Name: Analiza gęstości mitochondrialnej i rozmieszczenia podłużnego we włóknach mięśni szkieletowych żywych szczurów za pomocą mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Odkryj metodę analizy gęstości i rozmieszczenia mitochondriów we włóknach mięśni szkieletowych żywych szczurów przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Protokół obejmuje izolację włókien, obrazowanie fluorescencyjne oraz przetwarzanie obrazu z wykorzystaniem progowania i analizy Fouriera.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Szkołę Medyczną i Instytut Badań nad Otyłością w Tecnologico de Monterrey. Rysunek 3A został stworzony za pomocą oprogramowania Scientific Image and Illustration.

Confocal Microscopic Analysis of Rat Muscle Mitochondria

<ol><li>Lackner, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+dynamic+mitochondrial+network%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Shaping the dynamic mitochondrial network.</a> BMC Biology. 12, 35(2014).</li>
<li>De Mario, A., Gherardi, G., Rizzuto, R., Mammucari, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondria in health and disease.</a> Cell Calcium. 94, 102357(2021).</li>
<li>Chang, C. R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+mitochondrial+fission+through+modification+of+the+dynamin-related+protein+Drp1%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of mitochondrial fission through modification of the dynamin-related protein Drp1.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1201, 34-39 (2010).</li>
<li>Willingham, T. B., Ajayi, P. T., Glancy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+specialization+of+mitochondrial+form+and+function+in+skeletal+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Subcellular specialization of mitochondrial form and function in skeletal muscle cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 757305(2021).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+subpopulations+and+heterogeneity+revealed+by+confocal+imaging%3A+possible+physiological+role%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial subpopulations and heterogeneity revealed by confocal imaging: possible physiological role.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1757 (5-6), 686-691 (2006).</li>
<li>Díaz-Vegas, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+increase+induced+by+RyR1+and+IP3R+channel+activation+after+membrane+depolarization+regulates+skeletal+muscle+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium increase induced by RyR1 and IP3R channel activation after membrane depolarization regulates skeletal muscle metabolism.</a> Frontiers in Physiology. 9, 791(2018).</li>
<li>Boncompagni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+are+linked+to+calcium+stores+in+striated+muscle+by+developmentally+regulated+tethering+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria are linked to calcium stores in striated muscle by developmentally regulated tethering structures.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (3), 1058-1067 (2009).</li>
<li>Reggiani, C., Marcucci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controversial+issue%3A+Can+mitochondria+modulate+cytosolic+calcium+and+contraction+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">A controversial issue: Can mitochondria modulate cytosolic calcium and contraction of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of General Physiology. 154 (9), e202213167(2022).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2%2B+release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circulation Research. 102 (3), 338-346 (2008).</li>
<li>Al-Qusairi, L., Laporte, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+biogenesis+and+triad+formation+in+skeletal+muscle+and+implication+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 26(2011).</li>
<li>Pérez-Treviño, P., Pérez-Treviño, J., Borja-Villa, C., García, N., Altamirano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+T-tubules+and+sarcoplasmic+reticulum+in+ventricular+myocytes+in+early+cardiac+hypertrophy+in+a+pressure+overload+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Changes in T-tubules and sarcoplasmic reticulum in ventricular myocytes in early cardiac hypertrophy in a pressure overload rat model.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (4), 1329-1344 (2015).</li>
<li>Celestino-Montes, A., Pérez-Treviño, P., Sandoval-Herrera, M. D., Gómez-Víquez, N. L., Altamirano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+role+of+T-tubules+disruption+and+decreased+SERCA2+on+contractile+dynamics+of+isolated+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Relative role of T-tubules disruption and decreased SERCA2 on contractile dynamics of isolated rat ventricular myocytes.</a> Life Sciences. 264, 118700(2021).</li>
<li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orphaned+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Orphaned ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li>
<li>Houzelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+mitochondrial+dynamics+in+relation+to+oxidative+capacity+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle mitochondrial dynamics in relation to oxidative capacity and insulin sensitivity.</a> Diabetologia. 64 (2), 424-436 (2021).</li>
<li>Call, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulk1-mediated+autophagy+plays+an+essential+role+in+mitochondrial+remodeling+and+functional+regeneration+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Ulk1-mediated autophagy plays an essential role in mitochondrial remodeling and functional regeneration of skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 312 (6), C724-C732 (2017).</li>
<li>Fealy, C. E., Grevendonk, L., Hoeks, J., Hesselink, M. K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+network+dynamics+in+metabolic+disorders+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial network dynamics in metabolic disorders and aging.</a> Trends in Molecular Medicine. 27 (11), 1033-1044 (2021).</li>
<li>Rivera-Alvarez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+session+of+physical+activity+restores+the+mitochondrial+organization+disrupted+by+obesity+in+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">A single session of physical activity restores the mitochondrial organization disrupted by obesity in skeletal muscle fibers.</a> Life Sciences. 256, 117965(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2022).</li>
<li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeconvolutionLab2%3A+An+open-source+software+for+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy.</a> Methods. 115, 28-41 (2017).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes%2C+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes, and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).</li>
<li>Ma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%2C+mitochondrial+homeostasis%2C+and+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitophagy, mitochondrial homeostasis, and cell fate.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 467(2020).</li>
<li>Meinild, L. A. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+training+increases+skeletal+muscle+mitochondrial+volume+density+by+enlargement+of+existing+mitochondria+and+not+de+novo+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Exercise training increases skeletal muscle mitochondrial volume density by enlargement of existing mitochondria and not de novo biogenesis.</a> Acta Physiologica. 222 (1), (2018).</li>
<li>Memme, J. M., Erlich, A. T., Phukan, G., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+mitochondrial+health%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exercise and mitochondrial health.</a> Journal of Physiology. 599 (3), 803-817 (2021).</li>
<li>Gan, Z., Fu, T., Kelly, D. P., Vega, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+remodeling+in+exercise+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial remodeling in exercise and diseases.</a> Cell Research. 28 (10), 969-980 (2018).</li>
<li>Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+between+structure+and+function+in+rat+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers.</a> Journal of Cell Biology. 47 (1), 107-119 (1970).</li>
<li>Vincent, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+mitochondrial+ultrastructural+defects+in+mitochondria+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The spectrum of mitochondrial ultrastructural defects in mitochondria myopathy.</a> Scientific Reports. 6, 30610(2016).</li>
<li>Mishra, P., Varuzhanyan, G., Pham, A. H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+is+a+distinguishing+feature+of+skeletal+muscle+fiber+types+and+regulates+organellar+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics is a distinguishing feature of skeletal muscle fiber types and regulates organellar compartmentalization.</a> Cell Metabolism. 22 (6), 1033-1044 (2015).</li>
<li>Cheng, A. J., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+isolation%2C+and+measurement+of+force+and+myoplasmic+free+%5BCa2%2B%5D+in+fully+intact+single+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mechanical isolation, and measurement of force and myoplasmic free [Ca2+] in fully intact single skeletal muscle fibers.</a> Nature Protocols. 12 (9), 1763-1776 (2017).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Javadov, S., Margreiter, R., Hagenbuchner, J., Ausserlechner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function%2C+structure%2C+and+intracellular+organization+in+situ+in+cardiomyocytes+and+skeletal+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function, structure, and intracellular organization in situ in cardiomyocytes and skeletal Muscles.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (4), 2252(2022).</li>
<li>Pawley, J. B. Fundamental limits in confocal microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22In%3A+Pawley%2C+J.+%28eds%29+Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">In: Pawley, J. (eds) Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. , Springer, Boston, MA. (2006).</li>
<li>Otsu, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold+selection+method+from+gray-level+histogram%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+System+Man+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">Threshold selection method from gray-level histogram.</a> IEEE Transactions on System Man Cybernetics. 9, 62-66 (1979).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Jakobs, S., Stephan, T., Ilgen, P., Brüser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+of+mitochondria+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Light microscopy of mitochondria at the nanoscale.</a> Annual Review of Biophysics. 49, 289-308 (2020).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Mitochondria to organelle o dużej zdolności przebudowy. Ich zawartość, gęstość i dystrybucja mogą być szybko modyfikowane poprzez aktywację mechanizmów fuzji i rozszczepienia mitochondriów, znanych jako dynamika mitochondriów1, oraz równowagę między mechanizmami obrotu mitochondrialnego: biogenezą mitochondriów i wyspecjalizowanym szlakiem degradacji mitochondriów, mitofagią21,22. Zawartość i morfologia mitochondriów może się różnić w zależności od typu komórki i etapu rozwoju oraz może być przebudowywana pod wpływem różnych bodźców fizjologicznych i patologicznych 17,22,23,24. Dlatego badania nad morfologią mitochondriów są istotne od ponad pół wieku25. Warto zauważyć, że analiza mitochondriów za pomocą mikroskopii elektronowej była standardową techniką stosowaną w wielu badaniach26.
Badania fluorescencyjne za pomocą mikroskopii konfokalnej zyskały na znaczeniu w ciągu ostatnich kilku lat ze względu na ich zdolność do obrazowania żywych komórek mitochondriów na różnych głębokościach włókien, co może pomóc w lepszym zrozumieniu roli mitochondriów w mięśniach szkieletowych w różnych warunkach adaptacyjnych i nieadaptacyjnych27. W pracy opisano metodologię analizy gęstości i rozmieszczenia mitochondriów we żywych włóknach mięśni szkieletowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Jednym z głównych wyzwań związanych z pracą z żywymi włóknami mięśni szkieletowych jest uniknięcie skurczu w wyniku procesów izolacji aż do mitochondrialnego zapisu konfokalnego. Aby osiągnąć ten cel, stosuje się roztwór Relax17 o wysokiej zawartości Mg i ATP, aby utrzymać włókna w stanie zrelaksowanym przez co najmniej 2 godziny, co daje wystarczająco dużo czasu na przeprowadzenie procesu izolacji włókien, obciążenia fluoroforem i uzyskania sygnału mitochondrialnego za pomocą mikroskopii konfokalnej. Krytycznym punktem protokołu jest mechaniczne pozyskiwanie włókien, ponieważ wymaga to dużej precyzji i świeżej tkanki; Możliwe jest jednak uzyskanie żywotnych wiązek włókien z mięśni szczura za pomocą tej wcześniej stosowanej i opisanej techniki28. Uzyskanie nienaruszonych włókien pozwala na zachowanie sarkolemmy i środowiska wewnątrzkomórkowego, przy zachowaniu metabolicznego i funkcjonalnego przesłuchu między strukturami komórkowymi28,29.
W przeciwieństwie do pracy z tkankami lub komórkami stałymi, akwizycja obrazów fluorescencyjnych obrazowania żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym wpływu różnych warunków eksperymentalnych. Obecny protokół może być wykorzystany do badania zmian w gęstości i dystrybucji mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz do badania różnic między grupami eksperymentalnymi, takich jak przedstawione tutaj przykłady między włóknami pochodzącymi z chudego i ob (ryc. 3 i ryc. 4). Należy zawsze brać pod uwagę, że obrazowanie żywych komórek oznacza standaryzację optymalnych warunków pracy przy niewielkim uszkodzeniu komórek. Czas pracy, jakość stosowanych roztworów, parametry akwizycji i naświetlanie laserów muszą być precyzyjnie kontrolowane. W związku z tym poniżej wymieniono podstawowe kwestie.
Mitochondria włókien mięśniowych nie mogą być zarejestrowane całkowicie podłużnie za pomocą mikroskopii konfokalnej ze względu na rozmiar włókna i uszkodzenia włókna, które mogą być spowodowane długą ekspozycją na laser. Niemniej jednak reprezentatywna próbka włókna jest rejestrowana w tej technice. Chociaż możliwe jest zarejestrowanie całej grubości włókna mięśni szkieletowych szczura za pomocą mikroskopii konfokalnej, oznacza to dłuższy czas rejestracji i ekspozycję na wiązkę laserową. W przypadku szczurów kontrolnych nie napotkano problemów z tymi nagraniami. Jednak włókna pochodzące ze stanów patologicznych mogą być bardziej podatne na uszkodzenia, co zaobserwowano we włóknach od szczurów Ob. W związku z tym preferowane jest uzyskanie stosu reprezentatywnych obrazów konfokalnych uzyskanych w różnych odległościach Z. Gdy rejestrowany jest tylko odcinek grubości włókna, zaleca się pobranie stosu na tej samej głębokości na wszystkich badanych włóknach, ponieważ rozmieszczenie i gęstość mitochondriów mogą się różnić w zależności od ich położenia we włóknie. Rejestracja sygnału na głębokości powyżej 15 μm jest zalecana w celu uzyskania reprezentatywnych obrazów konfokalnych IMF, unikając populacji SSM, które znajdują się blisko peryferii.
Podczas akwizycji konfokalnej należy wziąć pod uwagę kilka ważnych kwestii. Po pierwsze, wybór soczewki obiektywu immersyjnego z uwzględnieniem powiększenia, wysokiego NA i ośrodka immersyjnego. Ponieważ komórki są utrzymywane w hydrofilowym podłożu inkubacyjnym, współczynnik załamania światła pożywki inkubacyjnej i zanurzeniowej musi być podobny, aby uzyskać dobry sygnał i zeskanować w głąb tkanki. Zwykle osiąga się to za pomocą soczewki obiektywowej zanurzonej w wodzie. Obrazy konfokalne z rysunku 3 i rysunku 4 zostały wykonane za pomocą obiektywu zanurzonego w wodzie 20x, 0,7 NA. Obiektyw ten pozwala na rejestrację światłowodu na całej jego głębokości, ale zdecydowano się na skanowanie przy 15, 18 i 21 μm, ponieważ reprezentatywne obrazy konfokalne IMF można uzyskać przy sygnale o wysokiej intensywności fluorescencji i niewielkim uszkodzeniu światłowodu. Inne powiększenia, takie jak 40x i olej jako medium immersyjne, mogą być brane pod uwagę, ale muszą zostać ocenione.
Po drugie, rozmiar piksela do akwizycji obrazu jest obliczany zgodnie z twierdzeniem Nyquista, które pozwala na wybór odpowiedniego rozmiaru piksela, który pozwala uniknąć nadpróbkowania (wyższa ekspozycja lasera) i niedopróbkowania (prowadzi do mniejszej rozdzielczości)30. Obliczenia zależą od charakterystyki wybranej soczewki obiektywu i długości fali (~90 nm). Można go regulować za pomocą zoomu; Dlatego tylko jedno ustawienie powiększenia zapewnia optymalny rozmiar piksela30. Niemniej jednak w praktyce powiększenie zależy również od obszaru analizowanej próbki. W ten sposób znalezienie równowagi umożliwia pracę z rozmiarem piksela, który jest najbliższy kryterium Nyquista i który pasuje również do analizowanego obszaru. Rysunek 3 i Rysunek 4 zostały pozyskane z rozmiarem piksela 150 i 190 nm, co pozwoliło na analizę pełnej szerokości światłowodu, która wynosi ~50-80 μm.
Po trzecie, należy zastosować odpowiednią średnicę otworu, która zapobiega przedostawaniu się nieostrego światła do detektora. Zazwyczaj 1 Airy jest uważany za optymalny rozmiar otworka, ponieważ pozwala na wykrycie ~80% fotonów pochodzących z płaszczyzny ostrości30. Niemniej jednak niektóre barwione próbki biologiczne, które wykazują niski poziom fluorescencji, wymagają zwiększenia otworu30. Obrazy konfokalne z Rysunku 3 i Rysunku 4 zostały uzyskane z otworkiem o rozmiarze 3 Airy ze względu na słaby sygnał uchwycony za pomocą dolnego Airy. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że wzrost intensywności sygnału wynikający ze zwiększenia rozmiaru otworka prowadzi do zmniejszenia rozdzielczości z powodu zwiększonego nieostrego przechwyconego światła. Z tego powodu zalecamy użycie otworka o rozmiarze jak najbardziej zbliżonym do 1 airy.
Po odpowiednim pozyskaniu obrazy konfokalne mogą być przetwarzane w celu uzyskania ilościowych informacji na temat gęstości i rozmieszczenia mitochondriów. Niezależnie od tego, przed analizą należy wykonać krytyczny etap przetwarzania obrazu progowania, aby poprawić kwantyfikację sygnału. Podczas tego kluczowego kroku określana jest wartość intensywności fluorescencji, która oddziela dodatnie piksele mitochondriów od pikseli tła. Próg można zdefiniować za pomocą dopasowania Gaussa piku reprezentującego mitochondria, gdy histogram obrazu wyświetla dwa szczyty, jeden odpowiadający tłu, a drugi mitochondriom. Jednak rozkład bimodalny nie zawsze jest osiągany na każdym z obrazów, dlatego konieczne jest zastosowanie innych metod progowania.
W tym protokole opisano implementację progowania Otsu, które jest nieparametryczną i nienadzorowaną metodą przeznaczoną do znajdowania wartości progowej, gdy dwa piki nie są oddzielone lub występują inne piki31. Otsu można łatwo zastosować za pomocą platformy open source do analizy obrazów biologicznych; Można jednak przetestować inne metody progowania. Ta sama metoda progowania musi być zastosowana do wszystkich obrazów konfokalnych i musi być obliczana niezależnie dla każdego obrazu konfokalnego. Zastosowanie progu do całego stosu prowadzi do nieprawidłowych wyników. Po uzyskaniu obrazów binarnych po procesie progowania, analizę gęstości mitochondriów i FFT można łatwo przeprowadzić, postępując zgodnie z instrukcjami opisanymi w tym protokole. Należy jednak zachować ostrożność podczas wykonywania obu analiz, aby uniknąć uwzględnienia jąder i naczyń włosowatych, ponieważ prowadziłoby to do błędów ilościowych. Jeśli chodzi o gęstość, wystarczy odjąć piksele, czyli obszar zajmowany przez jądra lub naczynia włosowate, od pikseli lub całkowitej powierzchni, która ma być analizowana. Ponadto podczas wykonywania analizy FFT należy sprawdzić, czy sygnał mitochondriów jest prosty. I odwrotnie, gdy sygnał mitochondriów jest nachylony, może wytwarzać profile, które nie reprezentują podłużnego rozkładu mitochondriów, dając nieprawidłowe dane dotyczące widma FFT. Ponadto można zastosować etap przetwarzania wstępnego w celu zmniejszenia szumów na obrazach. W tym protokole opisano dwa opcjonalne kroki przetwarzania wstępnego przy użyciu filtru mediany i dekonwolucji 2D. Wpływ tych metod wstępnego przetwarzania na obraz i zawartość gęstości mitochondriów przedstawiono na rysunku uzupełniającym S1. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że chociaż te wstępne procesy mogą poprawić jakość obrazu, mogą również spowodować utratę niektórych szczegółów obrazu. Dlatego należy ich używać z ostrożnością i konsekwentnie stosować do wszystkich analizowanych obrazów.
Pomimo swoich zalet, mikroskopia konfokalna jest ograniczona rozdzielczością boczną (XY) 180-250 nm, gdy spełnione są optymalne warunki do akwizycji32. Średnica mitochondriów wynosi ~ 200-700 nm, blisko granicy dyfrakcji mikroskopii konfokalnej; w związku z tym struktury submitochondrialne nie mogą być odpowiednio wykryte33 i nie mogą być oceniane za pomocą analiz gęstości i FFT przedstawionych w tym protokole. Inne techniki mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, takie jak stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM), nanoskopia ze zmuszonym zubożeniem emisji (STED) lub mikroskopia oświetlenia strukturalnego (SIM), mogą być badane w celu rozwiązania struktur submitochondrialnych32. W tym protokole obrazy konfokalne mitochondriów uzyskuje się za pomocą fluoroforu TMRE, który zależy od potencjału błony mitochondrialnej. Dlatego intensywność fluorescencji mitochondriów może się różnić w zależności od ich potencjału błonowego. Przed analizą danych wykonywany jest proces progowania, aby przezwyciężyć ten problem. Wszystkie piksele powyżej zdefiniowanego progu są uważane za dodatnie dla sygnału mitochondrialnego, niezależnie od ich wartości fluorescencji. Niemniej jednak należy zauważyć, że mitochondria o bardzo niskim potencjale błonowym nie mogą być rozwiązane tą techniką. W związku z tym zaleca się uzupełniające badania ilościowe zawartości białek mitochondrialnych. Zaletą stosowania TMRE jest to, że obrazy konfokalne mogą być również wykorzystywane do analizy potencjału błony mitochondrialnej, ale konieczne jest przeprowadzenie odpowiednich kontroli za pomocą środków rozprzęgających, takich jak p-trifluorometoksyfenylohydrazon karbonylocyjanku (FCCP). Ponadto instrukcje dotyczące analizy gęstości i dystrybucji mitochondriów można uzyskać za pomocą zielonych wskaźników fluorescencyjnych dla mitochondriów, które obciążają mitochondria niezależnie od ich potencjału błonowego, ale strategia inkubacji i ustawienia akwizycji konfokalnej muszą być ustandaryzowane.
Biorąc pod uwagę, że struktura mitochondriów jest związana z podstawowymi funkcjami mitochondrialnymi i komórkowymi, opisany tutaj protokół może dostarczyć cennych informacji na temat ich przebudowy podczas choroby lub przez szczególne znieważenie stresowe. Może to przyczynić się do lepszego zrozumienia kluczowych funkcji mięśni szkieletowych zarządzanych przez mitochondria, takich jak produkcja energii, lub w których mitochondria odgrywają ważną rolę w interakcji z innymi organellami, takimi jak sprzężenie skurczu i metabolizmu. Postępowanie zgodnie z instrukcjami protokołu pozwala na oszacowanie gęstości i rozmieszczenia mitochondriów w żywych mięśniach szkieletowych. Etapy protokołu są podzielone na trzy główne etapy skoncentrowane na rozwarstwieniu pęczka mięśni szkieletowych, skanowaniu mikroskopią konfokalną i analizie obrazu, gdzie zawarte są szczegółowe instrukcje i ważne kwestie. Warto zauważyć, że protokół można dodatkowo zoptymalizować, aby zbadać dodatkowe kroki Z w celu pełnej rekonstrukcji mitochondriów w obrębie włókna zgodnie z potrzebami użytkownika. Na przykład można przetestować obrazy konfokalne i etapy analizy w celu zbadania struktur komórkowych o podobnym rozmieszczeniu, takich jak TT w żywych i stałych próbkach.

Mitochondria tworzą wysoce dynamiczne sieci, które są głównie regulowane przez równowagę między jego wydłużeniem (fuzją) a fragmentacją (rozszczepieniem)1,2, które są modulowane przez ekspresję i aktywność białek, takich jak Mitofusin 1 i 2 (Mfn1 i Mfn2) oraz Atrofia Białka Wzrokowego 1 (Opa1), które regulują fuzję zewnętrznej błony mitochondrialnej i wewnętrznej błony, odpowiednio1,2. Białko związane z dynaminą (Drp1) głównie reguluje rozszczepienie mitochondriów, gdy jest fosforylowane w klasie Ser616<sup="xref">3.
W mięśniach szkieletowych dobrze ustalono, że sieć mitochondrialna jest ułożona w strukturalnie dobrze zdefiniowane subpopulacje na podstawie ich bliskości do różnych regionów komórek (miofibryli, sarkolemma i jądra)4,5. Mitochondria znajdujące się tuż pod sarkolemmą nazywane są mitochondriami subsarkolemmalnymi (SSM), te znajdujące się między włóknami kurczliwymi nazywane są mitochondriami międzymiofibrylarnymi (IMF), a subpopulacja mitochondriów wokół jąder nazywana jest mitochondriami okołojądrowymi (PMN). Co więcej, zasugerowano, że te subpopulacje mitochondrialne mają funkcje specyficzne dla regionu i są wyspecjalizowane metabolicznie4,5.
Utrzymanie homeostazy energii komórkowej, która umożliwia funkcje metaboliczne i kurczliwe, zależy w dużej mierze od interakcji i komunikacji w określonych miejscach poprzez sieć mitochondrialną (np. interakcja IMF i SSM)4,6. Oprócz interakcji sieci mitochondriów, mitochondrium może również wchodzić w interakcje z innymi organellami, tworząc kompleksy strukturalne i funkcjonalne. W związku z tym wykazano, że IMF może znajdować się w sąsiedztwie retikulum sarkoplazmatycznego (SR) i w pobliżu jednostek uwalniających Ca2+ (CRU), utworzonych przez kanaliki poprzeczne (TT)7. Fakt ten jest istotny ze względu na rolę mitochondrialnego wychwytuCa2+ w regulacji syntezy ATP i apoptozy. Ostatnio zasugerowano również potencjalną rolę w regulacji cytozolowych stanów przejściowych Ca2+ 8.
TT to wgłębienia sarcolemmy, które mają okresowy rozkład wzdłuż osi podłużnej kardiomiocytów i włókien mięśni szkieletowych9,10, podobnie jak w dystrybucji IMF5. Zmiany w dystrybucji TT mają ważne implikacje fizjologiczne, biorąc pod uwagę ich rolę w funkcji skurczowej. Jednak zmiany te oceniano głównie w kardiomiocytach. Analiza szybkiej transformaty Fouriera (FFT) umożliwia konwersję sygnałów okresowych z dziedziny odległości do dziedziny częstotliwości, w wyniku czego uzyskuje się widmo FFT, które wskazuje częstotliwość i regularność sygnału11,12,13. Chociaż istnieją dowody na to, że organizacja sieci mitochondrialnej we włóknach mięśni szkieletowych jest niezbędna do adaptacji do różnych warunków metabolicznych, takich jak podczas regeneracji po urazie mięśni14,15, większość analiz jest wykonywana jakościowo.
Dodatkowo, biorąc pod uwagę, że dysfunkcja mitochondriów została powiązana z kilkoma chorobami związanymi z mięśniami szkieletowymi (np. zanik przy użyciu alkoholu)2 i chorobami niezwiązanymi z mięśniami, szczególnie chorobami metabolicznymi i związaną z tym utratą masy mięśniowej (tj. atrofią)16, ilościowa ocena sieci mitochondrialnej i rozmieszczenia w mięśniach szkieletowych nabiera znaczenia. Ostatnio zaobserwowano istotną różnicę w podłużnym rozmieszczeniu mitochondriów włókien mięśniowych brzuchatego łydki między grupą otyłych (Ob; Szczury Zucker fa/fa) i grupa lean (Lean; Zucker +/+ szczury) został zidentyfikowany przez FFT17. Badanie to wykazało przydatność FFT w analizie dystrybucji mitochondrialnej. W związku z tym w protokole przedstawiono metodologię badania mitochondriów w żywych włóknach mięśni szkieletowych na podstawie obrazów uzyskanych za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej. Gęstość mitochondriów określa się ilościowo za pomocą progowania tła, a także opisano analizę podłużnego rozkładu mitochondriów za pomocą analizy FFT. Schemat przepływu pracy jest przedstawiony w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>Hydrat soli disodowej adenozyno-5'-trifosforanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6419</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe ze szkła borokrzemianowego</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0709</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Oprogramowanie do</td> mikroskopu konfokalnego Leica <td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Pakiet aplikacji Leica&nbsp;</td><td>Leica</td><td>2.7.3.9723</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokinaza kreatynowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>DeconvolutionLab2 (DeconvolutionLab_2.jar)</td><td>Biomedical Imaging Group, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/deconvolution/deconvolutionlab2/</td><td></td></tr> <tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DL-Asparaginowy kwas potasowy półwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11240</td><td></td></tr><tr><td>Glikol-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N&ostry glikol etylenowy; Kwas N&aostry-tetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Miltex</td><td>MH-18</td><td></td></tr><tr><td>HC PL APO 20x/ 0,7 IMM obiektyw&nbsp;</td><td>Leica</td><td>506517</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do przysłony</td><td>Miltex</td><td>5-304</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-(-)-jabłkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7397</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli monosodowej kwasu L-glutaminowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Maxchelator</td><td>UC Davis Health</td><td>https://somapp.ucdmc.ucdavis.edu/pharmacology/bers/maxchelator/downloads.htm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Miltex</td><td>18-1633</td><td></td></tr><tr><td>Platforma open-source do biologicznej analizy obrazu Fidżi&nbsp;</td><td>Publiczne, utrzymywane przez grupę Eliceiri/LOSI, grupę Jug i laboratorium Tomancak. Fidżi</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td></tr> <tr><td>Fosfokreatyna sól disodowa hydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Generator PSF (PSF_Generator.jar)</td><td>Grupa Obrazowania Biomedycznego, EPFL</td><td>http://bigwww.epfl.ch/algorithms/psfgenerator/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Komora nagraniowa</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27N</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Arkusz kalkulacyjny Microsoft Excel</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 508</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametylorodamina, ester etylowy</td><td>Invitrogen</td><td>T669</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza gęstości mitochondrialnej i rozmieszczenia podłużnego we włóknach mięśni szkieletowych żywych szczurów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Analysis of the Mitochondrial Density and Longitudinal Distribution in Rat Live-Skeletal Muscle Fibers by Confocal Microscopy

Mitochondrium to organella, która może być wydłużana, fragmentowana i odnawiana zgodnie z wymaganiami metabolicznymi komórek. Przebudowa sieci mitochondrialnej pozwala zdrowym mitochondriom sprostać wymaganiom komórkowym; Jednak utrata tej zdolności jest związana z rozwojem lub postępem różnych patologii. W mięśniach szkieletowych zmiany gęstości i rozmieszczenia mitochondriów obserwuje się między innymi w stanach fizjologicznych i patologicznych, takich jak ćwiczenia, starzenie się i otyłość. Dlatego badanie sieci mitochondrialnej może zapewnić lepsze zrozumienie mechanizmów związanych z tymi warunkami.
Tutaj opisany jest protokół obrazowania mitochondriów żywych włókien mięśni szkieletowych od szczurów. Włókna są ręcznie preparowane w roztworze relaksującym i inkubowane za pomocą fluorescencyjnego wskaźnika obrazowania żywych komórek mitochondriów (ester etylowy tetrametylorodaminy, TMRE). Sygnał mitochondriów jest rejestrowany za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu trybu skanowania XYZ w celu uzyskania obrazów konfokalnych sieci mitochondrialnej międzymiofibrylarnej (IMF). Następnie obrazy konfokalne są przetwarzane przez progowanie i binaryzację. Binaryzowany obraz konfokalny uwzględnia dodatnie piksele mitochondriów, które są następnie zliczane w celu uzyskania gęstości mitochondrialnej. Sieć mitochondrialna w mięśniach szkieletowych charakteryzuje się dużą gęstością populacji IMF, która ma okresowy rozkład podłużny podobny do T-kanalików (TT). Szybka transformata Fouriera (FFT) to standardowa technika analizy wykonywana w celu oceny rozkładu TT, która pozwala znaleźć częstotliwość dystrybucji i poziom ich organizacji. W niniejszym protokole opisano implementację algorytmu FFT do analizy podłużnego rozmieszczenia mitochondriów w mięśniach szkieletowych.

Zastosowanie niniejszego protokołu umożliwia analizę gęstości i rozkładu mitochondriów w żywej tkance mięśni szkieletowych. Protokół podzielono na trzy główne etapy: wypreparowanie pęczków mięśni szkieletowych, skanowanie za pomocą mikroskopii konfokalnej oraz analizę obrazu. Przegląd schematu postępowania przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2A przedstawia cały mięsień brzuchaty łydki szczura w szalce Petriego, z zaznaczoną głową boczną, z której pobierane są włókna, natomiast Rysunek 2B przedstawia pęczki włókien w roztworze Relax. Dzięki mikroskopii konfokalnej można rejestrować mitochondria wzdłuż głębokości żywego włókna mięśnia szkieletowego przy użyciu wskaźnika fluorescencyjnego TMRE. TMRE jest lipofilnym kationowym fluorophorem, który selektywnie gromadzi się w mitochondriach w zależności od potencjału błony mitochondrialnej20.
Optymalny obraz konfokalny IMF można uzyskać, wybierając odległość Z powyżej 15 µm głębokości wewnątrz włókna (Rysunek 3A). Rysunek 3B przedstawia reprezentatywne obrazy konfokalne XY mitochondriów obciążonych TMRE, pozyskane wzdłuż odległości Z włókien mięśnia brzuchatego (od 15 do 21 µm). Obrazy konfokalne poddano procesowi progowania (thresholding), aby przekształcić je w obrazy binarne umożliwiające analizę mitochondriów. Rysunek 3B (lewy panel) pokazuje włókno od szczura szczupłego (Lean) po wysiłku. Przedstawia ono spodziewany zapis konfokalny mitochondriów włókna mięśnia szkieletowego, ponieważ wykazuje spójny wzorzec wzdłuż włókna. W przeciwieństwie do tego, wybrano włókno od szczura otyłego (Ob) (Rysunek 3B, prawy panel), które wykazuje znaczne zmiany w zawartości i rozkładzie mitochondriów. Rysunek 3C przedstawia ilościowe określenie powierzchni włókna zajętej przez mitochondria, wyrażone jako gęstość mitochondrialna, uzyskane z każdego zbinaryzowanego obrazu (pokazanego na panelu B). Zgodnie z oczekiwaniami, włókno Ob wykazało niższą gęstość mitochondrialną. Została ona określona w sposób spójny wzdłuż analizowanej odległości Z, co jest również widoczne na Rysunku 3D, gdy gęstość mitochondrialna jest obliczana dla stosu składającego się z trzech obrazów konfokalnych pozyskanych przy 15, 18 i 21 µm.
Podobnie jak w przypadku analizy gęstości mitochondriów, konfokalne skanowanie wskaźnika fluorescencyjnego do obrazowania żywych komórek, takiego jak TMRE, pozwala na badanie organizacji podłużnej mitochondriów w żywej tkance mięśni szkieletowych. IMF wykazuje okresową organizację w prążku I w pobliżu TT7, które można analizować za pomocą FFT w celu określenia częstotliwości sygnału mitochondrialnego oraz stopnia organizacji17. Rysunek 4 przedstawia różnice w organizacji IMF występujących w mięśniu brzuchatym szczurów chudych (Lean) oraz otyłych (Ob) oraz pokazuje, w jaki sposób FFT pozwala na wykrycie zmian w rozkładzie sygnału mitochondrialnego. Rycina 4A,B przedstawiono podłużne obszary zainteresowania (ROI), wybrane w centralnej i bocznej części włókna w celu przeprowadzenia analizy FFT. Przed wykonaniem FFT obliczana jest wartość progu dla odjęcia tła. Następnie obraz jest binaryzowany; procedury te eliminują różnice w poziomach intensywności fluorescencji sygnału mitochondrialnego. Obraz binarny dostarcza profilu rozkładu fluorescencji niezbędnego do przeprowadzenia analizy FFT.
Rysunek 4C, D przedstawia wybrane obszary zainteresowania (ROI) w panelach A i B wraz z ich profilami wykresów (panele górne). Z profili wykresów można zauważyć różnice w rozkładzie fluorescencji pomiędzy włóknami pochodzącymi od szczurów szczupłych (Lean) i otyłych (Ob), a także różnice między poszczególnymi ROI w obrębie tego samego włókna. Dla każdego profilu wykresu przedstawiono odpowiadające mu widmo FFT (panele dolne). Szczyt maksymalnego widma FFT wskazuje częstotliwość FFT (oś X) rozkładu sygnału mitochondrialnego wzdłuż osi podłużnej. Może on zostać przekształcony w wartość odległości bliską 2 µm w bocznych i centralnych ROI u szczura szczupłego. Co istotne, amplituda szczytu FFT jest wskaźnikiem regularności sygnału mitochondrialnego, a zmiany tej amplitudy ujawniają zaburzenia w rozkładzie mitochondriów.
Rysunek 4E,F przedstawiają różnice w widmie FFT pomiędzy włóknami typu Lean i Ob-derived, w których przeanalizowano odpowiednio boczne i centralne ROI. W bocznych ROI (Rysunek 4E) częstotliwość podłużnego rozkładu mitochondriów była podobna w włóknach lean i Ob-derived; niemniej jednak amplituda maksymalnego piku FFT w włóknach Ob-derived była wyższa, co zgadza się z większą regularnością sygnału zaobserwowaną na obrazie na Rysunku 4B. Natomiast w przypadku centralnego ROI (Rysunek 4F) w grupie Ob obserwuje się przykład krytycznej redukcji piku FFT w porównaniu z grupą Lean, gdy występuje istotna zmiana w rozkładzie mitochondriów.
<img alt="Schemat preparatyki włókien mięśnia brzuchatego łydki, mikroskopii konfokalnej, przetwarzania obrazu i analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat analizy mitochondriów w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ten schemat podsumowuje główne etapy protokołu w trzech oddzielnych fazach. Pierwsza faza, wycinek pęczków włókien mięśnia brzuchatego łydki, jest podzielona na trzy kolejne kroki: izolację mięśnia brzuchatego łydki, a następnie mechaniczną dyssekcję mięśnia na pęczki, aby w końcowej fazie dokonać wizualnego wyboru tych żywotnych. Druga faza obejmuje obrazowanie żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej, co składa się z inkubacji z fluoroforem (TMRE) przez 20 min w temperaturze pokojowej oraz umieszczenia włókien w komorze. Następnie w mikroskopie ustawia się odpowiednie parametry w celu wykonania akwizycji obrazów konfokalnych. W trzeciej fazie przeprowadzane jest przetwarzanie obrazów konfokalnych i analiza danych. Proces rozpoczyna się od przetwarzania obrazu, gdzie wymagane jest ustalenie progu (threshold) w celu wygenerowania obrazów binarnych, na podstawie których obliczana jest gęstość mitochondriów oraz ich rozkład za pomocą FFT. Skróty: TMRE = tetrametylorodaminy ester etylowy; FFT = szybka transformata Fouriera. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig01largev2.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Eksperyment kriokonserwacji: plaster tkanki w szalce Petriego. Badanie metod konserwacji i integralności." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Disekcja pęczka mięśnia szkieletowego. (A) Wypreparowana boczna głowa mięśnia brzuchatego szczura (czarna strzałka) w szalce Petriego z roztworem Relax. (B) Reprezentatywny obraz pęczków włókien mięśnia brzuchatego w roztworze Relax przed obciążeniem TMRE. Skrót: TMRE = tetrametylo-rhodaminy ester etylowy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat i wykresy analizy gęstości mitochondriów; przekroje poprzeczne włókien mięśniowych, badanie grupy LEAN vs Ob (otyłość)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analiza gęstości mitochondriów. (A) Ilustracja przedstawiająca zalecaną odległość Z dla skanowania konfokalnego mitochondriów IMF w włóknach mięśni szkieletowych. (B) Seria obrazów konfokalnych mitochondriów obciążonych TMRE we włóknach mięśni szkieletowych, uzyskanych od szczura Zucker +/+ poddanego ćwiczeniom (Lean) oraz od otyłego szczura Zucker fa/fa (Ob), zarejestrowanych w odległości Z (od 15 do 21 µm głębokości). Obrazy zostały przetworzone poprzez progowanie i przekształcone w obrazy binarne. (C) Obliczona gęstość mito- w przekrojach konfokalnych uzyskanych w różnych odległościach Z przedstawionych na panelu B. (D) Gęstość mito- uzyskana ze stosu obrazów przedstawionych na panelu B. Obrazy na panelu B mają wymiary 65 x 50 µm. Pasek skali = 10 µm. Skróty: Mito-density = gęstość mitochondriów; IMF = mitochondria międzymiofibrylarne; Ob = otyły; SSM = mitochondria podsarcolemmalne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schematy mikroskopowe próbek szczupłych i otyłych z fluorescencją, analiza FFT w celu badania strukturalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65306/65306fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analiza rozmieszczenia mitochondriów za pomocą FFT. Reprezentatywne obrazy konfokalne mitochondriów obciążonych fluorescencyjnym wskaźnikiem TMRE, uzyskane z głębokości 21 µm włókien mięśni szkieletowych pobranych od ćwiczącego szczura Zucker +/+ (szczupły, panel A) oraz od otyłego szczura Zucker fa/fa (Ob, panel B). Obrazy poddano procesowi progowania i przekształcono w obrazy binarne. Boczne i centralne obszary ROI z panelu A (panel C) i panelu B (panel D) wraz z ich odpowiednimi profilami wykresów intensywności fluorescencji (wykres górny) i widmem FFT (wykres dolny). FFT obliczono z obszarów ROI o szerokości 256 pikseli, co odpowiada rozmiarowi ROI 39 x 5 µm w panelu A oraz rozmiarowi ROI 50 x 5 µm w panelu B. Panel E przedstawia różnice w widmie FFT stwierdzone pomiędzy mitochondriami pochodzącymi od szczurów szczupłych i otyłych w bocznym obszarze ROI, natomiast panel F pokazuje różnice w widmie FFT dla centralnego obszaru ROI. Pasek skali = 10 µm. Skróty: A.U. = jednostki arbitralne; FFT = szybka transformata Fouriera; ROIs = obszary zainteresowania; Ob = otyły. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/65306fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Odczynnik</td>
			<td>Stężenie końcowe w 100 ml</td>
			<td>Roztwór macierzysty </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-asparaginian</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>20 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>20 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas L-glutaminowy</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas jabłkowy</td>
			<td>3 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl₂2</td>
			<td>1 mM wolnego Mg2+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl22</td>
			<td>0,00002 mM wolnego Ca2+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fosfokreatyna di-Na</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>500 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinaza kreatynowa</td>
			<td>5 U/ml</td>
			<td>200 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgATP</td>
			<td>5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH 7,3 (za pomocą NaOH)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Odczynniki i stężenia roztworu relaksacyjnego.
Rycina dodatkowa S1: Wpływ metod wstępnego przetwarzania obrazu. (A) Reprezentatywne obrazy konfokalne mitochondriów obciążonych fluorescencyjnym wskaźnikiem TMRE, pozyskane z głębokości 18 µm w włóknach mięśni szkieletowych szczura Zucker +/+ po ćwiczeniach (szczupły, górny panel) oraz z otyłego szczura Zucker fa/fa (dolny panel), wraz z odpowiednimi obrazami uzyskanymi po wstępnym przetwarzaniu z zastosowaniem progowania metodą Otsu, filtra medianowego i progowania metodą Otsu, oraz dekonwolucji 2D i progowania metodą Otsu. (B) Wykres profilu gęstości mitochondriów uzyskany z obrazów konfokalnych (panel A) po wstępnym przetwarzaniu różnymi metodami. Obrazy w panelu A mają wymiary 65 x 50 µm. Pasek skali = 10 µm. Skróty: 2D-Decon = dekonwolucja 2D; Mito-density = gęstość mitochondriów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65306/Supl%201-rev4.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do analizy zmian w gęstości mitochondriów i dystrybucji podłużnej za pomocą obrazowania mięśni szkieletowych na żywo przy użyciu mikroskopii konfokalnej do skanowania sieci mitochondrialnej.

Analiza gęstości mitochondrialnej i rozmieszczenia podłużnego we włóknach mięśni szkieletowych żywych szczurów za pomocą mikroskopii konfokalnej

The mitochondrion is an organelle that can be elongated, fragmented, and renovated according to the metabolic requirements of the cells. The remodeling of ...

Przebudowa sieci mitochondrialnej zachodzi w warunkach stresu fizjologicznego i patologicznego. Jednak skutki przebudowy mitochondriów w mięśniach szkieletowych pozostają nie w pełni poznane. Protokół ten umożliwia ilościowe określenie kolistych zmian mitochondriów w żywych mięśniach szkieletowych, zwiększając nasze zrozumienie wzajemnych zależności między zmianami mitochondrialnymi a funkcją komórkową.Praca z żywymi mięśniami szkieletowymi stanowi wyzwanie ze względu na kurczenie się włókien podczas izolacji i wrażliwość na obraz podczas skanowania konfokalnego. Protokół ten opisuje proces izolacji przy użyciu roztworu relaksacyjnego, umożliwiający analizę żywotnych włókien mięśniowych do oceny mitochondriów za pomocą mikroskopii konfokalnej. Nasz protokół rozwiązuje problem braku przepływów pracy do ilościowej analizy sieci mitochondrialnych we włóknach mięśni szkieletowych.Opisane tutaj kroki pozwalają użytkownikom na lepsze wykorzystanie obrazów uzyskanych za pomocą mikroskopii konfokalnej, przetwarzania obrazu przez progowanie i szybką analizę Fouriera w celu uzyskania kwantyfikacji gęstości i rozmieszczenia mitochondriów. Jesteśmy zainteresowani badaniem zmian w mięśniach szkieletowych, w szczególności dynamiki mitochondriów i przebudowy strukturalnej mitochondriów podczas przeciwności losu oraz tego, jak można je modulować do interwencji, takich jak ćwiczenia i przerywany post. Zacznij od przeniesienia wyciętej tylnej kończyny szczura na 60-mililitrową szalkę Petriego zawierającą trzy mililitry lodowatego roztworu relaksacyjnego.Następnie ostrożnie unieś ścięgno Achillesa za pomocą kleszczy. Za pomocą nożyczek do tęczówki wypreparuj mięśnie z dala od kości. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego zidentyfikuj i oddziel cały mięsień brzuchaty łydki.Za pomocą kleszczy z cienką końcówką przenieś boczną głowę mięśnia na nową szalkę Petriego z lodowatym roztworem relaksacyjnym. Delikatnie przytrzymaj mięsień kleszczami na jednym końcu i podziel mięsień na pęczki za pomocą mikronożyczek. Na koniec przenieś wiązki włókien na nową szalkę Petriego zawierającą dwa mililitry lodowatego roztworu relaksacyjnego.Zacznij od inkubacji włókien mięśni szkieletowych szczura za pomocą TMRE w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie uruchom standardowe oprogramowanie mikroskopu konfokalnego i wybierz strukturę konfiguracji. W oknie dialogowym konfiguracji sprzętu wybierz laser i zaznacz opcję hel neon 543.Uzyskaj dostęp do okna dialogowego pobierania za pośrednictwem struktury pobierania i wybierz panel XYZ. Następnie wybierz format 512 na 512 z prędkością 400 Hz. Pod wyświetlonym panelem otworkowym wybierz dowolne jednostki i wprowadź trzy przewiewne dla otworka.W oknie dialogowym ustawień ścieżki wiązki wybierz obiektyw z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie z aperturą numeryczną 0,7 i oknem długości fali emisji od 576 do 700 nanometrów. Wybierz DD 488/543 i ustaw moc lasera 543 na 15%Po 20-minutowej inkubacji dwukrotnie zmień podłoże inkubacyjne. Następnie przygotuj komorę nagraniową z 0,15-milimetrowym szkiełkiem nakrywkowym ze szkła borokrzemianowego.Przenieś wiązki włókien do komory zawierającej 200 mikrolitrów roztworu relaksacyjnego. Wykorzystaj tryb jasnego pola mikroskopu konfokalnego, aby zidentyfikować żywe włókna do fluorescencyjnego zapisu mitochondriów. Dostosuj wzmocnienie i przesunięcie, skanując fluorescencję za pomocą przycisku na żywo.Wybierz niskie wartości natężenia fluorescencji, aby uzyskać tło składające się z prawie zerowych jednostek arbitralnych i sygnału mitochondrialnego między 100 a 200 dowolnymi jednostkami. Wybierz rozmiar piksela od 150 do 190 nanometrów i dostosuj współczynnik powiększenia w oknie dialogowym XY, aby uzyskać pełną szerokość światłowodu. W oknie dialogowym Z-stack ustaw odległość Z, zaczynając od głębokości włókna od 15 mikrometrów do 22 mikrometrów i wybierz rozmiar kroku Z wynoszący trzy mikrometry.Kliknij przycisk start, aby uzyskać obrazy konfokalne i uzyskać stos Z złożony z trzech obrazów konfokalnych uzyskanych na głębokości 15, 18 i 21 mikrometrów. Konfokalne obrazy ćwiczonego chudego włókna mięśniowego szczura pokazują oczekiwany zapis mitochondriów włókien mięśni szkieletowych ze spójnym wzorem włókien. W przeciwieństwie do tego, włókno mięśniowe otyłego szczura wykazuje znaczne zmiany w zawartości i dystrybucji mitochondriów.Zacznij od uruchomienia oprogramowania do analizy obrazu. Następnie otwórz plik Z-stack i dostosuj orientację, aby umieścić światłowód w poziomie. Wybierz prostokątny obszar zainteresowania lub, ROI, obejmujący obszar mitochondriów.Wybierz rozmiary w zakresie od 65 do 90 mikrometrów w kierunku X i odpowiednie rozmiary w kierunku Y w zależności od szerokości włókna. Kontynuuj duplikowanie stosu Z z wybranym ROI i zapisz go jako nowy stos Z w formacie TIF. Zapisz pozycję ROI z oryginalnego stosu za pomocą narzędzia Menedżer ROI.Otwórz okno dialogowe progu za pomocą polecenia skrótu shift T. Wybierz algorytm progu Otsu i wybierz opcję czarno-białego ciemnego tła. Obserwuj histogram rozkładu intensywności fluorescencji i wartość progową wyświetlaną w oknie dialogowym. Zastosuj próg do stosu obrazów binarnych.Następnie wybierz oblicz próg dla każdego obrazu i utwórz nowy stos w wyświetlonym oknie dialogowym przed kliknięciem OK. Zapisz stos wygenerowany z trzema obrazami binarnymi w formacie TIF. Następnie uzyskaj dostęp do menu analizy i wybierz histogram. W wyświetlonym oknie dialogowym histogramu kliknij przycisk Tak, a następnie w oknie dialogowym histogramu stosu kliknij pozycję Lista, aby uzyskać dane histogramu.Przenieś dane histogramu do arkusza kalkulacyjnego i zidentyfikuj mitopiksele o wartości 255. Oblicz gęstość mitochondrialną, dzieląc mito-piksele przez całkowitą liczbę pikseli i mnożąc przez 100. Błonnik otyłego szczura wykazywał niższą gęstość mitochondrialną.Potwierdziła to analiza obrazu stosu. Zacznij od uruchomienia platformy open-source do analizy obrazów biologicznych. Otwórz stos BinDmito i narysuj prostokątny obszar zainteresowania o szerokości 256 pikseli i wysokości pięciu mikrometrów.Zlokalizuj centralny i boczny zwrot z inwestycji. Uzyskaj profil wykresu ROI za pomocą polecenia skrótu K i przenieś dane do arkusza kalkulacyjnego, wypełniając kolumny B i C.Wypełnij kolumnę D, wybierając drugą komórkę w kolumnie D.Przejdź do menu głównego. Wybierz opcję Wypełnienie i kliknij przycisk Seria.Następnie wybierz kolumny i wprowadź obliczoną częstotliwość próbkowania delta jako wartość kroku, a obliczoną wartość S jako wartość zakończenia. Przejdź do menu danych. Kliknij pozycję Analiza danych i wybierz opcję Analiza Fouriera.Wybierz zakres punktów danych w kolumnie C i odpowiadający mu zakres w kolumnie E.Teraz wypełnij kolumnę F wielkością FFT za pomocą funkcji IMABS, aby zwrócić wartość bezwzględną z liczby zespolonej w E i pomnóż przez dwa przez N w celu normalizacji. Automatyczne wypełnianie kolumny F tą formułą. Wykreślić widmo FFT, używając wielkości w F w funkcji częstotliwości FFT w D aż do S Na koniec znajdź punkt maksymalnego piku i odpowiadającą mu częstotliwość FFT.Profile wykresów wybranych ROI pokazują różnice w rozkładzie fluorescencji między włóknami pochodzącymi od chudych i otyłych szczurów, a także zmienność ROI w obrębie tego samego włókna. W bocznych ROI częstość mitochondrialnego rozkładu podłużnego była podobna we włóknach pochodzących od szczupłych i otyłych szczurów, z wyższą amplitudą we włóknach otyłych szczurów. W przeciwieństwie do tego, centralny zwrot z inwestycji włókna otyłego szczura jest przykładem krytycznego zmniejszenia piku FFT, gdy występuje istotna zmiana dystrybucji mitochondrialnej.

analysis-mitochondrial-density-longitudinal-distribution-rat-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fibroblasty pobrane od pacjentów z mutacjami w genach odpowiedzialnych za chorobę Parkinsona stanowią łatwo dostępny model ex vivo do badania fenotypów związanych z tą chorobą. Obrazowanie żywych komórek daje możliwość analizy parametrów morfologicznych i funkcjonalnych w żywych komórkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy przygotowanie ludzkich fibroblastów oraz późniejsze monitorowanie fenotypów mitochondrialnych.

Wykorzystanie pierwotnych ludzkich fibroblastów do monitorowania fenotypów mitochondrialnych w badaniach nad chorobą Parkinsona

Ten protokół wykorzystuje trójwymiarowe (3D) techniki obrazowania i analizy do wizualizacji i ilościowego określenia mitochondriów specyficznych dla nerwów. Techniki te mają zastosowanie w innych sytuacjach, w których jeden sygnał fluorescencyjny jest używany do odizolowania podzbioru danych od innego sygnału fluorescencyjnego.

Trójwymiarowe obrazowanie i analiza mitochondriów w obrębie śródnaskórkowych włókien nerwowych człowieka

Wizualizacja i analiza mitochondriów z tkanki mózgowej ssaków to trudne zadanie. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób trójwymiarowa (3D) analiza rekonstrukcji z seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBFSEM) może być wykorzystana do uzyskania wglądu w morfologiczną i wolumetryczną analizę tego krytycznego organcelli generującej energię.

Analiza mitochondriów mózgowych z wykorzystaniem seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z obrazowaniem powierzchni bloku (SBF-SEM)

Tutaj prezentujemy protokół do szybkich analiz włókien mięśniowych, który pozwala na poprawę jakości barwienia, a tym samym na automatyczne pozyskiwanie i kwantyfikację populacji włókien za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania ImageJ.

Szybki zautomatyzowany protokół analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny

Zmodyfikowana procedura po utrwaleniu zwiększa kontrast cząsteczek glikogenu w tkance. W tym artykule przedstawiono protokół krok po kroku opisujący, jak obchodzić się z tkanką, przeprowadzać obrazowanie i stosować metody stereologiczne w celu uzyskania bezstronnych i ilościowych danych na temat specyficznej dla typu włókien subkomórkowej dystrybucji glikogenu w mięśniach szkieletowych.

Kwantyfikacja subkomórkowego rozkładu glikogenu we włóknach mięśni szkieletowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Coraz więcej dowodów wskazuje, że nadmierna infiltracja lipidów wewnątrz mięśni szkieletowych prowadzi do lipotoksyczności i cukrzycy. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół, w tym przetwarzanie tkanek, barwienie za pomocą Bodipy, akwizycję obrazu i analizę, w celu ilościowego określenia wielkości, gęstości i subkomórkowego rozkładu kropelek lipidów w sposób specyficzny dla rodzaju włókna.

Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

W tym badaniu opisujemy krok po kroku protokół i kładziemy nacisk na kluczowe szczegóły dotyczące określania cech morfologicznych mitochondriów w żywych komórkach, w tym przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i analizę danych. Ta metoda jest powszechnie stosowana do badania morfologii mitochondriów w celu badania różnych schorzeń.

Oznaczanie morfologii mitochondriów w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej

W tym miejscu opisujemy lokalizator zdarzeń mitochondrialnych (MEL), wtyczkę ImageJ przydatną w ilościowym określaniu trójwymiarowych zmian w rozszczepieniu mitochondriów i aktywności fuzyjnej w czasie. Opisujemy również potok przetwarzania obrazu przydatny do czyszczenia mikrofotografii przed analizą w ImageJ.

Zrozumienie zmian w morfologii mitochondriów za pomocą dynamicznych i trójwymiarowych mikrofotografii fluorescencyjnych

Miejscowe wstrzyknięcia barwnika mitochondrialnego oznacza końcowe mitochondria komórek Schwanna in vivo do mikroskopii konfokalnej. Ta metoda wykorzystuje dowód koncepcji wykazany w tkance mięśniowej szkieletowej myszy ze zdrową lub chorą tkanką mięśniową, aby zapewnić wysoką rozdzielczość wizualizacji mitochondriów.

Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy

Przedstawiono nową, wszechstronną metodę obserwacji mikrokrążenia. Jest ona uważana za odpowiednią do długotrwałej obserwacji oraz do łączenia z interwencjami farmakofizjologicznymi lub biologii molekularnej.

Pomiar mikrokrążenia in vivo w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii intravitalnej

Odkryj metodę analizy gęstości i rozmieszczenia mitochondriów we włóknach mięśni szkieletowych żywych szczurów przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Protokół obejmuje izolację włókien, obrazowanie fluorescencyjne oraz przetwarzanie obrazu z wykorzystaniem progowania i analizy Fouriera.

Analiza gęstości mitochondrialnej i rozmieszczenia podłużnego we włóknach mięśni szkieletowych żywych szczurów za pomocą mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal

Analiza gęstości mitochondrialnej i rozmieszczenia podłużnego we włóknach mięśni szkieletowych żywych szczurów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów