endogenne fluorofory i utrwalacze. Środek redukujący autofluorescencję należy przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 roku. 
	UWAGA: Pracuj tylko z małymi odcinkami tkanek, aby uniknąć wysuszenia próbek lub przekroczenia czasu inkubacji.</li>
	<li>Ułóż szkiełka z powrotem w stojaku na szkiełka i płucz przez 1 minutę w 60% etanolu, wykonując ruchy w górę i w dół, aż cały niewykorzystany odczynnik redukujący autofluorescencję zostanie zmyty.</li>
	<li>Zanurz stojak na szkiełka na 5 minut w wodzie DI.</li>
	<li>W celu pobrania antygenu przenieś szkiełka do słoika do barwienia z podgrzanym TRS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 96 °C w łaźni wodnej. 
	UWAGA: Łaźnię wodną o temperaturze 96 °C można zastąpić kuchenką mikrofalową lub parowarem, jeśli TRS jest wstępnie podgrzany do 96 °C i zapewnione jest 10 minut czasu inkubacji w temperaturze 96 °C.</li>
	<li>Wyjmij słoik do barwienia i pozwól mu powoli ostygnąć do temperatury RT przez około 60-90 min. 
	UWAGA: Protokół można tutaj wstrzymać na okres do 4 godzin, pozostawiając slajdy w TRS.</li>
	<li>Wyjmij TRS, ale trzymaj szkiełka w słoiku. Spłucz dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną Tris z 0,05% Tween (TBST, pH 7,4) przez 3 minuty, aby zmyć wszelkie resztki TRS.</li>
	<li>W celu przepuszczalności należy przygotować 0,2% Triton w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,4 i wlać go do słoika do barwienia, aby przepuszczalność próbek przez 10 min. 
	UWAGA: Permeabilizacja zwiększa wiązanie pierwszorzędowych przeciwciał z wewnątrzkomórkowymi białkami docelowymi w utrwalonych próbkach.</li>
	<li>Ponownie płukać szkiełka dwa razy w TBST przez 3 minuty za każdym razem.</li>
	<li>Przygotuj mokrą komorę i połóż szkiełka. Wytrzyj nadmiar wody ze szkiełek chusteczkami papierowymi. Zakreśl każdą próbkę hydrofobowym pisakiem barierowym, aby zapobiec wyciekaniu roztworu przeciwciała. 
	UWAGA: Nie pozwól, aby próbki wyschły. Najlepiej pracować z małymi sekcjami.</li>
</ol>
4. Blokowanie niespecyficznego wiązania przeciwciał
<ol>
	<li>Weź gotowy do użycia roztwór blokujący z surowicą osła (tabela materiałów) i odpipetuj jedną kroplę na każdą próbkę. Inkubować przez 30 minut w temperaturze RT. 
	UWAGA: Ten etap blokowania minimalizuje wiązanie przeciwciała drugorzędowego z niespecyficznymi miejscami wiązania na próbce. Po zablokowaniu tych niespecyficznych epitopów i zastosowaniu przeciwciała pierwszorzędowego, przeciwciało drugorzędowe zwiąże się z przeciwciałem pierwszorzędowym i nie będzie wchodzić w interakcje z powierzchnią tkanki. Ten gotowy do użycia odczynnik blokujący jest przechowywany w temperaturze 2-8 °C przez 6 miesięcy.</li>
	<li>Usuń nadmiar roztworu blokującego ze szkiełek, stukając krawędzią szkiełek o twardą powierzchnię. Nie spłukuj ich.</li>
</ol>
5. Przeciwciało pierwszorzędowe
<ol>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w buforze do rozcieńczania przeciwciał (tabela materiałów). Na każdą próbkę należy użyć około 100 μl roztworu końcowego. Dla przeciwciał NE i H3cit (R8) oraz izokontroli rozcieńczyć do stężenia 5 μg/ml. W przypadku MPO i odpowiedniej izokontroli należy użyć 10 μg/ml. Przygotować jedną probówkę dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego i jedną dla każdego przeciwciała izokontrolnego. 
	UWAGA: H3cit (R8)/MPO lub NE/MPO i ich izokontrole mogą być łączone w celu barwienia NETs. W przypadku połączenia H3cit (R8)/MPO rozcieńczyć do końcowego stężenia 5 μg/ml dla H3cit (R8) i 10 μg/ml dla MPO do końcowej objętości 100 μl na próbkę. W przypadku NE/MPO rozcieńczyć do końcowego stężenia 5 μg/ml dla NE i 10 μg/ml dla MPO, do końcowej objętości 100 μl na próbkę. W przypadku izokontroli należy stosować takie samo stężenie, jak dla każdego odpowiadającego mu przeciwciała. Do każdego użytego przeciwciała należy zawsze używać nowej końcówki pipety. Przeciwciała pierwszorzędowe mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez 1-2 tygodnie oraz w temperaturze -20 °C lub -80 °C przez okres do 1 roku.</li>
	<li>Mając dwie próbki na jednym szkiełku, użyj jednej do rozcieńczenia przeciwciał izokontrolnych, a drugiej do rozcieńczenia przeciwciał MPO/H3cit lub MPO/NE. Na każdą próbkę należy użyć około 100 μl i równomiernie rozprowadzić roztwór przeciwciała. 
	UWAGA: Nie pozwól, aby próbki wyschły. Należy uważać, aby nie pomylić przeciwciał izokontrolnych i pierwszorzędowych.</li>
	<li>Przechowywać przez noc w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Następnego dnia strzepnij nadmiar roztworu przeciwciał pierwotnych ze szkiełek i ułóż szkiełka w kuwecie. Płukać trzy razy przez 5 minut za każdym razem TBST, aby zmyć pozostały roztwór przeciwciała pierwotnego.</li>
</ol>
6. Przeciwciało drugorzędowe
<ol>
	<li>Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciała. Użyj dwóch różnych fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych: osła-anty-kozła do MPO i osła-anty-królika do barwienia H3cit. Rozcieńczyć każdy z nich do stężenia 7,5 μg/ml buforem rozcieńczającym przeciwciała (tabela materiałów). 
	UWAGA: Do podwójnego barwienia należy użyć dwóch przeciwciał fluorescencyjnych o różnych obszarach wzbudzenia i minimalnym nakładaniu się widma. Połączyć oba przeciwciała drugorzędowe i rozcieńczyć do końcowego stężenia 7,5 μg/ml dla każdego przeciwciała, aby uzyskać końcową objętość 100 μl na próbkę. Chroń przeciwciała przed światłem. Przeciwciała drugorzędowe mogą być przechowywane w temperaturze 2-8 °C przez 6-8 tygodni lub w temperaturze -80 °C przez okres do 1 roku.</li>
	<li>Przechowywać szkiełka w mokrej komorze i dodawać 100 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej próbki. Pozwól im inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem.</li>
	<li>Stuknąć nadmiar roztworu przeciwciał wtórnych i ułożyć szkiełka w stojaku na szkiełka. Zanurz trzy razy na 5 minut każdy w słoiku do barwienia wypełnionym PBS, aby zmyć wszelkie pozostałe niezwiązane przeciwciała.</li>
	<li>Przygotować roztwór DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol) (tabela materiałów) i rozcieńczyć do stężenia 1 μg/ml wodą demineralizowaną. Zanurz stojak na szkiełka w słoiku do barwienia z roztworem DAPI i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. 
	UWAGA: DAPI jest używany jako barwnik fluorescencyjny dla dwuniciowego DNA. Przygotowane rozwiązanie DAPI może być używane wielokrotnie. Przygotowany roztwór DAPI należy przechowywać w temperaturze pokojowej. Koncentrat DAPI może być przechowywany w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.</li>
	<li>Zanurz ruszt do szkiełków na 5 minut w słoiku do barwienia z PBS, aby zmyć nadmiar roztworu DAPI.</li>
</ol>
7. Montaż i przechowywanie próbek, analiza mikroskopowa
<ol>
	<li>Mocować próbki za pomocą szkiełek nakrywkowych i podłoża montażowego (tabela materiałów). 
	UWAGA: Używaj tylko niewielkich ilości podłoża montażowego, a nadmiar podłoża zetrzyj wilgotnymi chusteczkami. Nosić rękawice i unikać przypadkowego wytarcia jakiegokolwiek medium z szkiełek nakrywkowych lub szkiełek. Unikaj tworzenia się pęcherzyków i użyj bawełnianych wacików, aby delikatnie docisnąć szkiełka nakrywkowe, aby usunąć wszelkie bąbelki ze szkiełek.</li>
	<li>Do obrazowania należy używać mikroskopu szerokokątnego lub mikroskopu konfokalnego. 
	UWAGA: Najpierw zrób zdjęcie isocontrol. Skróć czas naświetlania filtrów fluorescencyjnych (z wyjątkiem niebieskiego filtra dla DAPI), aż prawie nie będzie można wykryć sygnału. Następnie użyj tego ustawienia, aby zbadać odpowiednie próbki. Szukaj obszarów, w których sygnał fluorescencyjny może być wykryty w każdej pojedynczej próbce za pomocą kanału fluorescencji. Po wykonaniu zdjęcia obszaru, program generuje złożony obraz wszystkich kanałów i pokazuje różne sygnały fluorescencyjne jako nakładanie się różnych kolorów. Obraz może być następnie dalej analizowany pod kątem kolokalizacji za pomocą oprogramowania do obrazowania, takiego jak ImageJ.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
</ol>

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

<ol><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li>
<li>Urban, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+contain+calprotectin%2C+a+cytosolic+protein+complex+involved+in+host+defense+against+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans.</a> PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639(2009).</li>
<li>Abu Abed, U., Brinkmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+labelling+of+human+and+murine+neutrophil+extracellular+traps+in+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e60115(2019).</li>
<li>Kawasaki, H., Iwamuro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+roles+of+histones+in+host+defense+as+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Disorders+-+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents.</a> Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).</li>
<li>Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+anti-Aspergillus+defense+by+neutrophil+extracellular+traps+in+human+chronic+granulomatous+disease+after+gene+therapy+is+calprotectin-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).</li>
<li>Hakkim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+neutrophil+extracellular+trap+degradation+is+associated+with+lupus+nephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).</li>
<li>Papadaki, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+exacerbate+Th1-mediated+autoimmune+responses+in+rheumatoid+arthritis+by+promoting+DC+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation.</a> European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).</li>
<li>Toussaint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+DNA+released+by+NETosis+promotes+rhinovirus-induced+type-2+allergic+asthma+exacerbation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation.</a> Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+DNA+traps+promote+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extracellular DNA traps promote thrombosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cells+induce+metastasis-supporting+neutrophil+extracellular+DNA+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps.</a> Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).</li>
<li>Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation.+Neutrophil+extracellular+traps+license+macrophages+for+cytokine+production+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis.</a> Science. 349 (6245), 316-320 (2015).</li>
<li>Schauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregated+neutrophil+extracellular+traps+limit+inflammation+by+degrading+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines.</a> Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).</li>
<li>Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantitation+of+neutrophil+extracellular+traps+in+human+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22BioProtocol%22%5BJournal%5D)">Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections.</a> BioProtocol. 11 (18), e4159(2021).</li>
<li>de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+neutrophil+extracellular+traps+become+visible%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">How neutrophil extracellular traps become visible.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 4604713(2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+NETs+in+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue.</a> Frontiers in Immunology. 7, 513(2016).</li>
<li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage%2C+infiltrate+tissues%2C+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).</li>
<li>Santos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETs+detection+and+quantification+in+paraffin+embedded+samples+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy.</a> Micron. 114, 1-7 (2018).</li>
<li>Savchenko, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+form+predominantly+during+the+organizing+stage+of+human+venous+thromboembolism+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).</li>
<li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+%28ANCA%29-associated+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li>
<li>Barliya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+involvement+of+NETosis+in+inflammatory+processes+in+the+eye%3A+Evidence+from+a+small+cohort+of+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients.</a> Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).</li>
<li>Xu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduced+bone+marrow+neutrophils+in+collagen-induced+arthritis+are+primed+for+NETosis%3A+An+ignored+pathological+cell+involving+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis.</a> Cell Proliferation. 53 (7), e12824(2020).</li>
<li>Nonokawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+neutrophil+extracellular+traps+with+the+development+of+idiopathic+osteonecrosis+of+the+femoral+head%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head.</a> American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).</li>
<li>Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+are+present+in+the+airways+of+ENaC-overexpressing+mice+with+cystic+fibrosis-like+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease.</a> BMC Immunology. 22 (1), 7(2021).</li>
<li>Knackstedt, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+drive+inflammatory+pathogenesis+in+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria.</a> Science Immunology. 4 (40), (2019).</li>
<li>Nakazawa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones+and+neutrophil+extracellular+traps+enhance+tubular+necrosis+and+remote+organ+injury+in+ischemic+AKI%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).</li>
<li>Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neutrophil+extracellular+traps+in+paraffin-embedded+feline+arterial+thrombi+using+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (157), e60834(2020).</li>
<li>Stehr, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+drive+epithelial-mesenchymal+transition+of+human+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer.</a> Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).</li>
<li>Thålin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+citrullinated+histones%3A+Development+of+an+improved+assay+to+reliably+quantify+nucleosomal+H3Cit+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).</li>
<li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+Mechanisms+and+application+to+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Smyth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-vascular+interactions+drive+myeloperoxidase+accumulation+in+the+brain+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38(2022).</li>
<li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).</li>
<li>Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+autofluorescence+quenching+techniques+on+formalin-fixed+chicken+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues.</a> Journal of Immunological Methods. 496, 113097(2021).</li>
<li>Schneider, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IVIG+regulates+the+survival+of+human+but+not+mouse+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1296(2017).</li>
<li>Risso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+antimicrobial+peptides%3A+Multifunctional+effector+molecules+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity.</a> Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy dążyliśmy do adaptacji i optymalizacji istniejących protokołów obrazowania NET w odniesieniu do większej liczby typów tkanek, zaczynając od samego procesu barwienia. Pierwszym krytycznym krokiem w tej metodzie jest wybór najodpowiedniejszych przeciwciał. W przypadku NE przetestowaliśmy przeciwciało anty-NE pochodzące od myszy na tkance ludzkiej, które nie wykazało wiarygodnego barwienia w porównaniu do przeciwciała anty-NE pochodzącego od królika. Ponadto Thålin i wsp. zaproponowali H3cit (R8) jako prz...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated from:
Lavinia Sch&#246;enfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)
to:
Lavinia Schoenfeld1 
Birgit Appl1 
Laia Pagerols-Raluy1 
Annika Heuer3 
Konrad Reinshagen1 
Michael Boettcher1,2 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg 
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg 
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65272">Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofilowe zostały po raz pierwszy zobrazowane przez Brinkmanna i in. jako ścieżka śmierci komórkowej odmienna od apoptozy i nekrozy w 2004 roku1. W tym szlaku neutrofile uwalniają zdekondensowaną chromatynę do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, tworząc duże struktury przypominające sieć pokryte białkami przeciwdrobnoustrojowymi, które wcześniej były przechowywane w granulkach lub cytozolu. Te białka przeciwdrobnoustrojowe obejmują elastazę neutrofilową (NE), mieloperoksydazę (MPO) i cytrulinowany histon H3 (H3cit), które są powszechnie stosowane do pośredniego wykrywania immunofluorescencji NETs2. Metoda ta nie tylko identyfikuje ilościową obecność tych białek; w rzeczywistości ma tę zaletę, że specyficznie wykrywa struktury podobne do NET. W NET wspomniane białka kolokalizują się z zewnątrzkomórkowym DNA, co można wykryć poprzez nakładanie się sygnałów fluorescencyjnych każdego barwionego białka i zewnątrzkomórkowego DNA. W przeciwieństwie do nakładających się sygnałów spowodowanych kolokalizacją zewnątrzkomórkowego DNA i białek w NET, nienaruszone neutrofile nie wykazują kolokalizacji. W tym przypadku składniki NET są zwykle przechowywane oddzielnie w granulkach, jądrach i cytozolu3.
Od czasu ich pierwszego odkrycia, wykazano, że NET odgrywają kluczową rolę w wielu chorobach, szczególnie tych związanych z zapaleniem. NET wykazują funkcje przeciwdrobnoustrojowe podczas infekcji poprzez wychwytywanie i zabijanie zewnątrzkomórkowych patogenów we krwi i tkankach4,5. Jednak NET są również powiązane z chorobami autoimmunologicznymi i reakcjami hiperzapalnymi, takimi jak toczeń rumieniowaty układowy, reumatyczne zapalenie stawów i astma alergiczna6,7,8. NET sprzyjają niedrożności naczyń krwionośnych i stanom zapalnym w miażdżycy, adhezji płytek krwi i spekuluje się, że odgrywają rolę w raku z przerzutami9,10,11. Niemniej jednak uważa się, że mają one właściwości przeciwzapalne poprzez obniżanie poziomu cytokin prozapalnych12. Podczas gdy sieci NET zyskują coraz większe zainteresowanie w szerszej dziedzinie badań, solidna metoda wykrywania NET ma fundamentalne znaczenie dla przyszłych badań.
Mimo że wizualizacja NET w różnych tkankach za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego jest złożona i wymaga dostosowania, oprócz mikroskopii elektronowej, jest to obecnie jedna z najbardziej znanych metod wizualizacji interakcji między NET a komórkami i jest głównie stosowana w tkankach zatopionych w parafinie utrwalonym w formalinie (FFPE)13,14. Jednak porównywanie obrazowania NET jest trudne, ponieważ różne laboratoria stosują własne, dostosowane do potrzeb protokoły. Protokoły te różnią się zastosowaniem przeciwciał, pobieraniem antygenu lub metodą przenikania i często są zoptymalizowane pod kątem określonego typu tkanki3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27.
Po tym, jak Brinkmann et al. opublikowali pierwsze metodyczne badanie wykorzystujące immunofluorescencyjną wizualizację NET w tkance FFPE, chcieliśmy zoptymalizować ten protokół dla szerszej gamy tkanek i gatunków15. Dodatkowo, aby ustalić szeroko stosowany protokół immunofluorescencji, przetestowaliśmy różne zmodyfikowane protokoły z badań, w których wykorzystano metody immunofluorescencji w tkance FFPE do wykrywania NETs3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Ponadto wypróbowaliśmy nowe przeciwciało H3cit do bardziej specyficznego barwienia zewnątrzkomórkowego28. Stawiamy hipotezę, że poprzez systematyczne dostosowywanie obecnych protokołów barwienia do różnych gatunków i tkanek, obrazowanie in vitro może zostać ulepszone, co skutkuje lepszym odwzorowaniem interakcji między neutrofilami a NET zarówno lokalnie, jak i ogólnoustrojowo.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td><silny>Rozcieńczenie</mocny></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw elastazie neutrofilowej 100&mikro; g</td><td>abcam</td><td>Ab 68672&nbsp;</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-histonowe H3 (cytrulina R2 + R8 + R17) &nbsp; 100&mikro; g</td><td>abcam</td><td>Ab 5103</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mieloperoksydazy [2C7] anty-ludzkie 100 &mikro; g</td><td>abcam</td><td>Ab 25989</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mieloperoksydazy [2D4] anty-mysie 50 i mikro; g</td><td>abcam</td><td>Ab 90810</td><td>1:50</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do mikroskopii Axiovision&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>4.8.2.</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór blokujący z osłem serum (GOTOWY DO UŻYCIA) 50ml</td><td>GeneTex</td><td>&nbsp; </td><td></td>GTX30972</tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Marienfeld</td><td>0101202</td><td></td></tr><tr><td>Dako Target Retrieval Solution Cytrynian pH6 (x10)</td><td>Dako</td><td>S2369</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 25 mg</td><td>Roth</td><td>6335.1</td><td>1:25000</td></tr><tr><td>DCS rozcieńczenie przeciwciał 500 ml</td><td>diagnostyka DCS</td><td>DCS AL120R500</td><td></td></tr><tr><td>Osioł mrówka koza Cy3</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>705-165-147</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Osioł anty królik AF647</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Osioł anty królik Cy3</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Medium</td><td>montażowe Invitrogen</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Szklany stojak na prowadnice</td><td>Roth</td><td>H552.1</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie / mysie przeciwciało MPO</td><td>R& D Systems</td><td>AF 3667&nbsp;</td><td>Godzina 1:20</td></tr><tr><td>Długopis hydrofobowy</td><td>KISKER</td><td>MKP-1</td><td></td></tr><tr><td>Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg</td><td>abcam</td><td>Ab 37415</td><td>1:2000 i 1:250</td></tr><tr><td>MaxBlock Zestaw odczynników redukujących autofluorescencję (RUO) 100 ml</td><td>Maxvision</td><td>MB-L</td><td></td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa</td><td>Zeiss</td><td>AxioCamHR3</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofalówka</td><td>Bosch</td><td>HMT84M421</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IgG1 kontrola ujemna</td><td>Dako</td><td>X0931 Aglient</td><td>1:50 i 1:5</td></tr><tr><td>Normalna kontrola IgG kóz</td><td>R& D Systems</td><td>AB-108-C&nbsp;</td><td>1:100</td></tr><tr><td>PBS Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3813</td><td></td></tr><tr><td>PMP słoik do barwienia</td><td>Roth</td><td>2292.2</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane przeciwciało anty-histonowe H3 (cytrulina R8) 100 i mikro; g</td><td>abcam</td><td>Ab 219406</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Rekombinowana IgG królika, monoklonalna [EPR25A] - Kontrola izotypu 200&mikro; g</td><td>abcam</td><td>Ab 172730</td><td>1:300</td></tr><tr><td>ROTI Histol</td><td>Roth</td><td>&nbsp; 6640</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice SuperFrost Plus</td><td>R. Langenbrinck</td><td>03-0060</td><td></td></tr><tr><td>TBS Tris buforowana sól fizjologiczna (x10)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Memmert</td><td>830476</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie</td> <td>do gotowania ryżu do kąpieli wodnejreishunger</td><td>RCP-30</td><td></td></tr><tr><td>Komora mokra</td><td>Weckert Labortechnik</td><td>600016</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop szerokokątny Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie immunofluorescencyjne zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w tkankach ludzkich i mysich

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili są uwalniane przez neutrofile w odpowiedzi na infekcję bakteryjną lub urazowe uszkodzenie tkanki, ale także odgrywają rolę w chorobach autoimmunologicznych i sterylnych stanach zapalnych. Są to struktury przypominające sieć złożone z dwuniciowych włókien DNA, histonów i białek przeciwdrobnoustrojowych. Po uwolnieniu NET mogą wychwytywać i zabijać patogeny zewnątrzkomórkowe we krwi i tkankach. Ponadto NET uczestniczą w regulacji homeostazy poprzez stymulację adhezji i krzepnięcia płytek krwi. Jednak rozregulowana produkcja NET jest również związana z różnymi chorobami, w tym sepsą lub zaburzeniami autoimmunologicznymi, co czyni je obiecującym celem interwencji terapeutycznej. Oprócz mikroskopii elektronowej, wizualizacja NET za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego jest obecnie jedną z niewielu znanych metod wykazywania interakcji NET w tkance. W związku z tym zastosowano różne metody barwienia w celu wizualizacji sieci NET. W literaturze opisano różne protokoły barwienia i zidentyfikowaliśmy cztery kluczowe elementy wykazujące dużą zmienność między protokołami: (1) rodzaje stosowanych przeciwciał, (2) stosowanie środków redukujących autofluorescencję, (3) metody pobierania antygenu i (4) przepuszczalność. W związku z tym protokoły barwienia immunofluorescencyjnego in vitro zostały systemowo dostosowane i ulepszone w niniejszej pracy, aby można je było zastosować do różnych gatunków (myszy, człowiek) i tkanek (skóra, jelita, płuca, wątroba, serce, krążek międzykręgowy). Po utrwaleniu i zatopieniu w parafinie na szkiełkach zamontowano odcinki o grubości 3 μm. Próbki te barwiono pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko mieloperoksydazie (MPO), cytrulinowanemu histonowi H3 (H3cit) i elastazie neutrofilowej (NE) zgodnie ze zmodyfikowanym protokołem barwienia. Preparaty wybarwiono przeciwciałami drugorzędowymi i zbadano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu. Wyniki analizowano zgodnie z arkuszem oceny, a różnice rejestrowano półilościowo.
Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół barwienia NET, odpowiedni dla różnych tkanek. Użyliśmy nowego przeciwciała pierwszorzędowego do barwienia H3cit i zmniejszyliśmy niespecyficzne barwienie za pomocą środka redukującego autofluorescencję. Ponadto wykazaliśmy, że barwienie NET wymaga stałej wysokiej temperatury i ostrożnego obchodzenia się z próbkami.

Przed rozpoczęciem optymalizacji protokołu zidentyfikowaliśmy kluczowe etapy niezbędne do prawidłowego barwienia, przeszukując bazę PubMed w celu znalezienia badań, w których wykorzystano tkankę FFPE do immunobarwienia NETs, a następnie porównaliśmy zastosowane w nich protokoły. Różnice w najbardziej obiecujących protokołach uznano za kluczowe etapy optymalizacji, natomiast kroki, które w większości były ze sobą zgodne, pozostawiono bez zmian (Tabela 1).
Tabela 1: Prze...

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili są związane z różnymi chorobami, a immunofluorescencja jest często używana do ich wizualizacji. Istnieją jednak różne protokoły barwienia, aw wielu przypadkach badany jest tylko jeden rodzaj tkanki. W tym miejscu ustalamy ogólnie stosowany protokół barwienia NET w tkankach mysich i ludzkich.

Obrazowanie immunofluorescencyjne zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w tkankach ludzkich i mysich

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...

Wśród selekcji przeciwciał do obrazowania tkanek proces fiksacji stanowi wyzwanie związane z maskowaniem epitopów. Dlatego wymagany jest dostosowany krok aportera, aby wystawić te antygeny na wiązanie przeciwciał. Dodatkowo, autofluorescencja nieodłączna tkankami może powodować trudności ze względu na wysokie barwienie tła.Jednak stosowanie różnych podejść w protokołach w literaturze utrudnia ustandaryzowane porównanie obrazów. Nasze badanie ma na celu zaspokojenie zapotrzebowania na ustandaryzowane procedury i pomoc badaczowi w pokonywaniu wyzwań podczas procesu obrazowania. Opracowaliśmy wszechstronny protokół obrazowania mający zastosowanie do różnych tkanek, porównując różne protokoły.Dlatego nasza praca zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów, od stosowania przeciwciał po montaż próbki, podkreślając potencjalne pułapki. Nasze odkrycia naprzód badania, wprowadzając nowe pierwszorzędowe przeciwciało przeciwko cyralinizowanemu histonowi trzy oraz autofluorescencyjny środek redukujący w celu zminimalizowania barwienia tła. Ponadto, aby obrazowanie było skuteczne, kładziemy nacisk na ostrożne obchodzenie się z próbkami i znaczenie utrzymywania stałej wysokiej temperatury w celu pobrania antygenu.Na początek przygotuj 10-krotnie stężony roztwór do pobierania cytrynianu lub TRS o pH sześć, zgodnie z instrukcjami producenta. Rozcieńczyć go w stosunku od jednego do 10 wodą dejonizowaną. Następnie podgrzej roztwór w plastikowym słoiku do barwienia do 96 stopni Celsjusza.Wyjmij szkiełka ze stojaka na prowadnice i umieść je w wilgotnej komorze. Następnie odpipetować jedną lub dwie krople środka redukującego autofluorescencję na każdą próbkę tkanki i inkubować próbki przez pięć minut. Ułóż szkiełka z powrotem w stojaku na szkiełka i płucz przez jedną minutę i 60% etanolu, wykonując ruchy w górę i w dół, aby usunąć niewykorzystany odczynnik redukujący autofluorescencję, zanurz stojak na szkiełka w wodzie dejonizowanej na pięć minut.Przenieść szkiełka do słoika do barwienia z podgrzanym buforem TRS w celu pobrania antygenu. Inkubuj szkiełka przez 10 minut w temperaturze 96 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Wyjmij słoik do barwienia i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej przez około 60 do 90 minut.Następnie wyjmij TRS, trzymając szkiełka w słoiku. Przepłukać szkiełka dwukrotnie buforowaną solą fizjologiczną zawierającą 0,05% roztworu o pH 7,4 przez trzy minuty każda, aby usunąć wszelkie pozostałe pozostałości TRS, umieścić szkiełka w wilgotnej komorze, delikatnie wytrzeć nadmiar wody ze szkiełek za pomocą chusteczek papierowych. Następnie otoczyć każdą próbkę za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego, aby zapobiec wyciekaniu roztworu przeciwciała.Zacznij od odpipetowania jednej kropli gotowego do użycia roztworu blokującego z surowicą osła na próbki tkanek. Następnie inkubować próbki przez 30 minut w temperaturze pokojowej, usunąć nadmiar roztworu blokującego ze szkiełek, stukając krawędzią o twardą powierzchnię. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w buforze do rozcieńczania przeciwciał, aby przygotować 100 mikrolitrów roztworu końcowego dla każdej próbki.Ustaw przeciwciała, jedną probówkę dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego i jedną dla każdego przeciwciała kontrolnego ISO. Równomiernie rozprowadzić 100 mikrolitrów przeciwciał kontrolnych ISO do jednej próbki i 100 mikrolitrów peroksydazy mielo i przytoczyć histon H trzy lub rozcieńczenie przeciwciał przeciwko peroksydazie mielofilowej i elastazie neutrofilowej do drugiej próbki. Umieść szkiełka w wilgotnej komorze i przechowuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia strzepnij nadmiar roztworu przeciwciał pierwszorzędowych ze szkiełek i ułóż je w kuwecie. Przepłukać szkiełka trzy razy przez pięć minut, używając soli fizjologicznej trisespa z dwoma rurkami w celu usunięcia pozostałego roztworu przeciwciał pierwotnych. Przygotować dwa wyraźnie fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe.Antygo osła do peroksydazy mielo i anty królika osła do barwienia cytralinowanego histonu H trzy. Rozcieńczyć każde przeciwciało do stężenia 7,5 mikrograma na mililitr w buforze do rozcieńczania przeciwciał. Umieść szkiełka w mokrej komorze i dozuj 100 mikrolitrów wtórnego roztworu przeciwciał na każdą próbkę.Inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Usuń nadmiar roztworu przeciwciał drugorzędowych, stukając w szkiełka. Umieść szkiełka w stojaku na szkiełka, zanurz szkiełka trzy razy na pięć minut każde w słoiku do barwienia wypełnionym PBS, aby zmyć niezwiązane przeciwciała.Przygotuj roztwór DAPI i rozcieńcz go do stężenia jednego mikrograma na mililitr wodą dejonizowaną. Zanurz szkiełko w słoiku do barwienia zawierającym roztwór DAPI i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie zanurz hamulec szkiełka w słoiku do barwienia z PBS na pięć minut, aby zmyć nadmiar roztworu DAPI.Na koniec zamontuj próbki za pomocą szkiełek nakrywkowych i podłoża montażowego. Cytralinizowane przeciwciało histonu H-3 wiązało się tylko z histonami zewnątrzkomórkowymi i nie wykazywało barwienia histonów wewnątrzkomórkowych. Przeciwciało przeciwko peroksydazie mielologicznej swoistej dla ludzi lub myszy nie wykazywało specyficznego zabarwienia.Podczas gdy uniwersalne przeciwciała ludzkie i mysie wykazywały stałe dobre barwienie peroksydazy mielo. Gdy nie zastosowano żadnego środka blokującego, niektóre próbki myszy wykazywały bardziej niespecyficzne i częściowo dodatnie barwienie. Po zablokowaniu pięciominutowy czas blokowania wykazał dobre wyniki w porównaniu z 10-minutowym czasem blokowania.Wyższe temperatury w kuchence mikrofalowej i łaźni wodnej wykazywały niezmiennie umiarkowane lub dobre pobieranie antygenu. Natomiast w kąpieli wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza barwienie było tylko częściowo dodatnie lub nie było go wcale. W przypadku podwójnego barwienia korzystniejsze wyniki uzyskano dla próbek inkubowanych w łaźni wodnej o temperaturze 96 stopni Celsjusza, jednak przekroczenie czasu inkubacji wynoszącego 40 minut w temperaturze 96 stopni Celsjusza skutkowało mniej intensywnym barwieniem przeciwciał.

immunofluorescence-imaging-neutrophil-extracellular-traps-human-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe (NETs) stanowią istotny mechanizm odporności wrodzonej służący do zwalczania patogennych bakterii, grzybów i pasożytów. W niniejszym opracowaniu opisujemy metody izolacji granulocytów neutrofilowych z krwi ludzkiej oraz ich aktywacji w celu tworzenia NETs. Przedstawiamy techniki przygotowania próbek umożliwiające wizualizację NETs w mikroskopii świetlnej i elektronowej.

Zewnątrzkomórkowe pułapki neutrofilowe: Jak je generować i wizualizować

Ten film pokazuje fluorescencyjne barwienie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET), zewnątrzkomórkowych składników DNA wydalanych przez neutrofile. Technika ta umożliwia wizualizację interakcji adhezyjnej między komórkami nowotworowymi a sieciami NET.

Mikroskopia fluorescencyjna zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych lub NET: technika obserwacji interakcji adhezyjnej między komórkami nowotworowymi a NET

Ten film demonstruje indukcję i wizualizację zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili lub NET w wstępnie oznakowanych neutrofilach przy użyciu surowicy pacjenta zawierającej przeciwciała cytoplazmatyczne anty-neutrofilowe. Co więcej, zastosowanie nieprzepuszczalnego barwnika DNA i mikroskopii fluorescencyjnej umożliwia wizualizację NET.

Indukcja i wizualizacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili we wstępnie znakowanych neutrofilach

Opisujemy metody izolowania neutrofili u psów z krwi pełnej i wizualizacji powstawania NET w żywych neutrofilach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Opisano również protokoły ilościowego oznaczania powstawania NET i ekspresji cytrulinowanego histonu H3 (citH3) za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.

In vitro Tworzenie zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili u psów: analiza dynamiczna i ilościowa za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół opisuje wysoce czuły i wysokoprzepustowy test pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili (NET) do półautomatycznego oznaczania ilościowego tworzenia ex vivo NET za pomocą immunofluorescencji trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej. Protokół ten może być wykorzystany do oceny powstawania i degradacji NET po różnych bodźcach i może być wykorzystany do badania potencjalnych terapii ukierunkowanych na NET.

Wysokoprzepustowy test do oceny i ilościowego określania tworzenia pułapek zewnątrzkomórkowych w neutrofilach

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) neutrofili to trójwymiarowe struktury generowane przez stymulowane granulocyty neutrofilowe. W ostatnich latach stało się jasne, że sieci NET są zaangażowane w wiele różnych chorób. Wykrywanie NET w tkance może mieć znaczenie diagnostyczne, dlatego wymagane są standardowe protokoły znakowania składników NET.

Znakowanie immunofluorescencyjne ludzkich i mysich pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w tkance zatopionej w parafinie

Opisujemy metodę identyfikacji zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) w kardiogennych zakrzepach tętniczych kotów utrwalonych formaldehydem i parafinie, wykorzystując indukowane ciepłem pobieranie antygenu i protokół podwójnego znakowania immunologicznego.

Identyfikacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w zatopionych w parafinie zakrzepach tętniczych kotów przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej

Prezentujemy zautomatyzowaną, wysokoprzepustową metodę ilościowego oznaczania pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) przy użyciu systemu analizy żywych komórek, w połączeniu z zależnym od przepuszczalności błony metodą podwójnego barwnika.

Technika wysokoprzepustowa w czasie rzeczywistym do ilościowego określania tworzenia się pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w ludzkich neutrofilach

Przyleganie neutrofili do aktywowanego śródbłonka w miejscach infekcji jest integralnym składnikiem odpowiedzi zapalnej gospodarza. W niniejszym raporcie opisano test wiązania neutrofili, który pozwala na ilościowe określenie in vitro pierwotnego wiązania ludzkich neutrofili z komórkami śródbłonka aktywowanymi przez mediatory stanu zapalnego w warunkach statycznych.

Ilościowy test in vitro do pomiaru adhezji neutrofili do aktywowanych pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego w warunkach statycznych

Opisano metodę ilościowego oznaczania adhezji neutrofili. Ta metoda tworzy dynamiczne środowisko przepływu podobne do tego, które występuje w naczyniu krwionośnym. Pozwala to na badanie adhezji neutrofili do oczyszczonych cząsteczek adhezyjnych (ligand) lub substratu komórek śródbłonka (HUVEC) w kontekście podobnym do środowiska in vivo z czystym stresem.

Test adhezji w komorze przepływu ludzkich neutrofili

Poznaj standaryzowany protokół immunofluorescencyjnego obrazowania pułapek neutrofilowych w tkankach ludzkich i mysich. Ta metoda poprawia niezawodność wizualizacji NET i ułatwia porównywanie wyników badań.

Obrazowanie immunofluorescencyjne zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w tkankach ludzkich i mysich

Przeglądaj więcej filmów