Name: Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Poznaj metodę liCHi-C do badania interakcji chromatyny w rzadkich populacjach komórek, w tym komórek macierzystych i próbek nowotworowych. Ta technika umożliwia analizę organizacji genomu 3D z niskim nakładem materiału.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy pozostałym członkom laboratorium Javierre za ich opinie na temat manuskryptu. Dziękujemy programowi CERCA, Generalitat de Catalunya i Fundacji Josepa Carrerasa za wsparcie instytucjonalne. Prace te zostały sfinansowane przez FEDER/hiszpańskie Ministerstwo Nauki i Innowacji (RTI2018-094788-A-I00), Europejskie Towarzystwo Hematologiczne (4823998) oraz Hiszpańskie Stowarzyszenie Walki z Rakiem (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ jest finansowany przez projekt Junior Leader Fundacji Bankowej La Caixa (LCF/BQ/PI19/11690001), LR jest finansowany przez stypendium AGAUR FI (2019FI-B00017), a LT-D jest finansowany przez FPI Fellowship (PRE2019-088005). Dziękujemy programowi doktoranckiemu z biochemii i biologii molekularnej z Universitat Autònoma de Barcelona za wsparcie. Żaden z fundatorów nie był zaangażowany w żadnym momencie projektowania eksperymentu ani pisania manuskryptu.

A Comprehensive Approach to Studying the Promoter Interactome in Scarce Cells

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

liCHi-C oferuje możliwość generowania bibliotek interaktoomów promotorowych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu podobnej eksperymentalnej struktury z PCHi-C, ale ze znacznie zmniejszoną liczbą komórek. Można to w znacznym stopniu osiągnąć poprzez wyeliminowanie niepotrzebnych kroków, takich jak oczyszczanie fenolu i usuwanie biotyny. W klasycznym protokole ligacji Hi-C57 w jądrze i jego późniejszej technice pochodnej PCHi-C, biotyna jest usuwana z nieligowanych fragmentów restrykcyjnych, aby uni...

Czasowa ekspresja genów napędza różnicowanie komórek i ostatecznie rozwój organizmu, a jej zmiana jest ściśle związana z wieloma chorobami1,2,3,4,5. Transkrypcja genów jest precyzyjnie regulowana przez działanie elementów regulatorowych, które można sklasyfikować jako proksymalne (tj. promotory genów) i dystalne (np. wzmacniacze lub tłumiki), z których te ostatnie często znajdują się daleko od genów docelowych i fizycznie oddziałują z nimi poprzez pętlę chromatyny w celu modulacji ekspresji genów6,7,8.
Identyfikacja dystalnych regionów regulatorowych w genomie jest kwestią powszechnie zgodną, ponieważ regiony te posiadają specyficzne modyfikacje histonów9,10,11 i zawierają specyficzne motywy rozpoznawania czynników transkrypcyjnych, pełniąc dla nich rolę platform rekrutacyjnych12,13,14. Poza tym, w przypadku wzmacniaczy i super-wzmacniaczy15,16, mają one również niskie zajętość nukleosomów17,18 i są transkrybowane na niekodujące eRNAs19,20.
Niemniej jednak, geny docelowe każdego dystalnego elementu regulatorowego są trudniejsze do przewidzenia. Najczęściej interakcje między dystalnymi elementami regulatorowymi a ich celami są specyficzne dla typu komórki i bodźca21,22, obejmują setki kilozasad, mostkując inne geny w dowolnym kierunku23,24,25, a nawet mogą znajdować się w regionach intronowych docelowego genu lub innych genów, które nie występują między nimi26,27. Ponadto, dystalne elementy regulatorowe mogą również kontrolować więcej niż jeden gen w tym samym czasie i na odwrót28,29. Ta złożoność pozycyjna utrudnia wskazanie powiązań regulacyjnych między nimi, a zatem większość celów każdego elementu regulatorowego w każdym typie komórki pozostaje nieznana.
W ostatnich latach nastąpił znaczny boom w rozwoju technik wychwytywania konformacji chromosomów (3C) do badania oddziaływań chromatyny. Najczęściej stosowany z nich, Hi-C, pozwala na wygenerowanie mapy wszystkich interakcji pomiędzy każdym fragmentem genomu komórki 30. Jednakże, aby wykryć znaczące interakcje na poziomie fragmentu restrykcyjnego, Hi-C opiera się na ultragłębokim sekwencjonowaniu, co uniemożliwia jego stosowanie do rutynowego badania krajobrazu regulacyjnego poszczególnych genów. Aby przezwyciężyć to ekonomiczne ograniczenie, pojawiło się kilka technik 3C opartych na wzbogacaniu, takich jak ChIA-PET31, HiChIP32 i jego niskowejściowy odpowiednik HiCuT33. Techniki te polegają na wykorzystaniu przeciwciał do wzbogacenia w interakcje obejmujące cały genom, w których pośredniczy określone białko. Niemniej jednak unikalna cecha tych technik 3C jest również zmorą ich zastosowania; Użytkownicy liczą na dostępność wysokiej jakości przeciwciał dla interesującego ich białka i nie mogą porównywać warunków, w których wiązanie białka jest dynamiczne.
Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to kolejna technika wzbogacania 3C, która omija te ograniczenia34,35. Wykorzystując system wzbogacania sondy biotynylowanego RNA, PCHi-C jest w stanie wygenerować biblioteki całego genomu o wysokiej rozdzielczości regionów genomu oddziałujących z 28 650 promotorami genów z adnotacjami ludzkimi lub 27 595 myszymi, znanymi również jako interaktom promotora. Takie podejście pozwala na wykrycie znaczących oddziaływań dalekiego zasięgu z rozdzielczością na poziomie fragmentów restrykcyjnych zarówno aktywnych, jak i nieaktywnych promotorów, a także solidne porównanie interakcji promotorów między dowolnymi warunkami, niezależnie od dynamiki modyfikacji histonów lub wiązania białek. PCHi-C jest szeroko stosowany w ostatnich latach do identyfikacji reorganizacji interaktomu promotora podczas różnicowania komórek36,37, zidentyfikować mechanizm działania czynników transkrypcyjnych38,39, oraz odkryć nowe potencjalne geny i szlaki deregulowane w chorobie przez warianty niekodujące40,41,42,43,44,45,46,47,48, wraz z nowymi mutacjami niekodującymi sterownika49,50. Poza tym, po prostu modyfikując system przechwytywania, technikę tę można dostosować do pytania biologicznego, aby przesłuchać dowolny interaktom (np. wzmacniacz interactome51 lub interaktom, zbiór zmian niekodujących41,52).
Jednak PCHi-C wykorzystuje technikę do wykonania techniki na minimum 20 milionach komórek, co uniemożliwia badanie rzadkich populacji komórek, takich jak te często używane w biologii rozwojowej i zastosowaniach klinicznych. Z tego powodu opracowaliśmy niskowejściową metodę Capture Hi-C (liCHi-C), nową, opłacalną i konfigurowalną metodę opartą na eksperymentalnej strukturze PCHi-C do generowania oddziaływań promotorów o wysokiej rozdzielczości z danymi wejściowymi o niskiej liczbie komórek. Przeprowadzając eksperyment z minimalnymi zmianami w probówce, zamieniając lub eliminując kroki z oryginalnego protokołu PCHi-C, drastycznie zmniejszając objętości reakcji i modyfikując stężenia odczynników, złożoność biblioteki jest maksymalizowana i możliwe jest generowanie wysokiej jakości bibliotek zawierających zaledwie 50 000 komórek53.
Low input Capture Hi-C (liCHi-C) został porównany z PCHi-C i wykorzystany do wyjaśnienia przemiany interaktomii promotora podczas różnicowania ludzkich komórek krwiotwórczych, odkrycia potencjalnych nowych genów i szlaków związanych z chorobą zderegulowanych przez zmiany niekodujące oraz wykrywania nieprawidłowości chromosomalnych53. Protokół krok po kroku i różne kontrole jakości za pomocą tej techniki są szczegółowo opisane tutaj, aż do końcowego generowania bibliotek i ich analizy obliczeniowej.

<table><tbody><tr><td>0,4 mM Biotin-14-dATP</td><td>Invitrogen</td><td>19524-016</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Wymieniony jako bufor restrykcyjny 2 w manuskrypcie</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>10x bufor reakcyjny ligazy DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>16% roztwór formaldehydu (w/v), bez metanolu</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>20 mg / ml albumina surowicy bydlęcej</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>5PRIME Phase Lock Gel Świetlówki</td><td>Qiuantabio</td><td>2302820</td><td>Do oczyszczania fenolowo-chloroformowego w sekcji 4 (Oczyszczanie DNA). Probówki żelowe Phase Lock to komercyjny typ probówek specjalnie zaprojektowanych w celu maksymalizacji odzysku DNA po oczyszczeniu fenolowo-chloroformowym, unikając jednocześnie przenoszenia zanieczyszczeń w fazie organicznej poprzez zawartość żywicy o pośredniej gęstości, która osadza się między fazą organiczną a wodną i izoluje je. Probówki PLG należy przed użyciem wirować z prędkością 12 000 x g przez 30 s, aby upewnić się, że żywica jest dobrze umieszczona na dnie probówki</td></tr><tr><td>Adaptery i startery PCR do amplifikacji biblioteki</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> <td>DNA-Zakupione jako indywidualne startery z oczyszczaniem PAGE dla NGS</td></tr><tr><td>Skrobaki komórkowe</td><td>Nunc</td><td>179693</td><td>Lub dowolnej innej marki</td></tr><tr><td>Wirówka (wirnik o stałym kącie do probówek 1,5 ml)</td><td>Dowolna marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHiCAGO R pakiet</td><td>1.14.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koraliki</td><td>CleanNGS CleanNA</td><td>CNGS-0050</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Promega</td><td>U120A, U121A, U122A, U123A</td><td>Lub dowolnej innej marki</td></tr><tr><td>Probówka DNA LoBind, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind probówka, 2 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza DNA I duża (Klenow) fragment 5000 jednostek/ml</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Koraliki MyOne Streptavidin C1</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td>Do ściągania biotyny z biblioteki wstępnie przechwyconej w sekcji 8 (biotyna pull-down)</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1 koraliki</td><td>Invitrogen</td><td>65602</td><td>Do ściągania biotyny z biblioteki po przechwyceniu w sekcji 11 (pobieranie biotyny i amplifikacja PCR)</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>Lub dowolny inny magnes odpowiedni do 1,5 ml tubki L</td></tr><tr><td>Absolut etanolu</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>FBS, kwalifikowany</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>Lub dowolnej innej marki</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitant</td><td>Invitrogen</td><td>AM9515</td><td>Służy do koprecypitacji DNA w sekcji 4 (oczyszczanie DNA)</td></tr><tr><td>HiCUP</td><td>0,8.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HindIII, 100 U/&micro; L</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104T</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Klenow EXO- 5000 jednostek/ml</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrów o niskiej retencji&nbsp;( 10 &mikro; L, 20 i mikro; L, 200 i mikro; L oraz 1000 &mikro; L)</td><td>ZeroTip</td><td>PMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000</td><td></td></tr><tr><td>M220 Skoncentrowany ultrasonograf</td><td>Covaris</td><td>500295</td><td></td></tr><tr><td>Micro TUBE AFA Fiber Nasadka zatrzaskowa z nacięciem 6 x 16 mm Fiolki</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>Do sonikacji w sekcji 6 (sonikacja)</td></tr><tr><td>NheI-HF, 100 U/&micro; L</td><td>New England Biolabs</td><td>R3131M</td><td></td></tr><tr><td>Beznukleazowa klasa biologii molekularnej klasa wody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Startery PCR do kontroli jakości</td><td>Zintegrowane technologie</td> <td>DNA-Paski</td><td></td></tr> <tr><td>PCR&nbsp; i czapki</td><td>Agilent Technologies</td><td>410022, 401425</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: Chloroform: Alkohol izoamylowy 25:24:1, Nasycony 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>Phusion&nbsp; High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HF</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531L</td><td>Do amplifikacji biblioteki w sekcjach 9 (dATP-tailing, ligacja adaptera i amplifikacja PCR) i 11 (ściąganie biotyny i amplifikacja PCR)</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy (bez EDTA)</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K, rekombinowana, Klasa PCR</td><td>Roche</td><td>3115836001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 1x zestaw dsDNA o wysokiej czułości</td><td>Invitrogen</td><td>Q33230</td><td>Do oznaczania ilościowego DNA po wytrąceniu w sekcji 4 (oczyszczanie DNA)</td></tr><tr><td>Probówki do oznaczania kubitów</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>bufor rCutsmart</td><td>New England Biolabs</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>Lub dowolnej innej marki</td></tr><tr><td>SDS - Roztwór 10% dla biologii molekularnej</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0676</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu pH 5,2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowa biblioteka SureSelect 3-5,9 Mb</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-4831</td><td>Specjalnie zaprojektowany system przechwytywania myszy lub człowieka, używany do przechwytywania</td></tr><tr><td>SureSelect Target Enrichment Box 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-8645</td><td>Służy do przechwytywania</td></tr><tr><td>SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full Adapter</td><td>Agilent Technologies</td><td>931107</td><td>Służy do wychwytywania</td></tr><tr><td>T4 Ligazy DNA 1 U/&mikro; L</td><td>Invitrogen</td><td>15224025</td><td>Do ligacji w sekcji 3 (ligacja i decrosslinkowanie)</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4 2000000/ml</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>Do ligacji w sekcji 9 (dATP-tailing, ligacja adapterowa i amplifikacja PCR)</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA T4 3000 jednostek/ml</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK 10000 jednostek/ml</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4200</td><td>instrument Agilent Technologies</td><td></td><td>Do automatycznej elektroforezy w sekcji 9 (dATP-tailing, ligacja adaptera i amplifikacja PCR) i sekcja 11 (ściąganie biotyny i amplifikacja PCR). Każdy inny zautomatyzowany system elektroforezy jest ważny</td></tr><tr><td>Odczynniki Tapestation</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5582, 5067-5583, 5067-5584, 5067-5585,</td><td>Do automatycznej elektroforezy w sekcji 9 (dATP-tailing, ligacja adaptera i amplifikacja PCR) i sekcja 11 (ściąganie biotyny i amplifikacja PCR). Każdy inny zautomatyzowany system elektroforezy jest ważny</td></tr><tr><td>Triton X-100 dla biologii molekularnej</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A4975</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations

Czasoprzestrzenna transkrypcja genów jest ściśle regulowana przez dystalne elementy regulatorowe, takie jak wzmacniacze i tłumiki, które polegają na fizycznej bliskości z docelowymi promotorami genów w celu kontrolowania transkrypcji. Chociaż te elementy regulatorowe są łatwe do zidentyfikowania, ich geny docelowe są trudne do przewidzenia, ponieważ większość z nich jest specyficzna dla typu komórki i może być oddzielona setkami kilozasad w liniowej sekwencji genomu, pomijając inne geny niedocelowe. Od kilku lat Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) jest złotym standardem w zakresie łączenia dystalnych elementów regulatorowych z ich docelowymi genami. Jednak PCHi-C opiera się na dostępności milionów komórek, co uniemożliwia badanie rzadkich populacji komórek, takich jak te powszechnie uzyskiwane z tkanek pierwotnych. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowano niskowejściową metodę Capture Hi-C (liCHi-C), opłacalną i konfigurowalną metodę identyfikacji repertuaru dystalnych elementów regulatorowych kontrolujących każdy gen genomu. liCHi-C opiera się na podobnej strukturze eksperymentalnej i obliczeniowej jak PCHi-C, ale dzięki zastosowaniu minimalnych zmian lampy, modyfikacji stężenia i objętości odczynnika oraz zamianie lub eliminacji kroków, odpowiada za minimalne straty materiału podczas budowy biblioteki. Reasumując, liCHi-C umożliwia badanie regulacji genów i czasoprzestrzennej organizacji genomu w kontekście biologii rozwojowej i funkcji komórkowych.

liCHi-C umożliwia generowanie wysokiej jakości i rozdzielczości bibliotek interaktomu promotorów w skali całego genomu przy użyciu zaledwie 50 000 komórek53. Jest to możliwe dzięki – poza drastyczną redukcją objętości reakcji i stosowaniu plastikowych naczyń o niskim wiązaniu DNA w całym protokole – usunięciu z oryginalnego protokołu zbędnych etapów, podczas których dochodzi do znacznych strat materiału. Należą do nich oczyszczanie fenolem po odwiązaniu sieciowania (decrosslinking), usuwanie bioty...

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity ...

W przypadku LeTech głównym pytaniem, na które staramy się odpowiedzieć, jest to, w jaki sposób chromatyna oddziałuje w jądrze, a tym samym, aby zrozumieć nową warstwę regulacji genów. Dzięki LeTech udowodniliśmy, że możemy badać organizację genomu danej próbki, łączyć mutację niekodującą związaną z chorobą z potencjalnymi genami dotkniętymi chorobą oraz wykrywać rearanżacje chromosomów, takie jak translokacja, na przykład w próbkach guza. Teraz możemy zbadać organizację chromatyny 3D typów komórek bliznowatych, takich jak pierwotne komórki macierzyste lub odpowiednie próbki kliniczne.Nasz protokół zmniejsza ilość materiałów wejściowych oraz czas i koszty potrzebne do uzyskania wysokiej jakości danych do zbadania organizacji genomu w rozdzielczości fragmentów restrykcyjnych. LeTech rozszerza zasięg dziedziny organizacji chromatyny 3D, pozwalając nam odkrywać nowe typy komórek, które wcześniej były niemożliwe do analizy. Dzięki projektowi LeTech społeczność naukowa może badać specjalne regulacje ekspresji genów, na przykład w transformacji złośliwej w określonej populacji chromosomów wewnątrz guza.Na początek weź wymowny zamrożony rzadki komórek i dodaj jeden mililitr zimnego buforu do lizy, aby przerwać błonę komórkową. Inkubować komórki na lodzie przez 30 minut, mieszając przez odwrócenie co pięć minut. Odwirować jądra przez 10 minut w temperaturze 1000 G, usunąć nadnatant i ponownie zawiesić jądra w 500 mikrolitrach zimnego buforu restrykcyjnego 1,25 x 2.Następnie dodaj 5,5 mikrolitra 10% dodecylosiarczanu sodu. Wymieszaj przez wirowanie i inkubuj w bloku termicznym. Następnie ugasz SDS, dodając 37,5 mikrolitra 10% tritton X 100.Wymieszać i inkubować próbkę, jak pokazano wcześniej. Dodaj 7,5 mikrolitra podpowiedzi trzeciej, aby strawić chromatynę, wymieszaj roztwór i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na początek weź strawione DNA rzadkich komórek i umieść je na lodzie.Przygotować mieszankę wzorcową, używając odczynników niezbędnych do wypełnienia i biotynylowania nawisów fragmentów restrykcyjnych. Inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 75 minut, mieszając przez odwrócenie co 15 minut. Schłodzić próbkę na lodzie i podwiązać wypełnione końce DNA, przygotowując mieszankę wzorcową przy użyciu odczynników wymaganych do ligacji.Na koniec inkubuj próbkę przez cztery do sześciu godzin w temperaturze 16 stopni Celsjusza, a następnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 30 mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr proteinazy K, aby usieciować chromatynę. Wymieszaj roztwór i inkubuj przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza.Po oczyszczeniu DNA zacznij od pobrania ligowanej i usieciowanej strawionej chromatyny z rzadkich komórek. Ustaw sonicater kąpieli wodnej na współczynnik wypełnienia 20%Moc szczytów od 50 do 200 cykli na serię przez 65 sekund i zakres temperatur od 6 do 10 stopni Celsjusza, a następnie sonikuj ligowaną i usieciowaną strawioną chromatynę. Po zakończeniu naprawy próbki przenieś 150 mikrolitrów kulek streptawidyny C1 na próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra.Umieść je na magnesie rurkowym o pojemności 1,5 mililitra i poczekaj, aż wszystkie koraliki przykleją się do ściany. Następnie usuń supernatant, pozostawiając koraliki. Następnie umyj koraliki, dodając 400 mikrolitrów bufora do animacji i ponownie zawieszając je miękkim wirowaniem.Umieść rurkę z powrotem w magnesie, aż wszystkie koraliki przykleją się do ściany. Następnie usuń supernatant, pozostawiając koraliki. Po ponownym zawieszeniu kulek w 300 mikrolitrach 2x bez bufora pośredniego lub NTB, połącz je z 300 mikrolitrami próbki.Na koniec inkubuj przez 15 minut, obracając w temperaturze pokojowej, aby ściągnąć informacyjne fragmenty DNA za pomocą biotyny. Na początek weźmy rzadkie fragmenty DNA komórek ściągnięte biotyną. Przygotować mieszankę wzorcową, dodając odczynniki do ogonowania dATP i inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie dezaktywuj klenow exo-minus, inkubując próbkę przez 10 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza i schładzając ją na lodzie. Po umyciu kulek po 300 mikrolitrami TB, NTB i 100 mikrolitrami buforu ligacyjnego, ponownie zawieś je w 50 mikrolitrach buforu ligacyjnego. Dodać do próbki cztery mikrolitry 15-mikromolowej, wstępnie uklękniętej mieszanki adaptera i jeden mikrolitr 2000 jednostek na mikrolitr ligazy DNA T4.Umyj koraliki 400 mikrolitrami TB, 200 mikrolitrami NTB i 100 mikrolitrami bufora restrykcyjnego dwa. Po amplifikacji biblioteki metodą PCR, połącz wszystkie 50 mikrolitrowych reakcji z tej samej próbki w 1,5-mililitrowej probówce o niskim poziomie wiązania DNA. Umieść go na magnesie rurkowym i poczekaj, aż wszystkie koraliki przykleją się do ściany.Przenieś supernatant zawierający bibliotekę do nowej 1,5-mililitrowej probówki o niskim stopniu wiązania DNA i uzupełnij buforem TLE do 500 mikrolitrów. Aby przeprowadzić dwustronną selekcję za pomocą paramagnetycznego oczyszczania kulek, dodaj 200 mikrolitrów koralików wyjściowych do biblioteki, wymieszaj przez wirowanie i inkubuj przez 10 minut, obracając w temperaturze pokojowej. Następnie umieść bibliotekę na magnesie i poczekaj, aż wszystkie koraliki przykleją się do ściany.Przenieś supernatant zawierający bibliotekę do nowej 1,5-mililitrowej probówki o niskim poziomie wiązania DNA. Skoncentruj koraliki, biorąc 750 mikrolitrów koralików i umieszczając je w 1,5-mililitrowej tubie na magnesie. Gdy wszystkie koraliki przykleją się do ściany, usuń supernatant i ponownie zawieś koraliki, wprowadzając 300 mikrolitrów nowych koralików.Do próbki dodać 300 mikrolitrów skoncentrowanych kulek. Mieszać przez wirowanie i inkubować przez 10 minut, obracając w temperaturze pokojowej. Umieść na magnesie.Poczekaj, aż wszystkie koraliki przykleją się do ściany i usuń supernatant. Umyj koraliki, dodając jeden mililitr 70% etanolu do tubki, gdy kulki nadal znajdują się na magnesie. Pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu i ponownie zawieś je w 21 mikrolitrach bufora TLE przez wirowanie.Aby wymyć bibliotekę z kulek, inkubuj próbkę przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w bloku termicznym. Umieść probówkę w magnesie i przenieś supernatant zawierający bibliotekę do nowej 1,5-mililitrowej probówki o niskim poziomie wiązania DNA. Zacznij od pobrania od 500 do 1000 nanogramów z rzadkiej biblioteki DNA komórki.Wysuszyć DNA za pomocą koncentratora próżniowego i ponownie zawiesić w 3,4 mikrolitrze wody wolnej od nukleaz. Po dodaniu blokerów i podczas korzystania z termocyklera w temperaturze 65 stopni Celsjusza, przenieś roztwór hybrydyzacyjny z biotynylowanym RNA do zablokowanej biblioteki. Po dokładnym zamknięciu wieczka probówki inkubować w termocyklerze przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza.Następnie przenieś 50 mikrolitrów kulek streptawidyny T1 na próbkę do 1,5-mililitrowej probówki o niskim wiązaniu DNA i umieść je na 1,5-mililitrowym magnesie rurkowym. Gdy wszystkie koraliki przykleją się do ściany, usuń supernatant, pozostawiając koraliki. Następnie umyj koraliki trzykrotnie 200 mikrolitrami buforu wiążącego z docelowego zestawu do wzbogacania i ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach buforu wiążącego.Przenieść próbkę do zawieszonych kulek na termocyklerze i inkubować przez 30 minut. Po umyciu kulek 200 mikrolitrami jednego bufora do mycia, inkubuj je przez 15 minut, obracając w temperaturze pokojowej. Następnie umyj koraliki trzykrotnie 200 mikrolitrami bufora do płukania dwa podgrzanego do 65 stopni Celsjusza i inkubuj w bloku termicznym.Na koniec, po amplifikacji biblioteki metodą PCR, należy przeprowadzić oczyszczanie DNA za pomocą kulek paramagnetycznych, dodając do próbki 270 mikrolitrów kulek podstawowych i mieszając przez wirowanie. Zautomatyzowany profil elektroforezy z biblioteki pobrany tuż przed wychwytywaniem dostarczył 49,7 nanogramów na mikrolitr DNA w objętości reakcyjnej 20 mikrolitrów. Jednak 3,06 nanograma na mikrolitr DNA uzyskuje się z profilu automatycznej elektroforezy o wysokiej czułości z gotowej biblioteki lech.

an-integrated-workflow-to-study-promoter-centric-spatio-temporal

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Elementy regulatorowe DNA, takie jak wzmacniacze, kontrolują ekspresję genów poprzez fizyczny kontakt z docelowymi promotorami genów, często poprzez interakcje chromosomowe dalekiego zasięgu obejmujące duże odległości genomowe. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identyfikuje znaczące interakcje między promotorami a regionami dystalnymi, umożliwiając przypisanie potencjalnych sekwencji regulatorowych do ich docelowych genów.

Motiver Capture Hi-C: Profilowanie interakcji promotorów w całej rozdzielczości i całym genomie

Przedstawiona tutaj metoda wykorzystuje mikrowzorce wraz z obrazowaniem ilościowym, aby ujawnić organizację przestrzenną w kulturach ssaków. Technika ta jest łatwa do wdrożenia w standardowym laboratorium biologii komórki i oferuje elastyczny system do badania wzorców in vitro.

Mapowanie wyłaniającej się organizacji przestrzennej komórek ssaków za pomocą mikrowzorców i obrazowania ilościowego

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.

Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

Obecny protokół opisuje metodę pojedynczej komórki do iteracyjnych analiz epigenomicznych przy użyciu pojedynczej komórki wielokrotnego użytku. Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku umożliwia analizę wielu znaczników epigenetycznych w tej samej pojedynczej komórce i statystyczną walidację wyników.

Pojedyncza komórka wielokrotnego użytku do iteracyjnych analiz epigenomicznych

Przedstawiamy niewymagający kodowania przepływ pracy dla biologów w celu identyfikacji specyficznych tkankowo wzmacniaczy genów przy użyciu wyłącznie narzędzi opartych na przeglądarce. Nasz protokół wykorzystuje publiczne znaczniki histonowe H3K4me1/H3K27ac i dane Hi-C, umożliwiając naukowcom bez doświadczenia w programowaniu dostęp, analizę i identyfikację potencjalnych elementów regulacyjnych związanych z ich interesującymi genami.

Internetowy przepływ pracy do wyboru wzmacniaczy specyficznych dla genów i tkanek

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Przedstawiamy tutaj szybki i prosty protokół ATAC-seq do zaimplementowania w całym robaku Caenorhabditis elegans na etapie L4, używając tylko 30 µL pelletu z dżdżownic.

Analiza dostępności chromatiny w całym Caenorhabditis elegans larw L4

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.

Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych

Poznaj metodę liCHi-C do badania interakcji chromatyny w rzadkich populacjach komórek, w tym komórek macierzystych i próbek nowotworowych. Ta technika umożliwia analizę organizacji genomu 3D z niskim nakładem materiału.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek (Wideo) | JoVE Journal

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Przeglądaj więcej filmów