Name: Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę ilościowego wykrywania wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych, w tym ubiquitylacji i SUMOylacji. Protokół umożliwia badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez National Cancer Institute Center for Cancer ResearchExcellence in Postdoctoral Research Transition Award.

1. Hodowla komórkowa i leczenie farmakologiczne w ludzkiej linii komórkowej embrionalnej nerki 293 (HEK293)
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną, zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, 1% 2 mM L-glutaminy i 100 jednostek/ml penicyliny-streptomycyny.</li>
	<li>Wysiew 1 x 106 komórek na płytce 60 mm lub 6-dołkowej na warunek leczenia plus kontrola.</li>
	<li>Następnego dnia potraktuj komórki induktorami DPC z wyboru.
	<ol>
		<li>Aby indukować TOP1-DPC oraz ich ubikwitylację i SUMOylację, dodaj inhibitor TOP1 kamptotecynę w ilości 20 μM do komórek i zbierz komórki po 20, 60 i 180 minutach.</li>
		<li>Aby indukować TOP2α i β-DPC oraz ich ubikwitylację i SUMOylację, należy wystawić komórki na dodanie inhibitora TOP2 etopozydu w temperaturze 200 μM do komórek i zebrać komórki po 20, 60 i 180 minutach.</li>
		<li>Aby indukować nieenzymatyczne DPC i ich ubikwitylację oraz SUMOylację, dodaj FA w 1 mM i zbierz komórki 2 godziny po ekspozycji.</li>
		<li>Aby indukować PARylację TOP1-DPC, należy wstępnie potraktować komórki przez 1 godzinę w celu zablokowania dePARylacji inhibitorem glikohydrolazy poli(ADP-rybozy) (PARG) PDD00017273 przy 10 μM, a następnie jednocześnie leczyć 20 μM kamptotekiną przez 20, 60 i 180 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Izolacja i normalizacja DNA zawierającego usieciowane białka
<ol>
	<li>Po zabiegu szybko odessać pożywkę za pomocą pipety ssącej i przepłukać komórki lodowato zimną solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS). Natychmiast poddać komórki lizie w 600 μl odczynnika DNAzol zawierającego 1x inhibitor koktajlu proteazy, 1 mM ditiotreitol (DTT) i 20 mM N-etylomaleimidu (inhibitor enzymów desumo-ylujących i deubikwitylatujących).</li>
	<li>Powoli mieszać płytkę na platformie wibracyjnej przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 1/2 objętości 100% zimnego etanolu (0,3 ml) bezpośrednio do płytki i powtarzaj krok 2.2, aż pojawi się nieprzezroczyste agregaty kwasu nukleinowego. Przenieść lizat komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i poddać probówkę wirowaniu z maksymalną prędkością (20 000 x g) przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia kwasu nukleinowego i jego usieciowanych białek.</li>
	<li>Odessać supernatant za pomocą pipety ssącej i przemyć osad kwasu nukleinowego w 1 ml 75% etanolu, a następnie przez 2 minuty odwirowywać 20 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zassać supernatant, odwirować z tą samą prędkością i usunąć pozostałą ciecz za pomocą pipety P20. Suszyć pelety na powietrzu przez 5 minut.</li>
	<li>Szybko rozpuść osad kwasu nukleinowego w 0,1 ml ddH2O. Ponownie zawiesić osad przez wielokrotne pipetowanie, a następnie inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż osad pęcznieje do co najmniej trzykrotnie większego (około 30 min).</li>
	<li>Sonikować próbki za pomocą sondy ultradźwiękowej o amplitudzie 30% przez 10 sekund, aby całkowicie rozpuścić osad.</li>
	<li>Krok opcjonalny: Próbki należy poddać działaniu mieszaniny RNazy A/T1 (10 μg RNazy A i 25 U RNazy T1) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Dodać 1/10 objętości 3 M octanu sodu i dwie objętości lodowatego 100% etanolu do probówki, a następnie odwirować przy 20 000 x g przez 10 minut w celu pobrania DNA. Usunąć supernatant i rozpuścić wytrącony DNA w 0,1 ml ddH2O.</li>
	<li>Etap opcjonalny: Odwirować próbkę przez 5 minut przy 20 000 x g i przenieść supernatant do nowej probówki.</li>
	<li>Określić ilościowo stężenie DNA za pomocą spektrometru UV-Vis w ultrafiolecie. Typowa wydajność DNA wynosi około 600-800 ng/μl. Stosunek A260/A280 powinien zostać zmniejszony z 2,0-2,1 do 1,8-1,9 po usunięciu RNA.</li>
	<li>Dostosuj stężenie DNA do 400-500 ng/μL w 0,12 ml ddH2O. Przenieś 20 μl próbki do nowej probówki mikrowirówkowej jako kontrolę obciążenia niestrawionego DNA (patrz krok 2.4).</li>
	<li>Aby strawić DNA rozpuszczone w pozostałych 100 μl ddH2O, dodaj do próbki 2 000 jednostek żelu nukleazy mikrokokowej wraz z 1/10 objętości (~11 μl) 10x buforu reakcyjnego nukleazy mikrokokowej wapnia. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
</ol>
3. Western blotting strawionych próbek DNA
<ol>
	<li>Dodać 4x bufor do próbek Laemmli, a następnie gotować próbkę przez 5 minut.</li>
	<li>Załaduj 5-6 μg strawionej próbki (~15 μL) na 4%-20% żelu poliakrylamidowego, a następnie SDS-PAGE42, aby rozpuścić niezmodyfikowane i sprzężone z PTM DPC.</li>
	<li>Aby wykryć nieenzymatyczne gatunki DPC indukowane przez FA, należy inkubować żel z niebieską plamą Coomassie przez noc w temperaturze pokojowej. Przemyj żel ddH2O przez 2 godziny i uzyskaj obraz za pomocą systemu obrazowania.</li>
	<li>Przenieść żel i inkubować błony przez noc w temperaturze 4 °C, rozcieńczając odpowiednio pierwszorzędowe przeciwciało w buforze blokującym.
	<ol>
		<li>Aby wykryć ubikwitylację, należy rozcieńczyć przeciwciało anty-ubikwityny w stosunku 1:100.</li>
		<li>Aby wykryć modyfikację SUMO-1 lub SUMO-2/3, wykonaj rozcieńczenie przeciwciała anty-SUMO-1 lub anty-SUMO-2/3 w stosunku 1:250.</li>
		<li>Aby wykryć ADP-rybozylację, należy rozcieńczyć przeciwciało anty-PAR w stosunku 1:500.</li>
		<li>Aby wykryć całkowite przeciwciała TOP1-, TOP2α- lub TOP2β-DPC, należy rozcieńczyć przeciwciało anty-TOP1, anty-TOP2α lub anty-TOP2β w stosunku 1:500. 
		UWAGA: Szczegółowe informacje na temat rozcieńczania przeciwciał można znaleźć w Tabeli materiałów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować 1x PBS-T (0,1% tween 20) przemytą membranę z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym 5,000 razy w buforze blokującym przez 60 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wywołaj membranę za pomocą odczynnika o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i uzyskaj obraz za pomocą systemu obrazowania.</li>
</ol>
4. Slotting niestrawionych próbek DNA
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 20 μl niestrawionej próbki DNA w 180 μl buforu fosforanu sodu (25 mM, pH 6,6).</li>
	<li>Przeciąć membranę nitrocelulozową (0,45 μm) i równoważyć przez 5 minut w buforze fosforanu sodu.</li>
	<li>Zmontuj aparat do szczelinowania zgodnie z instrukcjami producenta i podłącz go do systemu próżniowego.</li>
	<li>Przemyć studzienki buforem fosforanu sodu, stosując próżnię. Upewnij się, że studzienki nie przeciekają.</li>
	<li>Zatrzymaj próżnię i załaduj 200 μl DNA na próbkę (1 μg). Wypełnić puste studzienki 200 μl buforu fosforanu sodu.</li>
	<li>Zastosuj próżnię.</li>
	<li>Gdy wszystkie studzienki są całkowicie puste, zatrzymaj próżnię, załaduj 200 μl buforu fosforanu sodu do każdej studzienki i powtórz krok 4.6.</li>
	<li>Pobrać membranę i blok z 5% buforem blokującym przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Sondę z przeciwciałem anty-dwuniciowym DNA (dsDNA) w rozcieńczeniu 1:5 000 przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć 3x 1x PBS-T i inkubować z rozcieńczonym 1:5 000 rozcieńczonym przeciwciałem wtórnym przeciwko mysiej peroksydazie chrzanowej (HRP).</li>
	<li>Wywołaj membranę za pomocą odczynnika o wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) i uzyskaj obraz za pomocą systemu obrazowania.</li>
</ol>
5. Analiza densytometryczna
<ol>
	<li>Za pomocą ImageJ oblicz stosunek intensywności każdego prążka/rozmazu w stosunku do intensywności szczeliny niestrawionego DNA i znormalizuj stosunek do intensywności komórek bez / przed leczeniem farmakologicznym.</li>
</ol>

Measuring Ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-Ribosylated DNA-Protein Crosslinks

<ol><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).</li>
<li>Klages-Mundt, N. L., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+repair+of+DNA-protein+crosslink+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Science+China.+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Formation and repair of DNA-protein crosslink damage.</a> Science China. Life Sciences. 60 (10), 1065-1076 (2017).</li>
<li>Weickert, P., Stingele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-protein+crosslinks+and+their+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA-protein crosslinks and their resolution.</a> Annual Review of Biochemistry. 91, 157-181 (2022).</li>
<li>Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Protein+cross-links%3A+formation%2C+structural+identities%2C+and+biological+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">DNA-Protein cross-links: formation, structural identities, and biological outcomes.</a> Accounts of Chemical Research. 48 (6), 1631-1644 (2015).</li>
<li>Pommier, Y., Nussenzweig, A., Takeda, S., Austin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+topoisomerases+and+their+roles+in+genome+stability+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human topoisomerases and their roles in genome stability and organization.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (6), 407-427 (2022).</li>
<li>Pommier, Y., Sun, Y., Huang, S. N., Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+eukaryotic+topoisomerases+in+transcription%2C+replication+and+genomic+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Roles of eukaryotic topoisomerases in transcription, replication and genomic stability.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 703-721 (2016).</li>
<li>Ruggiano, A., Ramadan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-protein+crosslink+proteases+in+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA-protein crosslink proteases in genome stability.</a> Communications Biology. 4 (1), 11(2021).</li>
<li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+crosslinking%3A+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li>
<li>Moretton, A., Loizou, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+cellular+metabolism+and+the+DNA+damage+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Interplay between cellular metabolism and the DNA damage response in cancer.</a> Cancers. 12 (8), 2051(2020).</li>
<li>Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA-dependent+protease+involved+in+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair.</a> Cell. 158 (2), 327-338 (2014).</li>
<li>Maskey, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spartan+deficiency+causes+accumulation+of+topoisomerase+1+cleavage+complexes+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Spartan deficiency causes accumulation of topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis.</a> Nucleic Acids Research. 45 (8), 4564-4576 (2017).</li>
<li>Stingele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+regulation+of+DNA-protein+crosslink+repair+by+the+DNA-dependent+metalloprotease+SPRTN%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism and regulation of DNA-protein crosslink repair by the DNA-dependent metalloprotease SPRTN.</a> Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).</li>
<li>Vaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metalloprotease+SPRTN%2FDVC1+orchestrates+replication-coupled+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Metalloprotease SPRTN/DVC1 orchestrates replication-coupled DNA-protein crosslink repair.</a> Molecular Cell. 64 (4), 704-719 (2016).</li>
<li>Lopez-Mosqueda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPRTN+is+a+mammalian+DNA-binding+metalloprotease+that+resolves+DNA-protein+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks.</a> eLife. 5, e21491(2016).</li>
<li>Kojima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FAM111A+protects+replication+forks+from+protein+obstacles+via+its+trypsin-like+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FAM111A protects replication forks from protein obstacles via its trypsin-like domain.</a> Nature Communications. 11 (1), 1318(2020).</li>
<li>Dokshin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCNA+interacts+with+spartan+and+topoisomerase+II+to+regulate+genome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">GCNA interacts with spartan and topoisomerase II to regulate genome stability.</a> Developmental Cell. 52 (1), 53-68 (2020).</li>
<li>Borgermann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMOylation+promotes+protective+responses+to+DNA-protein+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">SUMOylation promotes protective responses to DNA-protein crosslinks.</a> The EMBO Journal. 38 (8), e101496(2019).</li>
<li>Sun, Y., Zhang, Y., Schultz, C. W., Pommier, Y., Thomas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK7+inhibition+synergizes+with+topoisomerase+I+inhibition+in+small+cell+lung+cancer+cells+by+inducing+ubiquitin-mediated+proteolysis+of+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">CDK7 inhibition synergizes with topoisomerase I inhibition in small cell lung cancer cells by inducing ubiquitin-mediated proteolysis of RNA polymerase II.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 21 (9), 1430-1438 (2022).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+MRN+endonuclease+processing+of+topoisomerase+II-mediated+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Requirements for MRN endonuclease processing of topoisomerase II-mediated DNA damage in mammalian cells.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 1007064(2022).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARylation+prevents+the+proteasomal+degradation+of+topoisomerase+I+DNA-protein+crosslinks+and+induces+their+deubiquitylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PARylation prevents the proteasomal degradation of topoisomerase I DNA-protein crosslinks and induces their deubiquitylation.</a> Nature Communications. 12 (1), 5010(2021).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+repair+of+topoisomerase+DNA-protein+crosslinks+%28TOP-DPC%29%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Excision repair of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC).</a> DNA Repair. 89, 102837(2020).</li>
<li>Sun, Y., Saha, L. K., Saha, S., Jo, U., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Debulking+of+topoisomerase+DNA-protein+crosslinks+%28TOP-DPC%29+by+the+proteasome%2C+non-proteasomal+and+non-proteolytic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Debulking of topoisomerase DNA-protein crosslinks (TOP-DPC) by the proteasome, non-proteasomal and non-proteolytic pathways.</a> DNA Repair. 94, 102926(2020).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+SUMO+pathway+repairs+topoisomerase+DNA-protein+cross-links+by+engaging+ubiquitin-mediated+proteasomal+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">A conserved SUMO pathway repairs topoisomerase DNA-protein cross-links by engaging ubiquitin-mediated proteasomal degradation.</a> Science Advances. 6 (46), (2020).</li>
<li>Saha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA+cleavage+complexes+and+repair+pathway+for+TOP3B+RNA-+and+DNA-protein+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA cleavage complexes and repair pathway for TOP3B RNA- and DNA-protein crosslinks.</a> Cell Reports. 33 (13), 108569(2020).</li>
<li>Swan, R. L., Cowell, I. G., Austin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+to+repair+stalled+topoisomerase+II-DNA+covalent+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms to repair stalled topoisomerase II-DNA covalent complexes.</a> Molecular Pharmacology. 101 (1), 24-32 (2022).</li>
<li>Swan, R. L., Poh, L. L. K., Cowell, I. G., Austin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+inhibitors+confirm+ubiquitin-dependent+removal+of+TOP2-DNA+covalent+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Small molecule inhibitors confirm ubiquitin-dependent removal of TOP2-DNA covalent complexes.</a> Molecular Pharmacology. 98 (3), 222-233 (2020).</li>
<li>Sciascia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressing+proteasome+mediated+processing+of+topoisomerase+II+DNA-protein+complexes+preserves+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Suppressing proteasome mediated processing of topoisomerase II DNA-protein complexes preserves genome integrity.</a> eLife. 9, e53447(2020).</li>
<li>Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+topoisomerase+covalent+complexes+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1703, 283-299 (2018).</li>
<li>Subramanian, D., Furbee, C. S., Muller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICE+bioassay.+Isolating+in+vivo+complexes+of+enzyme+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ICE bioassay. Isolating in vivo complexes of enzyme to DNA.</a> Methods in Molecular Biology. 95, 137-147 (2001).</li>
<li>Nitiss, J. L., Kiianitsa, K., Sun, Y., Nitiss, K. C., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase assays.</a> Current Protocols. 1 (10), e250(2021).</li>
<li>Kiianitsa, K., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+assay+for+DNA-protein+covalent+complexes+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells.</a> Nucleic Acids Research. 41 (9), e104(2013).</li>
<li>Cowell, I. G., Tilby, M. J., Austin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+visualisation+and+quantitation+of+low+and+high+MW+DNA+adducts+using+the+trapped+in+agarose+DNA+immunostaining+%28TARDIS%29+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">An overview of the visualisation and quantitation of low and high MW DNA adducts using the trapped in agarose DNA immunostaining (TARDIS) assay.</a> Mutagenesis. 26 (2), 253-260 (2011).</li>
<li>Leng, X., Duxin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA-protein+crosslinks+via+post-translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA-protein crosslinks via post-translational modifications.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 944775(2022).</li>
<li>Kuhbacher, U., Duxin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+fix+DNA-protein+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">How to fix DNA-protein crosslinks.</a> DNA Repair. 94, 102924(2020).</li>
<li>Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA-protein crosslink repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 563-573 (2017).</li>
<li>Sun, Y., Nitiss, J. L., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%3A+A+Swiss+army+knife+for+eukaryotic+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">SUMO: A Swiss army knife for eukaryotic topoisomerases.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 871161(2022).</li>
<li>Krastev, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-dependent+ATPase+p97+removes+cytotoxic+trapped+PARP1+from+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-dependent ATPase p97 removes cytotoxic trapped PARP1 from chromatin.</a> Nature Cell Biology. 24 (1), 62-73 (2022).</li>
<li>Liu, J. C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+function+of+DNA+replication-independent+DNA-protein+crosslink+repair+via+the+SUMO-RNF4+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanism and function of DNA replication-independent DNA-protein crosslink repair via the SUMO-RNF4 pathway.</a> The EMBO Journal. 40 (18), e107413(2021).</li>
<li>Larsen, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+DNA-protein+crosslink+repair+by+SPRTN+and+the+proteasome+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled DNA-protein crosslink repair by SPRTN and the proteasome in Xenopus egg extracts.</a> Molecular Cell. 73 (3), 574-588 (2019).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin+switch+controls+autocatalytic+inactivation+of+the+DNA-protein+crosslink+repair+protease+SPRTN%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin switch controls autocatalytic inactivation of the DNA-protein crosslink repair protease SPRTN.</a> Nucleic Acids Research. 49 (2), 902-915 (2021).</li>
<li>Ruggiano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protease+SPRTN+and+SUMOylation+coordinate+DNA-protein+crosslink+repair+to+prevent+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The protease SPRTN and SUMOylation coordinate DNA-protein crosslink repair to prevent genome instability.</a> Cell Reports. 37 (10), 110080(2021).</li>
<li>Mahmood, T., Yang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blot%3A+technique%2C+theory%2C+and+trouble+shooting%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Western blot: technique, theory, and trouble shooting.</a> North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).</li>
</ol>

Autor deklaruje brak sprzecznych interesów.

Opisana metoda pozwala na pomiar enzymatycznych i nieenzymatycznych wiązań krzyżowych DNA-białko w komórkach ssaków i jest jedynym odpowiednim podejściem do badania ich ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji. Slot-blotting po teście ICE lub RADAR umożliwia szybkie wykrycie specyficznych enzymatycznych DPC, takich jak TOP-DPC, przy użyciu ich przeciwciał. Jednak zastrzeżeniem do tej metody jest jej niezdolność do rozdzielenia białek o różnej masie cząsteczkowej, co uniemożliwia określenie rozmiarów DPC sprzężonych z PTM. Opisana metoda rozwiązuje problem poprzez uwalnianie usieciowanych białek za pomocą nukleazy mikrokokowej, która degraduje DNA do oligonukleotydów z końcowymi 3'-fosforanami, umożliwiając w ten sposób pełną separację białek (sprzężonych z oligonukleotydami) przez SDS-PAGE. DPC modyfikowane monomerami ubikwityny, SUMO lub ADP-rybozy oraz polimerami o różnych rozmiarach mogą być zatem wizualizowane i oznaczane ilościowo przez przeciwciała skierowane przeciwko tym PTM, umożliwiając szczegółowe badanie ich powstawania i kinetyki. Aby zapewnić odtwarzalność i obliczyć istotność statystyczną, wymagane są powtórzenia biologiczne eksperymentów.
Jednym z najczęstszych problemów związanych z tym testem jest niska wydajność DNA po wytrąceniu etanolu. Z jednej strony wydajność DNA można zwiększyć przy użyciu większej ilości materiału wyjściowego (komórek). Z drugiej strony, inkubacja lizatów komórkowych z etanolem na płaskiej płytce, a nie w probówce Eppendorfa, może znacznie poprawić agregację cząsteczek DNA, a tym samym ułatwić ich wytrącanie. Niespecyficzne sygnały obserwowane w próbkach bez leczenia farmakologicznego mogą wskazywać na zanieczyszczenie białkami niekowalencyjnymi. W takim przypadku można rozważyć mycie granulek DNA buforem o wysokiej zawartości soli w celu usunięcia zanieczyszczeń przed sonikacją. Zaleca się również odwirowanie próbek DNA po sonikacji i trawieniu nukleazy mikrokokowej i odrzucenie wszelkich nierozpuszczalnych. W przypadku słabego sygnału lub jego braku można spróbować kilku potencjalnych rozwiązań. Po pierwsze, można zwiększyć ilość ładunku DNA dla SDS-PAGE i immunoblottingu. Aby umożliwić wykrywanie gatunków DPC SUMOylowanych i ubikwitylowanych, zaleca się załadowanie do żelu co najmniej 4 μg DNA. Po drugie, można zwiększyć stężenie leku, aby wywołać wyższe poziomy DPC i związanych z nimi PTM. Po trzecie, sugeruje się inkubację blot z pierwotnymi przeciwciałami przez kolejny dzień, jeśli prążki/rozmazy wydają się słabe. 2-dniowa inkubacja może znacznie wzmocnić sygnał, a tym samym zmniejszyć zmienność biologiczną wynikającą z niezależnych eksperymentów23. Usuwanie membrany w celu ponownego barwienia nieuchronnie prowadzi do utraty pewnej ilości gatunków DPC sprzężonych z PTM, które są już w niskiej liczebności. Dlatego zdecydowanie zaleca się stosowanie oddzielnych żeli do wykrywania ubikwityny i SUMO, zamiast ponownego sondowania jednego blota. Ponadto granulki DNA muszą być przemyte 75% etanolem w celu usunięcia pozostałego DNAzolu zawierającego sól guanidyny przed rozpuszczeniem w H2O lub innych rozpuszczalnikach, co w przeciwnym razie powoduje krystalizację próbki po dodaniu buforu ładującego Laemmli.
Przebieg pracy opisanej metody jest znacznie bardziej efektywny czasowo w porównaniu z kłopotliwym testem ICE, ponieważ opiera się na szybkim wytrącaniu etanolu zamiast czasochłonnego ultrawirowania chlorku cezu w celu wyizolowania genomowego DNA. Oczyszczanie oparte na etanolu ma swoją cenę i powoduje niewielką ilość zanieczyszczeń białkowych, które zwykle są pomijalne dla immunodetekcji. Jednak jeśli chodzi o badania analityczne, takie jak analiza proteomiczna oparta na spektrometrii mas lub sekwencjonowanie nowej generacji, które wymagają dokładności i precyzji, wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu jest nadal bardziej niezawodnym podejściem do izolowania czystego DNA o wysokiej obfitości. Metoda ta może być również potencjalnie zastosowana do profilowania miejsc modyfikacji na usieciowanych białkach oraz do określania typów sprzężeń poli-ubikwitylacji i poli-SUMOylacji przy użyciu odpowiednich metod opartych na spektrometrii mas.
Warto zauważyć, że test ten pozwala na identyfikację i scharakteryzowanie czynników regulujących PTM w celu naprawy DPC. Na przykład bezstronne, wysokoprzepustowe metody badań przesiewowych (interferencja RNA i CRISPR) są potężnymi narzędziami do odkrywania ligaz ubikwityny E3, ligaz SUMO E3 i powiązanych z nimi kofaktorów łagodzących cytotoksyczność induktorów DPC. Opisana metoda umożliwia walidację molekularną tych białek poprzez określenie, czy pomagają one komórkom przetrwać induktory DPC poprzez naprawę DPC. Za pomocą tego protokołu można również zwalidować nowe małocząsteczkowe inhibitory ukierunkowane na te białka, zidentyfikowane na przykład za pomocą wirtualnych badań przesiewowych. Biorąc pod uwagę, że inhibitory topoizomerazy są jednymi z najczęściej przepisywanych chemioterapeutyków, ten solidny test może zostać opracowany jako narzędzie do opracowywania leków, które działają synergistycznie z klinicznymi inhibitorami topoizomerazy.

Uszkodzenia genomowego DNA powstają w wyniku spontanicznego rozpadu, uszkodzeń wewnętrznych i czynników środowiskowych1. Powstałe zmiany DNA obejmują uszkodzone zasady, niedopasowania, pęknięcia jedno- i dwuniciowe, wiązania krzyżowe między- i wewnątrzniciowe oraz wiązania krzyżowe DNA-białko (DPC). DPC powstaje, gdy białko związane z chromatyną jest uwięzione w DNA poprzez wiązanie kowalencyjne. DPC są indukowane przez endogenne uszkodzenia DNA i reaktywne metabolity, a także czynniki egzogenne, takie jak chemioterapeutyki i dwufunkcyjne środki sieciujące. W pewnych okolicznościach dysfunkcja enzymów może również prowadzić do powstawania DPCs2. Ogromna różnica w induktorach DPC skutkuje różnicą w tożsamości białka związanego kowalencyjnie, regionie chromosomu, w którym powstaje DPC, typie struktury DNA usieciowanego z białkiem oraz właściwościach chemicznych wiązania kowalencyjnego między białkiem a DNA2,3,4.
Ze względu na ich chemiczną naturę, DPC są zazwyczaj klasyfikowane na dwie grupy: enzymatyczne DPC i nieenzymatyczne DPC. Niektóre enzymy, takie jak topoizomerazy, glikozylazy i metylo/acylotransferazy, działają poprzez tworzenie odwracalnych produktów kowalencyjnych enzymu i DNA podczas ich normalnych reakcji katalitycznych. Są to krótkożyciowe produkty pośrednie enzymatycznego DNA i mogą być przekształcane w długożyciowe enzymatyczne DPC po ich wyłapaniu przez czynniki endogenne lub egzogenne, w szczególności przez chemotherapeutics3. DPC topoizomerazy są jednymi z najczęstszych enzymatycznych DPC w komórkach eukariotycznych, które mogą być generowane przez klinicznie użyteczne inhibitory topoizomerazy (topotekan i irynotekan dla topoizomerazy I [TOP1] oraz etopozyd i doksorubicyna dla topoizomerazy II [TOP2]) i są głównymi mechanizmami terapeutycznymi tych inhibitorów5,6. Metylotransferazy DNA (DNMT) 1, 3A i 3B są celem 5-aza-2'-deoksycytydyny (znanej również jako decytabina) i tworzą DPC po ekspozycji na lek7. Czynniki reaktywne, a także światło ultrafioletowe i promieniowanie jonizujące, indukują nieenzymatyczne DPC poprzez niespecyficzne sieciowanie białek z DNA. Aldehydy reaktywne, takie jak aldehyd octowy i formaldehyd (FA), są często wytwarzane jako produkty uboczne metabolizmu komórkowego, wśród których FA jest wytwarzany w stężeniach mikromolowych podczas metabolizmu metanolu, peroksydacji lipidów i demetylacji histonów. Ponadto FA jest substancją chemiczną produkowaną na dużą skalę produkowaną na całym świecie, na którą wiele osób jest narażonych zarówno środowiskowo, jak i zawodowo8,9.
Zarówno enzymatyczne, jak i nieenzymatyczne DPC są wysoce toksyczne dla komórek, ponieważ ich masywne składniki białkowe skutecznie utrudniają prawie wszystkie procesy oparte na chromatynie, w tym replikację i transkrypcję, prowadząc do zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy, jeśli nie zostaną naprawione. W ciągu ostatnich dwóch dekad naprawa DPC była intensywnie badana, a kilka białek/szlaków zostało zidentyfikowanych jako kluczowe czynniki, które albo bezpośrednio naprawiają DPC, albo modulują ich procesy naprawy. Na przykład, dobrze ustalono, że proteoliza masy białkowej DPC jest kluczowym etapem naprawy DPC i że proteoliza może być katalizowana przez proteazy SPRTN10,11,12,13,14, FAM111A15, GCNA16,17, lub proteasom 26S complex18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 w sposób zależny od typu komórki lub kontekstu komórkowego. Identyfikacja i charakterystyka tych proteaz w dużej mierze opierała się na kompleksie in vivo testu enzymatycznego (ICE)28,29 oraz szybkim podejściu do odzyskiwania adduktów DNA (RADAR) class<="xref">30,31, z których oba izolują cząsteczki DNA i ich białka związane kowalencyjnie z wolnych białek komórkowych, aby umożliwić wykrycie DPC przez slot-blot przy użyciu przeciwciał ukierunkowanych na białka usieciowane. Również test immunobarwienia DNA z pułapką agarozy (TARDIS) został wykorzystany jako sposób wykrywania i ilościowego oznaczania DPC na poziomie pojedynczej komórki32. Obecnie naukowcy wybierają test RADAR zamiast testu ICE do pomiaru DPC, ponieważ test ICE opiera się na oczyszczaniu kwasów nukleinowych za pomocą ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu, co jest niezwykle czasochłonne, podczas gdy test RADAR wytrąca kwasy nukleinowe przy użyciu etanolu w znacznie krótszym czasie.
W ostatnich latach pojawiło się coraz więcej dowodów na to, że wiele modyfikacji potranslacyjnych (PTM) jest zaangażowanych w sygnalizację i rekrutację proteaz ukierunkowanych na DPC3,33,34,35. Na przykład stwierdzono, że zarówno TOP1, jak i TOP2-DPC są sprzężone z małym modyfikatorem podobnym do ubikwityny (SUMO)-2/3, a następnie SUMO-1 przez ligazę SUMO E3 PIAS4, niezależnie od replikacji i transkrypcji DNA. Sekwencyjne modyfikacje SUMO wydają się być celem ubikwityny, która jest deponowana w SUMOylowanych TOP-DPC i tworzy łańcuchy polimerowe poprzez resztę lizyny 48 przez ligazę ubikwityny ukierunkowaną na SUMO, zwaną RNF4. Następnie polimer ubikwityny wysyła sygnał i rekrutuje proteasom 26S do TOP-DPCs23,36. Niedawno wykazano, że ten sam szlak SUMO-ubikwityny działa na DNMT1-DPC, a także na kompleksy PARP-DNA w celu ich naprawy37,38. Ponadto, niezależna od SUMO ubikwitylacja przez ligazę ubikwityny E3 TRAIP została zgłoszona do głównych DPC w celu degradacji proteasomalnej w sposób sprzężony z replikacją39. Podobnie jak proteasomalna degradacja TOP-DPC, proteoliza enzymatycznych i nieenzymatycznych DPC przez sprzężoną z replikacją metaloproteazę SPRTN wymaga również ubikwitylacji substratów DPC jako mechanizmu angażującego SPRTN40,41. Określenie roli SUMOylacji i ubikwitylacji wymaga wykrycia DPC, które są oznaczone tymi PTM. Ponieważ oryginalny test ICE i test RADAR opierają się na aparacie slot-blot/dot-blot do pomiaru niestrawionych próbek DNA, żaden z tych dwóch testów nie jest w stanie rozpoznać i uwidocznić gatunków DPC sprzężonych z PTM o różnej masie cząsteczkowej. Aby przezwyciężyć ten problem, przetrawiliśmy próbki DNA po ich oczyszczeniu przez wytrącanie etanolu i normalizację próbki za pomocą nukleazy mikrokokowej, endoegzonukleazy DNA i RNA w celu uwolnienia usieciowanych białek, co umożliwiło nam rozwiązanie białek, a także ich kowalencyjnych PTM za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). Elektroforeza pozwoliła nam wykryć i określić ilościowo DPC sprzężone z PTM przy użyciu specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko PTM. Początkowo nazwaliśmy tę ulepszoną metodę testem DUST, aby podkreślić jej solidność w wykrywaniu ubikwitylowanych i SUMOylowanych TOP-DPCs23. Później rozszerzyliśmy zastosowanie testu do ilościowej oceny ADP-rybozylacji TOP1-DPC in vivo, używając przeciwciał przeciwko polimerom poli-ADP-rybozy20.
Prezentowany tutaj jest szczegółowy protokół testu, który wykrywa i mierzy ubikwitylowane, SUMOylowane i ADP-rybozylowane DPC, który został zoptymalizowany dla zmodyfikowanych TOP-DPC, które są indukowane przez ich inhibitory i niespecyficznych/nieenzymatycznych DPC, które są indukowane przez FA. Test ten izoluje DPC sprzężone z PTM poprzez lizę komórek środkiem chaotropowym, wytrącanie DNA etanolem i uwalnianie usieciowanych białek i ich modyfikatorów za pomocą nukleazy mikrokokowej. Białka związane z DNA i ich PTM są oznaczane ilościowo przez immunoblotting przy użyciu specyficznych przeciwciał. Test ten toruje nową drogę do wyjaśnienia mechanizmów molekularnych, za pomocą których komórka naprawia zarówno enzymatyczne, jak i nieenzymatyczne DPC. W szczególności umożliwia szczegółowe badania indukcji i kinetyki PTM ważnych dla regulacji degradacji i naprawy TOP-DPC, a tym samym pozwala na odkrycie nowych czynników, takich jak ligazy E3 dyktujące PTM. a także inhibitory ukierunkowane na te czynniki. Ponieważ niektóre z PTM odpowiedzialnych za naprawę TOP-DPC są prawdopodobnie zaangażowane w naprawę DPC indukowaną przez inne chemioterapeutyki, takie jak leki na bazie platyny22, test ten ma również potencjał do zastosowania do odkrywania nowych leków i racjonalnej optymalizacji terapii skojarzonych z inhibitorami topoizomerazy lub antynowotworami na bazie platyny w komórkach pacjenta w celu kierowania schematami leczenia.

<table><tbody><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>70011069</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 20% prefabrykowany żel poliakrylamidowy</td><td>Bio-Rad</td><td>4561096</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>AcquaStain (coomassie blue)</td><td>Bulldog Bio</td><td>AS001000</td><td></td></tr><tr><td>anty-dsDNA (monoklonalny myszy)</td><td>Abcam</td><td>27156</td><td>1: 5,000 zalecane jest rozcieńczenie</td></tr><tr><td>anty-PAR (monoklonalne mysie)</td> <td>R& Systemy D</td><td>4335-MC-100</td><td>1: Zalecane jest rozcieńczenie 1: 500</td></tr><tr><td>anty-SUMO-1 (monoklonalny królik)</td> <td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4940</td><td>Zalecane jest rozcieńczenie</td></tr><tr><td>anty-SUMO-2/3 (monoklonalne królika)</td> <td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4971</td><td>Zalecane jest rozcieńczenie 1: 250</td></tr><tr><td>anty-TOP1 (monoklonalne myszy)</td> <td>BD Biosciences</td><td>556597</td><td>1: Zalecane</td></tr> <tr><td>jest rozcieńczenie 1: 500anty-TOP2&alfa; (mysz monoklonalna)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-365799</td><td>1: 250 zaleca się rozcieńczenie</td></tr><tr><td>anty-TOP2 i beta; (mysz monoklonalna)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-25330</td><td>Zalecane jest rozcieńczenie 1: 250</td></tr><tr><td>anty-ubikwityna (monoklonalna mys)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8017</td><td>1: 100 zalecane jest rozcieńczenie</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>499609</td><td>Stosowany do trawienia nukleazy mikrokokowej</td></tr> System obrazowania <tr><td></td><td></td><td></td> Sigma-Aldrich PHL89593 <td></td></tr><tr><td>ChemiDo</td><td>Bio-Rad</td><td>12003154</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan disodowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5438380100</td><td>Służy do wytwarzania buforu fosforanowego sodu</td></tr><tr><td>DNAzol</td><td>Thermo Fisher</td><td>10503027</td><td></td></tr><tr><td>DTT (ditiotreitol)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy, 200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Etopozyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1268808</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47608</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Graphpad Prism</td><td>GraphStats</td><td>Prism 9.0.0</td><td></td></tr><tr><td>IgG myszy sprzężonej z HRP</td><td>Cytiva</td><td>NA931</td><td>Zalecane jest rozcieńczenie 1: 5,000</td></tr><tr><td>IgG królika sprzężonego z HRP</td><td>Cytiva</td><td>NA934</td><td>Zalecane jest rozcieńczenie 1: 5,000</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>NIH, USA</td><td>ImageJ 1.53e</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Maksymalna czułość Podłoże ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>34095</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza mikrokokkowa</td><td>New England BioLabs</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan monosodowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139</td><td>Służy do wytwarzania buforu fosforanu sodu</td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>N-etylomaleimid</td><td>Thermo Fisher</td><td>23030</td><td>Inhibitor deSUMOylacji/deubikwitylacji</td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa, 0,45 i mikro; m</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404XTU</td><td></td></tr><tr><td>PDD00017273</td><td>Selleckchem</td><td>S8862</td><td>Inhibitor glikohydrolazy poli(ADP-rybozy)</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sonikator</td><td></td> Thermo Fisher 78430 <td></td></tr><tr><td>Q700</td><td>Qsonica</td><td>Q700-110</td><td></td></tr><tr><td>Gotowy do montażu zestaw transferowy PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1704274</td><td></td></tr><tr><td>Aparat do blokosów</td><td>Bio-Rad</td><td>1706542</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna do bloksów</td><td>Bio-Rad</td><td>1620161</td><td></td></tr><tr><td>System turbotransferu Trans-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do elektroforezy Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>1610732</tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3179</td><td></td></tr><tr><td>Pionowe ogniwo do elektroforezy</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych dna-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

Wiązania krzyżowe DNA-białko (DPC) to częste, wszechobecne i szkodliwe uszkodzenia DNA, które powstają w wyniku endogennego uszkodzenia DNA, nieprawidłowego działania enzymów (topoizomerazy, metylotransferazy itp.) lub czynników egzogennych, takich jak chemioterapeutyki i środki sieciujące. Po indukowaniu DPC, kilka rodzajów modyfikacji potranslacyjnych (PTM) jest natychmiast sprzężonych z nimi jako mechanizmy wczesnej reakcji. Wykazano, że DPC mogą być modyfikowane przez ubikwitynę, mały modyfikator podobny do ubikwityny (SUMO) i poli-ADP-rybozę, które przygotowują substraty do sygnalizowania odpowiednich wyznaczonych enzymów naprawczych i, w niektórych przypadkach, koordynują naprawę w sposób sekwencyjny. Ponieważ PTM rozprzestrzeniają się szybko i są wysoce odwracalne, wyzwaniem było wyizolowanie i wykrycie DPC sprzężonych z PTM, które zwykle pozostają na niskim poziomie. Przedstawiono tutaj test immunologiczny do oczyszczania i ilościowego wykrywania ubikwitylowanych, SUMOylowanych i ADP-rybozylowanych DPC (DPC topoizomerazy indukowane lekiem i niespecyficzne DPC indukowane aldehydem) in vivo. Test ten wywodzi się z testu RADAR (rapid approach to DNA adduct recovery), który jest stosowany do izolacji genomowego DNA zawierającego DPC poprzez wytrącanie etanolu. Po normalizacji i trawieniu nukleazy, PTM DPC, w tym ubikwitylacja, SUMOylacja i ADP-rybozylacja, są wykrywane przez immunoblotting przy użyciu odpowiadających im przeciwciał. Ten solidny test może być wykorzystany do identyfikacji i scharakteryzowania nowych mechanizmów molekularnych, które naprawiają enzymatyczne i nieenzymatyczne DPC, a także ma potencjał do odkrycia małocząsteczkowych inhibitorów ukierunkowanych na określone czynniki, które regulują PTM w celu naprawy DPC.

Reprezentatywne wyniki przedstawione na Rysunku 1 pokazują powstawanie i kinetykę indukowanych lekiem kompleksów TOP1-DPC oraz ich sumoilację i ubikwitynację. TOP1 przecina jedną nić dupleksu DNA i tworzy kowalentny kompleks enzym-DNA, nazywany kompleksem cięcia TOP1 (TOP1cc). Podanie kamptotecyny (CPT), inhibitora TOP1, spowodowało związanie i stabilizację TOP1cc, co doprowadziło do powstania długotrwałych kompleksów TOP1-DPC. Zaobserwowano, że TOP1-DPC są indukowane i osiągają szczyt 20 min po ekspozycji na CPT. Jednocześnie TOP1-DPC zostały zmodyfikowane przez SUMO-2/3, co również osiągnęło szczyt 20 min po podaniu CPT. Ponieważ SUMO-2 i SUMO-3 wykazują 95% identyczności sekwencji, przeciwciało nie rozróżnia tych dwóch białek. Po 60 min poziom TOP1-DPC oraz ich modyfikacji SUMO-2/3 zmalał, co zbiegło się z kulminacją modyfikacji SUMO-1 i ubikwitynacji. Po 60 min leczenia poziomy modyfikacji SUMO-1 i ubikwitynacji TOP1-DPC zaczęły spadać. U ssaków izoformy TOP2 α i β działają poprzez wprowadzanie pęknięć dwuniciowych DNA, a także via tworzenie przejściowego i odwracalnego kowalentnego kompleksu enzym-DNA (TOP2cc). Inhibitory TOP2, takie jak etoposyd (ETOP), przekształcają TOP2cc w TOP2-DPC i indukują ich sumoilację oraz ubikwitynację. Podobnie jak w przypadku kinetyki TOP1-DPC i ich PTM, kompleksy TOP2α- i β-DPC oraz ich modyfikacja SUMO-2/3 osiągnęły szczyt w 20 min, a następnie zaczęły spadać; w tym czasie modyfikacje SUMO-1 i ubikwityny osiągnęły szczyt w 60 min (Rysunek 2). Wykazano, że usuwanie TOP-DPC wynika z degradacji proteasomalnej, a usuwanie sumoilacji i ubikwitynacji TOP-DPC wynika prawdopodobnie z recyklingu poprzez odpowiednio desumoilację i deubikwitynację przez enzymy odwracające te procesy. Eksperymenty przedstawione na Rysunku 3 badały nieenzymatyczne DPC indukowane przez FA oraz ich PTM. Zaobserwowano, że DPC oraz ich modyfikacje SUMO-2/3, SUMO-1 i ubikwitynacja tworzyły się i gromadziły w sposób zależny od dawki FA. Na koniec, PARylacja TOP1-DPC została ilościowo wykryta za pomocą przeciwciała anty-PAR przy użyciu tej samej metody (Rysunek 4). PARylacja TOP1-DPC nie była wykrywalna, dopóki do komórki nie dodano inhibitora PARG, co sugeruje, że PARylacja zachodzi szybko i jest wysoce dynamiczna. Zgodnie z poprzednim odkryciem, hamowanie dePARylacji przez PARGi wydawało się prowadzić do gromadzenia TOP1-DPC, prawdopodobnie poprzez blokowanie degradacji proteolitycznej.
<img alt="Analiza ekspresji białek metodą Western blot i wykres gęstości względnej po 200 min traktowaniu CPT." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65315/65315fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Analizy ilościowe powstawania i kinetyki TOP1-DPC oraz ich sumosylacji i ubikwitynacji po traktowaniu CPT w komórkach HEK293. (A) Komórki HEK293 traktowano 20 µM CPT przez wskazane okresy czasu. Lizaty komórkowe pobrano i poddano zmodyfikowanemu testowi RADAR oraz analizie Western blot z użyciem wskazanych przeciwciał. Próbki nieprzetrawionego DNA poddano analizie slot-blot z użyciem przeciwciała anty-dsDNA jako kontroli załadunku. (B>) Intensywność prążków określono przy użyciu oprogramowania ImageJ i przedstawiono za pomocą oprogramowania Prism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65315/65315fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza Western blot modyfikacji białek; schemat względnej gęstości zintegrowanej w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65315/65315fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Analizy ilościowe tworzenia i kinetyki TOP2-DPC oraz ich sumoilacji i ubikwitynacji po traktowaniu ETOP w komórkach HEK293. (A) Komórki HEK293 traktowano 200 µM ETOP przez wskazane okresy czasu. Lizaty komórkowe pobrano i poddano zmodyfikowanemu testowi RADAR oraz analizie Western blot z użyciem wskazanych przeciwciał. Próbki nieprzetrawionego DNA poddano analizie slot-blot z użyciem przeciwciała anty-dsDNA jako kontroli załadunku. (B) Intensywności prążków oznaczono za pomocą oprogramowania ImageJ i przedstawiono za pomocą oprogramowania Prism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65315/65315fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rozdział białek metodą SDS-PAGE; analiza immunoblotowa SUMOylacji; wykres gęstości względnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65315/65315fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analizy ilościowe nieenzymatycznych DPC oraz ich SUMOylacji i ubikwitynacji po traktowaniu FA w komórkach HEK293. (A) Komórki HEK293 traktowano FA w określonych stężeniach przez 2 h. Lizaty komórkowe pobrano i poddano zmodyfikowanemu testowi RADAR oraz western blottingowi z użyciem wskazanych przeciwciał. Próbki nieprzetrawionego DNA poddano metodzie slot-blotting z wykorzystaniem przeciwciała anty-dsDNA jako kontroli ilości załadowanego materiału. (B) Intensywność prążków określono za pomocą oprogramowania ImageJ i przedstawiono za pomocą oprogramowania Prism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65315/65315fig3v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Western blot i wykres przedstawiające poziomy białek PAR i TOP1 po traktowaniu CPT i PARGi w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65315/65315fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analizy ilościowe TOP1-DPC i ich PARylacji po traktowaniu CPT w komórkach HEK293. (A) Komórki HEK293 poddano wstępnej inkubacji z 10 µM PARGi przez 1 h, a następnie współtraktowano CPT przez określone przedziały czasu. Lizaty komórkowe zebrano i poddano zmodyfikowanemu testowi RADAR oraz western blottingowi z użyciem wskazanych przeciwciał. Próbki nieprzetrawionego DNA poddano technice slot-blottingu z użyciem przeciwciała przeciwko dsDNA jako kontroli ilości załadowanego materiału. (B) Intensywność prążków ilościowo określono za pomocą oprogramowania ImageJ, a wyniki przedstawiono za pomocą oprogramowania Prism. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65315/65315fig4v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Otóż moje badania koncentrują się na naprawie uszkodzeń DNA, a w szczególności na naprawie uszkodzeń DNA indukowanych przez inhibitory topoizomerazy, inhibitory PARP i aldehydy. Próbuję zilustrować mechanizmy molekularne, za pomocą których komórka naprawia wiązania krzyżowe białek DNA indukowane przez te leki. Ostatnie postępy w naprawie wiązań krzyżowych białek DNA obejmują identyfikację nowych szlaków naprawy wiązań krzyżowych białek DNA oraz mechanizmów modyfikacji po translacji, które regulują te szlaki naprawcze.Kompleks testów enzymatycznych in vivo i szybkie podejście do testu odzyskiwania adduktów DNA są najczęściej stosowanymi metodami pomiaru wiązań krzyżowych białek DNA. Niektóre wiązania krzyżowe białek DNA, takie jak wiązania krzyżowe białka DNA topoizomerazy I, można wykryć za pomocą immunofluorescencji przy użyciu specyficznego przeciwciała. Jednym z największych wyzwań jest badanie roli modyfikacji potranslacyjnych w naprawie wiązań krzyżowych białek DNA.Wzbogacenie i wykrycie potranslacyjnych wiązań krzyżowych białek DNA sprzężonych z modyfikatorami było bardzo trudne ze względu na ich bardzo niską liczebność. Protokół ten dostarcza szczegółowych informacji na temat wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych białek DNA ubikwitylowanych, SUMOylowanych i ADP-rybozylonych, umożliwiając naukowcom badanie kinetyki i powstawania tych modyfikacji w naprawie wiązań krzyżowych białek DNA z różnych źródeł. Inne protokoły wykrywania wiązań krzyżowych białek DNA nie liczą kroków opisujących wykrywanie ich modyfikacji po translacji, podczas gdy ten protokół zawiera szczegółowe informacje, takie jak stężenia leków i czas trwania indukcji modyfikacji oraz metody separacji i wykrywania modyfikacji, a także metody stabilizacji modyfikacji.Tak więc zidentyfikowano kilka modyfikacji potranslacyjnych w naprawie wiązań krzyżowych białek DNA. To, w jaki sposób koordynują naprawę, pozostaje w dużej mierze nieznane. W związku z tym wzajemne oddziaływanie między tymi modyfikacjami wymaga dalszych badań.Aby rozpocząć hodowlę komórkową, należy przygotować pożywkę hodowlaną DMEM i roztwory wymagane do hodowli komórkowej. Wysiewaj jedną raz od 10 do szóstej komórki HEK-293 na 60-milimetrowej płytce lub sześciodołkowej płytce na warunek traktowania plus kontrola. Następnego dnia potraktuj komórki wiązaniami krzyżowymi białek DNA lub induktorami DPC z wyboru w celu indukcji DPC, ich ubikwitylacji i SUMOylacji.Zbierz komórki po 20, 60 i 180 minutach lub dwóch godzinach w przypadku nieenzymatycznych DPC. Aby indukować PARylację TOP1 DPC, należy wstępnie potraktować komórki 10 mikromolową glikohydrolazą poli ADP-rybozy lub PARG, inhibitorem PDD 00017273 przez godzinę przed jednoczesnym traktowaniem 20 mikromolową kamptotekyną przez 20, 60 i 180 minut. Aby rozpocząć izolację i normalizację DNA zawierającego usieciowane białka, należy odessać pożywkę za pomocą pipety ssącej po leczeniu farmakologicznym ubikwitylacją i SUMOylacją.Przepłucz komórki lodowatym PBS przed dodaniem 600 mikrolitrów odczynnika DNAzol. Powoli mieszaj płytkę na platformie wibracyjnej przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i dodaj 0,3 mililitra 100% zimnego etanolu bezpośrednio do płytki. Powtarzaj mieszanie, aż nieprzezroczyste agregaty kwasu nukleinowego staną się widoczne.Następnie przenieś lizat komórkowy do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej i wiruj przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 20 000 G. Po zassaniu supernatantu przemyj kwas nukleinowy i usieciowane osady białkowe w jednym mililitrze 75% etanolu, a następnie przez dwie minuty wiruj w temperaturze 20 000 G i czterech stopniach Celsjusza. Zassać supernatant przed odwirowaniem z tą samą prędkością i usunięciem pozostałej cieczy za pomocą pipety P20.Suszyć pelety na powietrzu przez pięć minut. Rozpuść wysuszony granulat kwasu nukleinowego w 0,1 mililitra podwójnie destylowanej wody, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół. Następnie inkubować zawiesinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez 30 minut, aż osad pęcznieje co najmniej trzy razy.Sonikuj próbki przez 10 sekund za pomocą sondy procesora ultradźwiękowego o amplitudzie 30%. I określić ilościowo stężenie DNA za pomocą spektrometru UV-vis. Dodaj podwójnie destylowaną wodę, aby dostosować stężenie DNA do 400 do 500 nanogramów na mikrolitr w 120 mikrolitrach.Następnie przenieś 20 mikrolitrów próbki do nowej probówki mikrowirówkowej jako kontrolę obciążenia niestrawionego DNA. Dodaj 2 000 jednostek żelu nukleazy mikrokokowej i 11 mikrolitrów 10x buforu reakcyjnego nukleazy mikrokokowej wapnia do DNA rozpuszczonego w pozostałych 100 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.Aby rozpocząć western blotting znormalizowanych, strawionych próbek DNA, dodaj 4x bufor próbki Laemmli i gotuj próbkę przez pięć minut. Załaduj od pięciu do sześciu mikrogramów strawionej próbki na 4% do 20% żelu poliakrylamidowego i wykonaj SDS-PAGE, aby rozwiązać niezmodyfikowane i potranslacyjne modyfikacje lub DPC sprzężone z PMT. Inkubuj żel z niebieską plamą Coomassie przez noc w temperaturze pokojowej.Umyj żel podwójnie destylowaną wodą przez dwie godziny przed uzyskaniem obrazu. Aby wykryć ubikwitylację, modyfikację SUMO 1 lub SUMO 2 i 3, rybozylację ADP, całkowite DPC TOP1, TOP2 alfa lub TOP 2 beta, rozcieńczyć odpowiednie przeciwciała, jak pokazano w tabeli. Następnie przenieść żel w odpowiednim rozcieńczeniu przeciwciała pierwszorzędowego i buforu blokującego i inkubować błony przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po zakończeniu inkubować błonę przemytą PBST z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym 5 000 razy w buforze blokującym przez 60 minut w temperaturze pokojowej przed rozwinięciem membrany ze wzmocnionym odczynnikiem chemoluminescencyjnym. Uzyskaj obraz za pomocą systemu obrazowania. Ekspozycja na kamptotekcynę indukowała powstawanie TOP1 DPC.Formacja TOP1 DPC osiągnęła szczyt po 20 minutach ekspozycji na kamptotecynę, podobnie jak w przypadku modyfikacji anty-SUMO 2 i 3. Zaobserwowano również kulminację modyfikacji i ubikwitylacji SUMO 1. DPC i ich modyfikacje SUMO2 i 3 TOP1 zmniejszały się w sposób zależny od dawki kamptotecyny.Indukowane etopozydem TOP 2 DPC oraz modyfikacja SUMO 2 i 3 osiągnęły szczyt po 20 minutach, a następnie zmniejszyły się. Dla porównania, modyfikacje SUMO 1 i ubikwityny osiągnęły szczyt po 60 minutach. Indukowane formaldehydem DPC i ich SUMO 2 i 3, Sumo 1 i ubikwitylacja tworzyły się i akumulowały w sposób zależny od dawki.Ilościowe wykrywanie PARylacji TOP 1 DPC przy użyciu przeciwciała anty-PAR. Top 1 DPC PARylacja nie była wykrywalna, chyba że do komórki dodano inhibitor PAGR, co sugeruje, że PARylacja następuje szybko i jest bardzo dynamiczna.

quantitative-detection-dna-protein-crosslinks-their-post

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Test NU-ELISA (Nucleosome ELISA) jest czułą i ilościową metodą wykrywania ogólnych wzorców modyfikacji potranslacyjnych w preparatach natywnych, nienaruszonych nukleosomów. Modyfikacje te obejmują metylacje, acetylacje i fosforylacje w konkretnych resztach aminokwasowych histonów, dzięki czemu NU-ELISA stanowi globalny test proteomiczny ogólnego stanu modyfikacji chromatyny w określonych typach komórek.

Wykrywanie modyfikacji potranslacyjnych w natywnych, nienaruszonych nukleosomach metodą ELISA

Ten artykuł ilustruje zastosowanie znakowania radiowego w pogoni za impulsami w połączeniu z fotosieciowaniem specyficznym dla danego miejsca do monitorowania interakcji między interesującym białkiem a innymi czynnikami w E. coli. W przeciwieństwie do tradycyjnych chemicznych metod sieciowania, podejście to generuje "migawki" o wysokiej rozdzielczości uporządkowanej ścieżki składania w żywej komórce.

Monitorowanie tworzenia się wydzielanego bakteryjnego czynnika wirulencji za pomocą sieciowania specyficznego dla miejsca

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Architektura kompleksów białkowych jest niezbędna dla ich funkcjonowania. Połączenie różnych technik spektrometrii mas okazało się skuteczne w badaniu ich składania. Udostępniamy protokoły sieciowania chemicznego i natywnej spektrometrii mas oraz pokazujemy, w jaki sposób te uzupełniające się techniki pomagają wyjaśnić architekturę wielopodjednostkowych zespołów białkowych.

Połączenie chemicznego sieciowania i spektrometrii mas nienaruszonych kompleksów białkowych w celu zbadania architektury wielopodjednostkowych zespołów białkowych

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie naprawy zdefiniowanych wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidowym DNA. Uszkodzone plazmidy są transfekowane do linii komórkowych ssaków biorcy i zbierane o niskiej masie cząsteczkowej w wielu punktach czasowych po transfekcji. Kinetykę naprawy DNA określa się ilościowo za pomocą specyficznego dla nici wydłużania startera, a następnie qPCR.

Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

Od dawna wiadomo, że wiązania dwusiarczkowe stabilizują strukturę wielu białek. Prostą metodą analizy kompleksów multimerycznych stabilizowanych przez te wiązania jest nieredukcyjna analiza SDS-PAGE. Tutaj metoda ta jest zilustrowana poprzez analizę izoformy jądrowej dUTPazy z ludzkiej linii komórkowej kostniakomięsaka U-2 OS.

Połączenie nieredukcyjnej analizy SDS-PAGE i chemicznego sieciowania w celu wykrycia kompleksów multimerycznych stabilizowanych wiązaniami dwusiarczkowymi w komórkach ssaków w hodowli

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Tutaj opisujemy wykorzystanie Grafix (Gradient Fixation), wirowania gradientu glicerolu w obecności środka sieciującego, do identyfikacji interakcji między czynnikami splicingowymi, które przejściowo wiążą się z kompleksem spliceosomów.

Wykorzystanie Grafixu do wykrywania przejściowych interakcji podkompleksów spliceosomów Saccharomyces cerevisiae

Analityczny przepływ pracy oparty na chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu (LC-TIMS-ToF MS/MS) dla wysokiej pewności i wysoce powtarzalnej "oddolnej" analizy modyfikacji histonów i identyfikacji na podstawie głównych parametrów (czas retencji [RT], przekrój zderzenia [CCS] i dokładny stosunek masy do ładunku [m/z]).

Badania przesiewowe modyfikacji histonów przy użyciu chromatografii cieczowej, spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów i spektrometrii mas czasu przelotu

Tutaj prezentujemy prosty i szybki protokół wykrywania oddziaływań białek w miejscach uszkodzenia DNA.

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

Poznaj metodę ilościowego wykrywania wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych, w tym ubiquitylacji i SUMOylacji. Protokół umożliwia badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Przeglądaj więcej filmów