Name: Metoda dojenia mózgu do izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów od żywych szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Poznaj metodę "dojenia mózgu" do izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów od żywych szczurów. Technika umożliwia wielokrotne pobieranie komórek bez uszczerbku dla dobrostanu zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant Action Medical Research (UK) (GN2291) dla R.J.M.F. i I.K. Prace badawcze były również częściowo wspierane (koszty zwierząt i wsparcie dla doktora) przez Grecką Fundację Badań i Innowacji (H.F.R.I.) w ramach "Pierwszego zaproszenia do składania projektów badawczych H.F.R.I. w celu wsparcia pracowników naukowych i badaczy oraz uzyskania grantu na kosztowną aparaturę badawczą" (numer projektu: 3395).

Procedury hodowlane, hodowlane i eksperymentalne zwierząt były prowadzone zgodnie z Ustawą o Zwierzętach (Procedury Naukowe) w Wielkiej Brytanii z 1986 roku, autoryzowane przez Ministerstwo Spraw Wewnętrznych, oraz z Dekretem Prezydenckim 56/2013 Republiki Greckiej, analizowane przez Organy ds. Dobrostanu Zwierząt i Oceny Etyki Uniwersytetów w Cambridge i Patras, a także zatwierdzone i kontrolowane przez lokalną Prefekturalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (Numer protokołu: 5675/39/18-01-2021). Wykorzystano samce i samice szczurów Sprague-Dawley, Wistar i Long-Evans, w wieku od 2 do 4 miesięcy i o masie ciała od 150 g do 250 g. Protokół jest graficznie podsumowany w Rysunek 1.
1. Przygotowanie koktajlu
UWAGA: Przygotuj świeże w dniu zabiegu i trzymaj na lodzie. Ilości podane są na 2 μl do wstrzyknięcia dożylnego do każdej komory bocznej. Przygotować dodatkowy 1 μl na każde planowane wstrzyknięcie.
<ol>
	<li>Przygotować 0,5 μl neuraminidazy o stężeniu 500 mU z Clostridium perfringens (Clostridium welchii). 
	UWAGA: Przechowywać go jako zapas o pojemności 1 μl rozcieńczony w sterylnej wodzie o temperaturze -20 °C. Inne rodzaje neuraminidaz nie zostały przebadane.</li>
	<li>Przygotować 1 μl zawierający 1 μg przeciwciała blokującego integrynę-β1. 
	UWAGA: Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować 0,5 μl zawierającego 0,5 μg zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (rekombinowanego ludzkiego FGF-zasadowego). 
	UWAGA: Przechowywać go w postaci bulionu o pojemności 1 μg/μl rozcieńczonego w sterylnej wodzie o temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie koktajlu uwalniającego
UWAGA: Cały proces można wykonać w ciągu 20 minut. Należy zadbać o to, aby zabieg wykonać w warunkach aseptycznych. Wyczyść wszystkie powierzchnie środkiem antyseptycznym (np. 3% lub 6% nadtlenkiem wodoru). Używaj autoklawowanych lub łatwo sterylnych narzędzi, rękawiczek, fartuchów i zasłon.
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę doświadczalne przez inhalację izofluranu (2,5% w przypadku indukcji i 2% w leczeniu podtrzymującym). Potwierdź głębokość znieczulenia, sprawdzając odruch rogówkowy, reakcję na bodźce (test szczypania kończyn tylnych i ogona) oraz tryb oddychania. 
	UWAGA: Zabiegi chirurgiczne mogą być wykonywane w znieczuleniu ogólnym wywołanym znieczuleniem dootrzewnowym iniekcyjnym (np. ketamina [40 mg/kg] i ksylazyna [10 mg/kg]). Znieczulenie głębokie potwierdzono poprzez sprawdzenie odruchu rogówkowego, reakcji na bodźce (test szczypania kończyn tylnych i ogona) oraz trybu oddychania.</li>
	<li>Środek przeciwbólowy należy podawać podskórnie (np. 0,3 mg/ml buprenorfiny) po indukcji znieczulenia.</li>
	<li>Zamontuj szczura na ramie stereotaktycznej.</li>
	<li>Ogol sierść głowy brzytwą i oczyść skórę środkiem antyseptycznym, takim jak 10% roztwór jodu powidonu, a następnie alkohol. Nałóż środek antyseptyczny trzy razy za pomocą sterylnych wacików. Wcieraj okrężnymi ruchami przez 3-5 sekund za każdym razem. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Wykonaj 2-centymetrowe nacięcie w skórze głowy wzdłuż środkowej linii za pomocą sterylnego skalpela.</li>
	<li>Skrupulatnie oczyść czaszkę za pomocą sterylnych wacików i sterylnego roztworu soli fizjologicznej.</li>
	<li>Zidentyfikuj bregmę za pomocą krawędzi igły strzykawki Hamiltona o pojemności 10 μl zamontowanej na urządzeniu stereotaktycznym. Ustaw bregmę jako "punkt 0,0". 
	UWAGA: Bregma jest identyfikowana jako punkt przecięcia szwów strzałkowych i koronalnych. Więcej szczegółów można znaleźć w atlasie mózgów szczurów Paxinos i Watson5.</li>
	<li>Przesuń urządzenie na współrzędne przednio-tylne (AP) = 0,3 mm, boczne (L) = +1,2 mm (aby namierzyć SSE) lub AP = 1,5 mm, L = +2,0 mm (aby namierzyć CC).</li>
	<li>Wywierć otwór na zadziory o średnicy 1 mm za pomocą wiertła dentystycznego. 
	UWAGA: Podczas wiercenia ręcznego należy uważać, aby nie uszkodzić powierzchni kory mózgowej. Nie oczekuje się, że krwotok będzie znaczny. Oczyść krew solą fizjologiczną i uciskaj, aby zatrzymać bardziej uporczywe krwawienie.</li>
	<li>Załadować 4 μl koktajlu o uwalnianiu do 10 μl strzykawki Hamiltona.</li>
	<li>Opuścić igłę (najlepiej lub stożkową krawędź) strzykawki Hamiltona, aby uzyskać kontakt z oponą twardą.</li>
	<li>Wbić igłę na żądaną głębokość (D = 3,5 mm). 
	UWAGA: Wlej sól fizjologiczną na powierzchnię opony twardej, aby utrzymać nawodnienie tkanki.</li>
	<li>Wlać w infuzji 2 μl koktajlu o uwalnianiu z szybkością 1 μl/min.</li>
	<li>Pozostawić igłę na miejscu przez kolejne 2 minuty przed powolnym pobieraniem, aby uniknąć wypłynięcia koktajlu uwalniającego.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.8-2.14 dla drugiej półkuli na współrzędnych AP = 0.3 mm, L = -1.2 mm (aby celować w SSE) lub AP = 1.5 mm, L = -2.0 mm (aby celować w CC).</li>
	<li>Zszyj nacięcie nylonem 5-0 (średnica 0,1 mm) i oczyść zszyty obszar środkiem antyseptycznym.</li>
	<li>Zdejmij maskę podającą środek znieczulający i przenieś zwierzę do obszaru monitorowania pooperacyjnego. 
	UWAGA: Powrót do zdrowia po znieczuleniu i utrzymanie pozycji leżącej powinno nastąpić w ciągu 5-10 minut, a pełne wyzdrowienie (normalne zachowanie) w ciągu 25 minut.
	<ol>
		<li>Ściśle monitoruj regenerację (żywy i nieprzerwany ruch, częsty dostęp do wody) w dobrze ogrzanym (24-25 °C), cichym pomieszczeniu bez ściółki z drobnymi cząsteczkami, które mogą blokować drogi oddechowe. Zwierzę należy zwrócić w towarzystwie współwięźniów z klatki (nie nowym zwierzętom) dopiero po potwierdzeniu pełnego wyzdrowienia.</li>
		<li>Monitorować zwierzę w placówce konserwacyjnej przez co najmniej 48 godzin po operacji. Przeciwdziałać objawom bólu (chowanie głowy, nieprawidłowa postawa głowy lub ciała, nadwrażliwość i nadpobudliwość na dotykanie) poprzez podawanie środka przeciwbólowego (np. 0,3 mg/ml buprenorfiny podskórnie). Zwierzęta z przebarwioną lub wyprostowaną sierścią należy skierować do odpowiedzialnego weterynarza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Płynna biopsja płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF)
UWAGA: Cały proces można wykonać w ciągu 10 minut. Opisana tutaj płynna biopsja jest wykonywana 3 dni po wstrzyknięciu koktajlu uwalniającego, ale może być wykonana dokładnie w ten sam sposób, gdy jest to wymagane. Należy zadbać o to, aby zabieg wykonać w warunkach aseptycznych. Oczyść wszystkie powierzchnie środkiem antyseptycznym (np. 3% lub 6% nadtlenkiem wodoru). Używaj autoklawowanych lub łatwo sterylnych narzędzi, rękawiczek, fartuchów i zasłon.
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę przez inhalację izofluranu (2,5% w przypadku indukcji i 2% w leczeniu podtrzymującym). Potwierdź głębokość znieczulenia, sprawdzając rogówkę 
	odruch, reakcja na bodźce (test szczypania kończyn tylnych i ogona) oraz tryb oddychania. 
	UWAGA: Zabiegi chirurgiczne mogą być wykonywane w znieczuleniu ogólnym wywołanym znieczuleniem dootrzewnowym (np. ketamina [40 mg/kg] i ksylazyna [10 mg/kg]). Nie jest to jednak wskazane, ponieważ zabieg jest krótki, zwłaszcza jeśli biopsje będą wykonywane wielokrotnie w ciągu kolejnych dni.</li>
	<li>Środek przeciwbólowy należy podawać podskórnie (np. 0,3 mg/ml buprenorfiny) po indukcji znieczulenia.</li>
	<li>Zamontuj zwierzę doświadczalne na ramie stereotaktycznej. Użyj nauszników, aby zamocować głowę bez utrudniania ruchu obrotowego w kierunku przodu i tyłu.</li>
	<li>Ustabilizuj głowę pod kątem 40° w dół, aby uzyskać dobre przedłużenie tylnej części szyi. 
	UWAGA: Jednym ze sposobów, aby to zrobić, jest użycie paska ust urządzenia6.</li>
	<li>Ogol sierść w okolicy szyi za pomocą maszynki do golenia i oczyść skórę środkiem antyseptycznym, takim jak 10% roztwór jodu powidonu, a następnie alkohol. Nałóż środek antyseptyczny trzy razy za pomocą sterylnych wacików. Wcieraj okrężnymi ruchami przez 3-5 sekund za każdym razem.</li>
	<li>Opuszkiem palca znajdź obszar depresyjny w kształcie rombu znajdujący się między wypukłością potyliczną a grzbietem atlas6.</li>
	<li>Narysuj znak punktowy (np. za pomocą markera).</li>
	<li>Zamocuj strzykawkę o pojemności 1 ml lub 0,5 ml na ramce stereotaktycznej. 
	UWAGA: Zaleca się używanie strzykawek z nieodłączanymi igłami, ponieważ zapewniają one lepsze ssanie i mają mniejszą objętość martwą.</li>
	<li>Przysunąć igłę w miejsce kontaktu ze skórą w miejscu oznaczenia.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy unieść skórę, jednocześnie opuszczając strzykawkę przez warstwy skóry.</li>
	<li>Lekko odkręcić tłok, aby wytworzyć podciśnienie w strzykawce.</li>
	<li>Wznowić pracę, aby bardzo powoli zanurzać igłę, aż w strzykawce pojawi się płyn (CSF).</li>
	<li>Ustawić igłę w tej pozycji i pozwolić na powolny przepływ CSF. 
	UWAGA: Igłę można lekko obniżyć lub podnieść, jeśli przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego jest bardzo wolny.</li>
	<li>Rozpocznij usuwanie płynu mózgowo-rdzeniowego powoli (w krokach co 40 μl/min) do 120 μl.</li>
	<li>Powoli wyjmować strzykawkę.</li>
	<li>Dootrzewnowo podać 1 ml normalnej surowicy, aby wspomóc uzupełnianie płynów przez zwierzę doświadczalne.</li>
	<li>Zmieszać płynną biopsję (CSF) z 400 μl pożywki NSC i utrzymać probówkę do mikrowirówki w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia. 
	UWAGA: Biopsje płynne należy przetworzyć w ciągu 3 godzin, jeśli nie są zamrożone.</li>
	<li>Zdejmij maskę podającą środek znieczulający i przenieś zwierzę do obszaru monitorowania po operacji. 
	UWAGA: Powrót do zdrowia po znieczuleniu i utrzymanie pozycji leżącej powinno nastąpić w ciągu 5-10 minut, a pełne wyzdrowienie (normalne zachowanie) w ciągu 25 minut.
	<ol>
		<li>Ściśle monitoruj regenerację (żywy i nieprzerwany ruch, częsty dostęp do wody) w dobrze ogrzanym (24-25 °C), cichym pomieszczeniu bez ściółki z drobnymi cząsteczkami, które mogą blokować drogi oddechowe. Zwierzę należy zwrócić w towarzystwie jego współlokatorów (nie nowym zwierzętom) dopiero po potwierdzeniu pełnego wyzdrowienia.</li>
		<li>Monitorować zwierzę w placówce konserwacyjnej przez co najmniej 48 godzin po operacji. W przypadku zaobserwowania objawów bólu (ukrywanie głowy, nieprawidłowa postawa głowy lub ciała, nadwrażliwość i nadpobudliwość na dotykanie) należy podać środek przeciwbólowy (np. 0,3 mg/ml buprenorfiny podskórnie). Zwierzęta z przebarwioną lub wyprostowaną sierścią należy skierować do odpowiedzialnego weterynarza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przetwarzanie tkanek do immunofluorescencji
<ol>
	<li>Zwierzę należy poddać eutanazji przez dosercowy wlew 20 ml lodowatej soli fizjologicznej, a następnie 50 ml lodowatego 4% paraformaldehydu (PFA; w buforowanym fosforanie soli fizjologicznej [PBS] o pH = 7,4).</li>
	<li>Wypreparuj tkankę mózgową.
	<ol>
		<li>Oddziel głowę od ciała za pomocą nożyczek, aby wykonać nacięcie w okolicy szyjki macicy. Użyj nożyczek, aby usunąć skórę, a następnie przetnij kość czaszki wzdłuż strzałkowej linii środkowej, z końcami nożyczek skierowanymi do góry, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej. Staraj się kontynuować cięcie tak bardzo, jak to możliwe, mijając koronalną linię środkową.</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby usunąć kości, zaczynając od kości nadpotylicznej i ciemieniowej, a na końcu kości czołowych.</li>
		<li>Gdy tkanka mózgowa zostanie odsłonięta, użyj kleszczy lub szpatułki, aby wyjąć ją z czaszki. Aby to ułatwić, przetnij nerwy u podstawy mózgu i opuszki węchowe, jeśli nie chcesz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po utrwaleniu tkanki przez noc w 2% PFA w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Krioochronę tkanki w 30% sacharozie (w PBS) przez co najmniej 48 godzin w temperaturze 4 °C, aż tkanka opadnie na dno.</li>
	<li>Zamrozić tkankę w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Pokrój tkankę mózgową na skrawki koronalne o grubości 14 μm za pomocą kriostatu.</li>
	<li>Barwienie immunofluorescencyjne należy przeprowadzić przy użyciu standardowych protokołów 3,7
	<ol>
		<li>Inkubować skrawki z buforem blokującym (3% albuminy surowicy bydlęcej [BSA], 0,1% Triton X-100, w PBS) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przeprowadzić pobieranie antygenu (gotowanie przez 15 minut w 10 mM buforze cytrynianowym, pH = 6,0, przy użyciu szklanych słoików). 
		UWAGA: Ten krok jest opcjonalny, ale konieczny w przypadku antygenów jądrowych.</li>
		<li>Doprowadzić do temperatury pokojowej i inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko kwaśnemu białku fibrylarnemu gleju (GFAP), podwójnej kortynie (Dcx), S100β i β-kateninie (patrz tabela materiałów) w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Inkubować przez 2 godziny z przeciwciałami drugorzędowymi w PBS z 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) w celu barwienia przeciwjądrowego w temperaturze pokojowej (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przetwarzanie izolowanych komórek do immunofluorescencji
<ol>
	<li>Umieść komórki na 96-dołkowych płytkach kompatybilnych z mikroskopią, pokrytych poli-D-lizyną (100 μg/ml).</li>
	<li>Utrwal komórki w lodowatym 2% PFA na 10 minut i przemyj 3x PBS.</li>
	<li>Wykonaj immunofluorescencję przy użyciu standardowych procedur3,7dla PDGFRα, GFAP, Dcx, SOX2 i ID3 (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Przechowywać komórki w PBS + NaN3 (0,1%) w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
</ol>
6. Mikroskopia i analiza obrazu
<ol>
	<li>Wykonywanie zdjęć za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej i zliczanie komórek za pomocą standardowych narzędzi do analizy obrazu, takich jak liczniki komórek.</li>
</ol>

Rat "Brain Milking" for Neural Stem and Oligodendrocyte Progenitor Cell Isolation

<ol><li>Visvader, J. E., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+designs+of+stem+cell+hierarchies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific designs of stem cell hierarchies.</a> Nature Cell Biology. 18 (4), 349-355 (2016).</li>
<li>Dimitrakopoulos, D., Kakogiannis, D., Kazanis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+quiescent+and+active+neural+stem+cells+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of quiescent and active neural stem cells in the postnatal brain.</a> The International Journal of Developmental Biology. 66 (1-2-3), 51-58 (2022).</li>
<li>Kazanis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subependymal+zone-derived+oligodendroblasts+respond+to+focal+demyelination+but+fail+to+generate+myelin+in+young+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Subependymal zone-derived oligodendroblasts respond to focal demyelination but fail to generate myelin in young and aged mice.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 685-700 (2017).</li>
<li>Franklin, R. J. M., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerating+CNS+myelin-from+mechanisms+to+experimental+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regenerating CNS myelin-from mechanisms to experimental medicines.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 18 (12), 753-769 (2017).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th Edition. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6">https://www.elsevier.com/books/the-rat-brain-in-stereotaxic-coordinates/paxinos/978-0-12-391949-6</a> (2013).</li>
<li>Pegg, C. C., He, C., Stroink, A. R., Kattner, K. A., Wang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+for+collection+of+cerebrospinal+fluid+from+the+cisterna+magna+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Technique for collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in rat.</a> Journal of Neuroscience Methods. 187 (1), 8-12 (2010).</li>
<li>McClenahan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+neural+stem+and+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+brain+of+live+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of neural stem and oligodendrocyte progenitor cells from the brain of live rats.</a> Stem Cell Reports. 16 (10), 2534-2547 (2021).</li>
<li>Doetsch, F., García-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+a+germinal+layer+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regeneration of a germinal layer in the adult mammalian brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11619-11624 (1999).</li>
<li>Doetsch, F., Petreanu, L., Caille, I., Garcia-Verdugo, J. -M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+converts+transit-amplifying+neurogenic+precursors+in+the+adult+brain+into+multipotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">EGF converts transit-amplifying neurogenic precursors in the adult brain into multipotent stem cells.</a> Neuron. 36 (6), 1021-1034 (2002).</li>
<li>Del Carmen Gómez-Roldán, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblast+proliferation+on+the+surface+of+the+adult+rat+striatal+wall+after+focal+ependymal+loss+by+intracerebroventricular+injection+of+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroblast proliferation on the surface of the adult rat striatal wall after focal ependymal loss by intracerebroventricular injection of neuraminidase.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507 (4), 1571-1587 (2008).</li>
<li>Luo, J., Shook, B. A., Daniels, S. B., Conover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone-mediated+ependyma+repair+in+the+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone-mediated ependyma repair in the adult mammalian brain.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (14), 3804-3813 (2008).</li>
<li>Kazanis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescence+and+activation+of+stem+and+precursor+cell+populations+in+the+subependymal+zone+of+the+mammalian+brain+are+associated+with+distinct+cellular+and+extracellular+matrix+signals%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quiescence and activation of stem and precursor cell populations in the subependymal zone of the mammalian brain are associated with distinct cellular and extracellular matrix signals.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (29), 9771-9781 (2010).</li>
<li>Mirzadeh, Z., Merkle, F. T., Soriano-Navarro, M., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+confer+unique+pinwheel+architecture+to+the+ventricular+surface+in+neurogenic+regions+of+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells confer unique pinwheel architecture to the ventricular surface in neurogenic regions of the adult brain.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 265-278 (2008).</li>
<li>Calzolari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+clonal+expansion+and+limited+neural+stem+cell+self-renewal+in+the+adult+subependymal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fast clonal expansion and limited neural stem cell self-renewal in the adult subependymal zone.</a> Nature Neuroscience. 18 (4), 490-492 (2015).</li>
<li>Douet, V., Kerever, A., Arikawa-Hirasawa, E., Mercier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractone-heparan+sulphates+mediate+FGF-2+stimulation+of+cell+proliferation+in+the+adult+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Fractone-heparan sulphates mediate FGF-2 stimulation of cell proliferation in the adult subventricular zone.</a> Cell Proliferation. 46 (2), 137-145 (2013).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Obernier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+is+sustained+by+symmetric+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis is sustained by symmetric self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 22 (2), 221-234 (2018).</li>
<li>Delgado, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+stem+cells+from+quiescence+reveals+gliogenic+domains+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Release of stem cells from quiescence reveals gliogenic domains in the adult mouse brain.</a> Science. 372 (6547), 1205-1209 (2021).</li>
<li>Kalamakis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescence+modulates+stem+cell+maintenance+and+regenerative+capacity+in+the+aging+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain.</a> Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).</li>
<li>Llorens-Bobadilla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reveals+a+population+of+dormant+neural+stem+cells+that+become+activated+upon+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).</li>
<li>Gajera, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP2+in+ependymal+cells+regulates+BMP+signaling+in+the+adult+neurogenic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">LRP2 in ependymal cells regulates BMP signaling in the adult neurogenic niche.</a> Journal of Cell Science. 123 (11), 1922-1930 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, o których mogliby zadeklarować.

Komórki macierzyste i progenitorowe są stosunkowo rzadkie w tkance mózgowej ssaków. Ponadto NSC znajdują się w miejscach niedostępnych dla łatwych i bezpiecznych biopsji (ściany komór, hipokamp). Dlatego jak dotąd jedynym sposobem na eksperymentalną pracę z takimi komórkami była ich pośmiertna izolacja. Metoda pozwalająca na pojedyncze lub wielokrotne pobieranie NSC i OPC od żywych szczurów, zwana dojeniem, jest opisana tutaj krok po kroku. Metoda opiera się na dwóch kluczowych cechach: i) NSC lub OPC są oddzielone monowarstwą komórek wyściółki od płynu mózgowo-rdzeniowego, przepływającego w układzie komorowym mózgu; ii) Komórki wyściółki i progenitorzy nerwowe utrzymują kontakt między sobą oraz z innymi sąsiednimi typami komórek za pośrednictwem integryn. Dlatego koktajl uwalniający wstrzykiwany w określone obszary komór, aby umożliwić odłączenie NSC lub OPC od miąższu mózgu, zawiera neuraminidazę, toksynę, która specyficznie celuje i zabija komórki wyściółki10,11, oraz przeciwciało blokujące integrynę-β1. Zawiera również FGF2, ponieważ ten czynnik wzrostu jest niezbędny do przetrwania i utrzymania NSC w niszy i w kulturze15,16. Wykazano jużwcześniej7, że protokół ten jest dobrze tolerowany przez zwierzęta; W niniejszym raporcie potwierdzono ponadto, że uszkodzenie komórek wyściółki, wywołane przez koktajl uwalniający jako warunek wstępny uwolnienia NSC/OPC w płynie mózgowo-rdzeniowym, jest ograniczone wokół poziomu ostroogonowego wstrzyknięcia. Ma to kluczowe znaczenie, ponieważ protokół powinien zachować homeostatyczną funkcję mózgu, w tym samą niszę komórek macierzystych, i nie powinien zagrażać długoterminowemu dobrostanowi zwierząt. Stereotaktyczne wstrzyknięcie koktajlu uwalniającego ma łagodne nasilenie i nigdy nie spowodowało śmierci. Co więcej, wykonywanie płynnych biopsji z cisterna magna jest szybką i mało inwazyjną procedurą, którą można powtarzać kilka razy z rzędu.
Co ważne, próbki NSC wyizolowane podczas udoju ściśle odzwierciedlają endogenną pulę NSC. Na profil komórek progenitorowych SSE może mieć wpływ iniekcja dożylna FGF2. Kiedy tak się dzieje, w ten sam sposób wpływa to na profil komórek pochodzących z doju. Co więcej, wcześniejsze prace eksperymentalne wykazały, że NSC wyizolowane przez dojenie SSE mają ograniczony potencjał samoodnawiania, zachowanie podobne do endogennych NSC, co ujawniono w przypadku transgenicznych strategii losu komórek in vivo 14,17. Pourodzeniowe NSC mózgu są utrzymywane w stanie spoczynku, rzadko przechodząc w kierunku aktywacji mitotycznej w celu wytworzenia neurogennego i glejowego potomstwa 18,19,20. W tym miejscu przedstawiono dowody na to, że frakcja komórek pochodzących z doju, które wyrażają GFAP i oczekuje się, że będą zawierać NSC działające w dobrej wierze, współwyraża ID3, marker spoczynkowych NSC21. Wzbogacona obecność spoczynkowych NSC, które są następnie siane w pożywce NSC zwykle używanej do hodowli NSC izolowanych post mortem, wydaje się ograniczać potencjał ekspansji pobranych NSC (np. proces kluczowy, jeśli komórki miałyby być używane do przeszczepów autologicznych). Dzieje się tak, ponieważ pożywki te są zaprojektowane specjalnie do przetrwania i ekspansji mitotycznej aktywowanych NSC; w związku z tym wygenerowanie protokołów umożliwiających wydajną i szybką mitotyczną aktywację spoczynkowych NSC zwiększy wartość i zakres zastosowania doju.
Ogólnie rzecz biorąc, dane te wskazują, że dojenie umożliwia pobieranie próbek pourodzeniowych NSC i OPC mózgu (w zależności od rostrocaudalnego poziomu wstrzyknięcia koktajlu uwalniającego) od żywych szczurów. Praca ta wskazuje na możliwość przeprowadzania kolejnych biopsji płynnych u tego samego zwierzęcia, nawet w znacznych odstępach czasu po wstrzyknięciu koktajlu uwalniającego (a więc w celu zaplanowania i przeprowadzenia podłużnych badań eksperymentalnych), ponieważ neuroblasty pozostają skupione na ścianach komór nawet po 8 miesiącach od wstrzyknięcia. Takie metody mają kluczowe znaczenie, ponieważ pozwalają na badanie zdarzeń zachodzących u poszczególnych zwierząt, co skutkuje zmniejszeniem szumu biologicznego generowanego przez zmienność fizjologiczną. To z kolei prowadzi do zwiększenia dokładności i do wdrożenia zasad "3R" (replacement, reduction, and refinement). Przyszły kluczowy krok w kierunku ulepszenia metody będzie polegał na określeniu maksymalnej liczby i ram czasowych, w których można wykonać biopsję płynną po jednej procedurze uwalniania, chociaż w razie potrzeby powinno być wykonalne przeprowadzenie dodatkowych procedur uwalniania.

Tkankowe komórki macierzyste to częściowo zaangażowane komórki, które mogą dać początek wszystkim populacjom komórek, które tworzą odpowiednie tkanki. Oprócz tego, że są multipotencjalne, są samoodnawiającymi się komórkami i mają kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy i zdolności regeneracyjnych tkanek1. Niektóre tkankowo specyficzne komórki macierzyste pozostają w aktywnym, silnie proliferacyjnym stanie, takie jak jelitowe lub krwiotwórcze komórki macierzyste. Inne, takie jak komórki macierzyste mózgu, pozostają w dużej mierze w stanie spoczynku lub uśpienia2. W dorosłym mózgu nerwowe komórki macierzyste (NSC) można znaleźć w wyspecjalizowanych obszarach, często nazywanych niszami. Dwa takie dobrze opisane obszary istnieją w strefie podwyściółkowej (SSE) komór bocznych oraz w zakręcie zębatym hipokampa. Nisza SSE generuje największą liczbę komórek, przede wszystkim neuroblastów, które migrują w kierunku opuszki węchowej i przyczyniają się do lokalnej populacji interneuronów; w przeciwieństwie do tego, wygenerowane oligodendroblasty migrują do sąsiedniego ciała modzelowatego (CC)3. Komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC) są mitotycznie aktywnymi komórkami, szeroko rozmieszczonymi w ośrodkowym układzie nerwowym, które: i) są zaangażowane w linię oligodendroglialną, ii) mogą migrować do miejsc demielinizacji i iii) mogą różnicować się w mielinizujące oligodendrocyty. OPC wykazują również potencjał samoodnawiania się i spoczynku4.
Do tej pory izolacja i badanie NSC i OPC wymagało pośmiertnej dysocjacji wypreparowanej tkanki mózgu i rdzenia kręgowego. Aby obejść to eksperymentalne ograniczenie, opracowaliśmy metodę, która po raz pierwszy pozwala na izolację mózgowych NSC i OPC od żywych zwierząt. Nazywamy tę metodę "dojeniem", ponieważ umożliwia ona wielokrotne pobieranie komórek, ponieważ ich pule nie są wyczerpywane. Protokół został opracowany na szczurach, ze względu na ich duży rozmiar mózgu, ukierunkowany głównie na SSE lub CC i obejmuje dwa główne etapy. Po pierwsze, NSC lub OPC są "usuwane" z tkanki poprzez wstrzyknięcie dożylnie "koktajlu uwalniającego" zawierającego neuraminidazę, toksynę, która indukuje denudację ściany komór, przeciwciało blokujące integrynę-β1 i czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2). Koktajl jest stereotaktycznie wstrzykiwany obustronnie do komór bocznych. Jeżeli zamierzonym zastosowaniem jest izolacja NSC, celem są obszary rostralne komór bocznych. Jeśli celem jest czystsze wyizolowanie OPC, koktajl wstrzykuje się doogonowo w obszar fimbrii hipokampa. Na drugim etapie "pobierania" wykonuje się płynne biopsje płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) z cisterna magna znieczulonych szczurów, bez konieczności nacięcia. Płynną biopsję miesza się z pożywką hodowlaną NSC i można ją przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu posiewu.

<table><tbody><tr><td>Release cocktail</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta; Przeciwciało blokujące 1-integryny</td><td>BD Biosciences</td><td>#555002</td><td>oczyszczone NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Każda osoba z aktywnością blokującą powinna być odpowiednia.</td></tr><tr><td>Neuraminidaza z Clostridium perfringens (Clostridium welchii)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#N2876</td><td>Neuraminidazy z innych źródeł (np. z Vibrio cholerae) nie zostały przebadane.</td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka zasada FGF (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>#100-18B</td><td>przechowywany jako 1 &mu; g/&mu; L bulionu, rozcieńczonego w sterylnej wodzie o stempze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Zabiegi chirurgiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &mikro; L Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>#80330</td><td>Model 701 RN, Mała wyjmowana igła, rozmiar 26s, 2 cale, styl punktowy 2</td></tr><tr><td>BD Micro-fine 1 mL strzykawki insulinowe</td><td>BD biosciences</td><td>04085-00</td><td>29 G x 12,7 mm</td></tr><tr><td>BETADINE CUT. SOL 10% FLx30ML</td><td>LAVIPHARM-CASTALIA</td><td>SKU:</td><td></td></tr> 5201048131168 <tr><td>Bupaq</td><td>RICHTERPHARMA</td><td>1021854AF</td><td>10 mL (buprenofina 0,3 mg/ml)</td></tr><tr><td>Cyfrowy nowy standard stereotaksji, szczurów i myszy</td><td>Stoelting</td><td>51500D</td><td></td></tr><tr><td>Homeotermiczny system monitorowania</td><td>Aparat Harvarda</td><td>55-7020</td><td></td></tr><tr><td>ISOFLURIN 1,000 mg/g para wziewna, płyn</td><td>Vetpharma Zdrowie zwierząt</td><td>32509/4031</td><td></td></tr><tr><td>Ketamidor</td><td>RICHTER PHARMA</td><td>SKU:</td> 9004114002531 <td>Ketamina 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Nylonowy szew, Ethilon</td><td>Ethicon</td><td>D9635</td><td>Przezroczysty, rozmiar 5-0</td></tr><tr><td>Akumulatorowe akumulatorowe trymery chirurgiczne</td><td>Stoelting</td><td>Pozycja:51472</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela, sterylne</td><td>Swann Morton</td><td>AW050</td><td></td></tr><tr><td>Scopettes Jr.&nbsp; 8-calowe waciki</td><td>Birchwood Laboratories</td><td>34-7021-12P</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktyczna wiertarka szybkoobrotowa</td><td>Foredom</td><td>1474w / o1464</td><td></td></tr><tr><td>Stoelting' s Stereotaxic Instrument Kit</td><td>Stoelting</td><td>Pozycja: 52189</td><td></td></tr><tr><td>Xylan 2%</td><td>Chanelle Pharmaceuticals</td><td>13764/03/19-5-2004</td><td>Ksylazyna, 25 mL</td></tr><tr><td>Obsługa tkanek i komórek oraz barwienie immunologiczne</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe odpowiednie do mikroskopii</td><td>Greiner</td><td>#655866</td><td>Suplement</td></tr> <tr><td></td><td>do mikropłytki B27 w kształcie gwiazdy ekranowejThermoFisher Scientific</td><td>A1486701</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Merck</td><td>P06-1391100</td><td>Frakcja V, szok termiczny</td></tr><tr><td>Cytrynian</td><td>Merck</td><td>71497</td><td>Monozasadowy cytrynian sodu</td></tr><tr><td>Kriostat</td><td>Leica</td><td>CM1510S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck, Calbiochem</td><td>28718-90-3</td><td>Barwienie jądrowe, Rozcieńczenie: 1/1,000</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Naukowe</td><td>11995065</td><td>Wysokoglukozowy, pirogroniany</td></tr><tr><td>anty-kozy osłów</td><td>Biotium</td><td>20016 lub 20106 lub 20048</td><td>Rozcieńczenie: 1/1,000</td></tr><tr><td>osła anty-mysie</td><td>Biotium</td><td>20014 lub 20105 lub 20046</td><td>Rozcieńczenie: 1/1,000</td></tr><tr><td>osła anty-królik</td><td>Biotium</td><td>20015 lub 20098 lub 20047</td><td>Rozcieńczenie: 1/1,000</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2 (lub bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>koza anty-GFAP</td><td>Abcam</td><td>ab53554</td><td>Rozcieńczenie: 1/500</td></tr><tr><td>koza anty-SOX2</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-17320</td><td>Rozcieńczenie: 1/200</td></tr><tr><td>mysz anty-ID3</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>sc-56712</td><td>Rozcieńczenie: 1/200</td></tr><tr><td>mysz anty-S100&beta;</td><td>Sigma</td><td>S2532</td><td>Rozcieńczenie: 1/200</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Merck, Calbiochem</td><td>475904</td><td>Podłoże montażowe</td></tr><tr><td>Suplement N2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmadehyd</td><td>Merck</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Merck, roztwór miliporów</td><td>A-003-E</td><td>, 1,0 mg/ml</td></tr><tr><td>króliczego anty-Doublecortyny (DCX)</td><td>Abcam</td><td>ab18723</td><td>Rozcieńczenie: 1/500</td></tr><tr><td>królik anty-PDGFR&alpha;</td><td>Abcam</td><td>ab51875</td><td>Rozcieńczenie: 1/200</td></tr><tr><td>anty-&beta;- katenina królika</td><td>Abcam</td><td>ab16051</td><td>Rozcieńczenie: 1/500</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia i analiza obrazu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>SP6 i SP8</td><td></td></tr><tr><td>Analiza obrazu</td><td>NIH, USA</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>Analiza obrazu</td><td>Leica</td><td>LasX</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda "dojenia mózgu" do izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów od żywych szczurów

The "Brain Milking" Method for the Isolation of Neural Stem Cells and Oligodendrocyte Progenitor Cells from Live Rats

Tkankowo specyficzne nerwowe komórki macierzyste (NSC) pozostają aktywne w mózgu ssaków po urodzeniu. Przebywają w wyspecjalizowanych niszach, w których generują nowe neurony i glej. Jedną z takich nisz jest strefa podwyściółkowa (SSE; zwana również strefą komorowo-podkomorową), która znajduje się w poprzek bocznych ścian komór bocznych, przylegając do warstwy komórek wyściółki. Komórki progenitorowe oligodendrocytów (OPC) są obficie rozmieszczone w ośrodkowym układzie nerwowym, stanowiąc pulę proliferacyjnych komórek progenitorowych, które mogą wytwarzać oligodendrocyty.
Zarówno NSC, jak i OPC wykazują potencjał samoodnawiania się oraz cykle spoczynku/aktywacji. Ze względu na ich lokalizację, izolacja i badanie eksperymentalne tych komórek odbywa się post mortem. W tym miejscu szczegółowo opisujemy "dojenie mózgu", metodę izolacji NSC i OPC, między innymi, od żywych zwierząt. Jest to dwuetapowy protokół przeznaczony do stosowania u gryzoni i testowany na szczurach. Po pierwsze, komórki są "uwalniane" z tkanki poprzez stereotaktyczne wstrzyknięcie domózgowo-komorowe (i.c.v.) "koktajlu uwalniania". Głównymi składnikami są neuraminidaza, która celuje w komórki wyściółki i indukuje denudację ścian komór, przeciwciało blokujące integrynę-β1 i czynnik wzrostu fibroblastów-2. Na drugim etapie "pobierania" wykonuje się płynne biopsje płynu mózgowo-rdzeniowego z cisterna magna, u znieczulonych szczurów bez konieczności nacięcia.
Wyniki przedstawione tutaj pokazują, że izolowane komórki zachowują swój profil endogenny, a NSC SSE zachowują swój spokój. Denudacja warstwy wyściółki jest ograniczona do anatomicznego poziomu iniekcji, a protokół (uwolnienie i pobranie) jest dobrze tolerowany przez zwierzęta. To nowatorskie podejście toruje drogę do prowadzenia badań podłużnych endogennej neurogenezy i glejogenezy u zwierząt doświadczalnych.

Uwalnianie i zbieranie NSC 
NSC strefy podkomorkowej (SEZ) są oddzielone od płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) jedynie jednowarstwą komórek ependymalnych, mimo że pozostają w bezpośrednim kontakcie z zawartością komór mózgowia. poprzez interkalujące wypustki jednorzęskowate8,9Neuraminidaza działa specyficznie na komórki nabłonka oponiki. poprzez odszczepienie reszt kwasu sjalowego i może prowadzić do denudacji ściany komory. Prowadzi to do skupiania się neuroblastów na powierzchni komory10,11Co więcej, po wewnątrzkomorowym (i.c.v.) wstrzyknięciu przeciwciała blokującego integrynę-β1 zaobserwowano przepływ neuroblastów do płynu mózgowo-rdzeniowego, co prawdopodobnie wynika z rozluźnienia połączeń międzykomórkowych komórek nabłonka oponowego.12Obserwacje te doprowadziły do opracowania protokołu umożliwiającego izolację komórek macierzystych i progenitorowych mózgu poprzez kontrolowane naruszenie integralności ścian komory bocznej. W pierwszym kroku indukuje się uwolnienie z miąższu oraz następujący po nim przepływ NSC lub OPC do płynu mózgowo-rdzeniowego poprzez iniekcja koktajlu uwalniającego do komór mózgu (i.c.v.). Koktajl jest wstrzykiwany stereotaktycznie z prędkością 1 µL/min, obustronnie (2 µL na wstrzyknięcie) do komór bocznych (współrzędne celujące w NSC z SEZ: AP = 0,3 mm, L = ± 1,2 mm, D = 3,5 mm; współrzędne celujące w OPC z CC: AP = 1,5 mm, L = ± 2 mm, D = 3,5 mm). Drugi etap („pobieranie”) polega na wykonaniu płynnej biopsji PŁM z cysterny wielkiej. Szczury muszą zostać poddane znieczuleniu, a biopsję można przeprowadzić za pomocą strzykawek o objętości 1 ml. Zastosowanie urządzenia stereotaktycznego pozwala na niemal całkowity sukces w odzyskaniu około 100 µL płynu mózgowo-rdzeniowego, bez konieczności wykonywania nacięć. Biopsję płynną dodaje się do schłodzonej pożywki hodowlanej i przechowuje w 4 °C do momentu wysiewu na &lt;3 h (pożywka do hodowli NSC zawiera zmodyfikowane pożywkę Eagle'a Dulbecco [DMEM], suplement B27 [2%], suplement N2 [1%], FGF2 [20 ng/mL] oraz czynnik wzrostu naskórka [EGF; 20 ng/mL]).
Ocena histologiczna obszaru okołopokomorowego po wstrzyknięciu koktajlu uwalniającego 
Pierwsza seria doświadczeń wykazała, że przy wstrzykiwaniu więcej niż 3 µL cieczy komory mogły ulec uszkodzeniu w wyniku nieswoistego urazu mechanicznego (Rysunek 2B,C). Powolne wstrzyknięcie 2 µL koktajlu uwalniającego doprowadziło do pojawienia się skupisk Dcx-immunopozytywnych neuroblastów na powierzchni komory. Skupiska te pozostawały widoczne nawet 8 miesięcy po wstrzyknięciu (Rysunek 2D). Ponieważ metoda była przeznaczona do badań podłużnych, mających na celu długoterminową obserwację zwierząt, oceniono uszkodzenia tkanek wywołane przez koktajl uwalniający. Immunobarwienie wykonano na przekrojach mózgu o grubości 14 µm, przygotowanych za pomocą kriotomu, pod kątem markerów komórek ependymalnych, takich jak S100β i β-katenina13, a następnie oceniono ogólną integralność warstwy ependymalnej. Miejsca zaniku warstwy ependymalnej występowały jedynie blisko poziomu rostrokaudalnego wstrzyknięć, przy stopniowym spadku zaburzeń warstwy ependymalnej wykrytych w bardziej tylnych i przednich obszarach SEZ (Rysunek 2E,F), które całkowicie znikały w odległości ±2 mm od miejsca wstrzyknięcia. Powyższe wyniki pokazują, że częściowy zanik warstwy ependymalnej wywołany wstrzyknięciem dokomorowym (i.c.v.) koktajlu uwalniającego ma charakter ogniskowy, jest ograniczony do bezpośredniego sąsiedztwa miejsca wstrzyknięcia i pozostawia resztę okołopokomorowej warstwy ependymalnej nienaruszoną.
Profil markerów i in vitro zachowanie zebranych komórek 
Następnie in vitro zachowanie i profil markerowy wyizolowanych komórek poprzez oceniono protokół udoju. Średnia liczba uzyskanych komórek z każdej płynnej biopsji wynosi około 300 ± 45 komórek (na biopsję z 100 µL)7Biopsje metodą „milking” pozwoliły na uzyskanie kultur NSC o średnim potencjale pasażowania wynoszącym 3,17 ± 0,45. Komórki wyizolowane od szczurów wstrzykniętych solą fizjologiczną można było pasażować średnio 1,92 ± 0,76 raza; w przeciwieństwie do nich, komórki wyizolowane poprzez pobieranie mleka trwało nawet do dziewiątego pasażu (p = 0.038, t test) (Rysunek 3A)7Średnia zdolność do pasażowania standardowych kultur neurosfer pochodzących z obszaru SEZ pobranych po śmierci jest w naszych doświadczeniach wyższa niż 12 pasażów. Ponieważ in vivo potencjał ekspansyjny NSC z SEZ, wykazany przez in vivo eksperymenty z mapowania losów komórek14wykazano, że jest ograniczone, dojenie pozwala uzyskać komórki o znacząco odmiennych in vitro zachowanie niż komórki w hodowlach standardowych, choć znacznie bliższe zachowaniu endogennych NSC. Zebrane komórki wysiano do studni pokrytych poli-D-lizyną, gdzie rosły zarówno w formie przylegających monowarstw, jak i – rzadziej – w formie neurosfer (Rycina 3B). Świeżo wyizolowane komórki (zebrane 3 dni po wstrzyknięciu i utrwalone 24 h po wysianiu), które były immunopozytywne w odniesieniu do markera astroglialnego GFAP, wykazano również jako immunopozytywne dla ID3, markera spoczynku, i posiadały charakterystyczną dla NSC morfologię bipolarną (Rycina 3C). Ponadto, jak zgłoszono wcześniej7bardziej szczegółowe porównanie immunocytochemiczne komórek pochodzących z biopsji oraz komórek pobranych po śmierci z tych samych zwierząt, 3 dni po wstrzyknięciu (z analizą obecności astrocytów GFAP+, neuroblastów Dcx+, prekursorów oligodendrocytów PDGFRa+ oraz komórek linii neuronalnej SOX2+), wykazało, że profil zebranych komórek był podobny do profilu endogennych komórek SEZ (Rysunek 3D). Co istotne, po porównaniu komórek pochodzących z biopsji i tkanek w różnych warunkach (np. wstrzyknięcie koktajlu uwalniającego z dodatkiem FGF2 i bez niego), stwierdzono, że czynnik wzrostu spowodował jednoczesny i znaczący wzrost liczby komórek SOX2+ oraz znaczący spadek liczby neuroblastów Dcx+ w obu próbkach (Rycina 3D). Dane te potwierdziły, że wszelkie zmiany pojawiające się w profilu endogennych populacji NSC są odzwierciedlone w próbkach komórek uzyskanych metodą milkingu.
<img alt="Wykres równowagi statycznej; proces adhezji neuronów; przeciwciało blokujące β1-int; konfiguracja biopsji płynnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65308/65308fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1Graficzne podsumowanie procesu udoju. Przekrój wieńczący jednej półkuli mózgu z głównymi punktami orientacyjnymi anatomicznymi (komora boczna, nad nią ciało kal끔ate oraz poniżej komissura anterior [szlaki istoty białej w kolorze szarym] i strefa podependymalna w ścianach bocznych [w kolorze niebieskim]). Koktajl uwalniający jest wstrzykiwany do komory bocznej, co prowadzi do naruszenia integralności tkanki i uwolnienia postnatalnych komórek macierzystych mózgu do płynu mózgowo-rdzeniowego, z którego można je zebrać. poprzez płynne biopsje. Skróty: SEZ = strefa podependymalna; LV = komora boczna; CSF = płyn mózgowo-rdzeniowy; pbNSCs = postnatalne komórki macierzyste mózgu; β1-int = integryna beta1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65308/65308fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna regeneracji tkanki mózgowej, markery DCX, β-catenin, Sox2, 7-14 dni po leczeniu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65308/65308fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ocena histologiczna efektów wstrzyknięć i.c.v. (A-D) Obrazy przy niskim powiększeniu grzbietowej połowy komory bocznej po immunobarwieniu na Dcx (na czerwono, w celu oznaczenia neuroblastów). (A) Proste wprowadzenie strzykawki Hamiltona i.c.v. nie zakłóca cytoarchitektury SEZ, podczas gdy wstrzyknięcie 10 mL i.c.v. (szybkość infuzji 1 mL/min) prowadzi do ciężkiego uszkodzenia ściany komory, niezależnie od zawartości wstrzykniętej substancji. (B) Sól fizjologiczna i (C) koktajl uwalniający. (D) Wstrzyknięcie 2 µL koktajlu uwalniającego prowadzi do kontrolowanego uszkodzenia ściany komory, obserwowanego nawet 8 miesięcy po zabiegu. Szczegóły przy większym powiększeniu ściany SEZ w 7. i 14. dobie po wstrzyknięciu przedstawiono odpowiednio w (E) i (F). Widoczna jest zdezorganizowana struktura, w której neuroblasty Dcx+ (na zielono) spoczywają na powierzchni ściany, a pozostałe komórki niszy (Sox2+, na biało) znajdują się głębiej. Tkanka okołokomorowa jest uszkodzona na poziomie rostrokaudalnym w miejscu wstrzyknięcia w punkcie czasowym 2 miesięcy (w G), podczas gdy tkanka pozostaje nienaruszona na bardziej kaudalnym poziomie (w H) u tego samego zwierzęcia. Ścianę komory oceniono za pomocą immunobarwienia na markery ependymalne S100β i β-catenin. Szczegół typowej architektury ściany przedstawiono w (I). Barwienie jąder przeprowadzono przy użyciu DAPI (na niebiesko). Paski skali = 300 µm (A-C,G,H, wstawki), 150 µm (D), 30 µm (E,F) oraz 50 µm (I). Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy McClenahan et al.13. Skróty: SEZ = strefa podependymalna; i.c.v = dojątkowo-komorowo; Dcx = doublecortin; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65308/65308fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza hodowli komórkowych; A: Wykres słupkowy profili pasażowania; B: Immunofluorescencja markerów komórek macierzystych; C-D: Mikroskopia morfologii komórek; E: Skumulowany wykres słupkowy procentowej ekspresji markerów komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65308/65308fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ocena komórek wyizolowanych via milking. (A) Wykres przedstawiający maksymalną liczbę pasażów uzyskanych z próbki biopsji płynnej od zwierząt wstrzykniętych solą fizjologiczną (szare słupki, łącznie 12 próbek) lub po milkingu (czarne słupki, łącznie 29 próbek, koktajl uwalniający z neuraminidazą i przeciwciałem blokującym integrynę-β1). (B) Reprezentatywny obraz z mikroskopii konfokalnej pierwotnych komórek uzyskanych via milking, 3 dni po wstrzyknięciu, z immunobarwieniem przeciwko GFAP i ID3. (C,D) Obrazy w polu jasnym komórek wyizolowanych 3 dni po wstrzyknięciu, wysianych do studzienek pokrytych poli-D-lizyną i hodowanych w medium do proliferacji NSC przez 7 dni. (E) Wykres przedstawiający profil typów komórek wyizolowanych via milking z SEZ oraz endogennej populacji NSC z SEZ od tych samych zwierząt doświadczalnych. Frakcje SOX2+ i Dcx+ były odpowiednio istotnie zwiększone i zmniejszone po współwstrzyknięciu FGF2. (Analiza ANOVA jednoczynnikowa dla każdego markera, a następnie analiza post hoc; n = 4-6 zwierząt na grupę doświadczalną). Paski skali = 100 µm (C,D) i 10 µm (B). Rycina zmodyfikowana na podstawie pracy McClenahan et al.13. Skróty: SEZ = strefa podependymała; DPI = dni po wstrzyknięciu; NSC = neuralne komórki macierzyste; Dcx = doublecortin; GFAP = glia l fibrillary acidic protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65308/65308fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Metoda izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów z mózgów żywych szczurów jest tutaj przedstawiona w szczegółach eksperymentalnych. Pozwala to na wielokrotne pobieranie tych komórek od tych samych zwierząt bez uszczerbku dla ich dobrostanu.

Metoda "dojenia mózgu" do izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów od żywych szczurów

Tissue-specific neural stem cells (NSCs) remain active in the mammalian postnatal brain. They reside in specialized niches, where they generate new ...

Pracujemy z neuronalnymi komórkami macierzystymi mózgu, bardzo rzadkimi komórkami, które skupiają się w wyspecjalizowanych mikrośrodowiskach zwanych niszami. Chociaż przyczyniają się do węchu, pamięci i uczenia się, są wyjątkowo nieefektywne w napędzaniu regeneracji. W związku z tym badamy ich właściwości i sposoby manipulowania nimi w celu przyspieszenia gojenia się tkanki nerwowej.Wykazaliśmy, że udział nerwowych komórek macierzystych mózgu w regeneracji jest ograniczony przez czynniki endogenne i endogenne, takie jak ich ograniczony potencjał różnicowania oraz zależność od czynników mikrośrodowiska. Zidentyfikowaliśmy również kluczowe właściwości, które można wykorzystać do opracowania strategii modulowania ich zdolności. Protokół doju pozwala na pobranie komórek progenitorowych neuronów mózgowych i oligodendrocytów od żywych zwierząt doświadczalnych.Tym samym pozwala na bardziej nieprzerwaną analizę ich właściwości i wykonywanie badań podłużnych. Obecnie nie ma alternatywnych technik izolacji mysich komórek macierzystych i progenitorowych mózgu od żywych zwierząt doświadczalnych. Obecnym standardem porównawczym jest pośmiertna izolacja takich komórek, co wprowadza różne niepewności eksperymentalne i błąd biologiczny.Obecnie badamy, w jaki sposób neuronalne komórki macierzyste mózgu są aktywowane przez istniejący stan spoczynku. Porównujemy również właściwości różnych populacji przodków mózgu. Na przykład neurogenne i oligodendrogeniczne, w celu określenia ich zróżnicowanych właściwości i adaptacji do zróżnicowanego środowiska mikrośrodowiskowego.

the-brain-milking-method-for-isolation-neural-stem-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje szczegółowy protokół izolowania ścian bocznych komór od mózgu dorosłej myszy i przeprowadzania enzymatycznej dysocjacji tkanek w celu uzyskania pojedynczych komórek. Komórki te są następnie poddawane specyficznym warunkom hodowli, które selektywnie zwiększają proliferację nerwowych komórek macierzystych i promują ich różnicowanie w kokultury oligodendrocytów i astrocytów.

Uzyskiwanie mieszanej kultury oligodendrocytów i astrocytów z dorosłych komórek macierzystych nerwowych myszy

Ten film pokazuje proces izolowania mikronaczyń mózgowych od szczurów poddanych eutanazji. Obejmuje preparację mózgu, oczyszczanie tkanki i trawienie mechaniczne, a następnie wielokrotne wirowanie w celu wyizolowania czystej frakcji mikronaczyń.

Metoda izolacji jednostek nerwowo-naczyniowych z mózgu szczura

Ten film przedstawia metodę izolowania nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z tkanki okołokomorowej rdzenia kręgowego u dorosłych szczurów. Technika ta obejmuje inkubację fragmentów tkanek w roztworze zawierającym enzymy proteolityczne w celu zakłócenia macierzy zewnątrzkomórkowej i uwolnienia komórek. Następnie uwolnione komórki są siane w pożywce zawierającej specyficzne czynniki wzrostu, które zwiększają proliferację neuronalnych komórek macierzystych / progenitorowych i promują...

Izolacja nerwowych komórek progenitorowych łodygi z obszaru okołokomorowego rdzenia kręgowego dorosłego szczura

Ten film demonstruje metodę izolowania pierwotnych komórek oligodendrocytów z zawiesiny komórek nerwowych uzyskanej od mysiego szczeniaka za pomocą separacji magnetycznej. Technika ta wykorzystuje kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami specyficznymi dla antygenów oligodendrocytów, co umożliwia selektywną izolację tych komórek.

Izolowanie mysich pierwotnych oligodendrocytów za pomocą kulek immunomagnetycznych

Neuronalne komórki macierzyste pobrane z dorosłego mózgu są coraz częściej wykorzystywane w różnych zastosowaniach, począwszy od podstawowych badań nad rozwojem układu nerwowego, a skończywszy na odkrywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej. To sprawia, że rygorystyczna kontrola warunków izolacji i hodowli stosowanych do hodowli tych komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania solidnych wyników eksperymentalnych.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Rdzeń kręgowy dorosłego ssaka zawiera nerwowe komórki macierzyste/progenitorowe (NSPC), które mogą być izolowane i rozwijane w hodowli. Protokół ten opisuje pobieranie, izolację, hodowlę i pasażowanie NSPC generowanych z obszaru okołokomorowego dorosłego rdzenia kręgowego od szczura i od dawców narządów po przeszczepie.

Izolacja nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z obszaru okołokomorowego dorosłego szczura i ludzkiego rdzenia kręgowego

Oligodendrocyty to komórki mielinizujące ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje metodę izolacji i hodowli ich prekursorów, komórek progenitorowych oligodendrocytów, z kory szczura, a także szybką i wiarygodną metodę ilościową oceny oligodendrogenezy in vitro w odpowiedzi na czynniki eksperymentalne.

Przygotowanie hodowli progenitorowych oligodendrocytów szczurów i kwantyfikacja oligodendrogenezy za pomocą skanowania fluorescencyjnego w podwójnej podczerwieni

Ten protokół opisuje wytwarzanie systemu hodowli komórek, który umożliwia wysiewanie komórek macierzystych na przewodzącym rusztowaniu polimerowym do stymulacji elektrycznej in vitro, a następnie implantację in vivo rusztowania z komórek macierzystych przy użyciu techniki minimalnie inwazyjnej.

Rusztowanie przewodzące prąd elektryczny do modulacji i dostarczania komórek macierzystych

Opisujemy immunomagnetyczną izolację pierwotnych oligodendrocytów myszy, która pozwala na szybką i specyficzną izolację komórek do hodowli in vitro.

Szybka i swoista izolacja immunomagnetyczna pierwotnych oligodendrocytów myszy

Opisujemy produkcję mieszanych kultur astrocytów i komórek prekursorowych oligodendrocytów pochodzących z płodowych lub dorosłych nerwowych komórek macierzystych różnicujących się w dojrzałe oligodendrocyty, oraz modelowanie in vitro szkodliwych bodźców. Połączenie z techniką badań przesiewowych o wysokiej zawartości komórek tworzy niezawodny i solidny system badań przesiewowych leków.

Analiza przesiewowa, różnicowanie i dojrzewanie płodowych i dorosłych komórek macierzystych pochodzących z płodowych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Poznaj metodę "dojenia mózgu" do izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów od żywych szczurów. Technika umożliwia wielokrotne pobieranie komórek bez uszczerbku dla dobrostanu zwierząt.

Metoda "dojenia mózgu" do izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów od żywych szczurów

Przeglądaj więcej filmów