Name: Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Poznaj funkcjonalną fluorometrię ukierunkowaną na miejsce w komórkach natywnych do badania pobudliwości mięśni szkieletowych myszy. Ta metoda umożliwia śledzenie ruchów sensorów napięcia Kv1.1 w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. J. Vergara (University of California, Los Angeles) za udostępnienie plazmidu dzikiego typu EGFP-CaV1.1 (królik). Dziękujemy Wydziałowi Fizjologii, Laboratorium Elektroniki Uniwersytetu Yale, a w szczególności Henrikowi Abildgaardowi za zaprojektowanie i zbudowanie fotodiody z obwodem torowania i podtrzymywania. Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health R01-AR075726 i R01-NS103777

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Skeletal Muscle Cells

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

W tym miejscu opisano krok po kroku protokół przeprowadzania FSDF we włóknach mięśniowych w celu badania ruchów poszczególnych czujników napięcia z kanału CaV1.1. Mimo że liczba etapów i różnorodność podejść, które są łączone w tej technice, może wydawać się złożona, większość z tych technik jest często rutynowo stosowana w laboratoriach biofizyków/biologów komórkowych. W związku z tym pozorna złożoność polega głównie na połączeniu wszystkich różnych podejść w jednej zintegrowanej technice. Często przy przepro...

Możliwość śledzenia reorganizacji konformacyjnych kanałów jonowych w odpowiedzi na znany bodziec elektryczny w żywej komórce jest źródłem cennych informacji dla fizjologii molekularnej1. Kanały jonowe bramkowane napięciem to białka błonowe, które wyczuwają zmiany napięcia transbłonowego, a na ich funkcję wpływają również zmiany napięcia2. Rozwój technik cęgów napięcia w ubiegłym stuleciu pozwolił fizjologom badać w czasie rzeczywistym prądy jonowe przenoszone przez kanały jonowe bramkowane napięciem w odpowiedzi na depolaryzację membrany3. Zastosowanie technologii cęgów napięciowych miało kluczowe znaczenie dla zrozumienia właściwości elektrycznych komórek pobudliwych, takich jak neurony i mięśnie. W latach siedemdziesiątych XX wieku udoskonalenie cęgów napięciowych pozwoliło na wykrycie prądów bramkujących (lub ruchu ładunku) w kanałach wapniowych (CaV) i sodowych (NaV) bramkowanych napięciem4,5. Prądy bramkowania to nieliniowe prądy pojemnościowe, które powstają w wyniku ruchu czujników napięcia w odpowiedzi na zmiany pola elektrycznego przez błonę komórkową6. Prądy bramkowania są uważane za elektryczną manifestację przegrupowań molekularnych, które poprzedzają lub towarzyszą otwarciu kanału jonowego7. Podczas gdy te pomiary prądu dostarczają cennych informacji na temat funkcji kanału, zarówno prądy jonowe, jak i prądy bramkowania są pośrednimi odczytami między- i wewnątrzcząsteczkowych rearanżacji konformacyjnych kanałów bramkowanych napięciem7.
Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce (FSDF; określana również jako fluorometria zacisków napięcia, VCF) została opracowana na początku lat 90. < klasa sup="xref">8 i po raz pierwszy zapewniła możliwość bezpośredniego podglądu lokalnych zmian konformacyjnych i funkcji białka kanałowego w czasie rzeczywistym. Korzystając z kombinacji mutagenezy kanałowej, elektrofizjologii i heterologicznych systemów ekspresji, możliwe jest fluorescencyjne znakowanie i śledzenie ruchomych części określonych kanałów lub receptorów w odpowiedzi na bodziec aktywujący9,10. Podejście to jest szeroko stosowane do badania mechanizmów wykrywania napięcia w kanałach jonowych bramkowanych napięciem8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. Aby uzyskać wiarygodne recenzje, zobacz10,20,21,22,23.
Kanały CaV i NaV, kluczowe dla inicjacji i propagacji sygnałów elektrycznych, składają się z głównej podjednostki α1, która posiada centralny por i cztery nieidentyczne domeny wykrywania napięcia2. Oprócz ich odrębnej struktury podstawowej, kanały CaV i NaV są wyrażone jako kompleksy wielopodjednostkowe z podjednostkami pomocniczymi24. Kanały potasowe zależne od napięcia (KV) składają się z czterech podjednostek, które wyglądają jak pojedyncza domena NaV lub CaV25. Tworząca pory i wykrywająca napięcie podjednostka α1 kanałów CaV i NaV jest tworzona przez pojedynczy polipeptyd kodujący cztery indywidualne domeny sześciu unikalnych segmentów transbłonowych (S1-S6; <silna klasa="xfig">Rysunek 1A)24,26. Obszar składający się z segmentów transbłonowych S1 do S4 tworzy domenę wykrywania napięcia (VSD), a segmenty transbłonowe S5 i S6 tworzą domenę porów26. W każdym VSD α-helisa S4 zawiera dodatnio naładowaną argininę lub lizynę (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1A,B), które poruszają się w odpowiedzi na depolaryzację błony<klasa sup = "xref">7. Kilka dekad badań i wyniki bardzo zróżnicowanych podejść eksperymentalnych wspierają założenie, że segmenty S4 poruszają się na zewnątrz, generując prądy bramkowania, w odpowiedzi na depolaryzację błony6.
FSDF mierzy zmiany fluorescencji barwnika reagującego tiolem sprzężonego z określoną resztą cysteiny (tj. α-helisą S4) na kanale jonowym lub innym białku, zaprojektowanym za pomocą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce, ponieważ kanał działa w odpowiedzi na depolaryzację błony lub inne bodźce10. W rzeczywistości FSDF został pierwotnie opracowany w celu zbadania, czy segment S4 w kanałach KV, zaproponowany jako główny czujnik napięcia kanału, porusza się, gdy ładunki bramkowania poruszają się w odpowiedzi na zmiany potencjału błony8,10. W przypadku kanałów jonowych bramkowanych napięciem, FSDF może rozwiązać niezależne rearanżacje konformacyjne czterech VSD (śledząc jeden VSD w danym momencie), jednocześnie z pomiarami funkcji kanału. Rzeczywiście, stosując to podejście, wykazano, że poszczególne VSD wydają się być w różny sposób zaangażowane w określone aspekty aktywacji i dezaktywacji kanałów12,27,28,29,30. Określenie udziału każdego VSD w funkcjonowaniu kanałów ma duże znaczenie i może być wykorzystane do dalszego wyjaśnienia działania kanału i potencjalnej identyfikacji nowych celów dla rozwoju leków.
Użycie FSDF w heterologicznych systemach ekspresji było niezwykle pomocne w pogłębianiu naszego zrozumienia funkcji kanału z perspektywy redukcjonistycznej10,23. Podobnie jak wiele podejść redukcjonistycznych, ma ono zalety, ale ma również ograniczenia. Na przykład jednym z głównych ograniczeń jest częściowa rekonstrukcja nanośrodowiska kanału w układzie heterologicznym. Często kanały jonowe oddziałują z licznymi podjednostkami pomocniczymi i wieloma innymi białkami, które modyfikują ich funkcję31. Zasadniczo, różne kanały i ich podjednostki pomocnicze mogą być wyrażane w układach heterologicznych za pomocą wielu konstruktów kodujących białka lub plazmidów policistronicznych, ale ich natywne środowisko nie może być w pełni odtworzone30,32.
Nasza grupa niedawno opublikowała wariant FSDF w natywnych zdysocjowanych włóknach mięśni szkieletowych do badania wczesnych etapów sprzężenia pobudzenie-skurcz (ECC)33,34, proces, w którym depolaryzacja elektryczna włókien mięśniowych jest powiązana z aktywacją skurczu mięśni35,36. Po raz pierwszy podejście to pozwoliło na śledzenie ruchu poszczególnych czujników napięcia S4 z bramkowanego napięciem kanału Ca2+ typu L (CaV1.1, znanego również jako DHPR) w natywnym środowisku dorosłego zróżnicowanego włókna mięśniowego37. Osiągnięto to, biorąc pod uwagę wiele cech tego typu komórek, w tym aktywność elektryczną komórki umożliwiającą szybką samopropagującą się depolaryzację wywołaną stymulacją, zdolność do ekspresji plazmidu cDNA poprzez elektroporację in vivo, naturalną wysoką ekspresję i organizację kompartmentów kanałów w komórce oraz jego kompatybilność z szybkimi urządzeniami do obrazowania i rejestracji elektrofizjologicznej. Wcześniej używaliśmy szybkiego liniowego skaningowego mikroskopu konfokalnego jako urządzenia wykrywającego37. Teraz przedstawiono odmianę tej techniki wykorzystującą fotodiodę do akwizycji sygnału. Ten oparty na fotodiodach system detekcji może ułatwić wdrożenie tej techniki w innych laboratoriach.
Tutaj opisany jest krok po kroku protokół do wykorzystania FSDF w natywnych komórkach do badania ruchu poszczególnych czujników napięcia z CaV1.1. Podczas gdy kanał CaV1.1 został użyty jako przykład w całym tym manuskrypcie, technika ta może być zastosowana do zewnątrzkomórkowych domen innych kanałów jonowych, receptorów lub białek powierzchniowych.

<table><tbody><tr><td>Hialuronidaza</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>H3884-50mg</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Probówka Eppendorf</td><td>Millipore Sigma</td><td>EP022363719-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z683531-100EA</td><td>rurkowa końcówka poślizgowa</td></tr><tr><td>Sterylna igła i strzykawka do insuliny o długości 1/2 cala i rozmiarze 29 Becton</td><td>Dikinson</td><td>324702</td><td></td></tr><tr><td>35 mm niepowlekana plastikowa płytka</td><td>Falcon, Corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>60 mm niepowlekana płyta z tworzywa sztucznego</td><td>Falcon, Corning</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Bicz alkoholowy</td><td>PDI</td><td>B60307</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-533 kostka LP</td><td>Chroma</td><td>49907</td><td>Ex: 530/30x; BS: 532; Em: 550lp</td></tr><tr><td>Lampa łukowa</td><td>Sutter Instrumets</td><td>LB-LS 672</td><td></td></tr><tr><td>Krem ze sztucznymi łzami</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>Szkło borokrzemianowe Pipeta Pasteura 5 3/4"</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>BTS (N-benzylo-p-toluenosulfonamid)</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>203895</td><td></td></tr><tr><td>kolagenaza typ I</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>C0130-1g</td><td></td></tr><tr><td>Bawełniana końcówka</td><td>VWR</td><td>VWR-76048-960-BG</td><td></td></tr><tr><td>Układ podwójnych elektrod&nbsp; (do elektroporacji)</td><td>BTX harvard apparatus</td><td>45-0120</td><td>10mm 2 końcówki igłowe</td></tr><tr><td>EGFP kostka</td><td>Chroma</td><td>39002AT</td><td>Ex: 480/30x; Zobacz materiał BS 505; Em: 535/40m</td></tr><tr><td>Aparatura do elektroporacji</td><td>BTX harvard apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>EPC10</td><td>HEKA Elektronik GmbH&nbsp; (Harvard Bioscience)</td><td>895000</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biotechne,&nbsp; R& D Systems</td><td>RND-S11150H</td><td>Płodowa surowica bydlęca - Premium, szkło inaktywowane termicznie</td></tr><tr><td>Nakrywka 35 mm</td><td>MatTek Life Science</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Fluriso (Izofluran) Płyn do inhalacji</td><td>502017-250ml</td><td></td></tr><tr><td>Izotermiczna poduszka grzewcza</td><td>Braintree scientific inc</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Fisher</td><td>INV-23017015</td><td>Białko myszy Laminin, żarówka z naturalnego</td></tr><tr><td>lateksu</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>LED 530 nm</td><td>Sutter Instrumets</td><td>5A-530</td><td></td></tr><tr><td>Białko o niskim poziomie wiązania 0,2 i mu; m sterylny filtr</td><td>Pall</td><td>FG4579</td><td>acrodisk&nbsp; filtr strzykawkowy 0,2um membrana suporowa niskie wiązanie białek niepirogenny</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>INV-11380037</td><td></td></tr><tr><td>MTS-5-TAMRA</td><td>Biotium</td><td>89410-784</td><td>MTS-5-TAMRA</td></tr><tr><td>Oprogramowanie analityczne OriginPro</td><td>OriginLab Corporation</td><td>OriginPro 2022 (64-bitowa) SR1</td><td></td></tr><tr><td>Fotodioda</td><td>Wykonane na zamówienie</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>PlanApo 60x oil&nbsp; 1.4 N.A/&infin;/0.17</td><td>Olympus</td><td>BFPC2</td><td></td></tr><tr><td>Drut platynowy 0,5 mm, 99.9 % na bazie metali</td><td>SIGMA</td><td>267228-1G</td><td>Do produkcji elektrody do stymulacji pola</td></tr><tr><td>Generator impulsów</td><td>WPI</td><td>Pulsemaster A300</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik napędu migawki</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>Shuttter</td><td>Uniblitz</td><td>VS2582T0-100</td><td></td></tr><tr><td>S-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>INV-11380037</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna podkładka stołowa</td><td>VWR</td><td>DSI-B1623</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>1419447-1198</td><td></td></tr><tr><td>Waporyzator do znieczulenia</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PK</td><td></td></tr><tr><td>Generator napięcia</td><td>Custom Made</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych

Functional Site-Directed Fluorometry in Native Cells to Study Skeletal Muscle Excitability

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce była techniką z wyboru do badania zależności struktura-funkcja wielu białek błonowych, w tym kanałów jonowych bramkowanych napięciem. Podejście to było stosowane głównie w heterologicznych systemach ekspresyjnych do jednoczesnego pomiaru prądów błonowych, elektrycznej manifestacji aktywności kanałów i pomiarów fluorescencji, raportujących lokalne rearanżacje domen. Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce łączy elektrofizjologię, biologię molekularną, chemię i fluorescencję w jedną szeroko zakrojoną technikę, która umożliwia badanie przegrupowań strukturalnych i funkcji w czasie rzeczywistym odpowiednio za pomocą fluorescencji i elektrofizjologii. Zazwyczaj takie podejście wymaga zaprojektowanego kanału membranowego bramkowanego napięciem, który zawiera cysteinę, którą można przetestować za pomocą tiolowo-reaktywnego barwnika fluorescencyjnego. Do niedawna chemia tiolowo-reaktywna stosowana do fluorescencyjnego znakowania białek była przeprowadzana wyłącznie w oocytach i liniach komórkowych Xenopus, co ograniczało zakres podejścia do pierwotnych komórek niepobudliwych. W niniejszym raporcie opisano zastosowanie funkcjonalnej fluorometrii ukierunkowanej na miejsce w dorosłych komórkach mięśni szkieletowych do badania wczesnych etapów sprzężenia pobudzenie-skurcz, procesu, w którym depolaryzacja elektryczna włókien mięśniowych jest powiązana z aktywacją skurczu mięśni. Niniejszy protokół opisuje metodologie projektowania i transfekcji kanałów Ca2 + bramkowanych napięciem za pomocą cysteiny (CaV1.1) do włókien mięśniowych zginacza palca brevis dorosłych myszy przy użyciu elektroporacji in vivo oraz kolejne kroki wymagane do funkcjonalnych pomiarów fluorometrii skierowanej w miejsce. Podejście to można zaadaptować do badania innych kanałów jonowych i białek. Zastosowanie funkcjonalnej fluorometrii mięśni ssaków jest szczególnie istotne dla badania podstawowych mechanizmów pobudliwości.

Gdy w odpowiedzi na powtarzalną stymulację polową wyzwalane są propagujące potencjały czynnościowe, możliwe jest śledzenie ruchu konkretnego czujnika napięcia w odpowiedzi na określoną częstotliwość depolaryzacji. Jak pokazano na Rysunku 6A, ruch helis znakowanych VSD-II można śledzić w odpowiedzi na każdą z dwóch następujących po sobie depolaryzacji przy częstotliwości 10 Hz (tj. w odstępach 100 ms). Wypalenie sygnału można skorygować poprzez odjęcie linii bazowej od zapisu (<strong class="...

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce to metoda badania ruchów domen białek w czasie rzeczywistym. Modyfikacja tej techniki pod kątem jej zastosowania w komórkach natywnych umożliwia teraz wykrywanie i śledzenie ruchów pojedynczego czujnika napięcia z bramkowanych napięciem kanałów Ca2+ w mysich izolowanych włóknach mięśni szkieletowych.

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych

Functional site-directed fluorometry has been the technique of choice to investigate the structure-function relationship of numerous membrane proteins, ...

Kv1.1, członek kanałów jonowych bramkowanych napięciem, ma cztery odrębne czujniki napięcia. Dowody sugerują, że niektóre czujniki napięcia w większym stopniu przyczyniają się do aktywacji receptora ryanodynowego lub prądu wapniowego. Naszym celem jest zidentyfikowanie dokładnej roli każdego czujnika napięcia w wzbudzeniu, skurczu, sprzężeniu i aktywacji kanału wapniowego.Sprzężenie wzbudzenia i skurczu jest badane od wczesnych lat 50., jednak szczegóły molekularne zachodzące w tym procesie są nadal nieznane. Niedawny postęp w strukturze kanału w mikroskopie krioelektronowym, charakterystyka nowego białka pomocniczego Kv1.1, odkrycie alternatywnych wariantów splicingu kanałów oraz identyfikacja mutacji powodujących chorobę ponownie rozbudziły zainteresowanie tą dziedziną. W naszej dziedzinie stosuje się wiele technik, od klasycznej elektrofizjologii i biologii molekularnej po bardziej nowatorskie techniki, takie jak mikroskopia krioelektronowa, symulacja dynamiki molekularnej, ukierunkowana degradacja białek i funkcjonalna fluorometria ukierunkowana bocznie, a także komórki inżynieryjne lub modele zwierzęce.Obecnie dziedzina ta stoi przed kilkoma wyzwaniami eksperymentalnymi. W mięśniach szkieletowych prawidłowy transport i komunikacja między Kv1.1 i RYR1, wraz z wieloma białkami regulatorowymi, ma kluczowe znaczenie dla wspierania sprzężenia skurczu wzbudzenia. Brakuje metod bezpośredniego badania tych interakcji białko-białko między Kv1.1 i RYR1 lub są one niekompletne.Laboratorium dr Martina Schneidera od dziesięcioleci pracuje nad sprzężeniem wzbudzenia-skurczu, charakteryzując mechanizmy wykrywania napięcia w Kv1.1, uwalnianiu wapnia i zlokalizowane w zdarzeniach uwalniania wapnia, znanych jako iskry wapniowe. W ostatnim czasie nasze laboratorium wdraża nowe techniki optyczne do badania różnych etapów sprzężenia wzbudzenie-skurcz i ruchu czujnika napięcia w funkcjonujących dorosłych komórkach mięśniowych. Chociaż robiono to już wcześniej w heterologicznym systemie ekspresji, nasz protokół umożliwia teraz śledzenie potwierdzających zmian w czujnikach napięcia Kv1.1 podczas propagowanego potencjału czynnościowego w jego natywnym środowisku.Nasza nowa technika pozwoli nam zbadać precyzyjny ruch czujnika napięcia potrzebnego do sprzężenia wzbudzenia-skurczu. Chcemy wiedzieć, które reszty ładunku w każdym S4 są krytyczne dla jego funkcji, lub dokładnie każda translokacja S4 i cała ta translokacja jest związana z otwarciem Kv1.1 lub aktywacją receptora reanogenu. Aby rozpocząć, wygeneruj konstrukcję CaV1.1 CDNA typu dzikiego, oznaczoną fluorescencyjnie.W tym przypadku stosuje się powłokę plazmidową dla wzmocnionego białka zielonej fluorescencji lub znakowanej EGFP podjednostki alfa wściekłego Cav1.1. Obecność promotora wirusa cytomegalii pozwala na dużą skuteczność transfekcji we włóknach mięśniowych. Wprowadź substytucję cysteiny do kanału, który byłby śledzony za pomocą fluorometrii, przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce.Tutaj cysteiny są wprowadzane w pozycji odpowiadającej błonowemu interfejsowi zewnątrzkomórkowemu jednego z czterech S4 kanału. Za pomocą obserwacji GFP i rejestracji prądu jonowego potwierdzono, że ani wprowadzone cysteiny, ani obecność barwnika reagującego z tiolem nie wpływają na zależność od napięcia i przewodność kanału. Włącz wszystkie składniki konfiguracji akwizycji dla pomiaru fluorometrii.Umieść 35-milimetrowe naczynie ze szklanym dnem zawierające zdysocjowane włókna mięśniowe na stoliku mikroskopu. Ostrożnie usuń pożywkę hodowlaną za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i zastąp ją dwoma mililitrami roztworu Ringera o temperaturze pokojowej. Za pomocą mechanicznego lub zmotoryzowanego manipulatora umieść dwa platynowe druty prostopadle do dna naczynia.Upewnij się, że końcówki elektrod są wyrównane względem osi podłużnej włókien i w odległości kilku milimetrów od włóknistych końców. Dostosuj położenie elektrody, obracając czaszę lub przesuwając każdą elektrodę, jeśli jest zamontowana na niezależnym mikromanipulatorze. Włącz światło przechodzące i znajdź włókna w polu widzenia za pomocą obiektywu 20X.Przesuń kostkę filtra EGFP na ścieżkę światła. Po wyłączeniu światła przepuszczanego aktywuj światło wzbudzenia o długości fali 488 nanometrów za pomocą zdalnie sterowanej migawki świetlnej. Aby zidentyfikować włókna dodatnie EGFP, wyśrodkuj włókna z najjaśniejszym sygnałem EGFP w środku pola widzenia.Użyj membrany umieszczonej na ścieżce światła wzbudzenia, aby skupić światło wzbudzenia w określonym obszarze światłowodu. Umożliwia to akwizycję sygnału tam, gdzie sygnał EGFP Cav1.1 jest maksymalny. Dostosuj położenie światłowodu za pomocą stolika mechanicznego, aby wyrównać się ze ścieżką światła membrany i zapisać lokalizację XY światłowodu.Po powrocie do pierwszej zapisanej lokalizacji należy ustawić czas trwania dwóch sekwencyjnych impulsów stymulacji na jedną milisekundę, amplitudę na 20 woltów, a biegunowość impulsów na naprzemienną. Następnie użyj ręcznego przełącznika spustowego, aby dostarczyć dwa sekwencyjne impulsy. Podczas stymulacji obserwuj dwa koncentryczne skurcze jednorodnych włókien w odpowiedzi na dwa impulsy o przeciwnej polaryzacji.Jeśli nie obserwuje się skurczu lub obserwuje się tylko jeden koncentryczny skurcz z impulsami o zmiennej polaryzacji, wyrzuć włókna z reszty eksperymentu. Dodaj dwa mikrolitry 10-milimolowego roztworu MTS-5-TAMRA bezpośrednio do naczynia i delikatnie wymieszaj pipetą o pojemności 1 000 mikrolitrów. Inkubować przez cztery do pięciu minut, aby umożliwić dyfuzję fluorescencyjnej cząsteczki tiolu do światła systemu kanalików poprzecznych.Poprzez stymulację polową zastosuj dwubiegunowe powtarzające się stymulacje, aby wywołać kolejne pociągi potencjału czynnościowego z częstotliwością 50 Hz przez 300 milisekund co sekundę przez pięć minut. Usuń roztwór barwiący z naczynia za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i zastąp go dwoma mililitrami roztworu dzwonka o temperaturze pokojowej. Pozwól poplamionemu włóknu zregenerować się po protokole barwienia przez co najmniej 10 minut.Po ponownej ocenie stanu włókien i aktywności elektrycznej za pomocą dwóch naprzemiennych impulsów, przenieś kostkę filtrującą MTS-5-TAMRA na ścieżkę światła i aktywuj światło wzbudzające o długości 533 nanometrów za pomocą zdalnie sterowanej przesłony świetlnej, aby wizualnie potwierdzić barwienie włókien. Następnie, korzystając z zapisanej lokalizacji na zmotoryzowanej scenie, umieść włókno na środku pola z kostką filtrującą MTS-5-TAMRA, membraną i obiektywem zanurzeniowym 60X. Po zmianie orientacji platynowych drutów stymulujących pole na każdym końcu światłowodu, ustaw druty na głównej osi włókien w linii prostej i rozstaw je w odległości pięciu milimetrów od siebie z włóknem pośrodku.W oprogramowaniu do akwizycji wybierz protokół, który będzie używany do akwizycji. Ten krok jest kontrolowany tylko za pomocą komputera i uruchamia wszystkie urządzenia znajdujące się za nim w celu stymulacji elektrycznej i sterowania żaluzją ścieżki światła. Dla każdego protokołu zminimalizuj całkowity czas akwizycji tak bardzo, jak to możliwe, aby uniknąć blaknięcia sygnału, ale pozwól na kilkadziesiąt milisekund oświetlenia światłem i akwizycji sygnału przed pierwszą stymulacją elektryczną, aby zarejestrować linię bazową.Uruchom protokół, naciskając przycisk Wykonaj. Nagrany sygnał jest automatycznie wyświetlany na ekranie. Mała amplituda sygnału i szybkie mechaniczne kurczenie się światłowodu często ukrywają większość sygnału i wyświetlają artefakt ruchu.Dodać jeden mikromol 100 milimolów i benzoilu na sulfonimid toluenu do roztworu rejestrującego, aby zminimalizować odpowiedzi umowne i dalej rozróżnić sygnał powstający z ruchów S4 w wyniku aktywacji światłowodu. Po kilku minutach uruchom ten sam protokół po raz drugi. Artefakt ruchu jest teraz usuwany, ale niewielka zmiana fluorescencji odpowiadająca ruchowi S4 pozostaje.Lekko przesuń antenę za pomocą stolika mechanicznego, aby uzyskać sygnał z obszaru bez żadnych włókien ani zanieczyszczeń. Uruchom protokół po raz ostatni, aby zarejestrować fluorescencję tła, wyeksportuj ślady i użyj programu arkusza kalkulacyjnego, aby wyrazić sygnał jako Delta F powyżej F zero w funkcji czasu i w razie potrzeby zastosuj korekcję linii bazowej. Przedstawiono tutaj przykłady transmitowanych i fluorescencyjnych obrazów rozciętego i niezdysocjowanego mięśnia wyrażającego konstrukt EGFP Kv1.1.Reprezentatywne obrazy włókna mięśniowego wyrażającego konstrukt EGFP Kv1.1 VSD3 przed i po barwieniu MTS-5-TAMRA pokazano na tym rysunku. Barwnik ten barwi również endogenne cysteiny włókien nietransfekowanych. Obrazy konfokalne konstruktu EGFP Kv1.1 VSD3 i barwienia MTS-5-TAMRA pokazują wzór dwupasmowy, charakterystyczny dla lokalizacji Kv1.1 w układzie kanalików poprzecznych włókna mięśniowego.Reprezentatywny zapis fluorometryczny w odpowiedzi na dwa bodźce i mierzony za pomocą fotodiody pokazano tutaj. Oba sygnały są normalizowane przez ich minimalną wartość i wykreślane jako funkcja czasu w stosunku do ich odpowiedniej depolaryzacji. Z nagrań tych wynika, że faza narastania i czas do szczytu sygnału są podobne dla obu depolaryzacji nałożonych na światłowód.

functional-site-directed-fluorometry-native-cells-to-study-skeletal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy szczegółowe procedury wydajnej transfekcji plazmidowego DNA do włókien mięśni stop żywych myszy z wykorzystaniem elektroporacji oraz następującej po niej wizualizacji ekspresji białka za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Transfekcja DNA mięśni szkieletowych ssaków z wykorzystaniem elektroporacji in vivo

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Opisana tutaj jest metoda bezpośredniego pomiaru iskier wapniowych, podstawowych jednostek uwalniania Ca2+ z siateczki sarkoplazmatycznej w nienaruszonych włóknach mięśni szkieletowych. Metoda ta wykorzystuje wyzwalanie za pośrednictwem stresu osmotycznego uwalniania Ca2 + z receptora ryanodine w izolowanych włóknach mięśniowych. Dynamika i zdolność homeostatyczna wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2 + można wykorzystać do oceny funkcji mięśni w zdrowiu i chorobie.

Ocena iskier wapniowych w nienaruszonych włóknach mięśni szkieletowych

Ten protokół wykorzystuje elektroporację do wprowadzania i ekspresji fluorescencyjnie znakowanych białek we włóknach mięśniowych myszy. Po rekonwalescencji po elektroporacji włókna są izolowane. Poszczególne włókna są następnie obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu wizualizacji struktury mięśni.

Elektroporacja DNA, izolacja i obrazowanie włókien mięśniowych

Tutaj opisujemy metodologię uzyskiwania czystej populacji ludzkich mioblastów z dorosłej tkanki mięśniowej. Komórki te są wykorzystywane do badania różnicowania mięśni szkieletowych in vitro, a w szczególności do badania białek zaangażowanych w sygnalizację Ca2 +.

Izolacja ludzkich mioblastów, ocena różnicowania miogennego i pomiar wejścia wapnia w magazynie

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Mutageneza celowana całych plazmidów to prosty sposób na stworzenie nieco odmiennych wariantów oryginalnego plazmidu. W niniejszej pracy demonstrujemy łatwą i kosztowo efektywną metodę wprowadzania substytucji zasad w plazmidzie przy użyciu standardowych odczynników.

Własna metoda mutagenezy celowanej całych plazmidów

Technika mikrodysekcji eksplantów jest solidną i niezawodną metodą izolacji proliferujących komórek mięśni szkieletowych z mięśni młodocianych, dorosłych lub embrionalnych w celu pozyskania macierzystych komórek mięśni szkieletowych. Wyjątkowo komórki te zostały wyprowadzone klonalnie, co pozwoliło na stworzenie linii macierzystych komórek mięśni szkieletowych wykorzystywanych do transplantacji in vivo.

Kultura mikroeksplantów szkieletowych mięśni dorosłych i embrionalnych oraz izolacja komórek macierzystych mięśni szkieletowych

Niniejszy protokół opisuje procedurę badania oddychania mitochondriów izolowanych z mięśni szkieletowych. Metoda ta została opracowana na podstawie pracy Scorrano et al. (2007). Procedura izolacji mitochondriów zajmuje około 2 godzin. Pomiar oddychania mitochondriów może zostać ukończony w ciągu około 1 godziny.

Izolacja mitochondriów z mięśni szkieletowych

Poznaj funkcjonalną fluorometrię ukierunkowaną na miejsce w komórkach natywnych do badania pobudliwości mięśni szkieletowych myszy. Ta metoda umożliwia śledzenie ruchów sensorów napięcia Kv1.1 w czasie rzeczywistym.

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych

Przeglądaj więcej filmów