Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych

Kv1.1, członek kanałów jonowych bramkowanych napięciem, ma cztery odrębne czujniki napięcia. Dowody sugerują, że niektóre czujniki napięcia w większym stopniu przyczyniają się do aktywacji receptora ryanodynowego lub prądu wapniowego. Naszym celem jest zidentyfikowanie dokładnej roli każdego czujnika napięcia w wzbudzeniu, skurczu, sprzężeniu i aktywacji kanału wapniowego.

Sprzężenie wzbudzenia i skurczu jest badane od wczesnych lat 50., jednak szczegóły molekularne zachodzące w tym procesie są nadal nieznane. Niedawny postęp w strukturze kanału w mikroskopie krioelektronowym, charakterystyka nowego białka pomocniczego Kv1.1, odkrycie alternatywnych wariantów splicingu kanałów oraz identyfikacja mutacji powodujących chorobę ponownie rozbudziły zainteresowanie tą dziedziną. W naszej dziedzinie stosuje się wiele technik, od klasycznej elektrofizjologii i biologii molekularnej po bardziej nowatorskie techniki, takie jak mikroskopia krioelektronowa, symulacja dynamiki molekularnej, ukierunkowana degradacja białek i funkcjonalna fluorometria ukierunkowana bocznie, a także komórki inżynieryjne lub modele zwierzęce.

Obecnie dziedzina ta stoi przed kilkoma wyzwaniami eksperymentalnymi. W mięśniach szkieletowych prawidłowy transport i komunikacja między Kv1.1 i RYR1, wraz z wieloma białkami regulatorowymi, ma kluczowe znaczenie dla wspierania sprzężenia skurczu wzbudzenia. Brakuje metod bezpośredniego badania tych interakcji białko-białko między Kv1.1 i RYR1 lub są one niekompletne.

Laboratorium dr Martina Schneidera od dziesięcioleci pracuje nad sprzężeniem wzbudzenia-skurczu, charakteryzując mechanizmy wykrywania napięcia w Kv1.1, uwalnianiu wapnia i zlokalizowane w zdarzeniach uwalniania wapnia, znanych jako iskry wapniowe. W ostatnim czasie nasze laboratorium wdraża nowe techniki optyczne do badania różnych etapów sprzężenia wzbudzenie-skurcz i ruchu czujnika napięcia w funkcjonujących dorosłych komórkach mięśniowych. Chociaż robiono to już wcześniej w heterologicznym systemie ekspresji, nasz protokół umożliwia teraz śledzenie potwierdzających zmian w czujnikach napięcia Kv1.1 podczas propagowanego potencjału czynnościowego w jego natywnym środowisku.

Nasza nowa technika pozwoli nam zbadać precyzyjny ruch czujnika napięcia potrzebnego do sprzężenia wzbudzenia-skurczu. Chcemy wiedzieć, które reszty ładunku w każdym S4 są krytyczne dla jego funkcji, lub dokładnie każda translokacja S4 i cała ta translokacja jest związana z otwarciem Kv1.1 lub aktywacją receptora reanogenu. Aby rozpocząć, wygeneruj konstrukcję CaV1.1 CDNA typu dzikiego, oznaczoną fluorescencyjnie.

W tym przypadku stosuje się powłokę plazmidową dla wzmocnionego białka zielonej fluorescencji lub znakowanej EGFP podjednostki alfa wściekłego Cav1.1. Obecność promotora wirusa cytomegalii pozwala na dużą skuteczność transfekcji we włóknach mięśniowych. Wprowadź substytucję cysteiny do kanału, który byłby śledzony za pomocą fluorometrii, przy użyciu dostępnego na rynku zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce.

Tutaj cysteiny są wprowadzane w pozycji odpowiadającej błonowemu interfejsowi zewnątrzkomórkowemu jednego z czterech S4 kanału. Za pomocą obserwacji GFP i rejestracji prądu jonowego potwierdzono, że ani wprowadzone cysteiny, ani obecność barwnika reagującego z tiolem nie wpływają na zależność od napięcia i przewodność kanału. Włącz wszystkie składniki konfiguracji akwizycji dla pomiaru fluorometrii.

Umieść 35-milimetrowe naczynie ze szklanym dnem zawierające zdysocjowane włókna mięśniowe na stoliku mikroskopu. Ostrożnie usuń pożywkę hodowlaną za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i zastąp ją dwoma mililitrami roztworu Ringera o temperaturze pokojowej. Za pomocą mechanicznego lub zmotoryzowanego manipulatora umieść dwa platynowe druty prostopadle do dna naczynia.

Upewnij się, że końcówki elektrod są wyrównane względem osi podłużnej włókien i w odległości kilku milimetrów od włóknistych końców. Dostosuj położenie elektrody, obracając czaszę lub przesuwając każdą elektrodę, jeśli jest zamontowana na niezależnym mikromanipulatorze. Włącz światło przechodzące i znajdź włókna w polu widzenia za pomocą obiektywu 20X.

Przesuń kostkę filtra EGFP na ścieżkę światła. Po wyłączeniu światła przepuszczanego aktywuj światło wzbudzenia o długości fali 488 nanometrów za pomocą zdalnie sterowanej migawki świetlnej. Aby zidentyfikować włókna dodatnie EGFP, wyśrodkuj włókna z najjaśniejszym sygnałem EGFP w środku pola widzenia.

Użyj membrany umieszczonej na ścieżce światła wzbudzenia, aby skupić światło wzbudzenia w określonym obszarze światłowodu. Umożliwia to akwizycję sygnału tam, gdzie sygnał EGFP Cav1.1 jest maksymalny. Dostosuj położenie światłowodu za pomocą stolika mechanicznego, aby wyrównać się ze ścieżką światła membrany i zapisać lokalizację XY światłowodu.

Po powrocie do pierwszej zapisanej lokalizacji należy ustawić czas trwania dwóch sekwencyjnych impulsów stymulacji na jedną milisekundę, amplitudę na 20 woltów, a biegunowość impulsów na naprzemienną. Następnie użyj ręcznego przełącznika spustowego, aby dostarczyć dwa sekwencyjne impulsy. Podczas stymulacji obserwuj dwa koncentryczne skurcze jednorodnych włókien w odpowiedzi na dwa impulsy o przeciwnej polaryzacji.

Jeśli nie obserwuje się skurczu lub obserwuje się tylko jeden koncentryczny skurcz z impulsami o zmiennej polaryzacji, wyrzuć włókna z reszty eksperymentu. Dodaj dwa mikrolitry 10-milimolowego roztworu MTS-5-TAMRA bezpośrednio do naczynia i delikatnie wymieszaj pipetą o pojemności 1 000 mikrolitrów. Inkubować przez cztery do pięciu minut, aby umożliwić dyfuzję fluorescencyjnej cząsteczki tiolu do światła systemu kanalików poprzecznych.

Poprzez stymulację polową zastosuj dwubiegunowe powtarzające się stymulacje, aby wywołać kolejne pociągi potencjału czynnościowego z częstotliwością 50 Hz przez 300 milisekund co sekundę przez pięć minut. Usuń roztwór barwiący z naczynia za pomocą pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów i zastąp go dwoma mililitrami roztworu dzwonka o temperaturze pokojowej. Pozwól poplamionemu włóknu zregenerować się po protokole barwienia przez co najmniej 10 minut.

Po ponownej ocenie stanu włókien i aktywności elektrycznej za pomocą dwóch naprzemiennych impulsów, przenieś kostkę filtrującą MTS-5-TAMRA na ścieżkę światła i aktywuj światło wzbudzające o długości 533 nanometrów za pomocą zdalnie sterowanej przesłony świetlnej, aby wizualnie potwierdzić barwienie włókien. Następnie, korzystając z zapisanej lokalizacji na zmotoryzowanej scenie, umieść włókno na środku pola z kostką filtrującą MTS-5-TAMRA, membraną i obiektywem zanurzeniowym 60X. Po zmianie orientacji platynowych drutów stymulujących pole na każdym końcu światłowodu, ustaw druty na głównej osi włókien w linii prostej i rozstaw je w odległości pięciu milimetrów od siebie z włóknem pośrodku.

W oprogramowaniu do akwizycji wybierz protokół, który będzie używany do akwizycji. Ten krok jest kontrolowany tylko za pomocą komputera i uruchamia wszystkie urządzenia znajdujące się za nim w celu stymulacji elektrycznej i sterowania żaluzją ścieżki światła. Dla każdego protokołu zminimalizuj całkowity czas akwizycji tak bardzo, jak to możliwe, aby uniknąć blaknięcia sygnału, ale pozwól na kilkadziesiąt milisekund oświetlenia światłem i akwizycji sygnału przed pierwszą stymulacją elektryczną, aby zarejestrować linię bazową.

Uruchom protokół, naciskając przycisk Wykonaj. Nagrany sygnał jest automatycznie wyświetlany na ekranie. Mała amplituda sygnału i szybkie mechaniczne kurczenie się światłowodu często ukrywają większość sygnału i wyświetlają artefakt ruchu.

Dodać jeden mikromol 100 milimolów i benzoilu na sulfonimid toluenu do roztworu rejestrującego, aby zminimalizować odpowiedzi umowne i dalej rozróżnić sygnał powstający z ruchów S4 w wyniku aktywacji światłowodu. Po kilku minutach uruchom ten sam protokół po raz drugi. Artefakt ruchu jest teraz usuwany, ale niewielka zmiana fluorescencji odpowiadająca ruchowi S4 pozostaje.

Lekko przesuń antenę za pomocą stolika mechanicznego, aby uzyskać sygnał z obszaru bez żadnych włókien ani zanieczyszczeń. Uruchom protokół po raz ostatni, aby zarejestrować fluorescencję tła, wyeksportuj ślady i użyj programu arkusza kalkulacyjnego, aby wyrazić sygnał jako Delta F powyżej F zero w funkcji czasu i w razie potrzeby zastosuj korekcję linii bazowej. Przedstawiono tutaj przykłady transmitowanych i fluorescencyjnych obrazów rozciętego i niezdysocjowanego mięśnia wyrażającego konstrukt EGFP Kv1.1.

Reprezentatywne obrazy włókna mięśniowego wyrażającego konstrukt EGFP Kv1.1 VSD3 przed i po barwieniu MTS-5-TAMRA pokazano na tym rysunku. Barwnik ten barwi również endogenne cysteiny włókien nietransfekowanych. Obrazy konfokalne konstruktu EGFP Kv1.1 VSD3 i barwienia MTS-5-TAMRA pokazują wzór dwupasmowy, charakterystyczny dla lokalizacji Kv1.1 w układzie kanalików poprzecznych włókna mięśniowego.

Reprezentatywny zapis fluorometryczny w odpowiedzi na dwa bodźce i mierzony za pomocą fotodiody pokazano tutaj. Oba sygnały są normalizowane przez ich minimalną wartość i wykreślane jako funkcja czasu w stosunku do ich odpowiedniej depolaryzacji. Z nagrań tych wynika, że faza narastania i czas do szczytu sygnału są podobne dla obu depolaryzacji nałożonych na światłowód.