Ulepszona technika wykrywania trimetyloaminy w medycynie pochodzenia zwierzęcego za pomocą chromatografii gazowej z tandemową kwadrupolową spektrometrią mas w przestrzeni czołowej
10 marca 2023
Tutaj opisana jest metoda chromatografii gazowej z tandemową kwadrupolową spektrometrią mas (HS-GC-MS/MS) odpowiednia do oznaczania trimetyloaminy (TMA) w lekach pochodzenia zwierzęcego. Protokół obejmuje wstępną obróbkę próbki, obróbkę w przestrzeni nad głową, warunki analizy, walidację metodologiczną oraz oznaczanie TMA w lekach pochodzenia zwierzęcego.
Zakresem naszych badań jest podstawa materialna i zmienność zapachu ryb w medycynie zwierząt. Protokół ten zapewnia prostą metodę leczenia wstępnego i dokładne wykrywanie trimetyloaminy w lekach dla zwierząt. Proste metody obróbki wstępnej i obwody programatora masy masowej HS GC tego protokołu wymagają dalszej optymalizacji, a przed nami jeszcze wiele pracy.
Nasz protokół przyjmuje wielozadaniowy tryb monitorowania masy GC w połączeniu z unikalną prostą obróbką wstępną, która jest nie tylko pierwszą obróbką wstępną do analizy trimetyloaminy, ale także pierwszym trybem analitycznym, który można zastosować. Na początek zmiażdż materiały lecznicze, Pheretima Periplaneta americana i Hirudo za pomocą młynka do ziół. Przesiać proszek leczniczy przez standardowe sita do leków numer dwa i numer cztery, zebrać proszek między dwoma sitami, aby uzyskać wymaganą próbkę proszku.
Weź jeden gram proszku do 50-mililitrowej plastikowej probówki wirówkowej. Dodać 20 mililitrów 5% roztworu kwasu trichlorooctowego i homogenizować przy 1 000 obr./min przez jedną minutę za pomocą wysokoobrotowego homogenizatora dyspersyjnego. Po homogenizacji odwirować homogenat o stężeniu 1,717 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
I przefiltrować supernatant przez chłonny lejek ze szkła zanurzonego w bawełnie do 50-mililitrowej kolby miarowej. Po dwukrotnym powtórzeniu procesu ekstrakcji 15 i 10 mililitrami 5% roztworu kwasu trichlorooctowego, połączyć filtraty i uzupełnić objętość do 50 mililitrów 5% roztworem kwasu trichlorooctowego. Następnie dokładnie dodaj dwa mililitry roztworu wodorotlenku sodu i 0,5 grama stałej parafiny w 20-mililitrowych fiolkach z przestrzenią nad głową.
Następnie wstawiamy je do piekarnika nagrzanego do 70 stopni Celsjusza na około 30 minut. Wyjmij fiolki i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej, aby parafina zastygła. Aby przetworzyć przestrzeń nad próbką, dodaj dwa mililitry każdego roztworu do ekstrakcji próbki do zestalonych fiolek zawierających parafinę.
Nałożyć nakrętkę i zamknąć fiolkę. Umieść zapieczętowane fiolki z przestrzenią nad głową na GCMS w celu pomiaru. Aby uzyskać krzywą wzorcową, należy zassać serię dwóch mililitrów roztworu wzorcowego trimetyloaminy na wierzchu zestalonej warstwy parafiny.
Umieść zapieczętowane fiolki z przestrzenią nad głową na maszynie w celu pomiaru trimetyloaminy. Aby wykonać test precyzji, odessać dwa mililitry 0,1 mikrograma na mililitr wzorcowego roztworu trimetyloaminy na wierzchu zestalonej warstwy parafiny. Wykonaj sześć równoległych testów w maszynie zgodnie z instrukcjami producenta.
W eksperymencie dotyczącym współczynnika odzysku należy upiec kilka partii próbki w proszku w piecu, aż w GCMS nie zostanie wykryta trietyloamina, jak wykazano wcześniej. Następnie weź każdy gram pieczonego w piekarniku i drobnego proszku do oddzielnych 50-mililitrowych plastikowych probówek wirówkowych. Dodać 50 mikrolitrów wzorcowego roztworu trimetyloaminy do wszystkich probówek i ekstrahować 5% roztworem kwasu trichlorooctowego, jak wykazano wcześniej.
Stwierdzono, że czas retencji trimetyloaminy wynosi 2,3 minuty. Ostry szczyt i brak zakłóceń ze strony innych zanieczyszczeń. Próbki Pheretima, Periplaneta americana i Hirudo poddane testom odzysku z dodatkiem przez suszenie w celu redukcji trietyloaminy w ziołach wykazały średnie wskaźniki odzysku wynoszące odpowiednio 84,49, 94,66 i 85,67%.
Trietyloaminę wykryto w dziewięciu partiach ziół, w stężeniach od 13,23 do 271,63 miligramów na kilogram.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę chromatografii gazowej z analizą przestrzeni nad próbką i tandemową spektrometrią mas z quadrupolem (HS-GC-MS/MS) do oznaczania trimetyloaminy (TMA) w lekach pochodzenia zwierzęcego. Protokół obejmuje przygotowanie próbek, warunki analizy oraz walidację metodyczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Chemia analityczna
- Nauki farmaceutyczne
Wstęp
- Trimetyloamina (TMA) jest związana z rybim zapachem w lekach weterynaryjnych.
- Dokładne wykrywanie TMA jest kluczowe dla kontroli jakości.
- Istniejące metody mogą wymagać optymalizacji w celu poprawy ich wydajności.
- Niniejsze badanie wprowadza nowatorską metodę przygotowania próbek do analizy TMA.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody oznaczania TMA w lekach pochodzenia zwierzęcego.
- Optymalizacja przygotowania próbek oraz warunków analizy.
- Zwiększenie dokładności ilościowego oznaczania TMA.
Zastosowane metody
- Przygotowanie wstępne próbek obejmujące rozdrabnianie i przesiewanie materiałów leczniczych.
- Wykorzystanie techniki HS-GC-MS/MS do analizy TMA.
- Walidacja metodologiczna w celu zapewnienia dokładności i wiarygodności.
- Tryb monitorowania wieloreakcyjnego dla zwiększonej czułości detekcji.
Główne wyniki
- Opracowana metoda zapewnia dokładne oznaczanie ilościowe TMA.
- Zoptymalizowane przygotowanie próbek usprawnia proces detekcji.
- Walidacja metodologiczna potwierdza wiarygodność wyników.
- Jest to pierwsza metoda analityczna opracowana specjalnie do analizy TMA.
Wnioski
- Metoda HS-GC-MS/MS jest skuteczna w wykrywaniu TMA.
- Konieczna jest dalsza optymalizacja metod przygotowania próbek.
- Niniejsze badanie stanowi podstawę dla przyszłych analiz zawartości TMA w produktach leczniczych stosowanych w weterynarii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładne oznaczanie ilościowe trimetyloaminy (TMA) w lekach pochodzenia zwierzęcego rozwiązuje kluczowy problem w kontroli jakości i przestrzeganiu zaleceń terapeutycznych przez pacjentów ze względu na cechy związane z zapachem. Ulepszony protokół GC-MS/MS z analizą przestrzeni nad próbką i izolacją parafinową zwiększa czułość detekcji oraz powtarzalność, wspierając niezawodne procesy analityczne. Możliwość ta wzmacnia wczesną walidację analityczną i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji w dalszych etapach procesów w ramach prac badawczo-rozwojowych w farmacji.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjny pomiar TMA jako krytycznego parametru jakościowego w związkach pochodzenia zwierzęcego.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację i kwantyfikację komponentów powodujących zapach.
- Ułatwia walidację funkcjonalną procesów przetwarzania surowców i strategii oczyszczania.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia odtwarzalną, ilościową analizę służącą do wykrywania TMA w złożonych matrycach biologicznych.
- Standaryzuje wstępne przygotowanie próbek oraz warunki analityczne w celu zapewnienia porównywalności między partiami.
- Umożliwia wysokoczułe przesiewowe badanie interwencji odorekcyjnych podczas opracowywania formulacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zgodność wyników analitycznych z benchmarkami jakości translacyjnej dla terapeutyków pochodzenia zwierzęcego.
- Wspiera ciągłość procesu od oceny surowców po optymalizację formulacji przedklinicznej.
- Zmniejsza ryzyko braku współpracy pacjentów wynikającego z cech sensorycznych w badaniach translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta jest zintegrowana z fazą walidacji analitycznej, stanowiąc pomost między oceną surowców a opracowywaniem formulacji leków pochodzenia zwierzęcego.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe oznaczenie TMA w celu wyjaśnienia wpływu przetwarzania na metabolity odpowiedzialne za zapach.
- Przesiewanie: Zapewnienie zestandaryzowanych, powtarzalnych pomiarów TMA do porównań między partiami.
- Analityka: Dostarczenie czułych, wolnych od zakłóceń odczytów wspierających analizę statystyczną cech jakościowych.
- Badania translacyjne: Zapewnienie ciągłości analitycznej od wczesnej fazy odkrywania po przedkliniczną ocenę właściwości sensorycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Opracowanie zwalidowanego protokołu możliwego do adaptacji do różnych matryc pochodzenia zwierzęcego oraz przyszłych potrzeb analitycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w pomiarze atrybutów jakościowych oraz zrozumienie mechanistyczne.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, czułość i standaryzację w różnych zespołach analitycznych.
- Wartość strategiczna: Stanowi podstawę do podejmowania decyzji go/no-go w zakresie pozyskiwania surowców i optymalizacji procesów.
- Wpływ na portfolio: Wspiera rozwój terapeutyków pochodzenia zwierzęcego z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez redukcję obciążeń związanych z właściwościami sensorycznymi.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w obsłudze układu GC-MS/MS z analizą przestrzeni nad próbką (headspace) oraz w przygotowaniu próbek.
- Wymaga dostępu do piecyków termostatycznych, homogenizatorów i zwalidowanej aparatury analitycznej.
- Niezbędna jest standaryzacja przygotowania próbek i parametrów analitycznych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowywalna do różnych macierzy pochodzenia zwierzęcego, przy ewentualnej optymalizacji protokołu.
- Potencjalne ograniczenia obejmują konieczność dalszej optymalizacji warunków przygotowania próbek i analizy w celu szerszego zastosowania.
