Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Otóż moje badania koncentrują się na naprawie uszkodzeń DNA, a w szczególności na naprawie uszkodzeń DNA indukowanych przez inhibitory topoizomerazy, inhibitory PARP i aldehydy. Próbuję zilustrować mechanizmy molekularne, za pomocą których komórka naprawia wiązania krzyżowe białek DNA indukowane przez te leki. Ostatnie postępy w naprawie wiązań krzyżowych białek DNA obejmują identyfikację nowych szlaków naprawy wiązań krzyżowych białek DNA oraz mechanizmów modyfikacji po translacji, które regulują te szlaki naprawcze.

Kompleks testów enzymatycznych in vivo i szybkie podejście do testu odzyskiwania adduktów DNA są najczęściej stosowanymi metodami pomiaru wiązań krzyżowych białek DNA. Niektóre wiązania krzyżowe białek DNA, takie jak wiązania krzyżowe białka DNA topoizomerazy I, można wykryć za pomocą immunofluorescencji przy użyciu specyficznego przeciwciała. Jednym z największych wyzwań jest badanie roli modyfikacji potranslacyjnych w naprawie wiązań krzyżowych białek DNA.

Wzbogacenie i wykrycie potranslacyjnych wiązań krzyżowych białek DNA sprzężonych z modyfikatorami było bardzo trudne ze względu na ich bardzo niską liczebność. Protokół ten dostarcza szczegółowych informacji na temat wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych białek DNA ubikwitylowanych, SUMOylowanych i ADP-rybozylonych, umożliwiając naukowcom badanie kinetyki i powstawania tych modyfikacji w naprawie wiązań krzyżowych białek DNA z różnych źródeł. Inne protokoły wykrywania wiązań krzyżowych białek DNA nie liczą kroków opisujących wykrywanie ich modyfikacji po translacji, podczas gdy ten protokół zawiera szczegółowe informacje, takie jak stężenia leków i czas trwania indukcji modyfikacji oraz metody separacji i wykrywania modyfikacji, a także metody stabilizacji modyfikacji.

Tak więc zidentyfikowano kilka modyfikacji potranslacyjnych w naprawie wiązań krzyżowych białek DNA. To, w jaki sposób koordynują naprawę, pozostaje w dużej mierze nieznane. W związku z tym wzajemne oddziaływanie między tymi modyfikacjami wymaga dalszych badań.

Aby rozpocząć hodowlę komórkową, należy przygotować pożywkę hodowlaną DMEM i roztwory wymagane do hodowli komórkowej. Wysiewaj jedną raz od 10 do szóstej komórki HEK-293 na 60-milimetrowej płytce lub sześciodołkowej płytce na warunek traktowania plus kontrola. Następnego dnia potraktuj komórki wiązaniami krzyżowymi białek DNA lub induktorami DPC z wyboru w celu indukcji DPC, ich ubikwitylacji i SUMOylacji.

Zbierz komórki po 20, 60 i 180 minutach lub dwóch godzinach w przypadku nieenzymatycznych DPC. Aby indukować PARylację TOP1 DPC, należy wstępnie potraktować komórki 10 mikromolową glikohydrolazą poli ADP-rybozy lub PARG, inhibitorem PDD 00017273 przez godzinę przed jednoczesnym traktowaniem 20 mikromolową kamptotekyną przez 20, 60 i 180 minut. Aby rozpocząć izolację i normalizację DNA zawierającego usieciowane białka, należy odessać pożywkę za pomocą pipety ssącej po leczeniu farmakologicznym ubikwitylacją i SUMOylacją.

Przepłucz komórki lodowatym PBS przed dodaniem 600 mikrolitrów odczynnika DNAzol. Powoli mieszaj płytkę na platformie wibracyjnej przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i dodaj 0,3 mililitra 100% zimnego etanolu bezpośrednio do płytki. Powtarzaj mieszanie, aż nieprzezroczyste agregaty kwasu nukleinowego staną się widoczne.

Następnie przenieś lizat komórkowy do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej i wiruj przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 20 000 G. Po zassaniu supernatantu przemyj kwas nukleinowy i usieciowane osady białkowe w jednym mililitrze 75% etanolu, a następnie przez dwie minuty wiruj w temperaturze 20 000 G i czterech stopniach Celsjusza. Zassać supernatant przed odwirowaniem z tą samą prędkością i usunięciem pozostałej cieczy za pomocą pipety P20.

Suszyć pelety na powietrzu przez pięć minut. Rozpuść wysuszony granulat kwasu nukleinowego w 0,1 mililitra podwójnie destylowanej wody, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Następnie inkubować zawiesinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez 30 minut, aż osad pęcznieje co najmniej trzy razy.

Sonikuj próbki przez 10 sekund za pomocą sondy procesora ultradźwiękowego o amplitudzie 30%. I określić ilościowo stężenie DNA za pomocą spektrometru UV-vis. Dodaj podwójnie destylowaną wodę, aby dostosować stężenie DNA do 400 do 500 nanogramów na mikrolitr w 120 mikrolitrach.

Następnie przenieś 20 mikrolitrów próbki do nowej probówki mikrowirówkowej jako kontrolę obciążenia niestrawionego DNA. Dodaj 2 000 jednostek żelu nukleazy mikrokokowej i 11 mikrolitrów 10x buforu reakcyjnego nukleazy mikrokokowej wapnia do DNA rozpuszczonego w pozostałych 100 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Aby rozpocząć western blotting znormalizowanych, strawionych próbek DNA, dodaj 4x bufor próbki Laemmli i gotuj próbkę przez pięć minut. Załaduj od pięciu do sześciu mikrogramów strawionej próbki na 4% do 20% żelu poliakrylamidowego i wykonaj SDS-PAGE, aby rozwiązać niezmodyfikowane i potranslacyjne modyfikacje lub DPC sprzężone z PMT. Inkubuj żel z niebieską plamą Coomassie przez noc w temperaturze pokojowej.

Umyj żel podwójnie destylowaną wodą przez dwie godziny przed uzyskaniem obrazu. Aby wykryć ubikwitylację, modyfikację SUMO 1 lub SUMO 2 i 3, rybozylację ADP, całkowite DPC TOP1, TOP2 alfa lub TOP 2 beta, rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała, jak pokazano w tabeli. Następnie przenieść żel w odpowiednim rozcieńczeniu przeciwciała pierwszorzędowego i buforu blokującego i inkubować błony przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po zakończeniu inkubować błonę przemytą PBST z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym 5 000 razy w buforze blokującym przez 60 minut w temperaturze pokojowej przed rozwinięciem membrany ze wzmocnionym odczynnikiem chemoluminescencyjnym. Uzyskaj obraz za pomocą systemu obrazowania. Ekspozycja na kamptotekcynę indukowała powstawanie TOP1 DPC.

Formacja TOP1 DPC osiągnęła szczyt po 20 minutach ekspozycji na kamptotecynę, podobnie jak w przypadku modyfikacji anty-SUMO 2 i 3. Zaobserwowano również kulminację modyfikacji i ubikwitylacji SUMO 1. DPC i ich modyfikacje SUMO2 i 3 TOP1 zmniejszały się w sposób zależny od dawki kamptotecyny.

Indukowane etopozydem TOP 2 DPC oraz modyfikacja SUMO 2 i 3 osiągnęły szczyt po 20 minutach, a następnie zmniejszyły się. Dla porównania, modyfikacje SUMO 1 i ubikwityny osiągnęły szczyt po 60 minutach. Indukowane formaldehydem DPC i ich SUMO 2 i 3, Sumo 1 i ubikwitylacja tworzyły się i akumulowały w sposób zależny od dawki.

Ilościowe wykrywanie PARylacji TOP 1 DPC przy użyciu przeciwciała anty-PAR. Top 1 DPC PARylacja nie była wykrywalna, chyba że do komórki dodano inhibitor PAGR, co sugeruje, że PARylacja następuje szybko i jest bardzo dynamiczna.