Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana

Prace w naszym laboratorium mają na celu zrozumienie molekularnych podstaw kompatybilności pyłku i znamion w rodzinie okrytozalążkowych Brassicaceae, w szczególności zidentyfikowanie pyłku i czynników stygmatycznych regulujących udane zapylanie, w szczególności tych, które działają na bardzo najwcześniejszych etapach rozmnażania roślin. Największym wyzwaniem eksperymentalnym jest identyfikacja genów kandydujących i białek, które mogą być zaangażowane w sygnalizację znamienia pyłku. Po zidentyfikowaniu kandydata wymagane są badania mutacyjne w celu określenia jego funkcji.

Nasze badania wykazały, że rodzina małych białek okrywy pyłkowej, określana jako PCP-B, jest ważnym regulatorem nawodnienia pyłku i kompatybilności znamion pyłku u Arabidopsis thaliana. Odkrycia te utorowały drogę do dalszych postępów w zrozumieniu percepcji sygnałów pyłkowych i sposobu, w jaki znamiona je przekazują. Do tej pory brakowało ustandaryzowanego protokołu pomiaru uwodnienia pyłku u Arabidopsis, co utrudniało porównywanie zestawów danych.

Zapewnienie szczegółowego protokołu testu biologicznego zapylania może ułatwić trwające badania i zapewnić łatwo dostępny zestaw narzędzi dla naukowców zainteresowanych tą dziedziną. Opublikowane protokoły często polegają na wycinaniu znamion z kwiatów przed rozpoczęciem zapylania, co może mieć fizjologiczne konsekwencje wpływające na nawodnienie pyłku. Obecna metoda jest najbardziej zbliżona do metody in vivo i jest bardziej precyzyjna w zbieraniu poszczególnych punktów danych.

Nasze laboratorium koncentruje się na odkrywaniu nowych determinantów nawodnienia przenoszonych przez pyłki i ich stygmatycznych partnerów. Nasza niedawno opublikowana praca badała białko płaszcza pyłkowego Arabidopsis thaliana, ujawniając, że powierzchnia pyłku zawiera wiele małych białek podobnych do ligandów, co silnie sugeruje, że wiele czynników decyduje o kompatybilności znamion pyłku. Zacznij od rozwarstwienia nasion pardopsis w sterylnej wodzie Milli-Q przez trzy dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przenieś warstwowe nasiona do doniczek kompostowych, pipetując uwarstwione nasiona. Umieść doniczki w kontrolowanej przez środowisko komorze wzrostu na około sześć tygodni, aż zmysły flory będą dobrze ugruntowane. Aby zapewnić synchroniczne kwitnienie, należy wysiewać razem rośliny dawcę i biorcę pyłku oraz wszelkie inne odpowiednie linie roślin kontrolnych.

Na dzień przed testem biologicznym wybierz te pąki kwiatowe etapu 12 z rośliny biorcy, z nieotwartymi pąkami kwiatowymi, które pokażą otwarcie kwiatu i rozejście się pylnika następnego dnia. Następnie umieść szklane szkiełko pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym. Przyklej obszar łodygi blisko wybranego kwiatu biorcy na tym szklanym szkiełku.

Za pomocą kleszczy z cienką końcówką ostrożnie otwórz pączek kwiatowy i usuń wszystkie płatki kwiatów i pylniki. Po zakończeniu upewnij się, że pistolet nie jest uszkodzony, a znamię jest wolne od zanieczyszczających pyłków. Rozpocznij test od ułożenia oznaczonej rośliny biorcy pyłku A thaliana na boku, umieszczając wykastrowany kwiat na stoliku odwróconego mikroskopu, aby zobrazować znamię.

Aby ustalić pozycję wykastrowanego kwiatu biorcy, unieruchom łodygę za pomocą pasków taśmy maskującej. Z rośliny dawcy pyłku usuń zdrowy i świeżo otwarty kwiat i umieść roślinę dawcy pyłku pod mikroskopem preparacyjnym. Zbierz ziarna pyłku za pomocą kleszczy z cienką końcówką.

Usuń nadmiar ziaren pyłku, lekko dotykając kleszczykami pedałów dawcy, aż utworzy się monowarstwa ziaren pyłku. Wróć do rośliny biorcy pyłku i użyj soczewki obiektywowej o małej mocy, aby ustawić odwrócony mikroskop na znamieniu. Trzymając kleszcze wzdłuż otworu między ramionami kleszczy, ostrożnie zbliż się do niezapylonej komórki brodawki stygmatycznej.

Kontynuuj zbliżanie się do niezapylonej komórki brodawki stygmatycznej, aż odpowiednio umieszczone ziarno pyłku na kleszczach zetknie się lekko z jego powierzchnią. Po potwierdzeniu przyczepienia się pyłku powoli wycofaj kleszcze. Ustaw ziarno pyłku tak, aby jego oś równikowa była widoczna i ostra, a następnie natychmiast przełącz się na soczewkę obiektywową o większej mocy, np. 20x.

Uchwyć pierwszy obraz ziarna pyłku jako T0 i kontynuuj rejestrowanie obrazów w odstępach jednominutowych przez 10 minut. Dostosuj ostrość, aby dostosować się do niewielkich ruchów ziarna pyłku lub znamienia. Rejestruj temperaturę otoczenia i wilgotność względną w pomieszczeniu co dwie minuty, co pozwoli na przyszłe porównania między powtórzeniami eksperymentalnymi.

Zapisz obrazy w formacie bezstratnym, takim jak nd2, przed powtórzeniem kroków zapylania i obrazowania w celu uzyskania dodatkowych ziaren pyłku w celu uzyskania danych do zapylania kontrolnego i eksperymentalnego. Rozpocznij pomiary danych do testu uwodnienia pyłku za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Stosować podobne parametry zoomu cyfrowego i podejścia określającego granicę pyłku dla wszystkich pomiarów w zbiorach danych.

Zapisz półpomocnicze wartości dostępu dla wszystkich punktów czasowych w zestawie danych. Po zakończeniu pomiarów dla zestawu danych wyeksportuj nieprzetworzone wartości dostępu półpomocniczego dla każdego pojedynczego punktu czasu do arkusza kalkulacyjnego. Przedstaw dane w kolumnach na stos obrazów i oblicz procentową zmianę dostępu w połowie drobnej.

Powtórz kroki i uzyskaj dane z co najmniej 15 uwodnionych ziaren pyłku dla każdej linii roślin. Kilka ziaren pyłku może nie ulegać nawodnieniu lub może uwodnić się znacznie wolniej niż oczekiwano. Są one znane jako ziarna niewypałów.

Wyklucz je z zestawu danych. Oblicz średnie wartości dla każdego punktu czasowego na roślinę za pomocą specjalistycznego pakietu oprogramowania GraphPad Prism. Analizuj dane dotyczące nawodnienia z linii typu dzikiego i zmutowanego w każdym punkcie czasowym za pomocą niesparowanych testów T i jednokierunkowej ANOVA, aby porównać średnie dla określonego punktu zainteresowania w czasie.

Aby porównać średnie we wszystkich punktach czasowych, wykonaj wielokrotny test T między liniami typu dzikiego i zmutowanego w wielu punktach czasowych. Dane szeregów czasowych uwodnienia pyłku dla roślin typu dzikiego zebrane w różnych dniach wykazały, że minimalne i maksymalne wartości średnich między powtórzeniami dla wszystkich punktów czasowych mieściły się w granicach 3%Te reprezentatywne dane dla zapyleń typu dzikiego wykazały wysoki stopień spójności dla stosunkowo niskiej liczby próbek i w różnych dniach.