Optymalizacja parametrów wydajnościowych testu długości telomerów TAGGG

Zakres naszych badań obejmuje pomiar różnic w długości telomerów pomiędzy różnymi grupami badawczymi. Pytania, na które staramy się odpowiedzieć, koncentrują się wokół chorób fizjologicznych i tego, jak mogą one wpływać na długość telomerów i odwrotnie. Technologie wykorzystywane obecnie do rozwoju badań w dziedzinie biologii długości telomerów i sekwencjonowania nanopo, a ostatnio pomiarów opartych na CRISPR-CAS.

Obecne wyzwania eksperymentalne polegają na dokładnym pomiarze bezwzględnej długości telomerów i zmian w niej. Ta sama próbka może dawać różne wyniki, gdy stosowane są różne metody pomiaru długości telomerów. Luka badawcza, którą się zajmujemy, polega na braku standardowej metody pomiaru długości telomerów.

Analiza fragmentów restrykcyjnych telomerów (TRF) jest nadal standardem, według którego oceniane są wszystkie nowe techniki. Ponadto nasze zoptymalizowane protokoły pomagają w przetwarzaniu większej liczby próbek przy ograniczonych zasobach. Nasze odkrycia pomogą posunąć naprzód badania w dziedzinie biologii długości telomerów, zapewniając niezawodny i stosunkowo ekonomiczny sposób porównywania nowszych metod ze złotym standardem, jakim jest TRF.

Nasze laboratorium skupi się na wpływie inhibitorów małocząsteczkowych na długość telomerów. Zbadamy również wpływ, jaki na siebie nawzajem mają choroby cywilizacyjne i długość telomerów. Zacznij od dodania 500 mikrolitrów buforu do lizy do wcześniej uzyskanego granulatu komórkowego A 2780 i delikatnie wymieszaj za pomocą naciętej końcówki o minimalnej średnicy otworu dwóch milimetrów.

Dodać 20 mikrogramów na mililitr świeżo przygotowanego RNAse-A i wymieszać przez delikatne odwrócenie. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Pod koniec inkubacji dodać proteinazę K do końcowego stężenia 100 mikrogramów na mililitr i delikatnie odwrócić 10 razy.

Inkubować ponownie w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez godzinę, odwracając probówkę co 10 minut. Odpipetować 500 mikrolitrów odczynnika alkoholowego izoamylowego z lejkiem chloroformowym do probówki i delikatnie odwrócić probówkę około 20 razy. Odwirować go przy 9,391 G przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Odpipetować górną lepką warstwę wody wodnistej do nowej probówki. Dodać równą objętość chloroformu i wymieszać przez delikatne odwrócenie. Po jednokrotnym odwirowaniu probówki zbierz warstwę wodną.

Dodać odpowiednią ilość pięciomolowego chlorku sodu do probówki, aby zwiększyć stężenie o 0,2 mola. Dodaj dwie objętości 100% etanolu do probówki i delikatnie odwróć ją 20 razy. Wirować przy 15 871 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po wyrzuceniu środka leżącego na wznak dodać 500 mikrolitrów 70% etanolu. Odwirować ponownie w tym samym stanie, a następnie wyrzucić supinatant. Po wysuszeniu granulki na powietrzu dodaj 50 mikrolitrów sterylnej wody wolnej od nukleaz i pozwól jej się nawodnić.

Następnie wymieszaj DNA, pipetując za pomocą odciętej końcówki. Użyj fotometrii spektralnej UV do pomiaru stężenia DNA. Po strawieniu DNA oddziel je za pomocą 0,8% żelu agros.

Zanurz żel agros w 0,25 molowym roztworze kwasu solnego na 10 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Następnie dwukrotnie spłucz żel wodą destylowaną. Aby zdenaturować DNA, zanurz żel w roztworze wodorotlenku sodu i chlorku sodu.

Następnie dwukrotnie spłucz żel wodą destylowaną. Aby zneutralizować DNA, jak pokazano, zanurz żel w roztworze 0,5 molowego kwasu solnego i trzech molowych chlorków sodu o pH siedem. Wyekstrahowane genomowe DNA wykazało dobrą integralność, co wskazuje na jego zastosowanie do dalszego przetwarzania fragmentów restrykcyjnych telomerów.

Aby wykonać southern blotting, zacznij od przecięcia nylonowej membrany na segment o wymiarach 10 na 12 centymetrów. Wykonaj nacięcie w tej samej pozycji co żel. Aktywuj membranę, zanurzając ją w wodzie destylowanej, a następnie dodaj 20 x bufor cytrynianu soli fizjologicznej.

Umieść z bibuły filtracyjnej na podwójnej odwróconej tacy. Ustaw tak, aby końce stykały się z podstawą tacki zewnętrznej. Umieść żel na bibule filtracyjnej.

Następnie umieść aktywowaną membranę nylonową na żelu, upewniając się, że nacięcia zachodzą na siebie. Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą szklanego pręta. Umieść dwucentymetrową stertę celulozowej bibuły filtracyjnej o wymiarach 9.5 na 11.5 cm i kolejną sześciocentymetrową stertę zwykłej bibuły filtracyjnej.

Umieść obciążnik na górze zestawu, aby równomiernie rozłożyć ciężar. Napełnij zewnętrzną tacę 20x buforem cytrynianu soli fizjologicznej sodu i pozostaw na noc, aby zapewnić skuteczne przenoszenie. Po transferze południowym utrwal przeniesione DNA na błonie poprzez sieciowanie UV na oświetlaczu transowym UV.

Przemyć membranę dwukrotnie 25 mililitrami dwóch x buforu cytrynianu soli fizjologicznej. Aby przeprowadzić hybrydyzację, inkubuj błonę w 10 mililitrach wstępnie ogrzanego buforu przed hybrydyzacją. Delikatnie mieszaj membranę ręcznie w częstych odstępach czasu.

Następnie inkubuj blot w 10 mililitrach buforu hybrydyzacyjnego w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez trzy godziny z delikatnym mieszaniem. Umyj blot dwukrotnie w 25 mililitrach rygorystycznego buforu przez 10 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Teraz umyj blot dwukrotnie w 25 mililitrach wstępnie ciepłego, rygorystycznego buforu w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 15 minut, delikatnie mieszając.

Płukać 15 mililitrami buforu do płukania przez pięć minut, delikatnie mieszając w temperaturze pokojowej. Inkubować membranę w 10 mililitrach świeżo przygotowanego roztworu blokującego przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Następnie umieść go w 10 mililitrach antydioksygenu sprzężonego z roztworem roboczym fosfatazy alkalicznej.

Płukać blot dwukrotnie w buforze do płukania w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Teraz inkubuj go w 10 mililitrach buforu detekcyjnego przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po usunięciu nadmiaru buforu umieść membranę na arkuszu octanu stroną DNA skierowaną do góry.

Dodaj około jednego do 1,5 mililitra roztworu substratu kroplami na membranę. Natychmiast umieść na nim kolejny arkusz octanu i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Wyciśnij nadmiar roztworu substratu przed obrazowaniem.

Korzystając z systemu obrazowania dokumentacji żelowej, zbierz wiele nienasyconych obrazów w różnych punktach czasowych w celu analizy. Po southern blotting i hybrydyzacji fragmenty restrykcyjne telomerów były wyraźnie widoczne, na co wskazuje rozmaz.