Analiza gęstości mitochondrialnej i rozmieszczenia podłużnego we włóknach mięśni szkieletowych żywych szczurów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Przebudowa sieci mitochondrialnej zachodzi w warunkach stresu fizjologicznego i patologicznego. Jednak skutki przebudowy mitochondriów w mięśniach szkieletowych pozostają nie w pełni poznane. Protokół ten umożliwia ilościowe określenie kolistych zmian mitochondriów w żywych mięśniach szkieletowych, zwiększając nasze zrozumienie wzajemnych zależności między zmianami mitochondrialnymi a funkcją komórkową.

Praca z żywymi mięśniami szkieletowymi stanowi wyzwanie ze względu na kurczenie się włókien podczas izolacji i wrażliwość na obraz podczas skanowania konfokalnego. Protokół ten opisuje proces izolacji przy użyciu roztworu relaksacyjnego, umożliwiający analizę żywotnych włókien mięśniowych do oceny mitochondriów za pomocą mikroskopii konfokalnej. Nasz protokół rozwiązuje problem braku przepływów pracy do ilościowej analizy sieci mitochondrialnych we włóknach mięśni szkieletowych.

Opisane tutaj kroki pozwalają użytkownikom na lepsze wykorzystanie obrazów uzyskanych za pomocą mikroskopii konfokalnej, przetwarzania obrazu przez progowanie i szybką analizę Fouriera w celu uzyskania kwantyfikacji gęstości i rozmieszczenia mitochondriów. Jesteśmy zainteresowani badaniem zmian w mięśniach szkieletowych, w szczególności dynamiki mitochondriów i przebudowy strukturalnej mitochondriów podczas przeciwności losu oraz tego, jak można je modulować do interwencji, takich jak ćwiczenia i przerywany post. Zacznij od przeniesienia wyciętej tylnej kończyny szczura na 60-mililitrową szalkę Petriego zawierającą trzy mililitry lodowatego roztworu relaksacyjnego.

Następnie ostrożnie unieś ścięgno Achillesa za pomocą kleszczy. Za pomocą nożyczek do tęczówki wypreparuj mięśnie z dala od kości. Za pomocą mikroskopu stereoskopowego zidentyfikuj i oddziel cały mięsień brzuchaty łydki.

Za pomocą kleszczy z cienką końcówką przenieś boczną głowę mięśnia na nową szalkę Petriego z lodowatym roztworem relaksacyjnym. Delikatnie przytrzymaj mięsień kleszczami na jednym końcu i podziel mięsień na pęczki za pomocą mikronożyczek. Na koniec przenieś wiązki włókien na nową szalkę Petriego zawierającą dwa mililitry lodowatego roztworu relaksacyjnego.

Zacznij od inkubacji włókien mięśni szkieletowych szczura za pomocą TMRE w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie uruchom standardowe oprogramowanie mikroskopu konfokalnego i wybierz strukturę konfiguracji. W oknie dialogowym konfiguracji sprzętu wybierz laser i zaznacz opcję hel neon 543.

Uzyskaj dostęp do okna dialogowego pobierania za pośrednictwem struktury pobierania i wybierz panel XYZ. Następnie wybierz format 512 na 512 z prędkością 400 Hz. Pod wyświetlonym panelem otworkowym wybierz dowolne jednostki i wprowadź trzy przewiewne dla otworka.

W oknie dialogowym ustawień ścieżki wiązki wybierz obiektyw z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie z aperturą numeryczną 0,7 i oknem długości fali emisji od 576 do 700 nanometrów. Wybierz DD 488/543 i ustaw moc lasera 543 na 15%Po 20-minutowej inkubacji dwukrotnie zmień podłoże inkubacyjne. Następnie przygotuj komorę nagraniową z 0,15-milimetrowym szkiełkiem nakrywkowym ze szkła borokrzemianowego.

Przenieś wiązki włókien do komory zawierającej 200 mikrolitrów roztworu relaksacyjnego. Wykorzystaj tryb jasnego pola mikroskopu konfokalnego, aby zidentyfikować żywe włókna do fluorescencyjnego zapisu mitochondriów. Dostosuj wzmocnienie i przesunięcie, skanując fluorescencję za pomocą przycisku na żywo.

Wybierz niskie wartości natężenia fluorescencji, aby uzyskać tło składające się z prawie zerowych jednostek arbitralnych i sygnału mitochondrialnego między 100 a 200 dowolnymi jednostkami. Wybierz rozmiar piksela od 150 do 190 nanometrów i dostosuj współczynnik powiększenia w oknie dialogowym XY, aby uzyskać pełną szerokość światłowodu. W oknie dialogowym Z-stack ustaw odległość Z, zaczynając od głębokości włókna od 15 mikrometrów do 22 mikrometrów i wybierz rozmiar kroku Z wynoszący trzy mikrometry.

Kliknij przycisk start, aby uzyskać obrazy konfokalne i uzyskać stos Z złożony z trzech obrazów konfokalnych uzyskanych na głębokości 15, 18 i 21 mikrometrów. Konfokalne obrazy ćwiczonego chudego włókna mięśniowego szczura pokazują oczekiwany zapis mitochondriów włókien mięśni szkieletowych ze spójnym wzorem włókien. W przeciwieństwie do tego, włókno mięśniowe otyłego szczura wykazuje znaczne zmiany w zawartości i dystrybucji mitochondriów.

Zacznij od uruchomienia oprogramowania do analizy obrazu. Następnie otwórz plik Z-stack i dostosuj orientację, aby umieścić światłowód w poziomie. Wybierz prostokątny obszar zainteresowania lub, ROI, obejmujący obszar mitochondriów.

Wybierz rozmiary w zakresie od 65 do 90 mikrometrów w kierunku X i odpowiednie rozmiary w kierunku Y w zależności od szerokości włókna. Kontynuuj duplikowanie stosu Z z wybranym ROI i zapisz go jako nowy stos Z w formacie TIF. Zapisz pozycję ROI z oryginalnego stosu za pomocą narzędzia Menedżer ROI.

Otwórz okno dialogowe progu za pomocą polecenia skrótu shift T. Wybierz algorytm progu Otsu i wybierz opcję czarno-białego ciemnego tła. Obserwuj histogram rozkładu intensywności fluorescencji i wartość progową wyświetlaną w oknie dialogowym. Zastosuj próg do stosu obrazów binarnych.

Następnie wybierz oblicz próg dla każdego obrazu i utwórz nowy stos w wyświetlonym oknie dialogowym przed kliknięciem OK. Zapisz stos wygenerowany z trzema obrazami binarnymi w formacie TIF. Następnie uzyskaj dostęp do menu analizy i wybierz histogram. W wyświetlonym oknie dialogowym histogramu kliknij przycisk Tak, a następnie w oknie dialogowym histogramu stosu kliknij pozycję Lista, aby uzyskać dane histogramu.

Przenieś dane histogramu do arkusza kalkulacyjnego i zidentyfikuj mitopiksele o wartości 255. Oblicz gęstość mitochondrialną, dzieląc mito-piksele przez całkowitą liczbę pikseli i mnożąc przez 100. Błonnik otyłego szczura wykazywał niższą gęstość mitochondrialną.

Potwierdziła to analiza obrazu stosu. Zacznij od uruchomienia platformy open-source do analizy obrazów biologicznych. Otwórz stos BinDmito i narysuj prostokątny obszar zainteresowania o szerokości 256 pikseli i wysokości pięciu mikrometrów.

Zlokalizuj centralny i boczny zwrot z inwestycji. Uzyskaj profil wykresu ROI za pomocą polecenia skrótu K i przenieś dane do arkusza kalkulacyjnego, wypełniając kolumny B i C.Wypełnij kolumnę D, wybierając drugą komórkę w kolumnie D.Przejdź do menu głównego. Wybierz opcję Wypełnienie i kliknij przycisk Seria.

Następnie wybierz kolumny i wprowadź obliczoną częstotliwość próbkowania delta jako wartość kroku, a obliczoną wartość S jako wartość zakończenia. Przejdź do menu danych. Kliknij pozycję Analiza danych i wybierz opcję Analiza Fouriera.

Wybierz zakres punktów danych w kolumnie C i odpowiadający mu zakres w kolumnie E.Teraz wypełnij kolumnę F wielkością FFT za pomocą funkcji IMABS, aby zwrócić wartość bezwzględną z liczby zespolonej w E i pomnóż przez dwa przez N w celu normalizacji. Automatyczne wypełnianie kolumny F tą formułą. Wykreślić widmo FFT, używając wielkości w F w funkcji częstotliwości FFT w D aż do S Na koniec znajdź punkt maksymalnego piku i odpowiadającą mu częstotliwość FFT.

Profile wykresów wybranych ROI pokazują różnice w rozkładzie fluorescencji między włóknami pochodzącymi od chudych i otyłych szczurów, a także zmienność ROI w obrębie tego samego włókna. W bocznych ROI częstość mitochondrialnego rozkładu podłużnego była podobna we włóknach pochodzących od szczupłych i otyłych szczurów, z wyższą amplitudą we włóknach otyłych szczurów. W przeciwieństwie do tego, centralny zwrot z inwestycji włókna otyłego szczura jest przykładem krytycznego zmniejszenia piku FFT, gdy występuje istotna zmiana dystrybucji mitochondrialnej.