Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

W przypadku LeTech głównym pytaniem, na które staramy się odpowiedzieć, jest to, w jaki sposób chromatyna oddziałuje w jądrze, a tym samym, aby zrozumieć nową warstwę regulacji genów. Dzięki LeTech udowodniliśmy, że możemy badać organizację genomu danej próbki, łączyć mutację niekodującą związaną z chorobą z potencjalnymi genami dotkniętymi chorobą oraz wykrywać rearanżacje chromosomów, takie jak translokacja, na przykład w próbkach guza. Teraz możemy zbadać organizację chromatyny 3D typów komórek bliznowatych, takich jak pierwotne komórki macierzyste lub odpowiednie próbki kliniczne.

Nasz protokół zmniejsza ilość materiałów wejściowych oraz czas i koszty potrzebne do uzyskania wysokiej jakości danych do zbadania organizacji genomu w rozdzielczości fragmentów restrykcyjnych. LeTech rozszerza zasięg dziedziny organizacji chromatyny 3D, pozwalając nam odkrywać nowe typy komórek, które wcześniej były niemożliwe do analizy. Dzięki projektowi LeTech społeczność naukowa może badać specjalne regulacje ekspresji genów, na przykład w transformacji złośliwej w określonej populacji chromosomów wewnątrz guza.

Na początek weź wymowny zamrożony rzadki komórek i dodaj jeden mililitr zimnego buforu do lizy, aby przerwać błonę komórkową. Inkubować komórki na lodzie przez 30 minut, mieszając przez odwrócenie co pięć minut. Odwirować jądra przez 10 minut w temperaturze 1000 G, usunąć nadnatant i ponownie zawiesić jądra w 500 mikrolitrach zimnego buforu restrykcyjnego 1,25 x 2.

Następnie dodaj 5,5 mikrolitra 10% dodecylosiarczanu sodu. Wymieszaj przez wirowanie i inkubuj w bloku termicznym. Następnie ugasz SDS, dodając 37,5 mikrolitra 10% tritton X 100.

Wymieszać i inkubować próbkę, jak pokazano wcześniej. Dodaj 7,5 mikrolitra podpowiedzi trzeciej, aby strawić chromatynę, wymieszaj roztwór i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na początek weź strawione DNA rzadkich komórek i umieść je na lodzie.

Przygotować mieszankę wzorcową, używając odczynników niezbędnych do wypełnienia i biotynylowania nawisów fragmentów restrykcyjnych. Inkubować próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 75 minut, mieszając przez odwrócenie co 15 minut. Schłodzić próbkę na lodzie i podwiązać wypełnione końce DNA, przygotowując mieszankę wzorcową przy użyciu odczynników wymaganych do ligacji.

Na koniec inkubuj próbkę przez cztery do sześciu godzin w temperaturze 16 stopni Celsjusza, a następnie przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 30 mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr proteinazy K, aby usieciować chromatynę. Wymieszaj roztwór i inkubuj przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza.

Po oczyszczeniu DNA zacznij od pobrania ligowanej i usieciowanej strawionej chromatyny z rzadkich komórek. Ustaw sonicater kąpieli wodnej na współczynnik wypełnienia 20%Moc szczytów od 50 do 200 cykli na serię przez 65 sekund i zakres temperatur od 6 do 10 stopni Celsjusza, a następnie sonikuj ligowaną i usieciowaną strawioną chromatynę. Po zakończeniu naprawy próbki przenieś 150 mikrolitrów kulek streptawidyny C1 na próbkę do probówki o pojemności 1,5 mililitra.

Umieść je na magnesie rurkowym o pojemności 1,5 mililitra i poczekaj, aż wszystkie koraliki przykleją się do ściany. Następnie usuń supernatant, pozostawiając koraliki. Następnie umyj koraliki, dodając 400 mikrolitrów bufora do animacji i ponownie zawieszając je miękkim wirowaniem.

Umieść rurkę z powrotem w magnesie, aż wszystkie koraliki przykleją się do ściany. Następnie usuń supernatant, pozostawiając koraliki. Po ponownym zawieszeniu kulek w 300 mikrolitrach 2x bez bufora pośredniego lub NTB, połącz je z 300 mikrolitrami próbki.

Na koniec inkubuj przez 15 minut, obracając w temperaturze pokojowej, aby ściągnąć informacyjne fragmenty DNA za pomocą biotyny. Na początek weźmy rzadkie fragmenty DNA komórek ściągnięte biotyną. Przygotować mieszankę wzorcową, dodając odczynniki do ogonowania dATP i inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie dezaktywuj klenow exo-minus, inkubując próbkę przez 10 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza i schładzając ją na lodzie. Po umyciu kulek po 300 mikrolitrami TB, NTB i 100 mikrolitrami buforu ligacyjnego, ponownie zawieś je w 50 mikrolitrach buforu ligacyjnego. Dodać do próbki cztery mikrolitry 15-mikromolowej, wstępnie uklękniętej mieszanki adaptera i jeden mikrolitr 2000 jednostek na mikrolitr ligazy DNA T4.

Umyj koraliki 400 mikrolitrami TB, 200 mikrolitrami NTB i 100 mikrolitrami bufora restrykcyjnego dwa. Po amplifikacji biblioteki metodą PCR, połącz wszystkie 50 mikrolitrowych reakcji z tej samej próbki w 1,5-mililitrowej probówce o niskim poziomie wiązania DNA. Umieść go na magnesie rurkowym i poczekaj, aż wszystkie koraliki przykleją się do ściany.

Przenieś supernatant zawierający bibliotekę do nowej 1,5-mililitrowej probówki o niskim stopniu wiązania DNA i uzupełnij buforem TLE do 500 mikrolitrów. Aby przeprowadzić dwustronną selekcję za pomocą paramagnetycznego oczyszczania kulek, dodaj 200 mikrolitrów koralików wyjściowych do biblioteki, wymieszaj przez wirowanie i inkubuj przez 10 minut, obracając w temperaturze pokojowej. Następnie umieść bibliotekę na magnesie i poczekaj, aż wszystkie koraliki przykleją się do ściany.

Przenieś supernatant zawierający bibliotekę do nowej 1,5-mililitrowej probówki o niskim poziomie wiązania DNA. Skoncentruj koraliki, biorąc 750 mikrolitrów koralików i umieszczając je w 1,5-mililitrowej tubie na magnesie. Gdy wszystkie koraliki przykleją się do ściany, usuń supernatant i ponownie zawieś koraliki, wprowadzając 300 mikrolitrów nowych koralików.

Do próbki dodać 300 mikrolitrów skoncentrowanych kulek. Mieszać przez wirowanie i inkubować przez 10 minut, obracając w temperaturze pokojowej. Umieść na magnesie.

Poczekaj, aż wszystkie koraliki przykleją się do ściany i usuń supernatant. Umyj koraliki, dodając jeden mililitr 70% etanolu do tubki, gdy kulki nadal znajdują się na magnesie. Pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu i ponownie zawieś je w 21 mikrolitrach bufora TLE przez wirowanie.

Aby wymyć bibliotekę z kulek, inkubuj próbkę przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w bloku termicznym. Umieść probówkę w magnesie i przenieś supernatant zawierający bibliotekę do nowej 1,5-mililitrowej probówki o niskim poziomie wiązania DNA. Zacznij od pobrania od 500 do 1000 nanogramów z rzadkiej biblioteki DNA komórki.

Wysuszyć DNA za pomocą koncentratora próżniowego i ponownie zawiesić w 3,4 mikrolitrze wody wolnej od nukleaz. Po dodaniu blokerów i podczas korzystania z termocyklera w temperaturze 65 stopni Celsjusza, przenieś roztwór hybrydyzacyjny z biotynylowanym RNA do zablokowanej biblioteki. Po dokładnym zamknięciu wieczka probówki inkubować w termocyklerze przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza.

Następnie przenieś 50 mikrolitrów kulek streptawidyny T1 na próbkę do 1,5-mililitrowej probówki o niskim wiązaniu DNA i umieść je na 1,5-mililitrowym magnesie rurkowym. Gdy wszystkie koraliki przykleją się do ściany, usuń supernatant, pozostawiając koraliki. Następnie umyj koraliki trzykrotnie 200 mikrolitrami buforu wiążącego z docelowego zestawu do wzbogacania i ponownie zawieś kulki w 200 mikrolitrach buforu wiążącego.

Przenieść próbkę do zawieszonych kulek na termocyklerze i inkubować przez 30 minut. Po umyciu kulek 200 mikrolitrami jednego bufora do mycia, inkubuj je przez 15 minut, obracając w temperaturze pokojowej. Następnie umyj koraliki trzykrotnie 200 mikrolitrami bufora do płukania dwa podgrzanego do 65 stopni Celsjusza i inkubuj w bloku termicznym

Na koniec, po amplifikacji biblioteki metodą PCR, należy przeprowadzić oczyszczanie DNA za pomocą kulek paramagnetycznych, dodając do próbki 270 mikrolitrów kulek podstawowych i mieszając przez wirowanie. Zautomatyzowany profil elektroforezy z biblioteki pobrany tuż przed wychwytywaniem dostarczył 49,7 nanogramów na mikrolitr DNA w objętości reakcyjnej 20 mikrolitrów. Jednak 3,06 nanograma na mikrolitr DNA uzyskuje się z profilu automatycznej elektroforezy o wysokiej czułości z gotowej biblioteki lech.