Name: Świński model zakażenia biofilmem i niewidocznymi ranami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Poznaj model zakażenia biofilmem u świń do badania przewlekłych ran. Ta metoda pozwala analizować interakcje gospodarz-drobnoustrój oraz oceniać funkcjonalne gojenie skóry.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Laboratory Animal Resource Center (LARC), Indiana University, za wsparcie i opiekę weterynaryjną nad zwierzętami podczas badania. Prace te były częściowo wspierane przez granty National Institutes of Health NR015676, NR013898 i DK125835 oraz grant Departamentu Obrony W81XWH-11-2-0142. Ponadto praca ta skorzystała z następujących nagród National Institutes of Health: GM077185, GM069589, DK076566, AI097511 i NS42617.

Developing a Long-Term Swine Model for Biofilm-Infected Burn Wound Studies

<ol><li>Goodwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate-depleting+conditions+induce+biofilm+dispersion+and+enhance+the+efficacy+of+antibiotics+in+killing+biofilms+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Pyruvate-depleting conditions induce biofilm dispersion and enhance the efficacy of antibiotics in killing biofilms in vitro and in vivo.</a> Scientific Reports. 9 (1), 3763(2019).</li>
<li>Sen, C. K., Roy, S., Mathew-Steiner, S. S., Gordillo, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+management+in+wound+care%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Biofilm management in wound care.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 148 (2), 275-288 (2021).</li>
<li>Church, D., Elsayed, S., Reid, O., Winston, B., Lindsay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+wound+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Burn wound infections.</a> Clinical Microbiology Reviews. 19 (2), 403-434 (2006).</li>
<li>Nguyen, T. T., Gilpin, D. A., Meyer, N. A., Herndon, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+treatment+of+severely+burned+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Current treatment of severely burned patients.</a> Annals of Surgery. 223 (1), 14-25 (1996).</li>
<li>Eriksson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wounds%3A+Treatment+consensus%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Chronic wounds: Treatment consensus.</a> Wound Repair and Regeneration. 30 (2), 156-171 (2022).</li>
<li>Lebeaux, D., Chauhan, A., Rendueles, O., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+in+vitro+to+in+vivo+models+of+bacterial+biofilm-related+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">From in vitro to in vivo models of bacterial biofilm-related infections.</a> Pathogens. 2 (2), 288-356 (2013).</li>
<li>Ganesh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wound+biofilm+model%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Chronic wound biofilm model.</a> Advances in Wound Care. 4 (7), 382-388 (2015).</li>
<li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vivo+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The in vivo biofilm.</a> Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).</li>
<li>Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+of+biofilm+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Biophysics of biofilm infection.</a> Pathogens and Disease. 70 (3), 212-218 (2014).</li>
<li>Jensen, L. K., Johansen, A. S. B., Jensen, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+models+of+biofilm+infections+with+focus+on+pathomorphology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Porcine models of biofilm infections with focus on pathomorphology.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1961(2017).</li>
<li>Mah, T. F., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Trends in Microbiology. 9 (1), 34-39 (2001).</li>
<li>Gonzalez, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+biofilm-based+infections%3A+Skewing+of+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response.</a> Pathogens and Disease. 76 (3), 023(2018).</li>
<li>Roy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed-species+biofilm+compromises+wound+healing+by+disrupting+epidermal+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Mixed-species biofilm compromises wound healing by disrupting epidermal barrier function.</a> Journal of Pathology. 233 (4), 331-343 (2014).</li>
<li>Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+wound+and+its+burden%3A+Updated+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Compendium+of+Estimates.+Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Human wound and its burden: Updated 2020.</a> Compendium of Estimates. Advances in Wound Care. 10 (5), 281-292 (2021).</li>
<li>Barki, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+field+based+dressing+disrupts+mixed-species+bacterial+biofilm+infection+and+restores+functional+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Electric field based dressing disrupts mixed-species bacterial biofilm infection and restores functional wound healing.</a> Annals of Surgery. 269 (4), 756-766 (2019).</li>
<li>Dusane, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroceutical+treatment+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroceutical treatment of Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2008(2019).</li>
<li>Roy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+biofilm+infection+compromises+wound+healing+by+causing+deficiencies+in+granulation+tissue+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus biofilm infection compromises wound healing by causing deficiencies in granulation tissue collagen.</a> Annals of Surgery. 271 (6), 1174-1185 (2020).</li>
<li>Ghanbari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+density+and+nutrient+level+determine+the+formation+of+mushroom-shaped+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inoculation density and nutrient level determine the formation of mushroom-shaped structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Scientific Reports. 6, 32097(2016).</li>
<li>Yin, R., Cheng, J., Wang, J., Li, P., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+Pseudomonas+aeruginosa+infectious+biofilms%3A+Challenges+and+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Treatment of Pseudomonas aeruginosa infectious biofilms: Challenges and strategies.</a> Frontiers in Microbiology. 13, 955286(2022).</li>
<li>Norbury, W., Herndon, D. N., Tanksley, J., Jeschke, M. G., Finnerty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+in+burns%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Infections%22%5BJournal%5D)">Infection in burns.</a> Surgical Infections. 17 (2), 250-255 (2016).</li>
<li>Nitz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+drug-resistance+genes+of+bla%28OXA-23%29-bla%28OXA-51%29+and+mcr-1+in+clinical+isolates+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of drug-resistance genes of bla(OXA-23)-bla(OXA-51) and mcr-1 in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa.</a> Microorganisms. 9 (4), 786(2021).</li>
<li>Davis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+and+physiologic+evidence+for+biofilm-associated+wound+colonization+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Microscopic and physiologic evidence for biofilm-associated wound colonization in vivo.</a> Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 23-29 (2008).</li>
<li>Breuing, K., Kaplan, S., Liu, P., Onderdonk, A. B., Eriksson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+fluid+bacterial+levels+exceed+tissue+bacterial+counts+in+controlled+porcine+partial-thickness+burn+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Wound fluid bacterial levels exceed tissue bacterial counts in controlled porcine partial-thickness burn infections.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (2), 781-788 (2003).</li>
<li>Nusbaum, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+method+to+remove+wound+bacteria%3A+Comparison+of+various+debridement+modalities+in+an+in+vivo+porcine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Effective method to remove wound bacteria: Comparison of various debridement modalities in an in vivo porcine model.</a> Journal of Surgical Research. 176 (2), 701-707 (2012).</li>
<li>Hirsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+susceptibility+to+infections+in+a+diabetic+wound+healing+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Surgery%22%5BJournal%5D)">Enhanced susceptibility to infections in a diabetic wound healing model.</a> BMC Surgery. 8, 5(2008).</li>
<li>Roche, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+presence+of+biofilm+and+healing+delay+in+a+porcine+model+of+MRSA-infected+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Increasing the presence of biofilm and healing delay in a porcine model of MRSA-infected wounds.</a> Wound Repair and Regeneration. 20 (4), 537-543 (2012).</li>
<li>Hartoch, R. S., McManus, J. G., Knapp, S., Buettner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergency+management+of+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Emergency+Medical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Emergency management of chronic wounds.</a> Emergency Medical Clinics of North America. 25 (1), 203-221 (2007).</li>
<li>Mustoe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+chronic+wounds%3A+a+unifying+hypothesis+on+their+pathogenesis+and+implications+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Understanding chronic wounds: a unifying hypothesis on their pathogenesis and implications for therapy.</a> American Journal of Surgery. 187 (5), 65-70 (2004).</li>
<li>Bhattacharya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+biofilms+release+leukocidins+to+elicit+extracellular+trap+formation+and+evade+neutrophil-mediated+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus biofilms release leukocidins to elicit extracellular trap formation and evade neutrophil-mediated killing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7416-7421 (2018).</li>
<li>Chum, H., Pacharinsak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotracheal+intubation+in+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Endotracheal intubation in swine.</a> Lab Animal. 41 (11), 309-311 (2012).</li>
<li>Sinha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+theft+biofilm+require+host+lipids+of+cutaneous+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa theft biofilm require host lipids of cutaneous wound.</a> Annals of Surgery. 277 (3), e634-e647 (2023).</li>
<li>Fan, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+burn+injury+in+a+swine+model+for+clinical+dressing+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57942(2018).</li>
<li>Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pig+as+a+model+for+human+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The pig as a model for human wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 9 (2), 66-76 (2001).</li>
<li>Meyer, W., Schwarz, R., Neurand, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+skin+of+domestic+mammals+as+a+model+for+the+human+skin%2C+with+special+reference+to+the+domestic+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Problems+in+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The skin of domestic mammals as a model for the human skin, with special reference to the domestic pig.</a> Current Problems in Dermatology. 7, 39-52 (1978).</li>
<li>Vardaxis, N. J., Brans, T. A., Boon, M. E., Kreis, R. W., Marres, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+of+porcine+skin%3A+implications+for+human+wound+healing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy of porcine skin: implications for human wound healing studies.</a> Journal of Anatomy. 190, 601-611 (1997).</li>
<li>Heinrich, W., Lange, P. M., Stirtz, T., Iancu, C., Heidemann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+large+cyanogen+bromide+peptides+from+the+alpha1-+and+alpha2-chains+of+pig+skin+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the large cyanogen bromide peptides from the alpha1- and alpha2-chains of pig skin collagen.</a> FEBS Letters. 16 (1), 63-67 (1971).</li>
<li>Marcarian, H. Q., Calhoun, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+anatomy+of+the+integument+of+adult+swine%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Microscopic anatomy of the integument of adult swine.</a> American Journal of Veterinary Research. 27 (118), 765-772 (1966).</li>
<li>Sullivan, T. P., Eaglstein, W. H., Davis, S. C., Mertz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pig+as+a+model+for+human+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The pig as a model for human wound healing.</a> Wound Repair and Regeneration. 9 (2), 66-76 (2001).</li>
<li>Dawson, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+annotation+of+the+porcine+immunome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Structural and functional annotation of the porcine immunome.</a> BMC Genomics. 14, 332(2013).</li>
<li>Kim, J. Y., Dunham, D. M., Supp, D. M., Sen, C. K., Powell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+burn+device+for+rapid%2C+reproducible+burn+wound+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Novel burn device for rapid, reproducible burn wound generation.</a> Burns. 42 (2), 384-391 (2016).</li>
<li>Nielson, C. B., Duethman, N. C., Howard, J. M., Moncure, M., Wood, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burns%3A+Pathophysiology+of+systemic+complications+and+current+management%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Burn+Care+and+Research%22%5BJournal%5D)">Burns: Pathophysiology of systemic complications and current management.</a> Journal of Burn Care and Research. 38 (1), e469-e481 (2017).</li>
<li>Rowan, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burn+wound+healing+and+treatment%3A+Review+and+advancements%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Burn wound healing and treatment: Review and advancements.</a> Critical Care. 19 (1), 243(2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Niniejszy raport zawiera szczegółowy protokół tworzenia modelu przewlekłego zakażenia biofilmem rany u świń do badań eksperymentalnych. Kilka modeli biofilmu świń zostało zgłoszonych wcześniej 22,23,24,25,26, ale żaden z nich nie jest modelem świń obejmującym 8-tygodniowe długoterminowe badania. Rany przewlekłe to takie, które pozostają otwarte przez 4 tygodnie lub dłużej 14,27,28. W piśmiennictwie nie ma innych modeli biofilmu ran przewlekłych. Niniejsza praca odnosi się do pojęcia funkcjonalnego zamykania ran 2,7,13,15,17,29. Badanie przeprowadzone w 2014 roku było pierwszym, które wykazało, że rany zakażone biofilmem mogą się zamknąć bez przywrócenia funkcji bariery7. W niniejszej pracy przedstawiono pomiar funkcji bariery skórnej w gojącej się ranie za pomocą przeznaskórkowej utraty wody (TEWL).
Anatomicznie i fizjologicznie skóra świni, w porównaniu ze skórą innych małych zwierząt, jest bardziej zbliżona do skóry ludzkiej 32,33,34. Zarówno skóra świni, jak i ludzka ma gruby naskórek33, a stosunek grubości skóry do naskórka waha się od 10:1 do 13:1 u świni, co jest porównywalne z ludzką 34,35. Histerologicznie i biomechanicznie skóra ludzi i świń wykazuje podobieństwa w grzbietach grzbietowych, tłuszczu podskórnym, kolagenie skórnym, rozmieszczeniu włosów, strukturach przydatków oraz wielkości i rozmieszczeniu naczyń krwionośnych 36,37,38. Pod względem funkcjonalnym zarówno świnie, jak i ludzie mają podobieństwa w składzie składników lipidowych, białkowych i keratynowych warstwy naskórka, a także porównywalne wzorce immunohistologiczne37,38. Układ odpornościowy świń, w porównaniu z układem odpornościowym innych małych zwierząt, wykazuje większe podobieństwa do układu odpornościowego człowieka, co oznacza, że świnie są odpowiednim modelem do badań nad interakcjami gospodarza, które są integralną częścią złożoności patologicznego biofilmu w zakażeniach ran39. Krytyczna ocena zalet i wad oferowanych przez różne modele zwierzęce doprowadziła do konsensusu, że świnie stanowią skuteczny model do badania gojenia się ran34,38. Ponadto u świń domowych spontanicznie rozwijają się przewlekłe infekcje bakteryjne, co obserwuje się u ludzi10. Urządzenie do oparzeń używane do tworzenia ran jest zaawansowanym i zautomatyzowanym urządzeniem do oparzeń, które dostarcza energię cieplną na podstawie temperatury odczytanej z docelowego miejsca skóry22,40. Takie podejście poprawia rygor i powtarzalność oparzenia. Wykorzystanie klinicznych izolatów bakterii u ludzi do zakażenia ran świń stanowi wartość dodaną jako model przedkliniczny.
Oparzenia są złożone i powodują szereg zaburzeń ogólnoustrojowych20,41. Dlatego ważne jest, aby reanimować świnię odpowiednimi płynami i zapobiegać hipotermii podczas znieczulenia i rekonwalescencji. Kilka czynników może zakłócać gojenie się rany, w tym odżywianie po oparzeniu, płyny i ból42. Dlatego tak ważne jest ścisłe monitorowanie odżywiania i oceny bólu. Ból pooparzeniowy może być silny i wpływać na zachowanie i dietę zwierzęcia. Interwencje mające na celu rozwiązanie problemów behawioralnych muszą być aktywnie rozważane. Konieczna jest regularna i ciągła ocena i leczenie bólu. W tym protokole znajduje się dokładny arkusz oceny bólu z bardzo szczegółowym planem leczenia bólu. Aby uniknąć zakażenia krzyżowego między ranami, należy zwrócić szczególną uwagę na nakładanie pierwszej warstwy opatrunku na każdą ranę z osobna. Należy zachować szczególną ostrożność przy obchodzeniu się ze wszystkimi materiałami niebezpiecznymi biologicznie oraz podczas przeprowadzania dokładnej dezynfekcji sprzętu, narzędzi i całej sali operacyjnej. Nałożenie wielu warstw opatrunku zapobiega odsłanianiu ran przez świnię podczas wysiłku pocierania lub drapania swędzących grzbietów.
Świnia w obecnym modelu nie była zagrożona przez podstawowe zaburzenia metaboliczne (np. cukrzycę), a zatem badany efekt był wyłącznie wpływem infekcji biofilmem bakteryjnym na gojenie się ran. Jednak model ten nadaje się do indukcji cukrzycy (na przykład przy użyciu streptozotocyny) i może być wykorzystany do badania infekcji biofilmem w odniesieniu do leżącego u podstaw zaburzenia metabolicznego. Innym ograniczeniem modelu jest kontrolowane otoczenie infekcji przy użyciu P. aeruginosa, bakterii. Oczekuje się, że normalna mikroflora skóry świni może również rosnąć w ranie i może wpływać na gojenie. Konieczna jest dalsza analiza przy użyciu NGS lub innych zaawansowanych technik w celu określenia zawartości mikrobiologicznej w ranie. Obecny model może być również stosowany do zakażeń mieszanych różnymi gatunkami drobnoustrojów (np. grzybiczymi, wirusowymi itp.). Jest to ważny element, ponieważ rany istotne klinicznie mogą być wypełnione mieszanymi drobnoustrojami, co może w różny sposób wpływać na gojenie się ran.
Model ten ma wiele potencjalnych zalet, w tym podobieństwo do złożoności i długoterminowych następstw przewlekłych ran u ludzi, zautomatyzowany i powtarzalny proces oparzeń oraz zastosowanie klinicznie izolowanych gatunków bakterii. Zastosowanie wielu nieinwazyjnych metod obrazowania stanowi potężne podejście do zbierania użytecznych danych fizjologicznych charakteryzujących ranę. Wreszcie, krytyczna jest ocena funkcjonalnego gojenia się ran poprzez przywrócenie funkcji bariery skórnej w oparciu o TEWL. Podsumowując, w niniejszej pracy przedstawiono solidny, prosty, szczegółowy i łatwy w użyciu protokół do opracowania poważnego oparzenia zakażonego biofilmem przy użyciu systemu modelu świni.

Zakażenie biofilmem komplikuje oparzenia i przewlekłe rany oraz powoduje przewlekłość1,2,3,4,5. W mikrobiologii bada się przede wszystkim mechanizmy biofilmu, ze szczególnym uwzględnieniem drobnoustrojów1,6. Wnioski wyciągnięte z tych badań mają ogromne znaczenie z punktu widzenia nauk biologicznych, ale niekoniecznie muszą mieć zastosowanie do klinicznie istotnych patogennych biofilmów6,7,8. Klinicznie istotne agregaty strukturalne biofilmu powinny obejmować zarówno czynniki mikrobiologiczne, jak i gospodarza8,9,10. Takie mikrośrodowisko pozwala na włączenie iteracyjnych interakcji gospodarz-mikroorganizm, które mają kluczowe znaczenie dla rozwoju klinicznie istotnego biofilmu7,8. W takim procesie udział komórek odpornościowych i czynników krwiopochodnych ma kluczowe znaczenie11,12. Interakcje gospodarz-drobnoustroje leżące u podstaw klinicznych biofilmów chorobotwórczych, obserwowanych w ranach przewlekłych, zachodzą przez długi czas. W związku z tym każde podejście eksperymentalne mające na celu opracowanie istotnego translacyjnie modelu infekcji biofilmu musi uwzględniać te czynniki. W związku z tym staraliśmy się opracować klinicznie odtwarzalny model przewlekłego zakażenia biofilmem u świń.
Chociaż badania na ludziach wyraźnie reprezentują najlepsze podejście do badania wyników leczenia, często nie są one najlepiej dostosowane do zajmowania się podstawowymi mechanizmami i nowymi mechanistycznymi paradygmatami. Względy etyczne ograniczają stosowanie projektów badań wymagających pobrania wielu biopsji z rany przewlekłej w różnych punktach czasowych. Dlatego tak ważne jest posiadanie dobrze ugruntowanego i powtarzalnego modelu zwierzęcego, aby umożliwić inwazyjne badania w celu dokładnego zbadania losu biofilmu7,13. Wybór modelu zwierzęcego zależy od kilku czynników, w tym znaczenia naukowego/translacyjnego i logistyki. System świński jest powszechnie uznawany za najbardziej wartościowy pod względem translacyjnym model eksperymentalny do badania ran ludzkiej skóry7. W związku z tym praca ta przedstawia ustalony model świńskiego oparzenia o pełnej grubości zakażonego biofilmem. Ta praca opiera się na kilku oryginalnych publikacjach opublikowanych w literaturze2,7,13,14,15,16,17. W tym badaniu wybrano kliniczny izolat wielolekoopornego Pseudomonas aeruginosa (PA01) do zakażenia rany. P. aeruginosa jest częstą przyczyną zakażeń ran2,18,19,20. Jest to bakteria Gram-ujemna, która może być trudna do leczenia ze względu na jej oporność na niektóre antybiotyki11,19,21. Żaden z przedstawionych do tej pory modeli biofilmu świń nie obejmował 8-tygodniowych długoterminowych badań22,23,24,25,26. Rany przewlekłe to takie, które pozostają otwarte przez 4 tygodnie lub dłużej14,27,28. W piśmiennictwie nie ma innych modeli biofilmu ran przewlekłych. Ta praca odnosi się do pojęcia funkcjonalnego zamykania ran2,7,13,15,17,29.

<table><tbody><tr><td>Sedation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Zoetis</td><td>10004027</td><td>100mg/ml</td></tr><tr><td>Telazol</td><td>Zoetis</td><td>106-111</td><td>100mg/ml</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Pivetal</td><td>04606-6750-02</td><td>100mg/ml Strzykawka Anased</td></tr><tr><td>3ml z igłą 20g</td><td>Covidien-Monoject</td><td>8881513033</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do infuzji Winged 21g</td><td>Jorgensen Labs</td><td>J0454B</td><td></td></tr><tr><td>Anesthetic</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pivetal</td><td>21295097</td><td></td></tr><tr><td>Surgery</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia włosów</td><td>Wahl</td><td>8787-450A</td><td></td></tr><tr><td>Nair</td><td>Church and Dwight Co. Inc</td><td>70506572</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór chlorheksydyny</td><td>First Priority Inc.</td><td></td><td></td>179925722</tr><tr><td>70% alkohol izopropylowy</td><td>Uline</td><td>S-17474</td><td></td></tr><tr><td>0,9% roztwór soli</td><td>fizjologicznej OIOM Medycyna</td><td>&nbsp; RL-7282</td><td></td></tr><tr><td>Gaza włókninowa</td><td>Pivetal</td><td>21295051</td><td></td></tr><tr><td>Taśma papierowa</td><td>McKesson</td><td>455531</td><td></td></tr><tr><td>2" Taśma elastyczna</td><td>Pivetal</td><td>21300869</td><td></td></tr><tr><td>18-22g Dożylny Angiocath</td><td>SurVet</td><td>(01)14806017512306</td><td></td></tr><tr><td>Haczyk do kastracji</td><td>Jorgensen Labs</td><td>J0112A</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny lubrykant</td><td>McKesson</td><td>16-8942</td><td></td></tr><tr><td>Laryngoskop</td><td>Jorgensen Labs</td><td>J0449S</td><td></td></tr><tr><td>Gaza rolkowa</td><td></td> Rurka <td>dotchawicza</td> 21295032 <td></td></tr> (<tr><td>7-9 mm)</td><td>Covidien</td><td>86112</td><td>Shiley Hi-Lo Doustna rurka dotchawicza z mankietem</td></tr><tr><td>15gtt / ml zestaw do podawania dożylnego</td><td>ICU Medical</td><td>12672-28</td><td></td></tr><tr><td>LRS 1000ml</td><td>worek ICU Medical</td><td>07953-09</td><td></td></tr><tr><td>Trzy ćwiartki serwety</td><td>McKesson</td><td>16-i80-12110G</td><td></td></tr><tr><td>Analgesia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>RX Generics</td><td>42023-0179-05</td><td>0,3 mg/ml</td></tr><tr><td>Fentanyl Transdermal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>21294548</td><td>Pivetal</td><td>50mg/ml Levafen</td></tr><tr><td> Bandażowanie</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>przezroczysty opatrunek foliowy 26x30</td><td>Genadyne Biotechnologies</td><td>A4-S00F5</td><td></td></tr><tr><td>Opatrunek foliowy 4 x 4-3/4 Styl ramy</td><td>McKesson</td><td>886408</td><td></td></tr><tr><td>Vetrap</td><td>3M</td><td>1410BK BULK</td><td></td></tr><tr><td>Taśma elastyczna 4"</td><td>Pivetal</td><td>21300931</td><td></td></tr><tr><td>Kerlix Roll Gauze</td><td>Cardinal Health</td><td>3324</td><td></td></tr><tr><td>Obrazowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS 80D</td><td>Canon</td><td>1263C004</td><td></td></tr><tr><td>Lampa błyskowa 600EX II-RT</td><td>Canon</td><td>1177C002</td><td></td></tr><tr><td>EFS 17-55mm Ultradźwiękowy</td><td>Canon</td><td>1242B002</td><td></td></tr><tr><td>GE Logiq E9</td><td>GE</td><td>5197104-2</td><td></td></tr><tr><td>ML6-15</td><td>Sonda GE</td><td>5199103</td><td></td></tr><tr><td>PeriCamPSI</td><td>Perimed</td><td>90-00070</td><td></td></tr><tr><td>DermaLab</td><td>Cortex Technologies Inc</td><td>4608D78</td><td></td></tr><tr><td>Biopsja/Biopsja tkanek</mocna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6mm biopsja dziurkowana</td><td>Integra Lifesciences</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>bupiwakaina 0,5%</td><td>Auromedics Pharma</td><td>55150017030</td><td></td></tr><tr><td>Rozmiar 10 Jednorazowy skalpel</td><td>McKesson</td><td>16-63810</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Pivetal</td><td>21294806</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do tkanek kciuka z zębem szczura</td><td>Aesculap</td><td>BD512R</td><td></td></tr><tr><td>Opatrunek nieprzywierający</td><td>Covidien</td><td>2132</td><td>Telfa</td></tr><tr><td>50ml Probówka stożkowa</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf/probówka do mikrowirówki</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>OCT Kaseta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>z włókniny Gaza 4x4</td><td>Pivetal</td><td>21295051</td><td></td></tr><tr><td><mocny>Inokulum</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>agar LB o niskiej zawartości soli</td><td>Invitrogen</td><td>22700-025</td><td></td></tr><tr><td>Rosół LB o niskiej zawartości soli</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Płytka Petriego</td><td>Sokół</td><td>REF-351029</td><td></td></tr><tr><td>Probówki z okrągłym dnem z polipropyliny (14 ml)</td><td>Falcon</td><td>REF-352059</td><td></td></tr><tr><td>Baza agarowa Pseudomonas (odwodniona)</td><td>Thermo Scientific</td><td>OXCM0559B</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar, proszek (agar Lennox L)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Life Technologies)</td><td>22700025</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&trade; DPBS, wapń, magnez</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Euthanasia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18-22g Dożylny angiocath</td><td>SurVet</td><td>(01)14806017512306</td><td></td></tr><tr><td>Fatal Plus</td><td>Vortech Pharmaceuticals</td><td>9373</td><td></td></tr></tbody></table>

Świński model zakażenia biofilmem i niewidocznymi ranami

Swine Model of Biofilm Infection and Invisible Wounds

Zakażenie biofilmem jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do przewlekłości ran. Ustalenie klinicznie istotnego eksperymentalnego zakażenia biofilmem rany wymaga zaangażowania układu odpornościowego gospodarza. Iteracyjne zmiany w gospodarzu i patogenie podczas tworzenia takiego klinicznie istotnego biofilmu mogą wystąpić tylko in vivo. Model ran świńskich jest uznawany za potężny model przedkliniczny. Istnieje kilka doniesień o podejściach do badania biofilmów ran. Systemy in vitro i ex vivo mają niedobór odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Krótkoterminowe badania in vivo wiążą się z ostrymi reakcjami, a zatem nie pozwalają na dojrzewanie biofilmu, jak wiadomo klinicznie. Pierwsze długoterminowe badanie biofilmu ran świń opisano w 2014 roku. W badaniu uznano, że rany zakażone biofilmem mogą się zamykać zgodnie z planimetrią, ale funkcja bariery skórnej w dotkniętym miejscu może nie zostać przywrócona. Później obserwacja ta została zweryfikowana klinicznie. W ten sposób narodziła się koncepcja funkcjonalnego zamykania ran. Rany zamknięte, ale z niedoborem funkcji bariery skórnej, mogą być postrzegane jako rany niewidoczne. W niniejszej pracy staramy się przedstawić szczegóły metodologiczne niezbędne do odtworzenia długoterminowego modelu poważnych oparzeń zakażonych biofilmem u świń, który jest istotny klinicznie i ma wartość translacyjną. Protokół ten zawiera szczegółowe wytyczne dotyczące ustalenia 8-tygodniowego zakażenia biofilmem rany przy użyciu P. aeruginosa (PA01). Osiem ran oparzeniowych o pełnej grubości powstało symetrycznie na grzbiecie domowych białych świń, które zaszczepiono (PA01) w 3 dniu po oparzeniu; Następnie przeprowadzono nieinwazyjną ocenę gojenia się ran w różnych punktach czasowych za pomocą laserowego obrazowania plamkowego (LSI), ultrasonografii o wysokiej rozdzielczości (HUSD) i przeznaskórkowej utraty wody (TEWL). Zaszczepione rany oparzeniowe pokryto czterowarstwowym opatrunkiem. Biofilmy, jak ustalono i potwierdzono strukturalnie za pomocą SEM w 7 dniu po inokulacji, utrudniały funkcjonalne zamknięcie rany. Taki niekorzystny wynik może zostać odwrócony w odpowiedzi na odpowiednie interwencje.

Do stworzenia pełnościennych oparzeń wykorzystano standaryzowane urządzenie do wywoływania oparzeń w 150 °C przez 1 min, co doprowadziło do powstania homogenicznego głębokiego oparzenia z jednolitym marginesem rumienia i stanu zapalnego (Rysunek 3 i Rysunek 7). Każda świnia otrzymała osiem pełnowarstwowych oparzeń na grzbiecie, jak przedstawiono w Rycina 3C. 
Nieinwazyjna ocena ran oparzeniowych w czasie rzeczywistym za pomocą wysokorozdzielczego ultradźwiękowego obrazowania B-mode w celu potwierdzenia głębokości rany i postępu gojenia w czasie wykazała zniszczenie wszystkich warstw skóry aż do tkanki tłuszczowej podskórnej (Rysunek 4). Do dalszej charakteryzacji perfuzji rany zastosowano obrazowanie spekiel laserowy (LSI) (Rysunek 4A).
W ranie oparzeniowej w 7. dniu po inokulacji na powierzchni rany widoczna była gruba błona ropna, co potwierdziło wystąpienie infekcji i utworzenie się biofilmu w ranie oparzeniowej (Rysunek 7A). Planimetria cyfrowa wykazała zwiększenie powierzchni rany w 3. dniu po inokulacji PAO1 w wyniku reakcji zapalnej w miejscu rany i na jej krawędziach (Rysunek 7A,B). Choć powierzchnia rany zaczęła się zmniejszać do 14. dnia po inokulacji, w 56. dniu zaobserwowano niepełne gojenie do około 25% pierwotnej wielkości rany, co wskazuje na przewlekły charakter ran (Rysunek 7B). Przewlekłość ran oraz zaburzone gojenie potwierdzono dodatkowo za pomocą TEWL, który wykazał wysoką przeznaskórkową utratę wody. Wyniki TEWL odzwierciedlały utratę funkcji barierowej skóry w porównaniu do skóry prawidłowej we wszystkich mierzonych punktach czasowych, co wskazuje na funkcjonalne upośledzenie gojenia rany oparzeniowej (Rysunek 7B). Potwierdzono to również poprzez supresję białekczczelnych połąceń ZO-1 i 213 oraz upośledzenie przywrócenia funkcji barierowej skóry, co odzwierciedlały wysokie wartości TEWL zaobserwowane w 35. dniu (etap środkowy) i 56. dniu (etap późny), pomimo wizualnego zamknięcia się rany (Rysunek 7I).
Głębokość oparzenia została dodatkowo potwierdzona barwieniem H&amp;E, które wykazało zniekształcenie i martwicę wszystkich histologicznych warstw skóry, co przedstawiono na ryc. 7C. Uformowany biofilm PA01 został dodatkowo potwierdzony w 7. dniu po inokulacji za pomocą metody CFU (ryc. 7E,F), obrazowania SEM (ryc. 7G) oraz barwienia immunofluorescencyjnego (ryc. 7H).
<img alt="Przygotowanie chirurgiczne z wyposażeniem medycznym, monitorowanie funkcji życiowych świni; obejmuje urządzenie do pomiaru temperatury." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65301/65301fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie do procedury. (A) Przygotowanie stołu chirurgicznego. (B) Kanulacja żyły usznej do podawania płynów IV i leków. (C) Przykrycie kocem termicznym w celu ochrony świni przed hipotermią podczas procedury. (D) Konfiguracja palnika i czasomierza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65301/65301fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces przygotowania i znakowania skóry do procedury dermatologicznej; metoda; układ eksperymentalny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65301/65301fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Sterylizacja i znakowanie miejsca operacyjnego. (A) Strzyżenie włosów i sterylizacja. (B) Znakowanie miejsca oparzenia przy użyciu sterylnego szablonu standardowego dla ośmiu ran (każda rana ma wymiary 2 in x 2 in). (C) Ostateczne znakowanie przy użyciu sterylnego markera do skóry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65301/65301fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment z krioterapii z użyciem sondy z regulowaną temperaturą na syntetycznej skórze w celu badania efektu termicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65301/65301fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Indukcja oparzeń. (A,B) Standaryzowany wypalacz z manometrem i automatyczną jednostką sterującą (2 in x 2 in) przyłożony do wcześniej zaznaczonego miejsca rany. (C) Całe plecy z widocznymi ośmioma pełnowarstwowymi oparzeniami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65301/65301fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ocena elastyczności skóry; konfiguracja obrazowania ultradźwiękowego, wyniki w trybie elasto, medyczna analiza diagnostyczna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65301/65301fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Nieinwazyjne obrazowanie i ocena rany oparzeniowej. (A) Obraz po lewej przedstawia obrazowanie plamek laserowych (LSI) z prawidłowym ustawieniem wskaźnika wiązki lasera w centrum rany; obraz po prawej przedstawia urządzenie LSI oraz mapę perfuzji naczyniowej skóry w czasie rzeczywistym. (B) Obraz po lewej przedstawia aplikację sondy do pomiaru transepidermalnej utraty wody (TEWL) w pięciu różnych miejscach rany (cztery narożniki rany i centrum, co pokazano na obrazie w prawym dolnym rogu); obraz po prawej to reprezentatywny zrzut ekranu z pomiaru TEWL w czasie rzeczywistym. (C) Po lewej stronie przedstawiono harmoniczne skanowanie ultradźwiękowe rany oparzeniowej za pomocą wysokorozdzielczej sondy ultradźwiękowej 16 MHz; obraz po prawej przedstawia urządzenie ultradźwiękowe i nagranie ekranu w czasie rzeczywistym. (D) Obrazy strukturalne (obrazy B-mode, ultradźwięki w skali szarości) i biomechaniczne (elastografia, kolorowe ultradźwięki) miejsca rany oparzeniowej w dniu inokulacji oraz w 7. dniu po inokulacji. Głębokość rany zaznaczono żółtą przerywaną linią. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65301/65301fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Proces nakładania opatrunku na ranę chirurgiczną, etapy bandażowania i zakrywania zaprezentowane na modelu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65301/65301fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Opatrywanie i bandażowanie ran. (A) Nakładanie przezroczystego opatrunku foliowego na każdą ranę osobno. (B) Wszystkie inokulowane rany oparzeniowe na grzbiecie są przykryte pierwszą warstwą opatrunku. (C) Większy przezroczysty opatrunek foliowy zostaje umieszczony nad całym obszarem ran. (D) Nałożenie drugiej warstwy gazy oraz luźnej warstwy rozciągliwego bandaża elastycznego wokół całego tułowia świni w celu wchłonięcia wysięku z ran. (E) Przykrycie całego obszaru ran końcową warstwą opatrunku przylepnego 4 in. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65301/65301fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Eksperyment z testem płatkowym skóry z pipetą i aplikacją płatka, zestaw badawczy dermatologiczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65301/65301fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Inokulacja bakteryjna. (A) Przygotowanie do inokulacji Pseudomonas aeruginosa (PA01) w 3. dobie po oparzeniu. (B) Miejscowa aplikacja inokulum za pomocą pipety, przy użyciu objętości 500 µL na każdą ranę. (C) Inokulum jest równomiernie rozprowadzane na powierzchni rany przy użyciu sterylnego jednorazowego rozprowadzacza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65301/65301fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Harmonogram gojenia ran, mikroskopia warstw skóry, wzrost kultur bakteryjnych, analiza spektroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65301/65301fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rysunek 7Postęp gojenia rany i potwierdzenie obecności biofilmu. (A) Reprezentatywne obrazy gojenia się rany w czasie trwania badania. Pasek skali = 1 cm. (B) Ilościowe oznaczenie powierzchni rany oraz pomiary TEWL w czasie trwania badania (n = 6). Dane przedstawiono jako średnia ± SD. N.S. odnosi się do wartości TEWL dla skóry prawidłowej. (C) Schemat przedstawiający różne miejsca pobrania biopsji rany. D. H&amp;Barwienie H&E wraz z odpowiadającym mu barwieniem trichromem Massona, wykazujące zniekształcenie i martwicę wszystkich warstw skóry w 3. dobie po oparzeniu oraz w 7. dobie po inokulacji. Pasek skali = 500 µm. (E) reprezentatywne obrazy cyfrowe agaru nieselektywnego (agar Luria-Bertani) oraz agaru selektywnego (Pseudomonas Agar izolacyjny) z koloniami bakterii wyhodowanymi z tkanki łoża rany świńskiego. Pożywka selektywna umożliwia dokładne przeliczenie wyłącznie kolonii PA01.FPrzedstawiono przykładowe obliczenie jednostek tworzących kolonie (CFU) na podstawie liczby kolonii uzyskanych z przetworzonych biopsji ran pobranych w 7. dobie po inokulacji.G) Reprezentatywne obrazy z rozpylnej mikroskopii elektronowej (SEM) inokulowanych ran oparzeniowych w 7. dniu po inokulacji, przedstawiające utworzony biofilm PA01, wraz z powiększeniem po prawej stronie. Pasek skali = 1 µmCzerwone groty strzałek wskazują na zewnątrzkomórkowe substancje polimerowe (EPS).H) P. aeruginosa rany oparzeniowe wizualizowano przy użyciu przeciwciał anty-Pseudomonas (zielone) przeciwciało; obrazy immunofluorescencyjne z biopsji ran w 7. dniu po inokulacji wykazują intensywną kolonizację tkanek rany przez P. aeruginosaPasek skali = 100 µm. (I) Reprezentatywny mozaikowy obraz (pasek skali = 200 µm) oraz odpowiadających im powiększeń (pasek skali =) 50 µm) obrazy przekrojów barwionych pod kątem ZO-1 i ZO-2 w 35. i 56. dniu po inokulacji, wykazujące obniżoną ekspresję białek po wywołaniu infekcji. Przekroje mrożone zatopione w OCT (10 µm) barwiono z użyciem przeciwciał anty-ZO-1 (zielony) lub anty-ZO-2 (zielony). Przekroje poddano barwieniu kontrastowemu DAPI. Wykresy słupkowe przedstawiają ilościowe oznaczenie intensywności sygnału ZO-1 i ZO-2. Dane przedstawiono jako średnią ± SD (n = 3); * p &lt; 0,05 w porównaniu do spontanicznych. W celu sprawdzenia istotności przeprowadzono testy Mann-Whitneya lub jednoczynnościkową analizę wariancji Kruskala-Wallisa. Rycina 7H,I zostało zmodyfikowane na podstawie pracy Roy i wsp.13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65301/65301fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Przewlekłe rany, które są odporne na antybiotyki, stanowią poważne zagrożenie dla systemu opieki zdrowotnej. Infekcje biofilmem są uporczywe i wrogie i mogą powodować nieprawidłowe zamykanie się ran. Przedstawiamy klinicznie istotny model świń z przewlekłymi ranami pełnej grubości zakażonymi biofilmem. Model ten jest przydatny zarówno w badaniach mechanistycznych, jak i w testowaniu interwencji.

Biofilm infection is a major contributor to wound chronicity. The establishment of clinically relevant experimental wound biofilm infection requires the ...

Zakażenie biofilmem w znacznym stopniu przyczynia się do przewlekłości rany. Ten model przedkliniczny infekuje rany świń Q-TDS o pełnej grubości klinicznie izolowanymi patogenami w celu zbadania tworzenia się biofilmu rany i zależnych od biofilmu zmian w wynikach rany. Uwzględniając zarówno czynniki mikrobiologiczne, jak i gospodarza, staramy się zbadać złożone interakcje mikroorganizmów gospodarza leżące u podstaw patogennych biofilmów w ranach przewlekłych.Chociaż obecna literatura nie rozróżnia tych dwóch ran biofilm agregaty różnią się znacznie od agregatów biofilmu występujących w wyniku interakcji mikrobiologicznych przy braku mechanizmów obronnych gospodarza. Na przykład biofilm wyhodowany na powierzchni plastiku lub na powiedzmy martwym naskórku. Iteracyjne oddziaływanie między procesami mikrobiologicznymi a systemami obrony immunologicznej gospodarza prowadzi do tworzenia agregatów biofilmu rany.Ponieważ proces ten trwa kilka dni, kluczowe znaczenie ma posiadanie długoterminowego modelu zakażenia rany. Zarówno systemy in vitro, jak i ex vivo nie mają niezbędnej odpowiedzi immunologicznej gospodarza wymaganej do badania biofilmu rany. Podczas gdy krótkoterminowe badania in vivo dają ostrą odpowiedź, która nie pozwala na dojrzewanie biofilmu, nasz ustandaryzowany przedkliniczny system eksperymentalny z raportowanymi klinicznie istotnymi wynikami wypełnia te luki.Podczas gdy rana zakażona biofilmem może zamykać się strukturalnie, może nie osiągnąć funkcjonalnego zamknięcia rany, ponieważ naprawiona skóra często nie jest w stanie przywrócić funkcji bariery. Uszkodzona skóra z upośledzoną funkcją barierową stanowi otwartą, niewidoczną ranę, która jest strukturalnie pokryta, ale funkcjonalnie otwarta. Nasze badanie podkreśla znaczenie pomiaru funkcji bariery skórnej i miejsca gojenia się rany w celu określenia funkcjonalnego zamknięcia rany.Funkcja bariery jest mierzona za pomocą klinicznie zwalidowanego pomiaru transskórnej utraty wody w miejscu opieki nad pacjentem. Aby rozpocząć zabieg w odpowiednio zaaranżowanej sali operacyjnej, należy umieścić znieczuloną świnię w pozycji leżącej mostka i upewnić się, że wszystkie połączone przewody i rurki są zabezpieczone. Usuń wszelkie resztki włosów z ogolonego obszaru przeznaczonego do zranienia za pomocą kremu do depilacji.Po wysterylizowaniu miejsc rany należy oznaczyć obszar za pomocą sterylnego szablonu oparzenia i chirurgicznego markera do skóry. Ustaw palnik, ustawiając nastawę na jednostce sterującej na 150 stopni Celsjusza, niską nastawę na 145 stopni Celsjusza, a wysoką nastawę na 155 stopni Celsjusza. Za pomocą podgrzanych bloczków ze stali nierdzewnej podłączonych do urządzenia do oparzeń, stwórz ranę oparzeniową o pełnej grubości, umieszczając bloki na skórze na 60 sekund.Zrób cyfrowe zdjęcie całego grzbietu świni, w tym tabliczkę z punktem czasowym i datą identyfikacji świni. Następnie osobno zrób zdjęcia każdej rany wraz z linijką i tabliczką z identyfikatorem świni, identyfikatorem rany i punktem czasowym. Aby ocenić perfuzję mikronaczyniową rany w czasie rzeczywistym za pomocą laserowego obrazowania plamkowego lub LSI, zobrazuj wszystkie rany w jednym nagraniu za pomocą obrazera perfuzyjnego krwi LASCA.Aby zmierzyć trans-naskórkową utratę wody lub TEWL, umieść czystą osłonę sondy na końcówce sondy TEWL, która będzie miała kontakt z tkanką rany. Zmierz każdą ranę pięć razy, najpierw w środku, a następnie w każdym rogu. Następnie wyeksportuj wszystkie odczyty do arkusza kalkulacyjnego.Wykonaj harmoniczne mapowanie ultrasonograficzne lub HUSD, skanując ranę sondą ultradźwiękową od linii środkowej lub kręgosłupa, zaczynając od normalnej skóry i przesuwając się w kierunku bocznej strony świni, nad ranami, aż do ponownego osiągnięcia normalnej skóry. Postępuj zgodnie ze wzorcem skanowania dla każdej rany zarówno w trybie B, jak i w trybie elastografii tkankowej. Zmień adnotację po zobrazowaniu każdej rany zarówno w trybie B, jak i w trybie elasto, co oznacza dwa nagrania na ranę.Po zakończeniu całego obrazowania należy przykryć rany oparzeniowe pojedynczo przezroczystymi opatrunkami foliowymi lub opatrunkiem testowym. Następnie umieść większy przezroczysty opatrunek filmowy na całej powierzchni rany. Nałóż luźno drugą warstwę zwiniętej gazy na cały pień świni, aby wchłonąć płyn wydostający się z ran.Przykryj gazę luźno warstwą elastycznego elastycznego bandaża. Przykryj elastyczny bandaż ostatnią warstwą czterocalowej elastycznej taśmy. Po odstawieniu gazu znieczulającego po zakończeniu bandażowania, należy pozostawić świnię na tlenie przez co najmniej pięć minut.Aby zaszczepić rany oparzeniowe w trzecim dniu po oparzeniu, rozprowadź inokulum na powierzchni odsłoniętych ran za pomocą pipety i rozprowadź je równomiernie za pomocą jednorazowego rozsiewacza, aby pobrać biopsje tkanek do analizy po obrazowaniu, naciekać obszar wokół rany 0,5% bupiwakainą. Za pomocą jednorazowego skalpela z ostrzem w rozmiarze 10 odetnij pasek o szerokości od trzech do czterech milimetrów od jednej krawędzi rany do drugiej, zachowując małe marginesy normalnej skóry po obu stronach. Wyciąć sześciomilimetrową biopsję dziurkowaną z rany, od łożyska rany lub krawędzi rany, uzyskać hemostazę po pobraniu próbek, delikatnie naciskając ranę sterylną gazą, przykryć ranę nieprzylegającym opatrunkiem i zabandażować ją, jak pokazano wcześniej.Analiza próbki biopsji za pomocą barwienia hematoksyliną i neozytyną wykazała zniekształcenie i martwicę wszystkich histologicznych warstw skóry. Utworzony biofilm poddano dalszej walidacji w siódmym dniu po inokulacji za pomocą jednostki tworzącej kolonię. Skanuj mikroskopię elektronową, obrazowanie i barwienie immunofluorescencyjne.Rany oparzeniowe wykazały grubą błonę biogenną na powierzchni rany w siódmym dniu po inokulacji, co potwierdza infekcję i utworzenie biofilmu. Obszar rany zaczął się zmniejszać w 14 dniu, ale niepełne gojenie do około 25% pierwotnego rozmiaru rany zaobserwowano w 56 dniu, co wskazuje na przewlekłość rany. Przewlekłość ran i upośledzone gojenie się ran zostały dodatkowo potwierdzone przez TEWL, wykazując wysoką transepidermalną utratę wody we wszystkich mierzonych punktach czasowych.Zostało to również potwierdzone przez supresję białek połączeń ścisłych, ZO-1 i 2, oraz upośledzone przywrócenie funkcji bariery skórnej.

swine-model-of-biofilm-infection-and-invisible-wounds

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: de Vries, C. R., et.al. Model opóźnionej inokulacji przewlekłej infekcji rany Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje opóźnione szczepienie luminescencyjnego Pseudomonas aeruginosa u myszy noszącej dwie pełnogrube rany grzbietowe pokryte przezroczystym opatrunkiem foliowym. Ułatwia to powstawanie biofilmu i powstawanie przewlekłych infekcji. Regularne monitorowanie bioluminescencji umożliwia ilościowe określenie obciążenia bakteriami oraz śledzenie postępu infekcji...

Opracowywanie mysiego modelu przewlekłej infekcji skóry Pseudomonas aeruginosa 

Source: Hunt, A. M. A., et al. Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model. J. Vis. Exp.(2017).This video demonstrates the procedure for assessing infection clearance and healing progression in a wounded diabetic mouse using bioluminescent and microscopic images.

Bioluminescence Imaging to Track Bacterial Infection and Wound Healing in a Mouse Model

Tutaj opisujemy nowy model myszy z cukrzycą, wykorzystujący bezwłose myszy do nieinwazyjnego monitorowania w czasie rzeczywistym infekcji ran biofilmu bioluminescencyjnych Pseudomonas aeruginosa. Metodę tę można zaadaptować do oceny infekcji innymi gatunkami bakterii i mikroorganizmami modyfikowanymi genetycznie, w tym biofilmami wielogatunkowymi, oraz do testowania skuteczności strategii zwalczania biofilmu.

Przejdźmy na jasną stronę mocy: monitorowanie in vivo zakażeń biofilmem Pseudomonas aeruginosa w ranach przewlekłych w modelu myszy bezwłosej z cukrzycą

Z tym artykułem związana jest aktualizacja. Kliknij tutaj, aby zobaczyć aktualizację. Przewlekłe rany powstają z ostrych ran na mysim modelu cukrzycowym poprzez wywołanie wysokiego poziomu stresu oksydacyjnego po pełnej grubości rany skórnej. Rana jest leczona inhibitorami katalazy i peroksydazy glutationowej, co powoduje upośledzenie gojenia i rozwoju biofilmu przez bakterie obecne w mikrobiomie skóry.

Protokół tworzenia przewlekłych ran u myszy z cukrzycą

Dokładne naśladowanie sposobu leczenia oparzeń wymaga współgrania między obserwacją kliniczną a badaniami na modelach zwierzęcych. W tym badaniu ustalono model ciężkiego oparzenia u świń w celu oceny eksperymentalnego opatrunku w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Ciężkie oparzenia w modelu trzody chlewnej do klinicznej oceny opatrunku

Opisujemy protokół opóźnionej inokulacji do generowania przewlekłych infekcji ran u myszy immunokompetentnych.

Model opóźnionej inokulacji przewlekłego zakażenia ran Pseudomonas aeruginosa

Tutaj opisujemy metody oceny ex vivo i in vivo rozprzestrzeniania się bakterii po zakażeniu ran u myszy. Protokół ten może być wykorzystany do testowania skuteczności miejscowych terapii przeciwbakteryjnych i przeciw biofilmowi lub do oceny zdolności dyspersji różnych szczepów lub gatunków bakterii.

Ocena dyspersji biofilmu w mysich ranach

Ten protokół opisuje powtarzalny model ran oparzeniowych o dużej głębokości u miniświnek z Jukatanu.

Model oparzeń świń do badania procesu gojenia się ran po oparzeniach o wielu głębokościach

Protokół opisujący zastosowanie systemu komórek przepływowych do hodowli i analizy biofilmów mikrobiologicznych w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM).

Biofilm Pseudomonas aeruginosa i Saccharomyces cerevisiae w komórkach przepływowych

Analiza opisuje szybką metodę pomiaru wczesnego tworzenia się biofilmu przez bakterie i grzyby. Metoda ta wykorzystuje płytkę mikrotitracyjną jako podłoże do tworzenia biofilmu mikrobiologicznego, a sam biofilm jest wizualizowany przy użyciu fioletu krystalicznego. Analiza ta pozwala na jakościowe lub ilościowe oznaczenie wczesnego etapu tworzenia biofilmu.

Analiza tworzenia biofilmu w płytkach mikrotitrowych

Poznaj model zakażenia biofilmem u świń do badania przewlekłych ran. Ta metoda pozwala analizować interakcje gospodarz-drobnoustrój oraz oceniać funkcjonalne gojenie skóry.

Świński model zakażenia biofilmem i niewidocznymi ranami

Przeglądaj więcej filmów