Ocena wpływu mszyc grzybów entomopatogenicznych na owada partenogenetycznego, mszycę musztardową, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Obecnie powszechnie preferowana jest przyjazna dla środowiska ochrona przed szkodnikami. Przed wdrożeniem grzyby entomofatogenne muszą jednak przejść dokładne testy. Nasze badanie pokazuje skuteczność entomofotogennej biblioteki grzybów w zwalczaniu mszycy musztardowej, służąc nam jako doskonały przykład jej potencjału.

Zmniejszenie wysokiej śmiertelności po wstępnym leczeniu grzybów entomofatogenicznych i zapobieganie szturmom na ścieżki w zawieszeniu sklepu jest wyzwaniem. Udało nam się opracować stabilny system, który przyniósł oczekiwany rezultat. Wiązało się to z zastosowaniem odpowiedniego systemu lub komory do testów biologicznych, aby skutecznie utrzymać tę cienką ścieżkę podczas procesu testowania.

Protokół ten z powodzeniem demonstruje wykonalny sposób ustawienia metody odłączania bez konieczności pomiaru temperatury agaru, upraszczając w ten sposób tworzenie komory doświadczalnej. Ponadto zaproponowaliśmy zminimalizowanie ekspozycji powierzchni agaru, aby zapobiec utknięciu mszyc podczas wędrowania po komorze. Jesteśmy zaintrygowani odpowiedzią immunologiczną mszycy musztardowej w konfrontacji z entomofatogenną infekcją grzybiczą przed śmiertelnością mszyc.

Badając dane dotyczące ekspresji genów, możemy zidentyfikować krytyczne geny, które mogą służyć jako potencjalne cele knockdownu genów w połączeniu z entomofatogennym zastosowaniem grzybów. Zacznij od przygotowania tymczasowej szalki Petriego do konserwacji z wyciętymi liśćmi krzyżowymi i bibułą filtracyjną infiltracyjną infiltrowaną przez wodę na dnie. Następnie umieść pięć mszyc na przygotowanej szalce Petriego.

Kiedy liczba mszyc wzrośnie, pokrój pierwotnie wycięte liście na cztery do sześciu mniejszych kawałków. Przenieś każdy mały kawałek liścia z mszycami na oddzielne szalki Petriego zawierające świeże liście i mokrą bibułę filtracyjną. Aby zebrać genomowe DNA mszyc, najpierw homogenizuj mszyce za pomocą tłuczka do granulek.

Następnie wyekstrahuj DNA za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA GENESpin zgodnie z wytycznymi producenta. Zakończ proces ekstrakcji, eluując genomowe DNA za pomocą 50 mikrolitrów podgrzanej wody wolnej od nukleaz. Wykonaj amplifikację PCR i sekwencjonowanie DNA, dodając próbkę DNA do głównej mieszanki PCR z parami starterów.

Przeanalizuj produkt PCR za pomocą 1% elektroforezy w żelu agarozowym, aby potwierdzić tożsamość mszycy musztardowej. Zebrane w terenie mszyce potwierdzono jako mszyce musztardowe za pomocą markerów molekularnych, w tym wielkości amplikonu PCR i sekwencjonowania CO1 Lipaphis erysimi. W celu odzyskania EPF z biblioteki grzybów, zacznij od rozsmarowania izolatów grzybów na płytce SDA o ćwiartce mocy.

Inkubuj go w ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 10 do 14 dni przed zbiorem konidiów. Następnie odpipetuj od dwóch do trzech mililitrów 0,03%Tween 80 na płytkę hodowlaną, a następnie użyj pętli do zaszczepiania, aby zeskrobać konidia. Następnie przenieś zawiesinę grzybów do probówki wirówkowej.

Energicznie rozmieszać zawiesinę z najwyższą prędkością, a następnie odpipetować próbkę do hemocytometru, aby policzyć liczbę konidiów. Rozcieńczyć konidia w zawiesinie, stosując 0,03%Tween 80, aż do uzyskania pożądanego stężenia. Aby przygotować komorę do zaszczepiania, najpierw wytnij krążek liściowy o średnicy dziewięciu centymetrów, używając dolnej szalki Petriego jako formy lub nożyczek.

Następnie przygotuj 1,5% agar wodny do każdego dania za pomocą kuchenki mikrofalowej. Wlej 30 mililitrów schłodzonego agaru wodnego do szalki Petriego i pozwól mu zastygnąć w okapie z przepływem laminarnym. Gdy powierzchnia agaru jest półstała, umieść krążek liściowy jego powierzchnią aosiową skierowaną do góry, a następnie lekko dociśnij, aby osadzić go w agarze.

Teraz umieść 20 dojrzałych osobników na krążku liściowym. Otwórz pokrywę komory do zaszczepiania, aby rozpylić 0,3 mililitra zawiesiny konidiów bezpośrednio na mszyce i krążek liściowy. Po wyschnięciu zawiesiny zamknij pokrywę, aby zapobiec utonięciu mszyc musztardowych.

Następnie uszczelnij komorę inokulacyjną za pomocą folii parafinowej, aby utrzymać wysoką wilgotność, umieść komorę w inkubatorze ustawionym na temperaturę 25 stopni Celsjusza, z jasnym i ciemnym okresem fotografowania wynoszącym 12 godzin każdy. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby policzyć śmiertelność co 12 godzin przez pięć dni. Zjadliwe badania przesiewowe wykazały stały wskaźnik przeżywalności mszyc musztardowych, przy czym grupa kontrolna wykazywała 85% wskaźnik przeżycia.

Cordyceps cateniannulata wykazał najszybszą zdolność zabijania mszyc, powodując 50% i 90% śmiertelność po trzech dniach i 4,5 dniu po inokulacji lub DPI. Szczepy Beauveria 141, 143 i 153 wykazywały powolne zdolności zabijania mszyc, z zaledwie 5% śmiertelnością przy 3 DPI. Z wyjątkiem Purpureocillium, większość izolatów EPF wykazywała skorygowane wskaźniki śmiertelności wyższe niż 70% w ciągu pięciu DPI.

Beauveria bassiana wykazała najwyższą śmiertelność wynoszącą 100% wśród izolatów EPF. Grzybicę EPF zaobserwowano na zwłokach mszyc musztardowych zakażonych gatunkami Metarhizium, Beauveria, Purpureocillium lilacinum i Cordyceps cateniannulata podczas badania przesiewowego wirulencji. Zacznij od uruchomienia platformy oprogramowania SPSS.

Utwórz zmienne określane mianem leczenia i skorygowanej śmiertelności, a następnie wprowadź obliczone wyniki dla różnych izolatów zaszczepionych w tym samym punkcie czasowym o tym samym stężeniu. Przejdź do analizy, porównania średnich i proporcji, a następnie testu T dla niezależnych próbek w SPSS w celu przeprowadzenia niezależnej analizy testu T. Następnie wprowadź leczenie do pola zmiennej grupującej i skorygowaną śmiertelność do pola zmiennych testowych.

Klasyfikuj grupy według różnych izolatów grzybów i naciśnij OK, aby rozpocząć analizę. Aby obliczyć medianę czasu śmiertelności i medianę stężenia śmiertelnego, utwórz zmienne zdefiniowane jako suma, odpowiedź i czas trwania lub stężenie. Następnie wprowadź zarejestrowany wynik do arkusza kalkulacyjnego.

Na koniec wybierz analizę, a następnie regresję, a następnie sonduj, aby obliczyć medianę czasu śmiertelności i medianę stężenia śmiertelnego. Inokulacje od 10 do siedmiu konidiów na mililitr skutkowały znacząco różnymi skorygowanymi śmiertelnościami dla szczepu Metarhizium 197 i szczepu Cordyceps 213 przy trzech i czterech DPI. Szczep Cordyceps 213 wykazywał znacznie krótszy czas trwania śmiertelności w porównaniu z innymi metodami leczenia.

Wykazał również niższą wartość dawki śmiertelnej w stosunku do szczepu Metarhizium 213.