Pomiary parametrów wapnia i kurczliwości w czasie rzeczywistym w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych
26 maja 2023
Tutaj opisana jest sprawdzona metoda wykonywania pomiarów kurczliwości i wapnia w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych za pomocą platformy opartej na optyce. Platforma ta umożliwia naukowcom badanie wpływu mutacji i reakcji na różne bodźce w szybki i powtarzalny sposób.
Indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych stanowią potężne narzędzie do badania zmian w funkcji kardiomiocytów za pośrednictwem mutacji i definiowania skutków stresorów i interwencji lekowych. Istnieje zapotrzebowanie na platformę, na której kurczliwość i przetwarzanie wapnia w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych może być mierzone w sposób przyjazny dla użytkownika i powtarzalny. Metoda ta umożliwia naukowcom badanie kurczliwości indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez korelację pikseli i jednoczesny pomiar międzykomórkowego przejściowości wapnia poprzez obciążenie komórek wrażliwym na wapń FloA-PhoR.
Korzystając z tej platformy, możliwe jest wykonywanie pomiarów w dobrze zachowanym środowisku temperaturowym na różnych formatach płyt i natychmiastowy dostęp do danych. Metoda ta umożliwia badanie mechanizmów patologicznych komórek oraz ocenia wpływ związków i funkcjonalność ludzkich kardiomiocytów pochodzących z IPSC, które mogą być pomocne w procesie przedklinicznych badań przesiewowych leków. Aby rozpocząć, włącz system pomiarowy oparty na optyce, źródło diody elektroluminescencji mikroskopu i komputer.
Uruchom program na komputerze i otwórz nowy plik, klikając Nowy pod plikiem w lewym górnym rogu ekranu. Kliknij na zbieranie, wybierz eksperymenty, a następnie wybierz IPSC i pomiary wapnia. Następnie zastąp ludzką pożywkę hodowlaną kardiomiocytów IPSC 0,5 mililitra na studzienkę roztworu tyrodowego na płytce 24-dołkowej.
Załóż pokrywę płyty na pokrywę klimatyzacji i umieść płytkę w układzie pomiaru przestrzeni optycznej w urządzeniu, ustawionym na temperaturę 37 stopni Celsjusza. Kliknij otwórz wyszukiwarkę komórek pod paskiem narzędzi i poczekaj, aż pojawi się nowy ekran. Wybierz format płyty w obszarze typ komory i dobrze u góry ekranu.
Wybierz studnię i wybierz obszar w studni, aby obserwować zsynchronizowane skurcze i rozluźnienie. Naciśnij start w lewym dolnym rogu ekranu. Następnie kliknij dodaj pomiar, aby zmierzyć obszar.
Zmierz około 10 obszarów na studzienkę w płytce 24-dołkowej. W przypadku pomiarów tylko podstawowych kontynuuj pomiar od następnego dołka. Aby przetestować związki, naciśnij przycisk Zakończ po zmierzeniu obszarów w studni.
Otwórz przyrząd pomiarowy oparty na optyce i dodaj żądany stresor lub związek do studni. Po inkubacji w żądanym okresie czasu kliknij automatyczny pomiar, aby wykonać sparowane pomiary w tych samych obszarach studni, w których wykonano pomiary podstawowe. Naciśnij przycisk Zakończ po wykonaniu wszystkich pomiarów.
Wybierz następny dołek w prawym górnym rogu ekranu i kontynuuj pomiary dla wszystkich wymaganych studzienek. Po zmierzeniu wszystkich wymaganych dołków kliknij stop i zapisz plik w żądanej lokalizacji. Rozpuścił podwielokrotności Fura-2 AM w roztworze tyrodowym, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikromolowego Fura-2 AM do dodania do komórek.
Odessać pożywkę i zastąpić ją roztworem tyrodowym zawierającym Fura-2 AM. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze lub systemie pomiarowym opartym na optyce. Usunąć roztwór tyrodowy zawierający Fura-2 AM i umyć studzienki dwa razy świeżym roztworem tyrodowym. Na koniec inkubować komórki w roztworze tyrodowym przez kolejne pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić desteryfikację Fura-2 AM. Umieść płytkę wewnątrz systemu pomiarowego opartego na optyce, aby kontynuować pomiary kurczliwości.
Wybierz studnię. Wybierz obszar w studni, aby obserwować zsynchronizowany skurcz i rozluźnienie, a następnie kliknij start i dodaj pomiar. Oprócz śladów kurczliwości na ekranie pojawia się metryka stanu przejściowego wapnia w czasie rzeczywistym.
Aby przeanalizować dane, kliknij Cytosolver na pulpicie. Kliknij import z menu plików i wybierz pliki do analizy. Po analizie obserwuj na ekranie zaakceptowane i odrzucone stany nieustalone.
Kliknij Eksportuj w lewym górnym rogu ekranu i włącz średnie dane przejściowe. Eksportuj do pliku Excel, a następnie kliknij przycisk eksportuj. Sprawdź przeanalizowane dane przedstawione w arkuszu kalkulacyjnym.
Wyłącz komputer i wszystkie inne instrumenty. Pomiary kurczliwości analizowano za pomocą programu Cytosolver i przedstawiono parametry częstotliwości spoczynku/dudnienia, czasu do szczytowej kurczliwości oraz czasu do kurczliwości wyjściowej kontrolnych ludzkich kardiomiocytów IPSC. Zastosowanie 500 nanomolowych izo, nieselektywnego agonisty receptora beta-adrenergicznego, znacznie zwiększyło częstotliwość dudnienia we wszystkich studzienkach.
Iso zwiększyło również kinetykę, o czym świadczy skrócenie czasu do szczytowej kurczliwości i czasu do kurczliwości wyjściowej. Podobnie jak w przypadku kurczliwości, przeanalizowano również pomiary wapnia i podano parametry.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia intuicyjną metodę pomiaru kurczliwości oraz gospodarki wapniowej kardiomiocytów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-CMs). Podejście to umożliwia badaczom szybką ocenę wpływu mutacji genetycznych i interwencji farmakologicznych, wykazując swoją użyteczność w przesiewaniu leków oraz zrozumieniu mechanizmów komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Funkcja kardiomiocytów
- Interwencje lekowe
- Patofizjologia komórkowa
Wstęp
- Kardiomiocyty pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC-CMs) są cenne w badaniu chorób serca.
- Zrozumienie dynamiki skurczu i wapnia jest kluczowe dla charakterystyki funkcji kardiomiocytów.
- W celu efektywnego przeprowadzania doświadczeń niezbędna jest powtarzalna platforma pomiarowa.
Zastosowane metody
- Optyczny system pomiarowy do oceny kurczliwości i poziomu wapnia
- Kardiomiocyty pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
- Techniki korelacji pikseli oraz analiza programem cytosolver
Główne wyniki
- Metoda ta pozwoliła na pomyślne zarejestrowanie zsynchronizowanego skurczu i rozkurczu oraz przejściowych zmian stężenia wapnia.
- Zastosowanie izoprenalolu, agonisty receptorów beta-adrenergicznych, zwiększyło częstotliwość uderzeń i poprawiło kinetykę skurczu.
- Dane zostały efektywnie przeanalizowane za pomocą programu Cytosolver.
Wnioski
- Ta metoda zwiększa możliwości badania funkcji serca na poziomie komórkowym.
- Wspiera ona opracowywanie strategii terapeutycznych poprzez przedkliniczne badania przesiewowe leków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Pomiar w czasie rzeczywistym kurczliwości i dynamiki wapnia w kardiomiocytach pochodzących z hiPSC odpowiada na krytyczną potrzebę tworzenia predykcyjnych, relewantnych dla ludzi modeli serca we wczesnych etapach odkrywania leków. Platforma ta umożliwia szybką, ilościową ocenę efektów mutacji i odpowiedzi na związki chemiczne, wspierając mechanistyczną redukcję ryzyka oraz ciągłość translacyjną. Podejście to usprawnia podejmowanie decyzji dotyczących portfolio poprzez dostarczanie odtwarzalnych i skalowalnych danych do przedklinicznej oceny bezpieczeństwa i skuteczności kardiologicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących funkcji serca z wykorzystaniem modeli komórkowych istotnych dla człowieka.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ilościowe określanie zmian w kurczliwości i gospodarce wapniowej.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów w badaniach nad chorobami serca i ścieżkami bezpieczeństwa.
- Zapewnia pewność prognostyczną przy selekcji wczesnych celów terapeutycznych w kardiologii.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane i powtarzalne testy kurczliwości oraz poziomu wapnia do oceny związków.
- Wspiera skalowalność testów dla wielu formatów płytek i warunków eksperymentalnych.
- Generuje dane ilościowe umożliwiające rzetelne porównanie stanów wyjściowych i po interwencji.
- Umożliwia szybkie przesiewanie perturbacji farmakologicznych i genetycznych w hiPSC-CMs.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Usprawnia spójność między wynikami funkcjonalnymi serca uzyskanymi in vitro a przedklinicznymi punktami końcowymi bezpieczeństwa i skuteczności.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej z wykorzystaniem systemów pochodzenia ludzkiego.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju leku w oparciu o ocenę ryzyka poprzez ilościowe określanie indukowanych lekami efektów kardiologicznych.
- Ułatwia opracowanie translacyjnych biomarkerów kurczliwości serca i gospodarki wapniowej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten system pomiarowy oparty na optyce integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając wczesne przesiewy funkcjonalne, badania mechanistyczne oraz walidację translacyjną w badaniach nad sercem.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie kurczliwości i przejściowych zmian stężenia wapnia w celu testowania hipotez kardiologicznych i wyjaśniania mechanizmów chorobowych.
- Przesiewanie: Dostarczanie gotowych do analizy, powtarzalnych wyników w celu oceny związków i stresorów w hiPSC-CMs.
- Analityka: Zapewnienie ilościowych pomiarów w czasie rzeczywistym oraz wyników statystycznych do porównań między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Przenoszenie wyników in vitro do punktów końcowych badań przedklinicznych z wykorzystaniem modeli kardiologicznych istotnych dla ludzi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferowanie skalowalnej, wielokrotnego użytku platformy do prowadzenia ciągłych badań nad bezpieczeństwem i skutecznością kardiologiczną.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów kardiologicznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje testy kurczliwości i poziomu wapnia w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej oceny ryzyka kardiologicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów kardiologicznych.
Kwestie dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w hodowli hiPSC-CM oraz w konfiguracji testów funkcjonalnych.
- Wymaga aparatury pomiarowej opartej na optyce oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego.
- Wymaga standaryzacji protokołów testowych i przepływów analizy danych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych formatów płytek i układów eksperymentalnych w celu elastycznego zaprojektowania badania.
- Zależność od stabilnej kontroli temperatury i warunków środowiskowych w celu zapewnienia spójności testów.
