Name: Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Poznaj optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny przez Rho1 w zarodkach Drosophila. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę napięcia nabłonkowego i badanie mechanizmów morfogenezy tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Ann Lavanway za wsparcie w zakresie obrazowania. Autorzy dziękują laboratorium Wieschaus i laboratorium De Renzis za udostępnienie odczynników oraz Bloomington Drosophila Stock Center za zasoby much. Badanie to jest wspierane przez NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 i American Cancer Society Institutional Research Grant #IRG-82-003-33 dla BH.

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility in Drosophila

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Protokół ten opisywał połączone zastosowanie optogenetyki i ablacji laserowej w celu zbadania zmian napięcia tkanek natychmiast po inaktywacji kurczliwości aktomiozyny. Opisane tutaj narzędzie optogenetyczne wykorzystuje dominującą negatywną formę Rho1 (Rho1DN) do ostrego hamowania endogennej kurczliwości Rho1 i zależnej od Rho1 aktomiozyny. Wcześniejsza charakterystyka Opto-Rho1DN w kontekście tworzenia bruzd brzusznych Drosophila wykazała, że narzędzie jest wysoce skuteczne w pośredniczeniu w szybkiej inaktywa...

Kurczliwość aktomyozyny, siła skurczu wywierana przez niemięśniową miozynę II (dalej 'miozynę') na sieć F-aktyny, jest jedną z najważniejszych sił w zmianie kształtu komórki i sterowaniu morfogenezą na poziomie tkanki1,2. Na przykład aktywacja kurczliwości aktomiozyny w domenie wierzchołkowej komórek nabłonka powoduje zwężenie wierzchołkowe, co ułatwia różne procesy morfogenetyczne, w tym fałdowanie nabłonka, wytłaczanie komórek, delaminację i gojenie się ran3,4,5,6,7. Aktywacja miozyny wymaga fosforylacji jej regulatorowego łańcucha lekkiego. Modyfikacja ta łagodzi hamującą konformację cząsteczek miozyny, umożliwiając im tworzenie dwubiegunowych wiązek włókien miozyny z wieloma domenami głowy na obu końcach. Dwubiegunowe włókna miozyny napędzają antyrównoległy ruch włókien aktyny i powodują generowanie siły skurczowej1,8,9.
Ewolucyjnie zachowana mała GTPaza rodziny Rho RhoA (Rho1 u Drosophila) odgrywa kluczową rolę w aktywacji kurczliwości aktomiozyny w różnych kontekstach komórkowych10,11. Rho1 działa jako przełącznik dwumolekularny, wiążąc GTP (forma aktywna) lub GDP (forma nieaktywna)12. Cykl między Rho1 związanym z GTP lub GDP jest regulowany przez białka aktywujące GTPazę (GAP) i czynniki wymiany nukleotydów guaniny (GEF)13. GEF funkcjonują w celu ułatwienia wymiany PKB na GTP, a tym samym aktywowania aktywności Rho1. Z drugiej strony GAP zwiększają aktywność GTPazy Rho1, a tym samym dezaktywują Rho1. Aktywowany Rho1 promuje kurczliwość aktomiozyny poprzez interakcję i aktywację jej efektorów, kinazy związanej z Rho (Rok) i Diaphanous14. Rok indukuje aktywację miozyny i kurczliwość aktomiozyny poprzez fosforylację regulatorowego łańcucha lekkiego miozyny15. Ponadto, Rok hamuje również fosfatazę łańcucha lekkiego regulatora miozyny, a tym samym dodatkowo promuje składanie włókien miozyny16. Rok może również fosforylować kinazy LIM, które po aktywacji zapobiegają rozkładowi aktyny poprzez fosforylację i hamowanie czynnika depolimeryzacji aktyny cofilin17,18. Przeźroczysty to nukleator aktyny z rodziny formin, który wspomaga polimeryzację aktyny, zapewniając bazę dla miozyny do interakcji z19,20,21.
Chociaż mechanizmy komórkowe aktywujące kurczliwość aktomiozyny zostały dobrze wyjaśnione, nasze zrozumienie jej funkcji w regulacji dynamicznej przebudowy tkanek pozostaje niekompletne. Wypełnienie tej luki w wiedzy wymaga podejść, które mogą szybko dezaktywować aktomiozynę w określonych regionach tkanek in vivo i rejestrować natychmiastowy wpływ na zachowanie i właściwości tkanek. Protokół ten opisuje zastosowanie podejścia optogenetycznego w celu ostrego zahamowania kurczliwości aktomiozyny podczas inwazji mezodermy Drosophila, a następnie pomiaru napięcia nabłonka za pomocą ablacji laserowej. Podczas gastrulacji Drosophila zlokalizowane brzusznie komórki prekursorowe mezodermy ulegają zwężeniu wierzchołkowemu i wnikają z powierzchni zarodka, tworząc bruzdę zorientowaną przednio-tylnie22,23. Powstawanie bruzd brzusznych od dawna służy jako model do badania mechanizmu fałdowania nabłonka. Tworzenie bruzd brzusznych jest zarządzane przez system wzorca grzbietowo-brzusznego u Drosophila24,25,26,27. Ekspresja dwóch czynników transkrypcyjnych, Twist i Snail, zlokalizowanych po brzusznej stronie zarodka, kontroluje tworzenie bruzd brzusznych i określa los komórek mezodermalnych28. Twist i Snail aktywują rekrutację Rho1 GEF RhoGEF2 do wierzchołka komórek prekursorowych mezodermy poprzez szlak receptora sprzężony z białkiem G i białko adaptorowe RhoGEF2, T4829,30,31,32,33. Następnie RhoGEF2 aktywuje miozynę na całej wierzchołkowej powierzchni potencjalnej mezodermy poprzez szlak kinazy Rho-Rho 34,35,36,37,38,39. Aktywowana miozyna tworzy nadkomórkową sieć aktomiozyny na całej wierzchołkowej powierzchni zawiązka mezodermy, której skurcze powodują zwężenie wierzchołkowe i powodują szybki wzrost napięcia tkanki wierzchołkowej14,37,40.
Narzędzie optogenetyczne opisane w tym protokole, Opto-Rho1DN, hamuje kurczliwość aktomiozyny poprzez zależną od niebieskiego światła rekrutację błony plazmatycznej dominującej negatywnej formy Rho1 (Rho1DN)41. Mutacja T19N w Rho1DN eliminuje zdolność zmutowanego białka do wymiany GDP na GTP, a tym samym sprawia, że białko jest wiecznie nieaktywne34. Kolejna mutacja w Rho1DN, C189Y, eliminuje jego naiwny sygnał ukierunkowany na błonę42,43. Kiedy Rho1DN jest podawany do błony komórkowej, wiąże się i gromadzi Rho1 GEF, blokując w ten sposób aktywację Rho1, a także aktywację miozyny i aktyny za pośrednictwem Rho1, w 34,44. Rekrutacja Rho1DN przez błonę plazmatyczną odbywa się za pomocą zależnego od światła modułu dimeryzacji pochodzącego z Cryptochrome 2 i jego partnera wiążącego CIB1. Kryptochrom 2 to aktywowany niebieskim światłem fotoreceptor kryptochromu u Arabidopsis thaliana45. Kryptochrom 2 wiąże się z CIB1, podstawowym białkiem helisa-pętla-helisa, tylko w stanie fotowzbudzonym45. Później odkryto, że konserwatywny N-końcowy region homologii fotoliazy (PHR) z kryptochromu 2 (CRY2PHR, dalej określany jako CRY2) i domena N-końcowa (aa 1-170) CIB1 (dalej CIBN) są ważne dla dimeryzacji indukowanej światłem46. Opto-Rho1DN zawiera dwa składniki. Pierwszym składnikiem jest białko CIBN połączone z kotwicą CAAX, która lokalizuje białko w błonie plazmatycznej47. Drugim komponentem jest CRY2 oznaczony mCherry połączony z Rho1DN41. Przy braku światła niebieskiego CRY2-Rho1DN pozostaje w cytoplazmie. Po stymulacji światłem niebieskim CRY2-Rho1DN jest kierowany do błony plazmatycznej poprzez interakcję między CIBN zakotwiczonym w błonie a wzbudzonym CRY2. Opto-Rho1DN może być aktywowany światłem ultrafioletowym A (UVA) i światłem niebieskim (400-500 nm, aktywacja szczytowa przy 450-488 nm) lub laserem impulsowym 830-980 nm podczas wykonywania stymulacji dwufotonowej 41,46,47,48. Dlatego Opto-Rho1DN jest stymulowany przez długości fal zwykle używane do wzbudzania GFP (488 nm dla obrazowania pojedynczych fotonów i 920 nm dla obrazowania dwufotonowego). W przeciwieństwie do tego, długości fal powszechnie używane do wzbudzania mCherry (561 nm dla obrazowania pojedynczych fotonów i 1,040 nm dla obrazowania dwufotonowego) nie stymulują modułu optogenetycznego i dlatego mogą być używane do obrazowania przed stymulacją. Protokół opisuje podejścia stosowane w celu zminimalizowania ryzyka niepożądanej stymulacji podczas manipulacji próbką.
Ablacja laserowa jest szeroko stosowana do wykrywania i mierzenia napięcia w komórkach i tkankach49. Wcześniejsze badania wykazały, że gdy intensywność lasera jest odpowiednio kontrolowana, dwufotonowa ablacja laserowa z użyciem femtosekundowego lasera bliskiej podczerwieni może fizycznie upośledzać niektóre struktury subkomórkowe (np. korowe sieci aktomiozyny) bez powodowania pęknięcia błony komórkowej50,51. Jeśli tkanka jest napięta, ablacja laserowa obszaru zainteresowania w tkance powoduje natychmiastowy odrzut na zewnątrz komórek sąsiadujących z obszarem poddanym ablacji. Prędkość odrzutu jest funkcją wielkości napięcia i lepkości ośrodka (cytoplazmy) otaczającego struktury poddawane odrzutowi49. Ze względu na doskonałą głębokość penetracji laserów bliskiej podczerwieni i zdolność do uzyskania dobrze ograniczonej ablacji ogniskowej, dwufotonowa ablacja laserowa jest szczególnie przydatna do wykrywania napięcia tkanek in vivo. Jak wykazano w tym protokole, metodę tę można łatwo połączyć z inaktywacją kurczliwości aktomiozyny za pośrednictwem Opto-Rho1DN w celu zbadania bezpośredniego wpływu zależnej od Rho1 kurczliwości komórkowej na mechanikę tkanek podczas dynamicznej przebudowy tkanki.

<table><tbody><tr><td>Naczynie ze szklanym dnem 35 mm</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Służy do przygotowania próbek</td></tr><tr><td>60 mm i czas; 15 mm szalka Petriego z pokrywką</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td>Służy do przygotowania próbki</td></tr><tr><td>ściereczka do przykrycia mikroskopu</td><td>Online</td><td>NA</td><td>Służy do unikania niepożądanej stymulacji światłem</td></tr><tr><td>Wybielacz Clorox Ultra Germicadal Bleach (8,25% podchlorynu sodu)</td><td>VWR</td><td>10028-048</td><td>Służy do dechorynacji zarodków</td></tr><tr><td>CO2</td><td>podkładka Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td>Służy do ustawiania krzyżowego</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>NA</td><td></td><td>NA Służy do przygotowania próbki</td></tr><tr><td>Pęseta Dumont Style 5</td><td>VWR</td><td>102091-654</td><td>Służy do przygotowania próbki</td></tr><tr><td>Narzędzie do rzęs (wykonane z okrągłej szczotki z czystego czerwonego sobola #2)</td><td>VWR</td><td>22940-834</td><td>Służy do przygotowania próbki</td></tr><tr><td>FluoView (oprogramowanie)</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>Służy do akwizycji obrazu i stymulacji optogenetycznej</td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 27</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8773-100ML</td><td>Używany do wizualizacji stadium zarodka</td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>Używany do analizy obrazu</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>NA</td><td>Używany do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Stereoskop Nikon SMZ-745</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Używany do przygotowania próbek</td></tr><tr><td>Mikroskop wielofotonowy Olympus FVMPE-RS z dwuliniowymi ultraszybkimi laserami InSight DS do jednoczesnego obrazowania wielofotonowego o podwójnej długości fali, obiektywem zanurzeniowym w wodzie (XLPLN25XWMP2) 25x/NA1.05 oraz jednostką stymulacji IR/VIS do fotoaktywacji/stymulacji. System ten jest również wyposażony w filtr TRITC (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M) oraz oświetlacz fluorescencyjny, który emituje światło białe.</td><td>Olympus</td><td>NA</td><td>Służy do akwizycji obrazu i stymulacji optogenetycznej</td></tr><tr><td>SP Bel-Art 100-miejscowy polipropylenowy pojemnik do zamrażania (, światłoszczelny pojemnik do przenoszenia próbek)</td><td>VWR</td><td>30621-392</td><td>Służy do unikania niepożądanej stymulacji światłem</td></tr><tr><td>Osłona filtra UV do fluory FM1403 (pomarańczowo-czerwona plastikowa osłona)</td><td>Bolioptics</td><td>FM14036151</td><td>Służy do unikania niepożądanej stymulacji światłem</td></tr><tr><td>Latarka czołowa VITCHELO V800 z białymi i czerwonymi światłami LED Amazon</td><td></td><td>NA</td><td>Służy do unikania niepożądanej stymulacji światłem</td></tr></tbody></table>

optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach drosophila

Optogenetic Inhibition of Rho1-Mediated Actomyosin Contractility Coupled with Measurement of Epithelial Tension in Drosophila Embryos

Siły skurczu generowane przez aktynę i miozynę II bez mięśni ("kurczliwość aktomiozyny") są kluczowe dla zmian morfologicznych komórek i tkanek w wielu skalach długości, takich jak podział komórek, migracja komórek, fałdowanie nabłonka i morfogeneza rozgałęzień. Dogłębne zrozumienie roli kurczliwości aktomiozyny w morfogenezie wymaga podejść umożliwiających szybką inaktywację aktomiozyny, co jest trudne do osiągnięcia przy użyciu konwencjonalnych podejść genetycznych lub farmakologicznych. Przedstawiony protokół demonstruje zastosowanie systemu dimeryzacji optogenetycznej opartego na CRY2-CIBN, Opto-Rho1DN, do hamowania kurczliwości aktomiozyny w zarodkach Drosophila z precyzyjną kontrolą czasową i przestrzenną. W tym systemie CRY2 jest połączony z dominującą ujemną formą Rho1 (Rho1DN), podczas gdy CIBN jest zakotwiczony w błonie plazmatycznej. Dimeryzacja CRY2 i CIBN za pośrednictwem światła niebieskiego powoduje szybką translokację Rho1DN z cytoplazmy do błony komórkowej, gdzie inaktywuje aktomiozynę poprzez hamowanie endogennego Rho1. Ponadto w artykule przedstawiono szczegółowy protokół sprzężenia inaktywacji aktomiozyny za pośrednictwem Opto-Rho1DN z ablacją laserową w celu zbadania roli aktomiozyny w generowaniu napięcia nabłonka podczas tworzenia bruzd brzusznych Drosophila. Protokół ten można zastosować do wielu innych procesów morfologicznych, które obejmują kurczliwość aktomiozyny w zarodkach Drosophila przy minimalnych modyfikacjach. Ogólnie rzecz biorąc, to narzędzie optogenetyczne jest potężnym podejściem do analizy funkcji kurczliwości aktomiozyny w kontrolowaniu mechaniki tkanek podczas dynamicznej przebudowy tkanek.

W niestymulowanych embrionach podlegających konstrikcji apikalnej białko Sqh-mCherry uległo wzbogaceniu w regionie medioapikalnym brzusznych komórek mezodermalnych, podczas gdy CRY2-Rho1DN-mCherry znajdowało się w cytozolu (Rycina 1A). Ablacja laserowa w obrębie domeny konstrikcji doprowadziła do szybkiego cofnięcia się tkanki wzdłuż osi A-P (Rycina 1B,C). W embrionach stymulowanych sygnał CRY2-Rho1DN-mCherry zlokalizował się w błonie plazmatycz...

Kurczliwość aktomyozyny odgrywa ważną rolę w morfogenezie komórek i tkanek. Jednak trudno jest dokładnie manipulować kurczliwością aktomiozyny in vivo. Protokół ten opisuje system optogenetyczny, który szybko hamuje kurczliwość aktomiozyny za pośrednictwem Rho1 w zarodkach Drosophila, ujawniając natychmiastową utratę napięcia nabłonka po inaktywacji aktomiozyny in vivo.

Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila

Contractile forces generated by actin and non-muscle myosin II ("actomyosin contractility") are critical for morphological changes of cells and tissues at ...

Nasze badania dotyczą morfogenezy tkanek, czyli powstawania złożonych trójwymiarowych struktur tkankowych w trakcie rozwoju. Interesują nas geny i cząsteczki, które regulują morfogenezę i staramy się zrozumieć fizyczne zasady leżące u podstaw morfogenezy, na przykład, w jaki sposób generowane są siły mechaniczne i jak napędzają rewitalizację tkanek. Siły kurczliwe generowane przez nitkowatą aktynę i niemięśniową miozynę II, znane również jako aktywność aktomiozyny, są jedną z najważniejszych sił napędzających morfogenezę tkanek.Nasze obecne badania dotyczą tego, w jaki sposób kurczliwość aktomiozyny pośredniczy w fałdowaniu arkuszy komórek nabłonka krwi, co jest podstawowym mechanizmem budowy tkanki w fazie rozwoju. Dogłębne zrozumienie roli kurczliwości aktomiozyny w fałdowaniu nabłonka i odpowiadanie za procesy genetyczne wymaga podejść, które mogą szybko dezaktywować aktomiozynę w ograniczonym masowo czasie i miejscu oraz rejestrować natychmiastowy wpływ zachowania i właściwości tkanki. Jest to jednak trudne do osiągnięcia przy użyciu konwencjonalnych podejść genetycznych.Podejście opisane w tym protokole ma na celu zbadanie, w jaki sposób komórki i tkanki reagują na nagłe zmiany sił mechanicznych, które normalnie napędzają przebudowę tkanek. Jest to ważne pytanie, ale było trudne do rozwiązania ze względu na ograniczone podejścia, które mogą szybko zmienić siły mechaniczne lub nienaruszone tkanki. W tym badaniu opracowaliśmy narzędzie optogenetyczne do szybkiej inaktywacji aktomiozyny w określonych regionach tkanek w zarodkach Drosophila.Odkryliśmy, że połączyli te dwa czynniki z ablacją laserową, aby zbadać bezpośredni wpływ kurczliwości aktomiozyny na mechanikę tkanek w fałdowaniu nabłonka. Nasze odkrycia dostarczają nowych informacji na temat mechanizmu mechanicznego i nowego środka zwężającego fałdowanie nabłonka. Dzięki modyfikacjom sposobu, protokół może być łatwo dostosowany do badania funkcji kurczliwości aktomiozyny w szerokim zakresie procesów morfogenetycznych.Aby rozpocząć zbieranie zarodków Drosophila, zmień talerz z sokiem jabłkowym z kubka i oznacz talerz. Przykryj powierzchnię płyty cienką warstwą oleju halowęglowego 27. Następnie umieść pomarańczowo-czerwoną plastikową osłonę na stoliku pionowego stereoskopu.Umieść talerz z sokiem jabłkowym na pomarańczowo-czerwonej tarczy. Włącz światło przechodzące mikroskopu stereoskopowego, aby oświetlić próbkę. Zbierz od pięciu do 15 zarodków z talerza z sokiem jabłkowym za pomocą pęsety.Delikatnie osusz zarodki na ręczniku papierowym o wymiarach około 1,5 na 1,5 centymetra. Następnie dodaj kilka kropli świeżo przygotowanego 40% wybielacza do nowego ręcznika papierowego za pomocą plastikowej pipety transferowej, aby pokryć ręcznik papierowy cienką warstwą wybielacza. Przenieś zarodek z suchego ręcznika papierowego na ręcznik papierowy nasączony wybielaczem i upewnij się, że zarodki są namoczone w wybielaczu.Odczekaj dwie minuty, aż zarodek ulegnie dekorionacji. Po dechorionacji za pomocą pęsety osusz ręcznik papierowy na dużym kawałku bibuły, aby usunąć nadmiar wybielacza. Opłucz zarodki ośmiokrotnie wodą dejonizowaną, aby usunąć pozostałości wybielacza.Za pomocą narzędzia do rzęs przenieś zarodek z ręcznika papierowego do 35-milimetrowego naczynia ze szklanym dnem, a następnie dodaj do naczynia wodę dejonizowaną, aby całkowicie przykryć zarodki. Na koniec dostosuj pozycję i orientację zarodków za pomocą narzędzia do rzęs. Umieść naczynie z zarodkami w światłoszczelnym czarnym pudełku, aby chronić próbkę przed ekspozycją na światło podczas procesu przenoszenia.Aby rozpocząć, wyłącz światło w pomieszczeniu. Wybierz okular pod panelem okularowym w oprogramowaniu FlowView. Zmień wieżyczkę kostki na 4TRTC i wyłącz kontroler panelu dotykowego, klikając podświetlenie kontrolera panelu dotykowego w oprogramowaniu, a następnie wyłącz ekran komputera.Otwórz przednią stronę czarnej osłony mikroskopu. Weź 35-milimetrowe szklane naczynie z dnem zawierające zarodki z czarnego pudełka i umieść je na stoliku mikroskopowym. Następnie włącz oświetlacz fluorescencyjny i użyj okularu, aby zidentyfikować interesujący nas zarodek.Ustaw ostrość. Zamknij czarną osłonę z tkaniny, aby chronić próbkę przed światłem. Włącz ekran komputera, aby uzyskać dostęp do oprogramowania sterującego mikroskopem.Zmień okular na LSM w oprogramowaniu do akwizycji obrazu. Wykonaj ablację laserową w kontrolnych niestymulowanych zarodkach za pomocą obiektywu zanurzonego w wodzie o 25-krotnym powiększeniu. Kliknij pozycję Bright Z, menedżer sekwencji i stymulacja LSM w oknie narzędzi.Ustaw typ skanera na galvano, a rozmiar skanowania na 512 na 512. Włącz kanał pierwszy i kanał trzeci w panelu ustawień PMT, aby umożliwić korzystanie z lasera 1040-nanometrowego i kliknij na żywo czterokrotnie prędkość, aby wyświetlić zarodek. Obróć zarodek za pomocą funkcji rotacji, aby przednia tylna oś była zorientowana pionowo i ustaw powiększenie na trzy.Narysuj obszar zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia kształtu w ustawieniach skanowania i ustaw rozmiar ROI w panelu odniesienia. Następnie ustaw ROI na 512 pikseli szerokości i 100 pikseli wysokości. Aby ustawić parametry akwizycji dla stosu Z przed ablacją, zarejestruj powierzchnię zarodka jako zero pod sekcją Z.Ustaw początek jako zero, a koniec jako 100 mikrometrów. Ustaw rozmiar kroku na dwa mikrometry i aktywuj tryb akwizycji Z, zaznaczając Z pod zakładką serii. Korzystając z funkcji Bright Z, ustaw intensywność lasera 1040 nm, aby rosła liniowo od 3% do 7%Zapisz bieżące ustawienie obrazowania jako pierwsze zadanie potoku, klikając LSM w menedżerze sekwencji.Aby ustawić parametry akwizycji dla filmu przed ablacją, ustaw ROI na poziomie 512 na 512 pikseli w pobliżu brzusznej powierzchni zarodka, jak pokazano wcześniej. Ustaw intensywność lasera 1014-nanometrowego na 3%sprawdź czas i odznacz Z pod panelem serii. Zachowaj interwał jako swobodny bieg pod panelem timelapse i ustaw cykl na 10.Zapisz bieżące ustawienie jako następne zadanie potoku, klikając LSM w menedżerze sekwencji. Aby ustawić parametry ablacji laserowej, zdefiniuj obszar 3D bezpośrednio pod membraną witelinową. Ustaw początek stosu Z jako płaszczyznę, a koniec jako 20 mikrometrów głębiej.Ustaw rozmiar kroku na 1,5 mikrometra. Włącz kanał drugi i kanał czwarty pod panelem ustawień PMT, aby umożliwić korzystanie z lasera 920 nm. Ustaw intensywność lasera na 30% i ustaw akwizycję obrazu za pomocą lasera dla pojedynczego stosu Z w zdefiniowanym regionie 3D.Zapisz bieżące ustawienie jako następne zadanie potoku, klikając LSM w menedżerze sekwencji. Aby ustawić parametry akwizycji dla filmu po ablacji, ustaw akwizycję obrazu dla 100-klatkowego filmu po ablacji w pojedynczej płaszczyźnie Z przy użyciu laserów 1040 i 920 nanometrów. Ustaw intensywność laserów na 3% i 0,3%Zapisz bieżące ustawienie jako następne zadanie potoku, klikając LSM w menedżerze sekwencji.Wybierz sekwencję w obszarze Pobieranie. W razie potrzeby zmień ścieżkę zapisywania danych i nazwę pliku. Kliknij przycisk Gotowe i poczekaj, aż oprogramowanie zainicjuje potok, a następnie kliknij przycisk Start, aby wykonać potok.Aby przeprowadzić ablację laserową w stymulowanych zarodkach, należy ustawić parametry akwizycji dla stosu Z przed ablacją, jak pokazano dla zarodków niestymulowanych. Zapisz bieżące ustawienie jako pierwsze zadanie potoku, klikając LSM w menedżerze sekwencji. Aby ustawić parametry stymulacji optogenetycznej w ramach zdefiniowanego ROI, zmień powiększenie na jedno i wybierz ROI, który obejmuje brzuszną powierzchnię zarodka.Wyłącz detektory kanału pierwszego do czwartego, kliknij stymulację LSM, odznacz ciągły w czasie trwania i wpisz 12 sekund. Zapisz bieżące ustawienie jako następne zadanie potoku, klikając stymulację w menedżerze sekwencji. Ustaw trzyminutowy czas oczekiwania po stymulacji, aby zapewnić całkowitą inaktywację miozyny i wierzchołkowy rozkład F-aktyny i uzyskać statyczną morfologię tkanki przed ablacją laserową.Następnie ustaw parametry akwizycji dla pojedynczego filmu pre-ablacji w płaszczyźnie Z, jak pokazano dla niestymulowanych zarodków, z wyjątkiem tego, że do akwizycji obrazu używane są lasery 1040 i 920 nm. Włącz detektory kanału pierwszego do czwartego. Ustaw intensywność laserów na 3% i 0,3%Zapisz bieżące ustawienie jako następne zadanie potoku, klikając LSM w menedżerze sekwencji.Ustaw parametry ablacji laserowej, jak pokazano dla niestymulowanych zarodków. Zapisz bieżące ustawienie jako następne zadanie potoku, klikając LSM w menedżerze sekwencji. Ustaw parametry akwizycji dla pojedynczego filmu po ablacji w płaszczyźnie Z, jak pokazano dla niestymulowanych zarodków.Zapisz bieżące ustawienie jako następne zadanie potoku, klikając LSM w menedżerze sekwencji. Wybierz sekwencję w obszarze Pobieranie. W razie potrzeby zmień ścieżkę zapisywania danych i nazwę pliku.Kliknij przycisk Gotowe i poczekaj, aż oprogramowanie zainicjuje potok, a następnie kliknij przycisk Start, aby wykonać potok. W niestymulowanych zarodkach ulegających zwężeniu wierzchołkowemu dynia spaghetti mCherry została wzbogacona w przyśrodkowej okolicy wierzchołkowej, podczas gdy CRY2 rząd pierwszy dominujący ujemny mCherry był cytozolny. W stymulowanych zarodkach jeden dominujący ujemny sygnał mCherry w rzędzie CRY2 został zlokalizowany w błonie plazmatycznej, podczas gdy przyśrodkowy sygnał wierzchołkowy dyni spaghetti mCherry całkowicie zniknął.Ablacja laserowa niestymulowanych zarodków w obrębie obszaru zwężenia doprowadziła do szybkiego cofania się tkanek wzdłuż osi przednio-tylnej, podczas gdy ablacja laserowa w stymulowanych zarodkach nie powodowała zauważalnego odrzutu tkanki. Ablacja została określona ilościowo i pokazana tutaj.

optogenetic-inhibition-rho1-mediated-actomyosin-contractility-coupled

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Tutaj opisujemy protokół optogenetycznej manipulacji aktywnością motoneuronalną podczas monitorowania zmian w wydatkach motorycznych (skurczu mięśni) u częściowo nienaruszonych larw Drosophila za pomocą laserów w konwencjonalnym mikroskopie konfokalnym. Technika ta umożliwia naukowcom osiągnięcie lokalnych zaburzeń aktywności neuronalnej w kilku neuromerach, aby wyjaśnić dynamikę obwodów motorycznych.

Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu

Prezentujemy zestaw pęsety optycznej sprzężonej z mikroskopem z arkuszem świetlnym oraz jej implementację do badania mechaniki komórkowej bez koralików w zarodku Drosophila.

Sondowanie mechaniki komórkowej za pomocą pęsety optycznej bez koralików w zarodku Drosophila

Tutaj opisujemy test kurczliwości z użyciem komórek Drosophila S2R+. Zastosowanie egzogennego liganda, gastrulacji fałdowej (Mgła), prowadzi do aktywacji szlaku sygnałowego Mgły i kurczliwości komórek. Test ten można wykorzystać do zbadania regulacji białek kurczliwości komórkowej w szlaku sygnałowym mgły.

Test komórkowy do badania kurczliwości miozyny II niezwiązanej z mięśniami za pośrednictwem szlaku sygnałowego zagiętego gastrulacji w komórkach S2R + Drosophila

Ten protokół zapewnia opartą na Fidżi, przyjazną dla użytkownika metodologię wraz z prostymi instrukcjami wyjaśniającymi, jak niezawodnie analizować zachowanie aktomiozyny w pojedynczych komórkach i zakrzywionych tkankach nabłonkowych. Do korzystania z samouczka nie są wymagane żadne umiejętności programowania; wszystkie kroki są wykonywane w sposób półinteraktywny przy użyciu graficznego interfejsu użytkownika Fiji i powiązanych wtyczek.

Analiza dynamiki aktomyozyny w lokalnej skali komórkowej i tkankowej z wykorzystaniem filmów poklatkowych z komór jajowych hodowanych Drosophila

Tutaj prezentujemy metodę rejestrowania skurczów mięśni embrionalnych w zarodkach Drosophila w sposób nieinwazyjny i zorientowany na szczegóły.

Obrazowanie i analiza na żywo skurczów mięśni w zarodku Drosophila

Celem tego protokołu jest wstrzyknięcie globularnej aktyny sprzężonej z rodaminą do zarodków Drosophila i zobrazowanie wewnątrzjądrowego montażu pręcików aktyny po stresie cieplnym.

Obrazowanie wewnątrzjądrowych pręcików aktynowych w żywych zarodkach Drosophila poddanych stresowi cieplnemu

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Aby zbadać mechanizm wykorzystania lipidów w błonach woreczków żółtkowych podczas późnych etapów rozwoju embrionalnego ptaków, stworzyliśmy podstawowy system hodowli komórek nabłonkowych encyklii encyklalnej przepiórek japońskich.

Pierwotna endodermalna hodowla komórek nabłonkowych z błony woreczka żółtkowego zarodków przepiórki japońskiej

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Zmodyfikowany protokół manipulacji ploidalnością wykorzystuje szok cieplny do wywołania jednocyklowego zatrzymania cytokinezy we wczesnym zarodku. Protokół ten został zademonstrowany w przypadku danio pręgowanego, ale może mieć zastosowanie do innych gatunków.

Manipulacja ploidalna zarodków danio pręgowanego z leczeniem szoku cieplnego 2

Poznaj optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny przez Rho1 w zarodkach Drosophila. Ta metoda umożliwia precyzyjną kontrolę napięcia nabłonkowego i badanie mechanizmów morfogenezy tkanek.

Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila (Wideo) | JoVE Journal

Optogenetyczne hamowanie kurczliwości aktomyozyny za pośrednictwem Rho1 w połączeniu z pomiarem napięcia nabłonka w zarodkach Drosophila

Przeglądaj więcej filmów